CN117987334A - 一种以甘油为碳源生产染料木苷的工程菌及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以甘油为碳源从头合成染料木苷的大肠杆菌工程菌及应用，所述大肠杆菌工程菌的构建方法为：在E.coli BL21(DE3)的lacZ基因座整合基因aroGfbr和基因tyrAfbr的表达元件，实现以甘油为碳源合成L‑酪氨酸；然后在该菌株中过表达L‑酪氨酸到染料木素的途径基因：TcTAL、Pc4CL、PxCHS、MsCHI、TpIFS和CrCPR；过表达转化染料木素为染料木苷的PlUGT15基因和合成UDP‑葡萄糖的cep94A和ugpA基因；过表达特异性转出染料木苷的yadH基因；过表达促进甘油利用的alrd、aldH和garK基因；通过CRISPR干扰抑制工程菌中的fadB、poxB、fadF和pta基因，从而提高染料木苷的产量。在摇瓶发酵和发酵罐的补料分批发酵中，工程菌分别产生137.8mg/L和202.7mg/L染料木苷。本发明所获得工程菌有望实现利用微生物法生产染料木苷，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种以甘油为碳源从头合成染料木苷的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
异黄酮是豆科植物中产生的具有生物活性的多酚次级代谢产物。除了在植物生长发育中的作用外，异黄酮还表现出各种健康促进作用，例如抗氧化活性、抗炎活性、抗肿瘤活性、神经保护活性、抗骨质疏松活性以及雌激素或抗雌激素活性。其中，染料木素是最著名和研究最多的异黄酮之一。从其抗氧化活性到对不同癌症的抗癌活性，近年来染料木素已成为许多研究的兴趣化合物。染料木苷(染料木素7-O-葡萄糖苷)是染料木素的一种糖基化衍生物，与染料木黄酮相比显示出更高的溶解度和稳定性。染料木苷可通过空肠和回肠中的β-葡萄糖苷酶以及结肠中的肠杆菌有效水解为染料木素，然后迅速被整个肠道吸收。因此，染料木苷可以通过水解成染料木素在体内发挥其生物活性。
这些理化性质和生物活性特征导致了将异黄酮作为药物在医疗应用和保健品中的研究。市场上可用的异黄酮主要来源于大豆提取。然而，从植物材料中提取是一种不稳定的方法，因为复杂的气候条件变化和土地资源的日益短缺都可能会影响原料的可用性。同时，异黄酮本身的复杂性限制了这些化合物的化学合成。因此，选择对生态友好且不需要耕地的染料木苷生产方法是有意义的。最近，通过代谢工程将异黄酮生物合成途径在微生物表达来开发微生物细胞工厂，已成为大规模生产这些异黄酮的可持续和生态友好的替代方法。
异黄酮通过黄酮类分支途径生物合成，这是一般苯丙类代谢的一部分。异黄酮的结构特征是碳骨架C6-C3-C6，与其他黄酮不同的是，B环连接在C环的C3位置而不是C2位置。这种独特的结构是通过异黄酮合成酶(IFS，一种细胞色素P450)的催化形成的。柚皮素在IFS催化下经历2-羟基化和芳基迁移，生成染料木素。糖基化是异黄酮生物合成中最普遍的修饰之一，它在很大程度上影响异黄酮的化学性质和生物活性。微生物中异源类黄酮途径的代谢工程为异源宿主中异黄酮的从头合成铺平了道路。最近报道了一种用于从头生产大豆苷元及其糖苷的酵母平台，使用多阶段代谢工程策略生产85.4mg/L大豆苷元、72.8mg/L葛根素和73.2mg/L大豆苷。这项研究极大地推进了微生物生产异黄酮的代谢工程。
大肠杆菌是现代生物技术研究最透彻的菌株，已成为微生物生产天然产品的一种有前景的宿主生物。最近，通过应用各种菌株改良策略，大肠杆菌细胞工厂实现了最高的中间柚皮素产量(1073.8mg/L)。然而，与酵母相比，大肠杆菌没有细胞色素P450还原酶(CPR)，也没有内质网，这阻碍了IFS的表达。几个小组通过在大肠杆菌中引入关键酶，成功地将添加的前体(包括柚皮素和对香豆酸)转化为异黄酮。在之前的一项研究中，Leonard和他的同事通过模仿自给自足的细菌P450的结构，率先在大肠杆菌中组装了植物P450。这种嵌合体催化的体内特异性产量比真核宿主中表达的天然酶高20倍，比植物高10倍。然而，这些异黄酮途径在大肠杆菌中的有效操作需要在培养基中补充可溶性较低且昂贵的前体，这在商业上是不利的。因此，构建一种能够从简单的碳源生产染料木苷的微生物菌株需要进一步研究。然而尽管已经实现了柚皮素的高生产率，但由大肠杆菌进行的从头染料木苷生物合成目前还存在如下几个问题：(1)通常用于柚皮素生产的葡萄糖碳源导致异黄酮产量的大幅减少，(2)染料木素引起的异黄酮合成酶的产物抑制以及(3)染料木苷对大肠杆菌宿主有毒性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，即针对目前微生物法从头合成染料木苷的局限性，提供一种利用可再生的廉价碳源甘油从头合成染料木苷基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述从头合成染料木苷基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述从头合成染料木苷基因工程菌的代谢工程调控方法。
本发明的思路为：针对通常用于柚皮素生产的葡萄糖碳源导致异黄酮产量的大幅减少的问题，在大肠杆菌中设计并构建了利用廉价可再生的甘油碳源从头合成染料木素的生物合成途径。该途径包括从甘油到L-酪氨酸途径、L-酪氨酸到柚皮素途径以及柚皮素到染料木素途径；针对染料木素引起的异黄酮合成酶的产物抑制的问题，我们上述染料木素合成工程菌中设计并构建染料木素糖基化途径，并表达前体UDP-葡萄糖再生途径；针对染料木苷对大肠杆菌宿主有毒性，我们在上述染料木苷生产菌株中筛选和表达糖苷特异性转运蛋白；在构建了染料木苷从头合成菌株的基础上，我们在该菌株中通过人工蛋白框架缩短异黄酮合成酶和P450还原酶空间距离并提供最优的化学计量学比例，然后为了优化甘油的利用效率，过表达外源甘油利用途径，为了减少副产物生成，最大化染料木苷的合成通量，采用CRISPR干扰介导的基因敲低调控菌株的中心碳代谢。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种生产染料木苷的基因工程菌，以E.coli BL21(DE3)为宿主，导入通过在E.coli BL21(DE3)染色体lacZ基因座整合3-脱氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶抗反馈抑制突变体基因aroGfbr和预苯酸脱氢酶抗反馈抑制突变体基因tyrAfbr的过表达元件，以甘油为碳源合成L-酪氨酸；导入编码L-酪氨酸到柚皮素的转化酶编码基因TcTAL、Pc4CL、PxCHS和MsCHI；导入编码柚皮素到染料木素的异黄酮合成酶基因TpIFS和细胞色素P450还原酶基因CrCPR基因；导入编码染料木素到染料木苷的转换酶编码基因糖基转移酶基因PlUGT15，以及编码从纤维二糖产生UDP-葡萄糖的转化酶基因纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94A、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpA；；导入编码染料木苷的特异性转出蛋白基因yadH；导入异源甘油利用途径基因alrd、aldH和garK；通过CRISPR干扰抑制大肠杆菌底盘细胞中的fadB、poxB、fadF、pta。
其中，所述的3-脱氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因aroG和预苯酸脱氢酶基因tyrA基因来源于E.coli K12，通过定点突变对aroG进行Asp-146-Asn突变得到aroGfbr，对tyrA进行Met-53-Ile，Ala-354-V突变得到tyrAfbr。所述的aroGfbr的核苷酸序列为SEQ IDNO：1，tyrAfbr的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。aroGfbr和tyrAfbr基因表达元件整合到大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ基因座。
所述的L-酪氨酸到柚皮素合成途径中的酪氨酸解氨酶基因TcTAL来自于Trichosporon cutaneum，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3，4-香豆酰-辅酶A连接酶基因Pc4CL来自于Petroselinum crispum，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4，所述的查尔酮合成酶基因PxCHS来自于Petunia X hybrida，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5，查尔酮异构酶MsCHI来自于Medicago sativa，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
所述的柚皮素到染料木素合成途径中的异黄酮合成酶基因TpIFS来自于Trifolium pratense，其5’带有[SH3ligand]3序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7，细胞色素P450还原酶基因CrCPR来自于Catharantus roseus，其5’带有SH3序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：8。
所述的糖基转移酶基因PlUGT15来自于Pueraria lobata，其核苷酸序列为SEQ IDNO：9，纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94A来自于Saccharophagus degradans 2-40，其核苷酸序列为SEQ ID NO：10、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpA来自于B.bifidum，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11。
所述的染料木苷的特异性转出蛋白基因yadH来自于E.coli K12，其核苷酸序列为SEQ ID NO：12。
所述的甘油利用途径中的醇脱氢酶基因aldH来自于Ralstonia eutropha H16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13，醛脱氢酶基因alrD基因也来自于Ralstonia eutropha H16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：14，甘油酸激酶基因garK来自于E.coli BL21(DE3)，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
所述的CRISPR干扰系统中的dCas9基因来自于Pseudomonas aeruginosa，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16，fadB-sgRNA包含RNA骨架和特异性N20序列，其核苷酸序列为SEQID NO：17、poxB-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：18、fadF-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：19、pta-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：20。
本发明还提供了上述染料木苷从头合成的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)从甘油到L-酪氨酸途径的构建：通过基因合成获得aroGfbr和tyrAfbr，将aroGfbr和tyrAfbr基因片段用限制性内切酶消化后，用胶回收试剂盒回收后，分别克隆到pACM4，产生pACM4-T7tyrAfbr-T7aroGfbr。使用CRISPR-Cas9系统将T7tyrAfbr-T7aroGfbr表达元件整合到E.coli BL21(DE3)的lacZ位点，从而获得E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr；
(2)L-酪氨酸到柚皮素途径的构建：通过将TcTAL和Pc4CL基因克隆到pCDM6表达载体上，构建pCDM6-TcTAL-Pc4CL，PxCHS和MsCHI基因克隆到pETM6表达载体上，构建pETM6-PxCHS-MsCHI重组质粒；
(3)柚皮素到染料木素途径构建：将5’带有[SH3ligand]3的TpIFS基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：7)和5’带有SH3序列的CrCPR(核苷酸序列为SEQ ID NO：8)组装到质粒pETM6-PxCHS-MsCHI下进行表达，构建pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR重组质粒；
(4)染料木素到染料木苷途径构建：将基因PlUGT15组装到质粒pCOM4下进行表达，产生pCOM4-PlUGT15，将cep94A和ugpA组装到pCOM4-PlUGT15，构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA重组质粒；
(5)染料木苷的特异性转出蛋白构建：基因yadH组装到质粒pCDM6-TcTAL-Pc4CL，构建pCDM6-TcTAL-Pc4CL-yadH
(6)甘油利用途径构建：将基因alrd、aldH和garK组装到质粒pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA下进行表达，构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH-garK重组质粒；
(7)工程菌CRISPR干扰系统的构建：通过将sgRNA表达原件和无催化活性的dCas9基因组装到pACM4，从而产生质粒pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9；
(8)利用甘油从头合成染料木苷的菌株构建：将步骤(2)～(7)中获得的重组质粒pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR、pCDM4-TcTAL-Pc4CL-yadH、pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA以及pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9同时转化入步骤(1)E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌，通过抗性筛选获得从甘油从头合成染料木苷的工程菌株。
其中，步骤(1)中，所述的甘油到L-酪氨酸重组质粒的构建，具体操作过程如下：通过基因合成获得aroGfbr和tyrAfbr基因，通过限制性内切酶酶切后，胶回收DNA片段。经过T4连接酶连接到pACM4(购自于Addgene公司)，产生pACM4-T7tyrAfbr-T7aroGfbr。使用CRISPR-Cas9系统将T7tyrAfbr-T7aroGfbr盒整合到E.coli BL21(DE3)的lacZ位点，从而获得E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr；
其中，步骤(2)中，L-酪氨酸到柚皮素途径的构建，具体操作过程如下：
通过公司合成TcTAL，Pc4CL，PxCHS和MsCHI基因，然后通过限制性内切酶消化后，胶回收后的DNA片段通过T4连接酶分别克隆到pCDM4(购自于Addgene公司)和pEM6(购自于Addgene公司)上，产生pCDM6-TcTAL-Pc4CL，pETM6-PxCHS-MsCHI重组质粒。
其中，步骤(3)中，柚皮素到染料木素途径构建，具体操作过程如下：
5’带有[SH3ligand]3的TpIFS基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：15)和5’带有SH3序列的CrCPR基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：16)通过生物公司基因合成，通过限制性内切酶消化后，用胶回收试剂盒回收后用T4连接酶组装到质粒pETM6-PxCHS-MsCHI，构建pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR重组质粒。
其中，步骤(4)中，染料木素到染料木苷途径构建，具体操作过程如下：
将通过基因合成获得的PlUGT15基因酶切消化后，胶回收后用T4DNA连接酶组装到质粒pCOM4(购自于Addgene公司)下进行表达，产生pCOM4-PlUGT15，将通过基因合成获得的cep94A和ugpA基因用限制性内切酶消化后，胶回收DNA片段组装到pCOM4-PlUGT15，构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA重组质粒。
其中，步骤(5)中，染料木苷的特异性转出蛋白构建，具体操作过程如下：
通过PCR以E.coli K12基因组为模版扩增yadH，通过酶切消化后，胶回收DNA片段再用T4连接酶连接到质粒pCDM6-TcTAL-Pc4CL，构建pCDM6-TcTAL-Pc4CL-yadH。
其中，步骤(6)中，甘油利用途径构建，具体操作过程如下：
通过PCR以E.coli K12基因组为模版扩增alrd、aldH和garK，用限制性内切酶消化后，将胶回收的DNA片段组装到质粒pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA，构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH-garK重组质粒。
其中，步骤(7)中，工程菌CRISPR干扰系统的构建，具体操作过程如下：
将合成的fadB-sgRNA，poxB-sgRNA，fadF sgRNA，pta-ssgRNA和dCas9基因用限制性内切酶消化后，用胶回收试剂盒纯化DNA片段，连接到pACM4(购自于Addgene公司)，从而产生质粒pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9。
其中，步骤(8)中，利用甘油从头合成染料木苷的菌株构建，具体操作过程如下：
将步骤(2)～(7)中获得的重组质粒pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR、pCDM4-TcTAL-Pc4CL-yadH、pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA以及pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9同时转化入步骤(1)E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌，通过抗性筛选获得从甘油从头合成染料木苷的工程菌株。
一种从头合成染料木苷的基因工程菌在利用以甘油为碳源的培养基制备染料木苷中的应用也在本发明保护的范围之内。
其中，在利用甘油为碳源的培养基制备染料木苷中的应用，包括如下步骤：
(a)含有甘油的M9最小营养培养基配置；
(b)种子液的制备：将基因工程菌按2-4％v/v接种于LB培养基中进行培养，获得种子液；
(c)将步骤(b)中获得的种子液按体积浓度10％的接种量接种于M9最小营养培养基中发酵生产染料木苷。
具体的，步骤(a)中，所述的含有甘油的M9最小营养培养基甘油浓度为5-20g/L，纤维二糖添加量5-10g/L。
具体的，步骤(b)中，所述的基因工程菌按2-4％v/v接种于LB培养基中进行培养，优选的接种量为2％v/v。
具体的，步骤(c)中，所述的发酵，其发酵条件为：在摇瓶发酵条件下，以初始工程菌OD600＝0.05-0.15接种于初始pH值为7.5-8.5的培养基中，37℃条件下培养至OD600＝1-2后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的染料木苷的发酵液；在5-L发酵罐的补料分批发酵条件下，以3％的接种量接种于初始pH值为7.5-8.5培养基中并且全程保持pH＝7.5，37℃条件下培养至OD600＝2-3后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的染料木苷的发酵液。
有益效果：
(1)本发明提供了一种不依赖于农业资源的染料木苷生产方法，所述染料木苷产生工程菌将在甘油的基础培养基产生染料木苷，并在摇瓶中产生137.8mg/L染料木苷，并进一步在发酵罐中补料分批发酵后产生202.7mg/L染料木苷。
(2)本发明构建的人工蛋白框架拉近异黄酮合成酶IFS和P450还原酶CPR之间的空间距离，并优化了这两个蛋白之间化学计量比。
(3)本发明通过优化大肠杆菌的甘油代谢，提高以甘油为碳源时异黄酮前体柚皮素在微生物细胞工厂中的合成。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1是pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR重组质粒的构建示意图。
图2是pCDM6-TcTAL-Pc4CL-yadH重组质粒的构建示意图。
图3是pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA重组质粒的构建示意图。
图4是pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9重组质粒的构建示意图。
图5是CRISPR-Cas9双质粒系统的构建示意图。
图6为以甘油为碳源从头合成染料木苷工程菌的染料木苷产量。
图7为染料木苷的HPLC色谱图
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
主要实验仪器：
表1 主要实验仪器
试剂、酶及相关试剂盒：
各种化学试剂均为分析纯，购于国药集团药业股份有限公司。
氯霉素等抗生素购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
各种限制性内切酶和DNA连接酶购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司。
DL5000 DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
柚皮素、染料木素、染料木苷以及L-酪氨酸标准品购自于上海源叶生物科技有限公司。
菌株和质粒：
质粒pETM6、pACM4、pACM4、pCOM4均购自于Addgene公司(美国)。
E.coli JM109、BL21(DE3)、质粒pUC57购买自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
培养基：
LB液体基础培养基：称取10g胰蛋白胨、5g氯化钠以及10g酵母浸粉溶于1L去离子水中，121℃灭菌20min。
M9培养基购自于上海生工有限公司，溶解后121℃灭菌20min。
LB固体基础培养基：称取10g胰蛋白胨、5g氯化钠以及10g酵母浸粉溶于1L去离子水中，量取100mL于10个100mL的锥形瓶中，加入2g琼脂粉，121℃灭菌20min。
实施例1：甘油到L-酪氨酸途径的构建
使用双酶切将通过全基因人工合成的来源于E.coli K12的aroGfbr(SEQ ID NO：1)以及tyrAfbr(SEQ ID NO：2)基因克隆到大肠杆菌兼性表达载体pACM4上，获得质粒pACM4-T7tyrAfbr-T7aroGfbr。
使用CRISPR-Cas9系统将T7tyrAfbr-T7aroGfbr盒整合到大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ位点。为了获得lacZ基因座的特异性sgRNA，使用生物信息学工具“sgRNAs9”鉴定sgRNA并与大肠杆菌BL21(DE3)遗传背景进行排序。，以p-target(图4，购自Addgene)全质粒为模板，通过引物Pf_lacz和Pr_lacz进行全质粒PCR取代原来20bp的N20序列，构建靶向lacZ的sgRNA表达载体pTarget-lacZ。所用引物见表5。
表5 实施例4所用引物序列-1
PCR反应体系：2×prime star Buffer 25μl；dNTPs Mix 4μl；Permer-F 2μl；Permer-R 2μl；模版5μl；Prime Star 1μl；ddH2O补足至50μl。
PCR条件：98℃预变性5min，95℃变性30s，30个循环，55℃退火30s，72℃延伸2min，延伸速度1kb/min。
(2)对上述体系进行1％Agrose凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段，通过向回收液中加入1μl DpnI，37℃保持30min降解PCR模版。通过MutanBEST试剂盒(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)进行Blunting Kination反应磷酸化后，16℃条件下连接16h。将连接液转化至E.coli JM109感受态，取平板上转化子接入含有100μg/mL壮观霉素的5mL LB培养基中，37℃，200rpm培养12h。重组子测序成功即得改造过的p-target(ptsG)。
(3)根据大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组序列，在待lacZ整合位点的上下游各选择500bp通过引物Pf_lacZ(up)、Pr_lacZ(up)和Pf_lacZ(down)、Pr_lacZ(down)PCR获得同源臂。将胶回收纯化后得到的PCR产物通过引物Pf_lacZ(同源臂)和Pr_lacZ(同源臂)进行融合PCR，得到包含T7tyrAfbr-T7aroGfbr的融合片段，将其连入T载体中得到T-融合(lacZ)质粒。所用引物见表6。
表6 实施例4所用引物序列-2
(4)接种BL21(pcas)于5mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗性溶液，于30℃、200rpm下培养12h。以1％接种量接种于50mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的kana抗性溶液，于30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.2时加入终浓度为10mM的阿拉伯糖，于30℃，200rpm下培养至OD600＝0.6。将菌液转移至50mL离心管中置于冰上冷却15min。4℃条件下，4000rpm离心10min，使用25mL冷却的无菌水和25mL冷却的10％甘油各洗涤菌体2次。加入400μL预冷的10％甘油重悬菌体，50μL分装后-80℃保存。
(5)将BL21(pcas)感受态细胞冰浴融化，测序成功的p-target(lacZ)质粒、T-融合(lacZ)质粒回收片段以3∶7的比例加入BL21(pcas)感受态细胞中，轻柔地吸打混匀后冰浴10min，将其转移到预冷的2mm电击杯中，2.5kV电击，迅速加入1mL LB培养基后转移到1.5mLEP管中于30℃，200rpm振荡培养2h。将菌液涂布到50ug/mL kana抗性、100μg/mL壮观霉素平板上，30℃倒置培养12-16h，挑取单克隆做菌落PCR进行全长PCR验证，挑取阳性克隆接种于含有40μg/mL的kana抗性溶液以及终浓度1mM IPTG的5mL LB培养基中消除pTarget质粒，30℃、200rpm下振荡培养12h后，用基因组试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)提取整合成功的菌株的基因组，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(6)将消除pTarget质粒的菌株接种于5mL LB培养基中，42℃、200rpm下振荡培养12h，吸取10μL稀释至10-6倍均匀涂布平板上，37℃培养16h，挑取30个单菌落点于无抗性平板和同时含有50μg/mL Kana平板的同一位置，37℃培养16h后若在同一位置无抗性平板上长出菌落而Kana平板上未长出菌落则获得pCas消除的菌株。最终得到E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr菌株，制备E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr感受态细胞，于-80℃冰箱冷冻保藏。
实施例2：L-酪氨酸到柚皮素途径的构建
使用双酶切(NdeI/XhoI)将通过全基因人工合成的来源于Trichosporoncutaneum的TcTAL(SEQ ID NO：3)，来源于Petroselinum crispum的Pc4CL(SEQ ID NO：4)，来源于Petunia Xhybrida的PxCHS(SEQ ID NO：5)和来源于Medicago sativa的MsCHI(SEQID NO：6)。分别用T4连接酶将这些消化的基因片段连接到pCDM6和pETM6，最终得到pCDM6-TcTAL，pCDM6-Pc4CL，pETM6-PxCHS，pETM6-MsCHI。pETM6-PxCHS和pCDM6-TcTAL被SpeI和SalI双酶切，产生线性化载体，pCDM6-Pc4CL和pETM6-MsCHI被AvrlI和SalI双酶切，产生DNA片段，通过T4连接酶连接后产生pCDM6-TcTAL-Pc4CL和pETM6-PxCHS-MsCHI。
实施例3：柚皮素到染料木素途径的构建
将5’带有[SH3ligand]3的TpIFS基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：7)和5’带有SH3序列的CrCPR(核苷酸序列为SEQ ID NO：8)通过基因合成获取，通过使用双酶切(NdeI/XhoI)将其线性化，分别组装到pETM6的NdeI/XhoI位点，产生pETM6-[SH3ligand]3TpIFS和pETM6-SH3CrCPR。将pETM6-[SH3ligand]3TpIFS用AvrlI和SalI双酶切，pETM6-PxCHS-MsCHI用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS。将pETM6-SH3CrCPR用AvrlI和SalI双酶切，pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而产生pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR重组质粒。
实施例4：染料木素到染料木苷途径构建
使用双酶切(NdeI/XhoI)将通过全基因人工合成的来源于Pueraria lobata的PlUGT15(SEQ ID NO：9)，来源于Saccharophagus degradans 2-40的cep94A(SEQ ID NO：10)，来源于B.bifidum的ugpA(SEQ ID NO：11)，来源于B.bifidum的ugpA(SEQ ID NO：11组装到质粒pCOM4，产生pCOM4-PlUGT15，pCOM4-cep94A，pCOM4-ugpA。将cep94A和ugpA组装到pCOM4-PlUGT15。将pCOM4-PlUGT15用AvrlI和SalI双酶切，pCOM4-cep94A用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pCOM4-PlUGT15-cep94A。将pCOM4-PlUGT15-cep94A用AvrlI和SalI双酶切，pCOM4-ugpA用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugp。使用双酶切(NdeI/XhoI)将通过全基因人工合成的来源于E.coli的yadH(SEQ ID NO：12)消化后，连接到pCDM6，产生pCDM6-yadH。将pCDM6-TcTAL-Pc4CL用AvrlI和SalI双酶切，pCDM6-yadH用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pCDM6-TcTAL-Pc4CL-yadH。
实施例5：甘油利用途径构建
使用双酶切(NdeI/XhoI)将通过全基因人工合成的来源于Ralstonia eutrophaH16的aldH(SEQ ID NO：9)，alrD(SEQ ID NO：14)，来源于E.coli BL21(DE3)的garK(SEQ IDNO：15)消化，连接到产生pCOM4，产生pCOM4-aldH，pCOM4-alrd。将pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA用AvrlI和SalI双酶切，pCOM4-aldH用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrH。将pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrH用AvrlI和SalI双酶切，pCOM4-alrd用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH。将pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH用AvrlI和SalI双酶切，pCOM4-garK用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH-garK。
实施例6：工程菌CRISPR干扰系统的构建
使用双酶切(NdeI/XhoI)将通过全基因人工合成的来自于Pseudomonasaeruginosa的dCas9基因(SEQ ID NO：16)，一系类sgRNAs：fadB-sgRNA(SEQ ID NO：17)，poxB-sgRNA(SEQ ID NO：18)，fadF-sgRNA(SEQ ID NO：19)，pta-sgRNA(SEQ ID NO：20)消化，连接到产生pACM4，产生pACM4-dCas9，pACM4-fadB-sgRNA，pACM4-poxB-sgRNA，pACM4-fadF-sgRNA，pACM4-pta-sgRNA。将pACM4-fadB-sgRNA用AvrlI和SalI双酶切，pACM4-poxB-sgRNA，用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pACM4-fadB-poxB。将pACM4-fadB-poxB用AvrlI和SalI双酶切，pACM4-fadF-sgRNA用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pACM4-fadB-poxB-fadF。将pACM4-fadB-poxB-fadF用AvrlI和SalI双酶切，pACM4-pta-sgRNA，用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建pACM4-fadB-poxB-pta。将pACM4-fadB-poxB-fadF-pta用AvrlI和SalI双酶切，pACM4-dCas9，用SpeI和SalI双酶切，将胶回收后的片段通过T4连接酶连接，从而构建质粒pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9。
实施例7：利用甘油从头合成染料木苷的菌株构建
将实施例1-6构建的质粒中获得的重组质粒pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR、pCDM6-TcTAL-Pc4CLPxCHS、pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA以及pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9同时转化入步骤(1)E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌，通过抗性筛选获得从甘油从头合成染料木苷的工程菌株。
实施例8：一种以甘油为碳源生产染料木苷的工程菌的功能验证
本发明通过使用HPLC对工程菌生产染料木苷的能力进行功能验证，染料木苷产生工程菌的功能验证主要包括以下步骤：
(1)基因工程菌的准备
从-80℃冰箱中将50μL工程菌保藏液取出，将工程菌按2％v/v接种于5mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)、链霉素(50μg/mL)、氯霉素(50μg/mL)以及卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基，37℃、200rpm培养24h，获得种子液。
LB培养基终浓度组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0。
(2)工程菌发酵条件
在摇瓶发酵条件下，以初始工程菌OD600＝0.05-0.15接种于初始pH值为7.5-8.5的培养基中，37℃条件下培养至OD600＝1-2后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的染料木苷的发酵液；在5-L发酵罐的补料分批发酵条件下，以3％的接种量接种于初始pH值为7.5-8.5培养基中并且全程保持pH＝7.5，37℃条件下培养至OD600＝2-3后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的染料木苷的发酵液。(3)工程菌发酵液中染料木苷的HPLC检测。
吸取750μL发酵液于2mL EP管中，加入750μL乙酸乙酯进行萃取，重复两次，小心吸取上清液于干净的EP管中。使用0.22μm的有机滤膜过滤后，吸取200μL处理后的样液于高效液相进样小瓶中，用HPLC测定样液中染料木苷的浓度(图7)。
仪器型号：Agilent1260高效液相色谱仪配备DAD检测器
HPLC色谱条件：
1)色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18
2)柱温：30℃
3)进样量：10μL
4)流速：0.8mL/min
5)检测波长：254nm
6)流动相：流动相A是体积分数为0.1％的甲酸-水溶液。流动相B是纯甲醇溶液。
7)洗脱程序：0-5min，80％-50％流动相A；5-16min，50％-20％流动相A；16-17min，20％流动相A；17-19min，20％-80％流动相A；19-22min，保持80％流动相A。
从图7可以看出，优化后的最终菌株在含M9最小营养培养基的摇瓶发酵条件下产生137.8mg/L的染料木苷。该工程菌在5-L发酵罐中通过补料分批发酵48h时产生202.7mg/L的染料木苷。这些数据表明本发明所构建的工程菌能够有效的以甘油为碳源生产染料木苷。
本发明提供了一种生产染料木苷的基因工程菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种以甘油为碳源从头合成染料木苷的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，导入了编码甘油到L-酪氨酸的途径基因aroGfbr和tyrAfbr，过表达从L-酪氨酸到柚皮素的途径基因TcTAL、Pc4CL、PxCHS和MsCHI，过表达柚皮素到染料木素需要的异黄酮合成酶基因TpIFS和细胞色素P450还原酶基因CrCPR，导入编码染料木素到染料木苷的糖基转移酶基因PlUGT15，过表达纤维二糖产生UDP-葡萄糖的纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94A、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpA；导入编码染料木苷的特异性转出蛋白基因yadH；导入异源甘油利用途径基因alrd、aldH和garK。通过CRISPR干扰抑制大肠杆菌底盘细胞中的fadB、poxB、fadF、pta。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的3-脱氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因aroG和预苯酸脱氢酶基因tyrA基因来源于E.coli K12，通过定点突变对aroG进行Asp-146-Asn突变得到aroGfbr，对tyrA进行Met-53-Ile，Ala-354-V突变得到tyrAfbr。所述的aroGfbr的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，tyAfbr的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。aroGfbr和tyrAfbr基因表达元件整合到大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ基因座。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的L-酪氨酸到柚皮素合成途径中的酪氨酸解氨酶基因TcTAL来自于Trichosporon cutaneum，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3，4-香豆酰-辅酶A连接酶基因Pc4CL来自于Petroselinum crispum，其核苷酸序列为SEQID NO：4，所述的查尔酮合成酶基因PxCHS来自于Petunia X hybrida，其核苷酸序列为SEQID NO：5，查尔酮异构酶MsCHI来自于Medicago sativa，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的柚皮素到染料木苷合成途径中的异黄酮合成酶基因TpIFS来自于Trifolium pratense，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7，细胞色素P450还原酶基因CrCPR来自于Catharantus roseus，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8，糖基转移酶基因PlUGT15来自于Pueraria lobata，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9，纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94A来自于Saccharophagus degradans 2-40，其核苷酸序列为SEQID NO：10、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpA来自于B.bifidum，其核苷酸序列为SEQID NO：11，染料木苷的特异性转出蛋白基因yadH来自于E.coli K12，其核苷酸序列为SEQID NO：12。
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的甘油利用途径中的醇脱氢酶基因aldH来自于Ralstonia eutropha H16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13，醛脱氢酶基因alrD基因也来自于Ralstonia eutropha H16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：14，甘油酸激酶基因garK来自于E.coli BL21(DE3)，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的CRISPR干扰系统中的dCas9基因来自于Pseudomonas aeruginosa，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16，fadB-sgRNA包含RNA骨架和特异性N20序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：17、poxB-sgRNA核苷酸序列为SEQ IDNO：18、fadF-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：19、pta-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：20。
7.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
从甘油到L-酪氨酸途径的构建：对aroG定点突变的基因aroGfbr进行基因合成，对tyrA定点突变获得通过tyrAfbr进行基因合成，将aroGfbr和tyrAfbr基因分别克隆到pACM4，产生pACM4-T7tyrAfbr-T7aroGfbr。使用CRISPR-Cas9系统将T7tyrAfbr-T7aroGfbr盒整合到大肠杆菌BL21(DE3)的lacZ位点，从而获得E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr；
(2)L-酪氨酸到柚皮素途径的构建：通过将TcTAL和Pc4CL基因克隆到pCDM6表达载体上，构建pCDM6-TcTAL-Pc4CL，PxCHS和MsCHI基因克隆到pETM6表达载体上，构建pETM6-PxCHS-MsCHI重组质粒；
(3)柚皮素到染料木素途径构建：将5’带有[SH3ligand]3(核苷酸序列为SEQ ID NO：15)的TpIFS基因和5’带有SH3序列(核苷酸序列为SEQ ID NO：16)的CrCPR组装到质粒pETM6-PxCHS-MsCHI下进行表达，构建pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR重组质粒；
(4)染料木素到染料木苷途径构建：将基因PlUGT15组装到质粒pCOM4下进行表达，产生pCOM4-PlUGT15，将cep94A和ugpA组装到pCOM4-PlUGT15，构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA重组质粒；
(5)染料木苷的特异性转出蛋白构建：基因yadH组装到质粒pCDM4-TcTAL-Pc4CL，构建pCDM4-TcTAL-Pc4CL-yadH
(6)甘油利用途径构建：将基因alrd、aldH和garK组装到质粒pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA下进行表达，构建pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH-garK重组质粒；
(7)工程菌CRISPR干扰系统的构建：通过将sgRNA表达原件和无催化活性的dCas9 基因组装到pACM4，从而产生质粒pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9；
(8)利用甘油从头合成染料木苷的菌株构建：将步骤(2)～(7)中获得的重组质粒pETM6-PxCHS-MsCHI-[SH3ligand]3TpIFS-SH3CrCPR、pCDM4-TcTAL-Pc4CL-yadH、pCOM4-PlUGT15-cep94A-ugpA-alrd-aldH-garK以及pACM4-fadB-poxB-fadF-pta-sgRNA-dCas9同时转化入步骤(1)E.coli BL21(DE3)ΔlacZ：：T7-tyrAfbr-T7-aroGfbr菌株的感受态细胞中，获得重组工程菌，通过抗性筛选获得从甘油从头合成染料木苷的工程菌株。
8.权利要求1-6任意一项所述的基因工程菌在以甘油为碳源从头合成染料木苷中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(a)含有甘油的M9最小营养培养基配置，其中甘油浓度为5-20g/L，纤维二糖添加量5-10g/L；
(b)种子液的制备：将基因工程菌按2-4％v/v接种于LB培养基中进行培养，获得种子液；
(c)将步骤(b)中获得的种子液按体积浓度10％的接种量接种于M9最小营养培养基中发酵生产染料木苷。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(c)中，所述的发酵，其发酵条件为：在摇瓶发酵条件下，以初始工程菌OD600＝0.05-0.15接种于初始pH值为7.5-8.5的培养基中，37℃条件下培养至OD600＝1-2后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的染料木苷的发酵液；在5-L发酵罐的补料分批发酵条件下，以3％的接种量接种于初始pH值为7.5-8.5培养基中并且全程保持pH＝7.5，37℃条件下培养至OD600＝2-3后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的染料木苷的发酵液。
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