CN114736912A

CN114736912A - 优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用

Info

Publication number: CN114736912A
Application number: CN202210296049.0A
Authority: CN
Inventors: 郭晶心; 刘耀光; 罗婉妮; 祝钦泷; 谭建韬
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-03-24
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2042-03-24
Also published as: CN114736912B

Abstract

本发明公开了经密码子优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用，并基于此提供了一种提高植物遗传转化效率的技术体系，包括含有所述优化rZmG2基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高植物转化效率的应用。本发明同时提供了包含rZmG2基因的热激诱导的自删除载体结构，其为基于Cre/loxP的基因删除重组载体、表达盒或重组菌，用于删除转基因植株中的rZmG2基因和潮霉素筛选标记，或其他外源基因和筛选标记。本发明将优化的rZmG2基因通过植物表达载体以基因工程手段整合到植物染色体上，能显著提高植物的遗传转化效率。且利用本发明技术体系获得的转基因植株，可通过热激诱导的Cre/loxp基因删除系统自动删除rZmG2基因和筛选标记基因，从而避免转基因对植株后续生长发育的可能影响。

Description

优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种经密码子优化的玉米GOLDEN2基因(rZmG2)基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.和玉米(Zea mays L.)等作物是重要的粮食作物和模式植物，在粮食安全和植物基础研究中具有重要价值。在植物的遗传改良研究中，遗传转化是一种必不可少的手段。水稻和玉米的遗传转化技术日益成熟，但仍然存在基因型限制严重、转化效率偏低等问题，如籼稻的转化较粳稻难，且转化效率低，玉米的转化效率受遗传背景影响也很大。因此急需建立一套高效、稳定、广泛的适用不同基因型的水稻和玉米等植物的转化体系。

中国发明专利公开了一种玉米BBM1基因在提高遗传转化效率中的应用，将玉米BBM1基因构建到植物双元表达载体上，然后通过农杆菌介导法转化玉米，可以提高玉米的遗传转化效率，克服玉米转化基因型限制，拓宽了玉米转化的受体品种种类。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的适用于提高水稻、玉米等多种植物遗传转化效率的新体系。

一方面，提供优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率方面的应用。

另一方面，本发明提供一种在愈伤组织中导入和表达rZmG2基因，且在苗期即可实现rZmG2基因表达盒的自删除，对转基因植物生长不造成任何影响的提高植物遗传转化效率的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先对玉米rZmG2基因进行水稻密码子优化，在植物愈伤组织中导入rZmG2基因，使用愈伤组织强启动子驱动ZmG2表达，可促进水稻和玉米的愈伤组织向胚性愈伤组织分化和再生，提高遗传转化效率。本发明还在转化完成后，利用基因删除系统删除rZmG2基因和抗性筛选标记基因，在苗期即可实现rZmG2基因表达盒的自删除，有效避免转基因对植株后续生长发育的可能影响。该技术通过rZmG2基因提高遗传转化效率对其他多种作物同样有效。

因此本发明要求保护：

一种优化的玉米rZmG2基因，及其在提高植物遗传转化效率方面的应用，

以及包含所述优化的玉米rZmG2基因的重组载体、表达盒或重组菌，及其在提高植物遗传转化效率方面的应用。

所述优化的玉米rZmG2基因为如下任一所述DNA分子：

(1)将玉米rZmG2基因经水稻密码子优化所得DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列分子杂交，且能提高植物的遗传转化效率的DNA分子序列；

(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上的相似性，且能提高植物的遗传转化效率的DNA分子序列；

(4)编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的DNA分子。

具体优选地，上述(1)中所述DNA分子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种基于异位表达优化的rZmG2基因提高植物遗传转化效率的方法，是将上述优化的玉米rZmG2基因通过植物表达载体以基因工程手段整合到植物染色体上。

使用任一种在愈伤组织高表达的启动子，优选地使用愈伤组织特异启动子P_csp，构建由此启动子驱动rZmG2基因的表达盒，组装到植物双元表达载体上，然后通过农杆菌介导法转化水稻和玉米愈伤组织，以提高其遗传转化效率(愈伤组织再生出苗率)。

优选地，本发明所用的质粒有：pYLMF-H和pYLTAC380GW。

优选地，rZmG2基因组装到载体pYLMF-H的Fse I与Xba I酶切位点之间。

更具体，先将优化的玉米rZmG2基因构建到载体pYLMF-H的Fse I与Xba I酶切位点之间，再通过Gateway-BP重组反应构建到热激诱导的自删除重组载体pYLTAC380GW，最终重组载体为pYLTAC380H-Pcsp::rZmG2，以基因工程手段整合到植物染色体上。

本发明提供的热激诱导的自删除重组载体pYLTAC380H-Pcsp::rZmG2包含3个表达盒：P_CSP:rZmG2为愈伤组织特异启动子控制rZmG2；P_18.2:Cre为热激诱导重组酶Cre删除两个lox P位点间的DNA序列，P_35S:HPT为潮霉素筛选标记。

获得的转基因植株，可通过热激诱导的Cre/loxp基因删除系统自动删除rZmG2基因和潮霉素筛选标记基因HPT，从而避免转基因影响后续的生长发育。

植物遗传转化方法可为任一种植物遗传转化方法，优选为农杆菌介导法。

所述植物表达载体优选为双元表达载体。

优选地，所述植物表达载体的骨架载体为pYLMF-H、pYLTAC380GW、pCAMBIA1300或pYLTAC380H双元载体等，能用于植物遗传转化并得到转基因植株。

本发明技术适用植物包括水稻和玉米等，所述水稻材料包括籼稻(华光和华占)以及粳稻(Dongjing和中嘉8号)；玉米材料包括B104。

本发明具有以下有益效果：

本发明创新地利用玉米rZmG2基因提高水稻等植物遗传转化效率，主要通过提高其分化效率来实现的(具体表现为使分化阶段的愈伤组织提前出现绿点，而且绿点数目变多，使得愈伤组织提前再生出芽，加快了分化成苗的速度，提高分化再生效率)，对籼稻和粳稻都有作用。同时本发明证实，rZmG2也提高了玉米等其他作物的转化效率。

本发明技术在完成转化后，表达盒中的rZmG2基因和抗性筛选基因，可通过热激处理进行自删除，避免转基因影响植株后续的生长发育。

附图说明

图1为本发明实施实例2中质粒pYLMF-H的结构示意图。

图2为本发明实施实例2中质粒pYLTAC380GW的结构示意图。

图3为本发明实施实例2中重组质粒pYLTAC380H-P_csp::rZmG2的结构示意图。

图4为本发明实施实例4中水稻转化rZmG2基因的分化阶段愈伤组织表型图。

图5为本发明实施实例5中水稻转基因材料的检测结果。

图6为本发明实施实例6中热激删除处理后的检测结果。

图7为本发明实施实例7中转化玉米转化rZmG2基因的分化阶段愈伤组织表型图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 ZmG2基因的优化和克隆

根据玉米ZmG2基因的编码蛋白(SEQ ID NO.1)，经水稻密码子优化得到rZmG2基因序列，如SEQ ID NO.2所示，再由金开瑞公司合成此基因。

实施例2 pYLTAC380H-P_csp::rZmG2载体的构建

本发明采用的启动子能特异性的驱动目标基因在愈伤组织中表达，所述启动子为：以水稻品种中花11基因组DNA为模板，用引物PCSPF/PCSP G2 R(SEQ ID NO.5-6所示)直接PCR扩增水稻愈伤组织特异表达基因(基因号LOC_Os08g04210)获得的启动子。

本发明采用的终止子为Tmas。用Fse I与Xba I酶切质粒pYLMF-H(图1)，将P_csp-rZmG2-Tmas表达盒通过Gibson assembly方法组装到Fse I与Xba I之间得到pYLMF-H-P_csp-rZmG2-Tmas，再将其与受体载体pYLTAC380GW(图2，简称p380)发生Gateway-BP重组反应，得到重组质粒pYLTAC380H-P_csp::rZmG2(图3)。其中载体T-DNA区设计的两个loxp位点及其之间的HPT//rZmG2//Cre表达盒，是用于将植物转化体进行热激诱导Cre/loxp系统表达，以删除HPT//rZmG2//Cre表达盒序列。

sZmG2、P_csp、Tmas的扩增均采用带有接头的引物扩增，扩增体系如下表1：

表1

2×Phanta Max Buffer	10μL
		dNTP Mix(10uM)	0.5μL
引物(F)(10uM)	0.6μL
		引物(R)(10uM)	0.6μL
Phanta酶	0.5μL
		模板(基因组或基因)	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	补足至20μL

扩增sZmG2的引物如下(5’→3’)：

PCSP G2 F(SEQ ID NO.3)：

GGCGCCATCCATGCTGGAGGTTTCAACATTGAGG

G2 Tmas R(SEQ ID NO.4)：

TCGGATCAGGTTCATCCAGTAGCGCCTGTTG

扩增P_csp的引物如下(5’→3’)：

PCSPF(SEQ ID NO.5)：

GCCGCGGTACCAGCCGGCCGGATGACATGTAAACAACGAG

PCSP G2 R(SEQ ID NO.6)：

TGTTGAAACCTCCAGCATGGATGGCGCCAATTGCTCTC

扩增Tmas的引物如下(5’→3’)：

G2 Tmas F(SEQ ID NO.7)：

GCTACTGGATGAACCTGATCTCAAATCTTGGAC

TmasR(SEQ ID NO.8)：

CGGGCCATGGTGAATCTAGAGATCTGATAATTTATTTG

扩增反应程序采用常规热循环条件进行扩增。例如：预变性95℃3min，28～30个PCR循环(95℃30s，58℃30s，72℃1min/kb)，补充后延伸72℃2min。

扩增得到的PCR产物进行纯化，纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。

用Fse I与Xba I酶切质粒pYLMF-H，酶切试剂盒购自NEB公司，酶切体系如下表2：

表2

10×Buffer	1μL
		酶Fse I	0.5μL
酶Xba I	0.5μL
		pYLMF-H	8μL
	合计10μL

37℃条件下反应1h，进行酶切。

65℃条件下反应20min，进行酶失活。

将sZmG2、P_csp、Tmas 3个片段通过Gibson assembly连接到pYLMF-H上，连接体系如下表3：

表3

2×Gibson assembly反应液	9μL
		片段sZmG2	2μL
片段Pcsp	2μL
		片段Tmas	2μL
pYLMF-H(已酶切)	3μL
			18μL

连接反应：50℃条件下连接反应1h。

将上述连接产物通过电击或热击转化至大肠杆菌DH10B，摇菌后涂布于Amp抗性的LB培养基上过夜培养。对平板上的菌落进行菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆菌株，提取质粒，得到pYLMF-H-P_csp-sZmG2-Tmas。

将供体载体pYLMF-H-P_csp-sZmG2-Tmas与受体载体pYLTAC380GW发生Gateway-BP重组反应，反应所需试剂盒为Thermo Fisher公司。反应体系如下表4：

表4

pYLMF-H-Pcsp-sZmG2-Tmas	150ng
		p380GW	150ng
5×BP ClonaseⅡEnzyme Mix	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足至10μL

25℃条件下过夜反应；加入1μL蛋白酶K在37℃条件下反应10min终止反应。

将上述Gateway-BP重组反应的产物转化至大肠杆菌DH10B中，摇菌后涂布于含有5％蔗糖的Kan抗性LB培养基上过夜培养。对平板上的菌落进行菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆菌株，提取质粒，得到重组质粒pYLTAC380H-P_csp::rZmG2。

实施例3重组质粒转入农杆菌EHA105

重组质粒pYLTAC380H-P_csp::rZmG2转入农杆菌EHA105的步骤如下：

(1)取1μL质粒稀释10倍，4℃条件下透析30min；

(2)透析好的质粒与50μL农杆菌感受态充分混合，加入已预冷的点击杯中，放入电击仪中进行电击转化，电击参数为:升压器电阻200Ω，1650V。

(3)加入1mL SOC培养基并充分吹打，将菌体与培养基一同转入2mL离心管中；

(4)37℃，200rpm条件下，复苏40min～60min；

(5)涂布在含有Kan抗性的LB培养基上，36h～48h。

(6)对平板上的菌落进行菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆菌株，加入等体积50％的甘油于-80℃保存。

实施例4 rZmG2基因转化水稻粳稻和籼稻材料，并提高其遗传转化效率

利用农杆菌介导的转化方法，将重组质粒pYLTAC380H-P_csp::rZmG2和对照质粒(CK,包含p380H载体)分别转化籼稻华占和华光，和粳稻DongJing(DJ)和中嘉8号。转化过程中发现，转化rZmG2基因的愈伤组织在分化阶段较对照组出现提前变绿、变绿的愈伤数目变多、提前出芽等表型(图4)；进一步统计发现，转化rZmG2基因的愈伤组织分化效率明显提高，在受体材料华占中提高了19.73％，在华光中提高了28.23％，其转化效率也有明显的提高，在华占和华光中分别提高了6.7％和23.0％(表5)。在DJ中，转化对照质粒的愈伤组织分化效率极低，平均为6.53％，而转化rZmG2基因的愈伤组织分化效率可达到对照的2.8倍(表5)，有显著的提高；其转化率也有显著的提高，转化rZmG2的转化率为对照载体的3.4倍。对转化材料中嘉8号进行分化效率统计，转化rZmG2基因的愈伤组织分化效率较对照比有显著提高，提高了48.69％(表5)。

表5 rZmG2转化水稻统计数据

注：对于每个水稻品系，通过方差分析分析不同载体之间的分化率和转化率的显着差异(P<0.01**，P<0.001***)。/，未统计。

实施例5水稻转基因植株检测

取2cm左右的中嘉8号T0代转基因植株叶片，提取DNA，进行PCR扩增检测rZmG2基因，检测引物(5’→3’)为：

PCSP-JC-F(SEQ ID NO.9)：ATCACTGCATGTCTGCATGC

G2-JC2-R(SEQ ID NO.10)：TATCATCACCGCAAGTCTGC。

对转基因植株进行PCR检测，结果得到一条674bp大小的条带为阳性转基因植株。

结果如图5所示：M：2kb DNA marker。

实施例6转基因水稻植株中rZmG2和HPT基因的删除处理和检测

遗传转化完成后，rZmG2和HPT基因可以通过热激诱导Cre的表达进行自删除。将转化pYLTAC380H-P_csp::rZmG2载体的华光、华占、DJ的T0代种子在水中室温(28℃)条件下浸泡一天以打破休眠，将其置于培养箱中，培养箱每天(24h)设置的参数为：42℃，2.5h(光照，光强为13000lx)；28℃，9.5h(光照，光强为13000lx)；42℃，2.5h(黑暗)；28℃，9.5h(黑暗)；连续处理7d。将热处理后萌发的小苗种植于华南农业大学的实验基地，取第3或4片叶提取DNA，进行PCR扩增检测其删除情况，检测引物(5’→3’)为：

P-F(SEQ ID NO.11)：AATTAATTCCTAGGCCACCATGTTG

P-R1(SEQ ID NO.12)：GTGCTTGACATTGGGGAGTT

P-R2(SEQ ID NO.13)：GTGTGCAATGGGATGATCAGAC

扩增反应程序为：预变性95℃3min，30个PCR循环(95℃30s，57℃30s，72℃35s)，补充后延伸72℃1min。

若两个loxp之间发生重组删除，P-F/P-R2引物可以扩增出一条～0.5kb大小的条带，若没有发生删除，则可以扩增出～1.3kb的条带。扩增结果如图6A所示，大部分被检测的植株都可以扩增出两条一大一小的条带，说明热激处理有效，大部分植株都发生了部分删除。对扩增出的～0.5kb的条带进行测序，测序序列结果如图6B所示，与预期结果一致。

实施例7 rZmG2基因转化玉米B104，并提高其遗传转化效率

将重组质粒pYLTAC380B-P_csp::rZmG2和对照质粒p380B分别转化玉米B104，转化过程中发现，转化rZmG2基因的愈伤组织状态好于对照，且在分化阶段，转化rZmG2基因的愈伤较对照相比分化出芽变多(图7)；对转化数据进行统计发现，转化rZmG2基因的转化效率明显提高，对照组的平均转化效率为17.68％，而转化rZmG2组的平均转化效率可达30.86％，提高了13.18％，说明rZmG2对提高玉米的转化效率也同样有效。

表6 rZmG2转化玉米统计数据

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 461

<212> PRT

<213> ZmG2蛋白序列

<400> 1

Met Leu Glu Val Ser Thr Leu Arg Gly Pro Thr Ser Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

Ala Glu Gln His Cys Gly Gly Gly Gly Gly Phe Val Gly Asp His His

20 25 30

Val Val Phe Pro Thr Ser Gly Asp Cys Phe Ala Met Val Asp Asp Asn

35 40 45

Leu Leu Asp Tyr Ile Asp Phe Ser Cys Asp Val Pro Phe Phe Asp Ala

50 55 60

Asp Gly Asp Ile Leu Pro Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Glu Leu Leu

65 70 75 80

Ala Glu Phe Ser Ser Thr Pro Pro Ala Asp Asp Leu Leu Ala Val Ala

85 90 95

Val Phe Gly Ala Asp Asp Gln Pro Ala Ala Ala Val Ala Gln Glu Lys

100 105 110

Pro Ser Ser Ser Leu Glu Gln Thr Cys Gly Asp Asp Lys Gly Val Ala

115 120 125

Val Ala Ala Ala Arg Arg Lys Leu Gln Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr

130 135 140

Thr Glu Glu Glu Asp Ser Ser Pro Ala Gly Ser Gly Ala Asn Lys Ser

145 150 155 160

Ser Ala Ser Ala Glu Gly His Ser Ser Lys Lys Lys Ser Ala Gly Lys

165 170 175

Asn Ser Asn Gly Gly Lys Arg Lys Val Lys Val Asp Trp Thr Pro Glu

180 185 190

Leu His Arg Arg Phe Val Gln Ala Val Glu Gln Leu Gly Ile Asp Lys

195 200 205

Ala Val Pro Ser Arg Ile Leu Glu Ile Met Gly Thr Asp Cys Leu Thr

210 215 220

Arg His Asn Ile Ala Ser His Leu Gln Lys Tyr Arg Ser His Arg Lys

225 230 235 240

His Leu Met Ala Arg Glu Ala Glu Ala Ala Thr Trp Ala Gln Lys Arg

245 250 255

His Met Tyr Ala Pro Pro Ala Pro Arg Thr Thr Thr Thr Thr Asp Ala

260 265 270

Ala Arg Pro Pro Trp Val Val Pro Thr Thr Ile Gly Phe Pro Pro Pro

275 280 285

Arg Phe Cys Arg Pro Leu His Val Trp Gly His Pro Pro Pro His Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Thr Pro Met Leu Pro Val Trp Pro

305 310 315 320

Arg His Leu Ala Pro Pro Arg His Leu Ala Pro Trp Ala His Pro Thr

325 330 335

Pro Val Asp Pro Ala Phe Trp His Gln Gln Tyr Ser Ala Ala Arg Lys

340 345 350

Trp Gly Pro Gln Ala Ala Ala Val Thr Gln Gly Thr Pro Cys Val Pro

355 360 365

Leu Pro Arg Phe Pro Val Pro His Pro Ile Tyr Ser Arg Pro Ala Met

370 375 380

Val Pro Pro Pro Pro Ser Thr Thr Lys Leu Ala Gln Leu His Leu Glu

385 390 395 400

Leu Gln Ala His Pro Ser Lys Glu Ser Ile Asp Ala Ala Ile Gly Asp

405 410 415

Val Leu Val Lys Pro Trp Leu Pro Leu Pro Leu Gly Leu Lys Pro Pro

420 425 430

Ser Leu Asp Ser Val Met Ser Glu Leu His Lys Gln Gly Val Pro Lys

435 440 445

Ile Pro Pro Ala Ala Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly

450 455 460

<210> 2

<211> 1386

<212> DNA

<213> 优化的rZmG2基因序列

<400> 2

atgctggagg tttcaacatt gaggggaccc acaagttccg gaagcaaggc agagcaacac 60

tgcggaggag gaggtggatt cgttggagat catcacgtgg tgttccctac atctggtgac 120

tgcttcgcca tggtggacga caacctcctt gactacatcg acttctcctg cgacgtgccg 180

ttcttcgacg cagacggcga catcctcccg gacctggagg tcgacactac ggagctgctc 240

gccgagttct cctcgacccc tcctgccgac gacttgctgg cagtggccgt ctttggcgcc 300

gacgaccagc ctgctgccgc tgtggcgcag gagaagccgt cctcctcgct ggagcagact 360

tgcggtgatg ataagggcgt cgcagtggca gcggcacgaa gaaagctcca gaccacgacg 420

acaacgacaa ccaccgagga agaggattca tcgcccgctg gcagtggagc caacaaatca 480

tctgcgagtg cggaagggca ttcgtccaag aagaagtccg cgggaaagaa ctcaaatggc 540

ggcaaacgga aagtgaaggt ggattggaca ccggaactgc atcgccgctt tgtgcaggct 600

gtcgagcagc ttggcatcga taaggctgtc ccgtctcgga ttctggaaat aatgggcaca 660

gactgcctta cgagacacaa tatcgcgtct catcttcaga aatatcgctc tcatcggaaa 720

cacttgatgg caagggaagc ggaagctgcc acatgggccc aaaaacgcca tatgtatgct 780

ccacccgccc cgcggacaac cactactacc gatgcagctc gccccccgtg ggtcgtgcca 840

accaccattg gcttcccacc tccacgcttc tgtagaccgt tgcatgtctg gggacaccca 900

ccaccacacg ctgctgcggc agaagcagcg gcagcaacac caatgctgcc agtttggcca 960

agacatcttg cgccacctag acatctggca ccatgggcac accccacgcc cgttgaccct 1020

gcgttttggc atcaacaata ttcggctgca cgcaaatggg gtccgcaagc agcagccgtg 1080

acgcagggga cgccatgcgt cccgctgccc aggtttccag tcccgcaccc gatatattca 1140

cgcccggcca tggtgccacc gccaccgagc actaccaaac tggcacaact ccatttggag 1200

ctgcaggcgc atccgtcaaa ggaaagtatc gatgccgcaa taggtgatgt gcttgtcaaa 1260

ccgtggctcc cactcccgtt gggccttaag cccccaagtc ttgactcagt tatgagtgag 1320

ctccacaaac aaggagtccc gaaaattcca cctgctgcgg ccaccacaac aggcgctact 1380

ggatga 1386

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物PCSP G2 F

<400> 3

ggcgccatcc atgctggagg tttcaacatt gagg 34

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物G2 Tmas R

<400> 4

tcggatcagg ttcatccagt agcgcctgtt g 31

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物PCSPF

<400> 5

gccgcggtac cagccggccg gatgacatgt aaacaacgag 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物PCSP G2 R

<400> 6

tgttgaaacc tccagcatgg atggcgccaa ttgctctc 38

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物G2 Tmas F

<400> 7

gctactggat gaacctgatc tcaaatcttg gac 33

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物TmasR

<400> 8

cgggccatgg tgaatctaga gatctgataa tttatttg 38

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物PCSP-JC-F

<400> 9

atcactgcat gtctgcatgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物G2-JC2-R

<400> 10

tatcatcacc gcaagtctgc 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物P-F

<400> 11

aattaattcc taggccacca tgttg 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物P-R1

<400> 12

gtgcttgaca ttggggagtt 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物P-R2

<400> 13

gtgtgcaatg ggatgatcag ac 22

Claims

1.一种优化的玉米rZmG2基因，其特征在于，为如下任一所述DNA分子：

(1)将玉米rZmG2基因经水稻密码子优化所得DNA分子；

(4)编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示蛋白的DNA分子。

2.根据权利要求1所述优化的玉米rZmG2基因，其特征在于，(1)所述的DNA分子核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求1或2所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。

4.权利要求1或2所述基因在提高植物遗传转化效率方面的应用。

5.权利要求3所述重组载体、表达盒或重组菌在提高植物遗传转化效率方面的应用。

6.一种基于异位表达优化的rZmG2基因提高植物遗传转化效率的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述优化的玉米rZmG2基因通过植物表达载体以基因工程手段整合到植物染色体上。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述植物表达载体为双元表达载体。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，先将优化的玉米rZmG2基因构建到载体pYLMF-H的Fse I与Xba I酶切位点之间，再通过Gateway-BP重组反应构建到热激诱导的自删除重组载体pYLTAC380GW，最终重组载体为pYLTAC380H-Pcsp::rZmG2。

9.权利要求8中所得到的重组载体pYLTAC380H-Pcsp::rZmG2。

10.权利要求9所述重组载体pYLTAC380H-Pcsp::rZmG2在提高植物遗传转化效率方面的应用。