CN103194451B - 一种水稻种子糊粉层特异性表达启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻种子糊粉层特异性表达启动子及其应用。本发明提供了一种DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明发现一种启动子P-NF-YB1，将导入水稻，在水稻中驱动GUS基因的表达，结果表明，在水稻种子糊粉层中特异表达，该启动子为组织特异性启动子；本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种水稻种子糊粉层特异性表达启动子及其应用。
背景技术
启动子是指基因中一段能准确有效起始转录的ＤＮＡ序列，通常位于基因上游。高等植物启动子一般由两部分组成：一部分是形成普遍性转录结构所需要的，通常称为核心启动区，包括转录起始点及邻近的TATA框；另一部分是决定基因转录特异性和活性的区域，由多个保守序列组成，这些保守序列在不同启动子中的位置、种类及拷贝数存在较大差异。启动子参与调控目的基因在特定组织、发育阶段以及环境条件下的表达。因此,了解启动子的时空专一性表达特征及其作用机制已成为研究基因表达调控的主要内容,通过分离、鉴定相关基因的启动子也是寻找相关功能基因的一种有效途径。
水稻种子糊粉层是胚乳细胞分化过程中形成的累积蛋白质、脂肪酸、铁、锌、维生素B1等营养成分的单层活细胞。通过糊粉层特异性启动子将外源基因导入糊粉层从而改善稻米品质具有重要的实际意义。因此，寻找具有糊粉层表达特性的启动子或其相关调控序列具有重要意义。
目前已经发现很多在水稻种子淀粉胚乳特异性表达的启动子：水稻醇溶蛋白4ａ基因启动子；谷蛋白基因启动子；水稻26ｋＤａ的球蛋白启动子；水稻醇溶谷蛋白基因Ｏｓ12ｇ16890；过敏蛋白ＲＡ5基因Ｏｓ07ｇ11510的启动子等。但有关糊粉层特异性启动子的报道很少，尤其是在水稻中发现的更少。如在大麦中分离的脂转移蛋白启动子Ltp2；大麦几丁质酶基因增强子/沉默子调控序列；玉米脂转移蛋白AL9启动子；水稻谷蛋白B3启动子等等。其中启动子Ltp2融合GUS基因转化水稻后，在糊粉层和胚中均检测到GUS信号，说明在不同种属中启动子的活性并不完全一致。这些已知的启动子远远不能满足基因工程改良水稻品质的需求，因此本发明具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
本发明提供的DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：
1）序列表中序列1所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；
3）与1）限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述序列表中序列1的DNA序列由3018个核苷酸组成。
含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
在本发明的实施例中，上述重组载体为将上述DNA片段（序列表中序列1所示的DNA分子）插入表达载体pPLV15中，得到重组载体；具体构建方法见实施例。
扩增上述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
上述引物对中由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
上述DNA片段在启动目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述目的基因表达为组织特异表达。
上述应用中，所述组织为植物种子的糊粉层。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻。
上述应用中，所述目的基因为GUS基因。
本发明的实验证明，本发明发现一种启动子P-NF-YB1，将其导入水稻，在水稻中驱动GUS基因的表达，结果表明，GUS基因在水稻种子糊粉层中特异表达，该启动子为组织特异性启动子；本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。
附图说明
图1为荧光定量PCR结果
图2为组织原位杂交结果
图3为载体结构示意图
图4为GUS染色及切片观察
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、启动子的获得
一、水稻种子糊粉层特异性表达基因的筛选
1、荧光定量PCR筛选在水稻种子糊粉层特异性表达的转录因子
选取水稻叶片、小穗、根、不同发育时期的水稻种子（4、7、11、14、21天）及手工分离的水稻种子淀粉胚乳及糊粉层（11天的种子），分别提取mRNA，反转录合成cDNA，通过荧光定量PCR鉴定水稻NF-YB1基因（基因号：LOC_Os02g49410）在不同组织及发育时期的表达谱，初步确定NF-YB1基因在水稻糊粉层特异性表达（图1）。
2、组织原位杂交验证NF-YB1基因在水稻种子糊粉层特异性表达
选取水稻不同发育时期的种子，通过固定、脱水、包埋，进一步制备石蜡切片，经NF-YB1基因特异性DNA区段探针组织原位杂交检测，验证NF-YB1基因在水稻种子糊粉层特异性表达（图2，箭头指示糊粉层位置）。
二、水稻种子糊粉层特异性表达基因启动子片段的克隆
提取水稻中花11（Oryza.sativa L.记载在倪玉冲，水稻花培新品种—中花11号[J].农业科技通讯.1989(07)，35；公众可从中国科学院植物研究所获得；以下也称为野生型水稻）叶片基因组DNA作为模板，用引物1：5’-TAGTTGGAATGGGTTCGAAGTGGAAGTGTTACTACATGGCAG-3’（序列2，其中斜体部分为接头）和引物2：5’-TTATGGAGTTGGGTTCGAAGCTCTCTCAAGTCTCAATGACC-3’（序列3，其中斜体部分为接头）进行PCR扩增，得到3018bp的PCR产物。
上述PCR扩增的体系如下：
KOD FX buffer:25ul
基因组DNA(ZH11):5ul
dNTP:4ul
Forward primer:4ul
Reverse primer:4ul
KOD FX:0.5ul
ddH2O:7.5ul
上述PCR扩增程序如下:95℃2分钟，98℃30秒，60℃30秒，68℃延伸（1Kb/分钟），68℃5分钟，2-4步35个循环。
经过测序，该PCR具有序列表中序列1所示的核苷酸，将其命名为P-NF-YB1。
实施例2、启动子的功能验证
一、转P-NF-YB1水稻的获得
1、重组载体的获得
将由实施例1得到的3018bp的PCR产物P-NF-YB1与表达载体pPLV15（Gene bank号JF909468，记载该pPLV15的文献如下：A Versatile Set of Ligation-IndependentCloning Vectors for Functional Studies in Plants.作者：Bert De Rybel，Willyvan den Berg，Annemarie S.Lokerse,Che-Yang Liao，Hilda van Mourik,BarbaraMo¨ller,Cristina I.Llavata-Peris,and Dolf Weijers，Plant physiology,(2011),156:1292-1299；公众可从中国科学院植物研究所获得，该载体的结构示意图如图3所示）的连接是依赖于20多个碱基的粘性末端互补配对连接的方法：先用HpaⅠ单酶切载体pPLV15，再分别用T4DNA聚合酶酶切PCR产物和经Hpa Ⅰ酶切过的载体pPLV15，分别形成可以互补的粘性末端，最后混合两个酶切产物即可连接。
具体方法如下：
1）pPLV15载体用Hpa Ⅰ酶切
Hpa Ⅰ酶切体系（50ul）：
pPLV15质粒:1ug
10X Hpa Ⅰ buffer:5ul
Hpa Ⅰ:2ul
ddH2O:补加到50ul
37℃酶切2小时，回收7432bp的线性化pPLV15。
2）T4DNA聚合酶酶切
PCR产物酶切体系如下(20ul)：
PCR产物P-NF-YB1：200ng
10X T4buffer:2ul
100mM dGTP:2ul
100mM DTT:2ul
BSA(100X):0.2ul
T4DNA polymerase:0.4ul
ddH2O:补加到20ul
22℃酶切2小时，75℃变性20分钟，得到约3037bp P-NF-YB1酶切产物；
线性化pPLV15用T4DNA聚合酶进行酶切体系(50ul)：
线性化pPLV15载体:500ng
10X T4buffer:5ul
100mM dCTP:5ul
100mM DTT:2.5ul
BSA(100X):0.5ul
T4DNA polymerase:1ul
ddH2O:补加到50ul
22℃酶切2小时，75℃变性20分钟，得到约7432bp pPLV15酶切产物。
3）连接
3037bp的P-NF-YB1酶切产物20ul和7432bp的pPLV15酶切产物3ul在22℃连接2小时，得到连接产物。
将上述连接产物热击转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，得到克隆。
菌液PCR鉴定阳性克隆，引物为引物1和引物2，得到3056bp的为阳性克隆。
提取阳性克隆的质粒，结果该质粒为将序列表中的序列1所示的P-NF-YB1插入表达载体pPLV15中得到的载体，且插入的位置为GUS基因的前面（原来的GUS没有启动子），将该质粒命名为pPLV15-P-NF-YB1，即为重组载体。
2、重组菌的获得
将重组载体pPLV15-P-NF-YB1电击转化根癌农杆菌EHA105（Agrobacteriumtumefaciens EHA105；记载在如下文献中：New Agrobacterium helper plasmids forgene transfer to plants.Hood,Elizabeth E;Gelvin,Stanton B;Melchers,LeoS;Hoekema,Andre.Transgenic Research,2(4):p.208-218-218（1993）.公众可从中国科学院植物研究所获得。），得到重组菌。
提取重组菌的质粒，经过测序，该质粒为pPLV15-P-NF-YB1，说明含有该质粒的重组菌为阳性，命名为EHA105/pPLV15-P-NF-YB1。
上述转化农杆菌EHA105时需要pSOUP质粒（Hellens RP,Edwards EA,LeylandNR,Bean S,Mullineaux PM,pGreen:a versatile and flexible binary vectorfor Agrobacterium-mediated transformation.Plant Mol Bio(2000),42:819–832；公众可从中国科学院植物研究所获得。）共转化，具体方法如下：
1）分别取1ul重组载体pPLV15-P-NF-YB1和1ul的pSOUP质粒，加入到EHA105农杆菌感受态细胞中，混匀。
2）冰上孵育30分钟，同时准备电极杯，将电极杯用无水乙醇清洗，并晾干放置冰上备用。
3）电击:1800伏，6.2秒
4）加入1ml YEB液体培养基，28℃温箱或摇床中活化2小时。
5）涂抗性板：YEB培养基中加入利福平(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的固体培养基。
6）28℃温箱中培养48小时。
7）挑取单克隆于加入利福平(25ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的YEB液体培养基中，28℃摇床中200rpm培养1天。
8）从中取0.5ml转接到50ml（1/100比例稀释）同样YEB抗性培养基中，同样条件培养到OD600＝0.5左右便可进行转化愈伤组织。
3、转P-NF-YB1水稻的获得及分子鉴定
1）转化
将重组菌EHA105/pPLV15-P-NF-YB1转化水稻中花11愈伤组织中，得到T0代转P-NF-YB1水稻。
转化具体实验流程如下(Hiei et al.,1994;Hiei et al.,1997)：
a)种子消毒：饱满、成熟的水稻中花11种子剥去颖壳，置于70％乙醇水溶液中表面消毒10min，在0.1%HgCl水溶液中浸泡消毒10min，无菌水冲洗10次；浸泡16小时后，倒掉多余水分，但不要太干；
b)接种及愈伤组织的诱导：超净台中，在无菌滤纸上切取消毒种子胚，将盾片朝上置于诱导培养基NB2上，每个13*13cm的方皿培养基接种40粒，25℃暗培养4周诱导愈伤的形成；
c)继代：诱导出的愈伤组织转接于继代培养基NB1上，置于25℃的培养箱内，24小时黑暗条件下培养3周（不可超过4周），浅黄色质地较致密的胚性愈伤组织转移至新的NB1继代培养基上继续培养3周；
d)待转化的愈伤组织预培养：选择生长状态良好的黄白色致密胚性愈伤组织，把愈伤组织切成2mm大小，转移到新的NB1培养基上，25℃再暗培养4天；
e)农杆菌活化培养：将携带转化质粒的农杆菌EHA105划线培养，挑取单菌落于10ml YEB（含Kan50ug/ml，Rif25ug/ml），28℃振荡培养至对数期（OD600＝0.8），从中取0.5ml转接到50ml（1/100比例稀释）同样培养基，同样条件培养到OD600＝0.5左右；
f)共培养、转化：将活化好的农杆菌4200g离心10min，倒掉培养基，用等体积的AAM-AS培养基重悬菌体。将预培养4天的愈伤组织块（切成2mm大小）收集到一个小烧杯中，浸入AAM-AS菌液浸染20min，倒掉菌液再用枪吸干菌液，然后将组织块放到铺有4层滤纸的平皿中吹干约30min，最后转移到覆盖一层滤纸的NB2C共培养基上，25℃暗处共培养2天；
g)共培养后农杆菌的去除及筛选培养：将在NB2C培养基上培养的愈伤组织块转移至NBS1筛选培养基上暗培养两周，两周后再转移至NBS2筛选培养基暗培养两代，每代15天；最后得到鲜黄色的潮霉素抗性愈伤组织。
h)分化培养：将抗性愈伤组织转移至预分化培养基RE1上进行分化培养，先25℃暗培养2周，再置光下23℃培养2周，已分化出不定芽的愈伤组织转到分化培养基RE2上光照培养2周，如果状态不好可再在RE2上继代；未分化的愈伤组织块经第二次部分干燥处理及在RE1和RE2上再次预分化和分化后，再生植株获得率可达100％。
i)分化的植株当长至2cm高时，转移至含50mg/L潮霉素的生根培养基。在生根培养基上生根壮苗23℃℃，12小时光照培养；
j)待根系生长良好，小苗长至8cm时，打开盖炼苗6天。取出组织培养苗转移到土壤中，放到无阳光直射的温室中适应培养，然后移入室外栽培。得到T0代转P-NF-YB1水稻。
上述水稻转化主要培养基的配置：
（一）、诱导培养基和继代培养基的配制
（二）、NB2C共培养基的配制
NB2培养基+10g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮（As）+7g/L琼脂，调pH：5.2；
（三）、AAM-As转化培养基的配制
（四）、NBS1筛选培养基的配制
500ml NB1培养基（调pH5.8）中加入3.5g琼脂，灭菌后当冷却至50℃时加入250μl50mg/ml的潮霉素Hyg B（终浓度为：25mg/L）和1125μl的TMT100mg/ml（225mg/L）
（五）、NBS2筛选培养基的配制
500ml NB1培养基（调pH5.8）中加入3.5g琼脂，灭菌后当冷却至50℃时加入500μl50mg/ml的潮霉素Hyg B（终浓度为：50mg/L）和900μl的TMT100mg/ml（180mg/L）。
（六）、RE1/RE2的配制
（七）、生根培养基的配制：1/2MS＋NAA（0.2mg/ml，也可不加）
（八）、培养基母液成分的配制
1．N6大量（10×）
2．B5微量(1000×)
3．B5有机(100×)
4．铁盐（100×）
5．N6钙盐（10×）：CaCl2 .2H2O1.66g溶解于100ml水中。
6．肌醇（200×）：4g溶解于200ml（20mg/ml）
7．2，4－D（1mg/ml）：少量酒精溶解，容量瓶定容（1MNaOH有助于溶解，最好用乙醇溶解）。长期保存会有结晶，用前先在80℃溶解
8．MS大量（20×）
9．MS微量（1000×）
10．
11．MS钙盐（100×）：4.4g CaCl2.2H2O溶解于100ml水中。
12．激素的配制：
（1）2，4－D（1mg/ml）：先用少量无水乙醇或95％乙醇溶解后，再用水定容。0.1g溶解于100ml水。
（2）6－BA（1mg/ml）：先用1M HCl溶解后再定容，0.1g溶于100ml水。
（3）ZT（玉米素，1mg/ml）先用95％乙醇加热溶解后再用水定容。
（4）KT（激动素，0.5mg/ml）0.05gKT先溶于少量1M HCl，再用水定容至100ml。
（5）NAA（萘乙酸，0.5mg/ml）：0.05gNAA先溶于少量95％乙醇，再用水定容至100ml。
13．AAM-AS大量（10×）：
14．AAM-AS有机（1000×）：
15．AAM-AS氨基酸（10×）：
16．AS（已酰丁香酮）的配制：Mr：196.2，母液浓度：50mM/L
17．TMT(特美汀)的配制:1.6mg/瓶TMT加14ml灭菌水，完全溶解后过滤除菌并分装至灭菌的EP管中。
注：只有AS（已酰丁香酮）和TMT是过滤除菌，其他激素是可以高压灭菌的。
2）转基因植株的鉴定
将T0代转P-NF-YB1水稻移栽至人工气候室中，30℃/28℃，光照16h/黑暗8h，提取叶片的基因组DNA，用潮霉素特异引物（pPLV15载体上有潮霉素）鉴定外源基因是否存在并整合到基因组上。
hygB FP-2:CATGTGTATCACTGGCAAACTG
hygB RP-2:GTACTTCTACACAGCCATCGGTC
结果得到501bp的PCR产物，为阳性T0代转P-NF-YB1水稻。
采用同样的方法将空载体pPLV15导入野生型水稻中，获得T0代转pPLV15水稻。
二、转P-NF-YB1水稻GUS染色验证启动子功能
将阳性T0代转P-NF-YB1水稻的灌浆中期（开花后第10天到15天）的种子去掉内外稃片，而后分别对种子进行横切或纵切。将横切或纵切好的种子放入丙酮溶液中，丙酮溶液放于冰上预冷，而后抽真空10分钟后将材料放入-20℃冰箱固定1小时。倒掉丙酮，加入用没有加入X-gluc的GUS染色液500μl洗脱两遍，后加入带有X-gluc的GUS染色液，放入37℃培养箱反应1小时。于体视镜下观察是否出现GUS信号并拍照。
以T0代转pPLV15水稻为对照。
T0代转P-NF-YB1水稻的结果如图4所示，a:愈伤组织（诱导产生T0代转P-NF-YB1水稻的抗潮霉素的愈伤组织）、b:种子纵切、c,d:种子横切；可以看出，T0代转P-NF-YB1水稻的GUS基因在种子的糊粉层中具有表达活性（蓝色），而在种子的其他部分不表达。
T0代转pPLV15水稻的GUS基因在任何部分均无表达。
因此，P-NF-YB1为启动子，其可以启动目的基因如GUS在种子的糊粉层特异表达。
Claims (5)
1.一种DNA片段，为序列表中序列1所示的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.扩增权利要求1所述DNA片段的引物对；所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
4.权利要求1所述DNA片段在启动目的基因表达中的应用；所述目的基因表达为组织特异表达；所述组织为植物种子的糊粉层；所述植物为水稻。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述目的基因为GUS基因。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |