CN106086107A - 海藻糖的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了海藻糖的生产方法。本发明所提供的海藻糖的生产方法，包括将底物与海藻糖生产成套试剂进行反应得到海藻糖；海藻糖生产成套试剂包括麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和M；M为糖基转移酶和切支酶这两种的两种或任一种；底物为淀粉或淀粉水解物；麦芽寡糖基海藻糖合成酶为SEQ ID No.1的第42‑816位所示的蛋白质；麦芽寡糖基海藻糖水解酶为SEQ ID No.3的第42‑639位所示的蛋白质；糖基转移酶为SEQ ID No.5的第42‑697位所示的蛋白质。

Description

海藻糖的生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中海藻糖的生产方法。
技术背景
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α-1,1糖苷键结合的非还原性糖，分子式为C12H22011，其相对分子量为342.30。其结构式如式1所示：
海藻糖广泛存在于细菌、酵母、藻类、真菌、昆虫以及一些抗逆性植物中。它对生物大分子具有非特异性的保护作用，这种保护作用体现在：当生物细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压等恶劣环境时，细胞内海藻糖含量迅速上升，对多种大分子产生保护作用，从而维持生物体生命特性，因此海藻糖在科学界素有“生命之糖”的美誉。
目前海藻糖的生产工艺主要有三种：
(1)微生物提取法
微生物提取法主要是从乳酸菌、酵母及霉菌中提取，通过干燥、高温、高渗透压等极端环境处理生物细胞，使其积累大量的海藻糖，在酵母中海藻糖可达干重的20％，然后经过乙醇等有机溶剂抽提、精制，从而得到海藻糖。目前此法主要是从酵母中提取，从酵母中提取的海藻糖纯度可达98％以上、不含内毒素等优点，因此可以用于医疗领域。从微生物中提取海藻糖的过程中，由于微生物培养周期长，海藻糖转化率与含量低，提取源有限等原因，很大程度制约着海藻糖大规模工业化生产。
(2)微生物发酵法
微生物发酵法主要是通过培养产海藻糖的微生物，再从微生物发酵液中提取海藻糖，这些微生物包括节杆菌属、棒杆菌属、诺卡氏菌属、丝核核菌属、微球菌属等。一般通过诱变、细胞融合及基因重组等方法得到高产菌株，再通过高密度发酵，在发酵结束前饥饿处理菌体以使其积累海藻糖。该方法由于转化率低，发酵液成分复杂，海藻糖的提取、精制工艺复杂，因而大规模工业化产生、推广应用因难。
(3)酶转化法
酶转化法根据底物的不同又可以分为以葡萄糖、麦芽糖和淀粉三种方法。
以葡萄糖为底物：利用专一性很强的海藻糖-6-磷酸合成酶与海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶共同作用生成海藻糖，该方法以葡萄糖-6-磷酸为糖基受体，以UDP-葡萄糖、GDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖为糖基供体，在整个反应中要消耗高能物质，因此难以实现工业化生产。
以麦芽糖为底物：海藻糖合成酶具有较严格的底物专一性，只作用于麦芽糖生成海藻糖及海藻糖生成麦芽糖。此方法反应简单，底物麦芽糖价格便宜,耐热菌中的海藻糖合成酶热稳定性好,因而使用耐热菌可避免工业生产中杂菌的污染,这是较理想的工业生产途径。但海藻糖合成酶催化的是一个可逆反应，它既可以催化麦芽糖生成海藻糖，也可以催化海藻糖生成麦芽糖，当反应进行到一定程度时麦芽糖与海藻糖的转化会达到相对平衡，因此转化率达到60％以后难以再有提高。
以淀粉为底物：利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻海藻糖水解酶的作用将淀粉水解物转化为海藻糖，这类酶体系转化率可达80％以上，1995年日本林原公司将该方法应用于工业化大规模生产海藻糖，使海藻糖的价格大大降低。在国内，专利CN103205475A利用该方法生产海藻糖25-35h后，最高转化率可达到85％。以淀粉为底物，使用原料淀粉价格便宜，来源广泛，是海藻糖工业化生产的主要方法。
以上方法中，以淀粉为底物生产海藻糖是一种较为经济的方式，但目前生产方式存在酶的产量低，链长较短的寡糖难以反应，转化率得不到进一步提高等问题。文献Nakada,T.et al.(1995)Purification and properties of a novel enzyme,maltooligosyl trehalose synthase,from Arthrobacter sp.Q36.Biosci.Biotechnol.Biochem报道的MTSase的酶活为16.3U/mL；文献Nakada,T.et al.(1995)Purification and properties of a novel enzyme,maltooligosyl trehalosesynthase,from Arthrobacter sp.Q36.Biosci.Biotechnol.Biochem报道的MTHase的酶活为25.1U/mL。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何生产海藻糖及缩短海藻糖的生产时间。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了海藻糖的制备方法。
本发明所提供的海藻糖的制备方法，包括将底物与海藻糖生产成套试剂进行反应得到海藻糖；
所述海藻糖生产成套试剂包括麦芽寡糖基海藻糖合成酶(其名称为MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(其名称为MTHase)和M；所述M为糖基转移酶(其名称为GTase)和切支酶这两种的两种或任一种；所述底物为淀粉或淀粉水解物。
本申请中所述淀粉水解物是通过酸或酶转化淀粉得到的物质。所述淀粉水解物具体可为淀粉酶水解淀粉得到的水解物。所述淀粉水解物的DE值可为6-15，如6-11。
所述淀粉水解物具体可为麦芽五糖。
上述方法中，所述MTSase为如下G1)或G2)或G3)的蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的第42-816位的蛋白质；
G2)在SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
G3)在SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述MTSase功能的由G1)或G2)衍生的蛋白质；
所述MTHase为下述H1)或H2)或H3)的蛋白质：
H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的第42-639位的蛋白质；
H2)在SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
H3)在SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述MTHase功能的由H1)或H2)衍生的蛋白质；
所述GTase是下述I1)或I2)或I3)的蛋白质：
I1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的第42-697位的蛋白质；
H2)在SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
I3)在SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述GTase功能的由I1)或I2)衍生的蛋白质。
为了使G1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。为了使H1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。为了使I1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述G3)中的MTSase可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述G3)中的MTSase的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述H3)中的MTHase可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述H3)中的MTHase的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述I3)中的GTase可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述I3)中的GTase的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述方法中，所述海藻糖生产成套试剂可只由所述MTSase、所述MTHase和所述GTase组成(即海藻糖生产成套试剂1)，也可只由所述MTSase、所述MTHase和所述切支酶(即海藻糖生产成套试剂2)组成，也可由所述MTSase、所述MTHase、所述GTase和所述切支酶(即海藻糖生产成套试剂3)组成。所述海藻糖生产成套试剂由所述海藻糖生产成套试剂1、2或3和其他试剂组成，所述其他试剂可为将所述底物转化为利于所述MTSase、所述MTHase、所述GTase或所述切支酶进行催化的物质的试剂。所述其他试剂具体可为淀粉酶。
上述方法中，所述海藻糖的制备方法包括：将MTSase基因导入受体细胞中进行表达得到所述MTSase；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
上述方法中，所述MTSase基因可通过含有MTSase基因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
本发明中所述MTSase基因表达盒可含有所述MTSase基因和启动所述MTSase基因转录的启动子。本发明中所述MTSase基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸所示的MTSase的DNA，该DNA不但可包括启动所述MTSase基因转录的启动子，还可包括终止所述MTSase基因转录的终止子。进一步，所述MTSase基因表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述MTSase基因表达盒的重组表达载体，如pBAD-hisB。
在本发明的一个实施方式中，MTSase基因(SEQ ID No.2所示的DNA分子)通过含有MTSase基因的表达盒的重组载体导入大肠杆菌中得到重组菌。所述重组载体为用SEQ ID No.2所示的DNA分子替换pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段得到的重组载体pBAD-MTSase，pBAD-MTSase和pBAD-hisB的差别仅在于：pBAD-MTSase为将pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ IDNo.2所示的MTSase基因得到的重组载体，pBAD-MTSase表达SEQ ID No.1所示的MTSase。所述重组菌为将所述pBAD-MTSase导入大肠杆菌BW25113中得到的重组菌pBAD-MTSase/BW25113。
上述方法中，所述海藻糖的制备方法包括：将MTHase基因导入受体细胞中进行表达得到所述MTHase；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
上述方法中，所述MTHase基因可通过含有MTHase基因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
本发明中所述MTHase基因表达盒可含有所述MTHase基因和启动所述MTHase基因转录的启动子。本发明中所述MTHase基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸所示的MTSase的DNA，该DNA不但可包括启动所述MTHase基因转录的启动子，还可包括终止所述MTHase基因转录的终止子。进一步，所述MTHase基因表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述MTHase基因表达盒的重组表达载体，如pBAD-hisB。
在本发明的一个实施方式中，MTHase基因(SEQ ID No.4所示的DNA分子)通过含有MTSase基因的表达盒的重组载体导入大肠杆菌中得到重组菌。所述重组载体为用SEQ ID No.4所示的DNA分子替换pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段得到的重组载体pBAD-MTHase，pBAD-MTHase和pBAD-hisB的差别仅在于：pBAD-MTHase为将pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ IDNo.4所示的MTHase基因得到的重组载体，pBAD-MTHase表达SEQ ID No.3所示的MTHase。所述重组菌为将所述pBAD-MTHase导入大肠杆菌BW25113中得到的重组菌pBAD-MTHase/BW25113。
上述方法中，所述海藻糖的制备方法包括：将GTase基因导入受体细胞中进行表达得到所述GTase；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
上述方法中，所述GTase基因可通过含有GTase基因表达盒的重组表达载体导入所述受体细胞中。
本发明中所述GTase基因表达盒可含有所述GTase基因和启动所述GTase基因转录的启动子。本发明中所述GTase基因表达盒指能够在宿主细胞中表达SEQ ID No.5或SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸所示的GTase的DNA，该DNA不但可包括启动所述GTase基因转录的启动子，还可包括终止所述GTase基因转录的终止子。进一步，所述GTase基因表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述GTase基因表达盒的重组表达载体，如pBAD-hisB。
在本发明的一个实施方式中，GTase基因(SEQ ID No.6所示的DNA分子)通过含有GTase基因的表达盒的重组载体导入大肠杆菌中得到重组菌。所述重组载体为用SEQID No.6所示的DNA分子替换pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段得到的重组载体pBAD-GTase，pBAD-GTase和pBAD-hisB的差别仅在于：pBAD-GTase为将pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.6所示的GTase基因得到的重组载体，pBAD-GTase表达SEQ ID No.5所示的GTase。所述重组菌为将所述pBAD-GTase导入大肠杆菌BW25113中得到的重组菌pBAD-GTase/BW25113。
上述方法中，所述MTSase基因为下述G11)-G13)中的任一种DNA分子：
G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；
G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述MTSase的cDNA分子或基因组DNA；
G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述MTHase基因为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：
H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；
H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述MTHase的cDNA分子或基因组DNA；
H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述MTHase的cDNA分子或基因组DNA；
所述GTase基因为下述I11)-I13)中的任一种DNA分子：
I11)编码序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因组DNA；
I12)在严格条件下与I11)限定的DNA分子杂交且编码所述GTase的cDNA分子或基因组DNA；
I13)与I11)或I12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述GTase的cDNA分子或基因组DNA。
其中，SEQ ID No.2所示的MTSase基因编码SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸所示的MTSase；SEQ ID No.4所示的MTHase基因编码SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸所示的MTHase；SEQ ID No.6所示的GTase基因编码SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸所示的GTase。
上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65oC下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。
上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述方法中，所述切支酶具体可为普鲁兰酶。所述普鲁兰酶可为诺维信公司产品，货号为CAS：9075-68-7，D2。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述P1)或P2)的产品：
P1)所述海藻糖生产成套试剂；
P2)用于生产海藻糖的生物材料，为下述C1)或C2)或C3)：
C1)用于生产海藻糖的成套DNA分子，包括所述MTSase基因、所述MTHase基因和N；所述N为所述GTase基因和/或切支酶基因，各基因各自独立包装；
C2)用于生产海藻糖的重组载体或成套重组载体，所述重组载体或所述成套重组载体能产生所述海藻糖生产成套试剂；
C3)用于生产海藻糖的重组细胞或成套重组细胞，所述重组细胞或所述成套重组细胞能产生所述海藻糖生产成套试剂。
上述产品中，C2)所述重组载体或所述成套重组载体为利用C1)所成套DNA分子产生所述海藻糖生产成套试剂的载体；
C3)所述重组细胞或所述成套重组细胞为利用C1)所成套DNA分子产生所述海藻糖生产成套试剂的细胞。
上述产品中，C2)所述成套重组载体具体可由所述pBAD-MTSase、所述pBAD-MTHase和所述pBAD-GTase组成；
C3)所述成套重组细胞具体可由所述pBAD-MTSase/BW25113、所述pBAD-MTHase/BW25113和所述pBAD-GTase/BW25113组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
X1、所述产品在制备海藻糖中的应用；
X2、所述GTase在制备海藻糖中的应用；
X3、所述GTase基因在制备海藻糖中的应用。
利用所述用于生产海藻糖的生物材料生产所述海藻糖生产成套试剂的方法，也属于本发明的保护范围。
本发明中，所述细胞为大肠杆菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BW25113。
实验证明，本发明的海藻糖生产成套试剂中的MTSase、MTHase和GTase均有较高的酶活：本发明得到的MTSase浓缩液中MTSase的酶活平均可达903U/mL，pBAD-MTSase/BW25113上清液中MTSase的酶活平均可达81U/mL；MTHase浓缩液中MTHase的酶活平均可达1034U/mL，pBAD-MTHase/BW25113上清液中MTHase的酶活平均可达69U/mL。
实验证明，本发明的海藻糖生产成套试剂1、2和3均可以提高海藻糖的产量：(1)当以DE值为6的淀粉水解物为底物时，利用MTSase、MTHase生产海藻糖，转化率为29％，所需时间为6-8小时；利用本发明的海藻糖生产成套试剂2生产海藻糖，转化率为59％，所需时间为14-16小时；利用本发明的海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase均只加入反应体系一次时，转化率为59％，所需时间为14-16小时；利用海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase反复加入反应体系时，转化率为74％，所需时间为22-25小时。(2)当DE值为11的淀粉水解物为底物时，利用MTSase、MTHase生产海藻糖，转化率为30％，所需时间为6-8小时；利用本发明的海藻糖生产成套试剂2生产海藻糖，转化率为62％，所需时间为14-16小时；利用本发明的海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase均只加入反应体系一次时，转化率为62％，所需时间为14-16小时；利用本发明的海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase反复加入反应体系时，转化率为81％，所需时间为22-25小时。
(3)当以麦芽五糖为底物时，利用MTSase、MTHase生产海藻糖，转化率为41％，所需时间为6-8小时；利用本发明的海藻糖生产成套试剂1生产海藻糖，MTSase、MTHase反复加入反应体系时转化率为59％，所需时间为14-16小时。
实验证明，本发明利用大肠杆菌重组表达海藻糖酶法转化相关的酶，获得大量的酶，并利用糖基转移酶进一步提高了海藻糖酶法转化效率。本发明通过基因优化，使蛋白表达水平得到很大的提高，单位发酵液的酶活显著提高；本发明采用糖基转移酶，进一步提高了海藻糖的转化率；本发明通过优化MTSase与MTHase的酶量与比例，显著缩短了反应的时间，海藻糖的生产过程所需时间由相关专利EP0606753A2中的64小时缩短至不到25小时，降低了能耗，节约了生产海藻糖的成本。实验证明，利用本发明的海藻糖生产成套试剂1、2和3均可以提高海藻糖的产量，且时间短；可利用本发明的海藻糖生产成套试剂1、2和3生产海藻糖。
附图说明
图1为麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液的HPLC分析结果。
图2为利用海藻糖成套生产试剂1生产海藻糖的TLC分析结果。其中，M表示分子量Marker；1表示麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase反应液；2表示麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液；3表示麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的普鲁兰酶(诺维信公司,CAS：9075-68-7，D2))属于切支酶。
下述实施例中的大肠杆菌BW25113(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner,and Hirotada Mori1.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.MolecularSystems Biology(2006):1-11.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的DE值为6的淀粉水解物和DE值为11的淀粉水解物均为由淀粉酶水解淀粉得到的淀粉水解物。
下述实施例中的5052自诱导培养基为无菌培养基，其配制方法如下：100mL A+2mL B+2mL C+200μL D+100μL E；
A为ZY溶液，ZY溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)胰蛋白胨和0.5％(质量百分比浓度)酵母粉；
B为50×M溶液，50×M溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4；
C为50×5052溶液，50×5052溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：25％(质量百分比浓度)甘油，2.5％(质量百分比浓度)葡萄糖，10％(质量百分比浓度)L-阿拉伯糖；
D为1M MgSO4水溶液；
E为1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度分别为：50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，2mM CoCl2，2mM NiCl2，2mM Na2Mo4，2mM Na2SeO3，2mM H3BO3。
实施例1、海藻糖生产成套试剂的制备
本发明所提供跟的海藻糖生产成套试剂为海藻糖生产成套试剂1、海藻糖生产成套试剂2和海藻糖生产成套试剂3。海藻糖生产成套试剂1由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)和糖基转移酶(GTase)组成；海藻糖生产成套试剂2由MTSase、MTHase和普鲁兰酶组成；海藻糖生产成套试剂3由MTSase、MTHase、GTase和普鲁兰酶组成。
MTSase为氨基酸序列是SEQ ID No.1的第42-816位的蛋白质，由SEQ ID No.2所示的MTSase基因编码；
MTHase为氨基酸序列是SEQ ID No.3的第42-639位的蛋白质，由SEQ ID No.4所示的MTHase基因编码；
GTase是氨基酸序列为SEQ ID No.5的第42-697位的蛋白质，由SEQ ID No.6所示的GTase基因编码。
1、重组菌的制备
将载体pBAD-hisB(invitrogen公司产品)的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2所示的MTSase基因，得到重组载体pBAD-MTSase。pBAD-MTSase和pBAD-hisB的差别仅在于：pBAD-MTSase为将pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2所示的MTSase基因得到的重组载体，pBAD-MTSase表达SEQ ID No.1所示的蛋白质。
其中，SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸为SEQ ID No.2所示的MTSase基因编码的MTSase，SEQ ID No.1的第5-10位氨基酸为His标签序列。
将载体pBAD-hisB(invitrogen公司产品)的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的MTHase基因，得到重组载体pBAD-MTHase。pBAD-MTHase和pBAD-hisB的差别仅在于：pBAD-MTHase为将pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.4所示的MTSase基因得到的重组载体，pBAD-MTHase表达SEQ ID No.3所示的蛋白质。
其中，SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸为SEQ ID No.4所示的MTHase基因编码的MTHase，SEQ ID No.3的第5-10位氨基酸为His标签序列。
将载体pBAD-hisB(invitrogen公司产品)的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.6所示的GTase基因，得到重组载体pBAD-GTase。pBAD-GTase和pBAD-hisB的差别仅在于：pBAD-GTase为将pBAD-hisB的Kpn I和EcoR I识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.6所示的GTase基因得到的重组载体，pBAD-GTase表达SEQ ID No.5所示的GTase。
其中，SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸为SEQ ID No.6所示的GTase基因编码的GTase，SEQ ID No.5的第5-10位氨基酸为His标签序列。
分别将pBAD-MTSase、pBAD-MTHase和pBAD-GTase导入大肠杆菌BW25113中，得到重组菌pBAD-MTSase/BW25113、pBAD-MTHase/BW25113和pBAD-GTase/BW25113。
2、海藻糖生产成套试剂的制备
2.1MTSase的制备
2.1.1MTSase的制备
挑取pBAD-MTSase/BW25113单克隆接种至液体培养基(该液体培养基为向LB液体培养基中添加氨苄青霉素得到的培养基，该液体培养基中使氨苄青霉素的浓度为100μg/mL)中，于37℃、250rpm下活化10-12小时，得到pBAD-MTSase/BW25113培养液；按照1％接种量将pBAD-MTSase/BW25113培养液接种至5052自诱导培养基中，并加入L-阿拉伯糖(Macklin公司产品，货号：M-L800478-100G 100G EA)，得到pBAD-MTSase/BW25113诱导前液，pBAD-MTSase/BW25113诱导前液中L-阿拉伯糖的终浓度为0.2g/100mL；将pBAD-MTSase/BW25113诱导前液在30℃、220rpm下孵育14-16小时，离心，弃上清液，收集菌体；将菌体用超纯水洗两次后重悬于50mM pH为8.0的Tris-HCl中，得到pBAD-MTSase/BW25113重悬液，pBAD-MTSase/BW25113重悬液中菌体浓度为50OD/mL。
超声破碎pBAD-MTSase/BW25113重悬液中的菌体得到超声后pBAD-MTSase/BW25113，超声条件如下：探头直径为6mm；超声破碎总时间为25min；每个循环超声5s,间隙8s，功率为30％。将超声后pBAD-MTSase/BW25113于11000rpm下离心30min，弃沉淀，将得到的上清液再于11000rpm下离心30min，弃沉淀得到pBAD-MTSase/BW25113上清液。
SDS-PAGE电泳检测pBAD-MTSase/BW25113上清液，结果显示，pBAD-MTSase/BW25113上清液中含有目的蛋白MTSase，表明，MTSase在pBAD-MTSase/BW25113中得到了表达。
pBAD-MTSase/BW25113上清液中MTSase的纯化方法如下：将pBAD-MTSase/BW25113上清液用0.22μm水系滤膜过滤后得到pBAD-MTSase/BW25113过滤液。用AKTA FPLC仪器(GE公司产品，型号：AKTA FPLC)进行蛋白纯化，具体操作见AKTA FPLC仪器的操作说明：先用Binding buffer(Binding buffer由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度为500mM NaCl和50mM Tris-HCl，pH8.0)上样使目的蛋白与1mL的Ni-NTA预装柱(GE公司)结合，用将Elution buffer(Elutionbuffer由超纯水和溶质组成，溶质及其浓度为100mM NaCl、50mM Tris-HCl和500mM咪唑)用超纯水稀释20倍得到的Elution buffer稀释液1洗去杂蛋白，再用将Elution buffer用超纯水稀释2.5-5倍得到的Elution buffer稀释液洗脱目的蛋白，得到MTSase洗脱液。
将MTSase洗脱液装入透析袋中在50mM pH为8.0的Tris-HCl透析4-6次，每次约1小时，得到透析后MTSase溶液。将PEG400固体颗粒均匀洒于装有MTSase溶液的透析袋表面进行浓缩，得到蛋白浓度为4.30mg/mL的MTSase浓缩液。向MTSase浓缩液中加入甘油至甘油的体积百分比浓度为30％-50％，于-20℃或-80℃保存。
2.1.2MTSase活性的测定
按照下述方法测定MTSase的活性，实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
将麦芽五糖(阿拉丁公司产品，货号M121065-1G)溶于超纯水得到麦芽五糖水溶液，麦芽五糖水溶液中麦芽五糖的浓度为40g/100mL。向25μL麦芽五糖水溶液中加入1μL步骤2.1.1的MTSase浓缩液、5μL pH为7.0的1mol/L磷酸钠缓冲液和69μL超纯水，得到100μL的MTSase混合液，将该混合液于40℃下孵育10min后，于100℃水浴10min灭活MTSase终止反应，得到MTSase反应液；调MTSase反应液的pH至4.0后加入糖化酶(诺维信公司产品)40℃下充分反应，得到MTSase-糖化酶反应液。糖化酶可以水解α-1,4-糖苷键，而不能水解α-1,1-糖苷键，因此糖化酶处理的MTSase反应液中只有葡萄糖和海藻糖，且海藻糖的物质的量等于MTSase作用于麦芽五糖生成的麦芽三糖基海藻糖的物质的量。通过HPLC检测海藻糖的物质的量即可获得麦芽三糖基海藻糖的量进而可以计算MTSase的酶活。
通过HPLC分析MTSase-糖化酶反应液中海藻糖的物质的量，计算MTSase的酶活，MTSase的酶活单位(U)定义为在上述条件下，每分钟转化1μmol麦芽五糖生成1μmol麦芽三糖基海藻糖所需的酶量。计算得MTSase酶活为210U/mg·min。
HPLC分析中，以海藻糖(阿拉丁公司产品，货号：D110019-25g)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析MTSase-糖化酶反应液。
取10μl MTSase-糖化酶反应液注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析。使用的色谱柱为：Waters Xbridge Amide 4.6*250mm。分析条件为：流动相为80％乙腈+0.1％氨水，流速1mL/min，柱温35℃，检测器为示差检测器(RID)。
按照上述方法，将MTSase浓缩液替换为pBAD-MTSase/BW25113上清液，其他步骤均不变，得到pBAD-MTSase/BW25113上清液中MTSase的酶活。
结果表明，pBAD-MTSase/BW25113上清液中MTSase的酶活平均可达81U/mL，MTSase浓缩液中MTSase的酶活平均可达903U/mL，每毫升pBAD-MTSase/BW25113发酵液可产生81U的MTSase。
2.2MTHase的制备
2.2.1MTHase的制备
按照步骤2.1中2.1.1MTHase的制备方法，将pBAD-MTSase/BW25113替换为pBAD-MTHase/BW25113，其他步骤均不变，得到pBAD-MTHase/BW25113上清液。
SDS-PAGE电泳检测pBAD-MTHase/BW25113上清液，结果显示，pBAD-MTHase/BW25113上清液中含有目的蛋白MTHase，表明，MTHase在pBAD-MTHase/BW25113中得到了表达。
按照步骤2.1中2.1.1的MTSase的纯化方法，将pBAD-MTSase/BW25113上清液替换为pBAD-MTHase/BW25113上清液，其他步骤均不变，得到MTHase浓缩液。
2.2.2MTHase活性的测定
按照下述方法测定MTHase的活性，实验重复三次，每次重复实验的步骤如下：
向50μL步骤2.1.2的麦芽五糖水溶液中加入10μL步骤2.1.1的MTSase浓缩液、5μL pH为7.0的1mol/L磷酸钠缓冲液和35μL超纯水，得到100μL的MTSase混合液，将该混合液于40℃下孵育5小时后，得到MTSase反应液1。向MTSase反应液1中加入1μL步骤2.2.1中的MTHase浓缩液，于40℃反应10min，然后于100℃水浴10min灭活MTHase终止反应，得到MTHase反应液。
通过HPLC分析MTHase反应液中海藻糖，计算MTHase的酶活，MTHase的酶活单位(U)定义为每分钟转化1μmol麦芽三糖基海藻糖生成1μmol海藻糖所需的酶量。计算得MTHase酶活为565U/mg·min。
HPLC分析中，以海藻糖(阿拉丁公司产品，货号：D110019-25g)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析MTHase反应液。
取10μl MTHase反应液注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析。使用的色谱柱为：Waters Xbridge Amide 4.6*250mm。分析条件为：流动相为80％乙腈+0.1％氨水，流速1mL/min，柱温35℃，检测器为示差检测器(RID)。
按照上述方法，将MTHase浓缩液替换为pBAD-MTHase/BW25113上清液，其他步骤均不变，得到pBAD-MTHase/BW25113上清液中MTHase的酶活。
结果表明，pBAD-MTHase/BW25113上清液中MTHase的酶活平均可达69U/mL，MTHase浓缩液中MTHase的酶活平均可达1034U/mL，每毫升pBAD-MTHase/BW25113发酵液可产生69U的MTHase。
2.3GTase的制备
2.3.1GTase的制备
按照步骤2.1中2.1.1MTHase的制备方法，将pBAD-MTSase/BW25113替换为pBAD-GTase/BW25113，其他步骤均不变，得到pBAD-GTase/BW25113上清液。
SDS-PAGE电泳检测pBAD-GTase/BW25113上清液，结果显示，pBAD-GTase/BW25113上清液中含有目的蛋白GTase，表明，GTase在pBAD-GTase/BW25113中得到了表达。
按照步骤2.1中2.1.1的MTSase的纯化方法，将pBAD-MTSase/BW25113上清液替换为pBAD-GTase/BW25113上清液，其他步骤均不变，得到GTase浓缩液。
实施例2、利用实施例1的海藻糖生产成套试剂制备海藻糖
1、利用实施例1的MTSase和MTHase制备海藻糖
利用实施例1的MTSase和MTHase制备海藻糖，实验重复三次。
1.1以麦芽五糖为底物
向1mL麦芽五糖水溶液(麦芽五糖水溶液为向超纯水中加入麦芽五糖(阿拉丁公司产品)得到的溶液，麦芽五糖水溶液中麦芽五糖的质量百分比浓度为20％)中加入实施例1中步骤2的pBAD-MTSase/BW25113上清液和pBAD-MTHase/BW25113上清液各100μL后，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase反应前液，麦芽五糖-MTSase-MTHase反应前液中麦芽五糖、MTSase和pBAD-MTHase的比例关系为1g:5U:8U；将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育6-8小时，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液。
利用高效液相色谱(HPLC)分析麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液。HPLC分析中，以海藻糖(阿拉丁公司产品，货号：D110019-25g)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液。取10μl麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液注入液相色谱仪，进行高效液相色谱分析。使用的色谱柱为：Waters Xbridge Amide 4.6*250mm色谱柱。分析条件为：流动相为80％乙腈+0.1％氨水，流速1mL/min，柱温35℃，检测器为示差检测器(RID)。
麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液的分析结果如图1所示，结果显示，利用实施例1中步骤2的pBAD-MTSase/BW25113上清液和pBAD-MTHase/BW25113上清液转化麦芽五糖，每克麦芽五糖可得到0.41克海藻糖，转化率为41％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。转化率基本上可以达到理论转化率，麦芽五糖可完全反应转化生成海藻糖与麦芽三糖，理论转化率(％)＝海藻糖分子量/麦芽五糖分子量＝342.30/828.72＝41％。
1.2以DE值为6的淀粉水解物为底物
向1mL DE6淀粉水解物水溶液(DE6淀粉水解物水溶液为向超纯水中加入)中加入DE值为6的淀粉水解物(诺维信公司产品)得到的溶液，DE6淀粉水解物水溶液中DE值为6的淀粉水解物的质量百分比浓度为30％)中加入实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液，得到DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应前液，DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应前液中，DE值为6的淀粉水解物、MTSase与MTHase的比例关系为1g：5U：8U，将DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育6-8小时，得到DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液。
利用高效液相色谱(HPLC)分析DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液。按照步骤1.1的方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析DE6淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液转化DE值为6的淀粉水解物，每克DE值为6的淀粉水解物可得到0.29g海藻糖，转化率为29％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
1.3以DE值为11的淀粉水解物为底物
按照步骤1.2的方法，将DE6淀粉水解物水溶液替换为DE11淀粉水解物水溶液(DE11淀粉水解物水溶液为向超纯水中加入)中加入DE值为11的淀粉水解物(诺维信公司产品)得到的溶液，DE11淀粉水解物水溶液中DE值为11的淀粉水解物的质量百分比浓度为30％)，其他步骤均不变，得到DE11淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液。
利用高效液相色谱(HPLC)分析DE11淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液。按照步骤1.1的方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为DE11淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析DE11淀粉水解物-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液转化DE值为11的淀粉水解物，每克DE值为11的淀粉水解物可得到0.30g海藻糖转化率为30％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
2、利用实施例1的海藻糖生产成套试剂2制备海藻糖
利用实施例1的由MTSase、MTHase和普鲁兰酶组成的海藻糖生产成套试剂2制备海藻糖，实验重复三次。
2.1以DE值为6的淀粉水解物为底物
将步骤1中1.2的DE6淀粉水解物水溶液的pH调至5.0，得到pH为5.0的DE6淀粉水解物水溶液，向1mL pH为5.0的DE6淀粉水解物水溶液中加入普鲁兰酶，得到pH为5.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应前液，pH为5.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应前液中DE6淀粉水解物与普鲁兰酶的比例关系为1g:2μl，将pH为5.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应前液于60℃下孵育8-12小时后将pH调至7.0，得到pH为7.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应液；向pH为7.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应液中加入实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应前液，初始DE值为6的淀粉水解物与MTSase和MTHase的比例关系为1g：5U：8U；将DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育6-8小时，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液。
按照步骤1.1的高效液相色谱(HPLC)方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用普鲁兰酶及实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液转化DE值为6的淀粉水解物，每克DE值为6的淀粉水解物可得到0.59g海藻糖转化率为59％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
2.2以DE值为11的淀粉水解物为底物
按照步骤2.1的方法，将步骤1中1.2的DE6淀粉水解物水溶液替换为步骤1中1.3的DE11淀粉水解物水溶液，其他步骤均不变，得到DE11淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液。
按照步骤1.1的高效液相色谱(HPLC)方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为DE11淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析DE11淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用普鲁兰酶及实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液转化DE值为11的淀粉水解物，每克DE值为11的淀粉水解物可得到0.62g海藻糖转化率为62％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
3、利用实施例1的海藻糖生产成套试剂1制备海藻糖
(一)利用实施例1的由MTSase、MTHase和GTase组成的海藻糖生产成套试剂1制备海藻糖，MTSase和MTHase多次加入，实验重复三次。
3.1以麦芽五糖为底物
向1mL步骤1.1的麦芽五糖水溶液中加入实施例1中步骤2的pBAD-MTSase/BW25113上清液和pBAD-MTHase/BW25113上清液各100μL，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase反应前液，麦芽五糖-MTSase-MTHase反应前液中麦芽五糖、MTSase和pBAD-MTHase的比例关系为1g:5U:8U；将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育6-8小时，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液；将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液的pH调至6.0后，加入实施例1步骤2.3的pBAD-GTase/BW25113上清液，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase反应前液，将麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase反应前液于85℃下孵育4-6小时，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase反应液；将麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase反应液的调至7.0后，加入实施例1中步骤2的pBAD-MTSase/BW25113上清液和pBAD-MTHase/BW25113上清液各30μL，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应前液；将麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育2-3小时，得到麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
按照步骤1.1的高效液相色谱(HPLC)方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用实施例1中步骤2的pBAD-MTSase/BW25113上清液、pBAD-MTHase/BW25113上清液和pBAD-GTase/BW25113上清液转化麦芽五糖，每克麦芽五糖可得到0.59g海藻糖，转化率为59％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液、麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase反应液和麦芽五糖-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液进行TLC分析，方法如下：将上述反应液上样于TLC硅胶板(merck公司产品，货号1.05553.0001)，所用展开剂由异丙醇、乙酸乙酯和水组成，各组分的体积比为异丙醇：乙酸乙酯：水＝3：1：1。每个样品上样量约为5μg，将上好样品的硅胶板放在层析缸中进行层析分离，待展开剂跑至硅胶板顶端时取出硅胶析烘干，用20％硫酸染色，结果如图2所示，结果显示，麦芽五糖加入MTSase与MTHase后基本上完全反应生成海藻糖与麦芽三糖(泳道2)，加入GTase后链长较长的麦芽寡糖增加(泳道1)。因此，再次加入MTSase与MTHase后，海藻糖量提高(泳道3)。由此可见GTase提高海藻糖的转化率。
4、利用实施例1的海藻糖生产成套试剂3制备海藻糖
(一)利用实施例1的由MTSase、MTHase、GTase和普鲁兰酶组成的海藻糖生产成套试剂3制备海藻糖，MTSase和MTHase多次加入，实验重复三次。
4.1以DE值为6的淀粉水解物为底物
将步骤1中1.2的DE6淀粉水解物水溶液的pH调至5.0，得到pH为5.0的DE6淀粉水解物水溶液，向1mL pH为5.0的DE6淀粉水解物水溶液中加入普鲁兰酶，得到pH为5.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应前液，pH为5.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应前液中DE6淀粉水解物与普鲁兰酶的比例关系为1g:2μl，将pH为5.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应前液于60℃下孵育8-12小时后将pH调至7.0，得到pH为7.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应液；向pH为7.0的DE6淀粉水解物-普鲁兰酶反应液中加入实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应前液，初始DE值为6的淀粉水解物与MTSase和MTHase的比例关系为1g：5U：8U；将DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育6-8小时，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液；将DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase反应液的pH调至6.0后，加入实施例1步骤2.3的GTase浓缩液，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase反应前液，将DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase反应前液于85℃下孵育4-6小时，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase反应液；调节DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase反应液的pH至7.0后，再次加入实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应前液，初始DE值为6的淀粉水解物与再次加入的MTSase和MTHase的比例关系为1g：2U：2U；将DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应前液于40℃下孵育2-3小时，得到DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
按照步骤1.1的高效液相色谱(HPLC)方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析DE6淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用普鲁兰酶与GTase浓缩液及多次加入实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液转化DE值为6的淀粉水解物，每克DE值为6的淀粉水解物可得到0.74g海藻糖，转化率为74％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
4.2以DE值为11的淀粉水解物为底物
按照步骤4.1的方法，将步骤1中1.2的DE6淀粉水解物水溶液替换为步骤1中1.3的DE11淀粉水解物水溶液，其他步骤均不变，得到DE11淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
按照步骤1.1的高效液相色谱(HPLC)方法，将麦芽五糖-MTSase-MTHase反应液替换为DE11淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液，其他步骤均不变，分析DE11淀粉水解物-普鲁兰酶-MTSase-MTHase-GTase-MTSase-MTHase反应液。
结果显示，利用普鲁兰酶与GTase浓缩液及多次加入实施例1步骤2的MTSase浓缩液与MTHase浓缩液转化DE值为11的淀粉水解物，每克DE值为11的淀粉水解物可得到0.81g海藻糖，转化率为81％，转化率(％)＝反应体系中生成海藻糖质量/反应体系中加入底物质量。
结果表明，当以DE值为6的淀粉水解物为底物时，利用MTSase、MTHase生产海藻糖，转化率为29％，所需时间为6-8小时；利用海藻糖生产成套试剂2生产海藻糖，转化率为59％，所需时间为14-16小时；利用海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase均只加入反应体系一次时，转化率为59％，所需时间为14-16小时；利用海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase反复加入反应体系时，转化率为74％，所需时间为22-25小时。
当DE值为11的淀粉水解物为底物时，利用MTSase、MTHase生产海藻糖，转化率为30％，所需时间为6-8小时；利用海藻糖生产成套试剂2生产海藻糖，转化率为62％，所需时间为14-16小时；利用海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase均只加入反应体系一次时，转化率为62％，所需时间为14-16小时；利用海藻糖生产成套试剂3生产海藻糖，MTSase、MTHase反复加入反应体系时，转化率为81％，所需时间为22-25小时。
当以麦芽五糖为底物时，利用MTSase、MTHase生产海藻糖，转化率为41％，所需时间为6-8小时；利用海藻糖生产成套试剂1生产海藻糖，转化率为59％，所需时间为14-16小时。
结果表明，利用本发明的海藻糖生产成套试剂1、2和3均可以提高海藻糖的产量，且时间短，可利用本发明的海藻糖生产成套试剂1、2和3生产海藻糖。

Claims (11)

1.海藻糖的制备方法，包括将底物与海藻糖生产成套试剂进行反应得到海藻糖；
所述海藻糖生产成套试剂包括麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶和M；所述M为糖基转移酶和切支酶这两种的两种或任一种；所述底物为淀粉或淀粉水解物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶为如下G1)或G2)或G3)的蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的第42-816位的蛋白质；
G2)在SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
G3)在SEQ ID No.1的第42-816位氨基酸中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶功能的由G1)或G2)衍生的蛋白质；
所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶为下述H1)或H2)或H3)的蛋白质：
H1)氨基酸序列为SEQ ID No.3的第42-639位的蛋白质；
H2)在SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
H3)在SEQ ID No.3的第42-639位氨基酸中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶功能的由H1)或H2)衍生的蛋白质；
所述糖基转移酶是下述I1)或I2)或I3)的蛋白质：
I1)氨基酸序列为SEQ ID No.5的第42-697位的蛋白质；
H2)在SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
I3)在SEQ ID No.5的第42-697位氨基酸中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有所述糖基转移酶功能的由I1)或I2)衍生的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述海藻糖生产成套试剂还包括淀粉酶。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述海藻糖的制备方法包括：将麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述海藻糖的制备方法包括：将麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述海藻糖的制备方法包括：将糖基转移酶基因导入受体细胞中进行表达得到所述糖基转移酶；
所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因为下述G11)-G13)中的任一种DNA分子：
G11)编码序列是SEQ ID No.2所示的cDNA分子或基因组DNA；
G12)在严格条件下与G11)限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA；
G13)与G11)或G12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：
H11)编码序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因组DNA；
H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；
H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述糖基转移酶基因为下述I11)-I13)中的任一种DNA分子：
I11)编码序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因组DNA；
I12)在严格条件下与I11)限定的DNA分子杂交且编码所述糖基转移酶的cDNA分子或基因组DNA；
I13)与I11)或I12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述糖基转移酶的cDNA分子或基因组DNA。
8.下述P1)或P2)的产品：
P1)权利要求1或2或3所述的海藻糖生产成套试剂；
P2)用于生产海藻糖的生物材料，为下述C1)或C2)或C3)：
C1)用于生产海藻糖的成套DNA分子，包括权利要求4-7中任一所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因、所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因和N；所述N为权利要求4-7中任一所述糖基转移酶基因和/或切支酶基因，各基因各自独立包装；
C2)用于生产海藻糖的重组载体或成套重组载体，所述重组载体或所述成套重组载体能产生权利要求1或2或3所述海藻糖生产成套试剂；
C3)用于生产海藻糖的重组细胞或成套重组细胞，所述重组细胞或所述成套重组细胞能产生权利要求1或2或3所述海藻糖生产成套试剂。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：
C2)所述重组载体或所述成套重组载体为利用C1)所成套DNA分子产生权利要求1或2或3所述海藻糖生产成套试剂的载体；
C3)所述重组细胞或所述成套重组细胞为利用C1)所成套DNA分子产生权利要求1或2或3所述海藻糖生产成套试剂的细胞。
10.根据权利要求4-7中任一所述的方法或权利要求8或9所述产品，其特征在于：所述细胞为大肠杆菌。
11.下述任一应用：
X1、权利要求8或9所述产品在制备海藻糖中的应用；
X2、权利要求1或2所述糖基转移酶在制备海藻糖中的应用；
X3、权利要求6或7所述糖基转移酶基因在制备海藻糖中的应用。
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