JP2009536201A - Ｒａｇｅ融合タンパク質、製剤及びその使用方法 - Google Patents

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Abstract

第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチド配列を含むRAGE融合タンパク質が開示される。RAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位及びイムノグロブリンCH2ドメインのN-末端アミノ酸に直接連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドドメインを利用することができる。RAGE融合タンパク質製剤及びRAGE介在性病理学のための治療剤としてのRAGE融合タンパク質及びRAGE融合タンパク質製剤の利用も開示される。

Description

関連出願への相互参照
本発明は、２００６年５月５日に出願された米国仮特許出願第６０／７９８，４５５号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／７９８，４５５号の開示は、その全体が参考文献として本明細書中に援用されている。
本発明は、最終糖化産物受容体（Receptor for Advanced Glycated Endproducts (RAGE)）の制御に関する。より特別には、本発明は、RAGEポリペプチドを含む融合タンパク質、かかる融合タンパク質の製造方法及びかかるRAGE融合タンパク質の製剤、及びRAGEに基づく障害の治療のためのかかるRAGE融合タンパク質の使用を記載する。
アルドース糖類とタンパク質または脂質とのインキュベーションは、タンパク質上のアミノ基の非酵素的糖化及び酸化を起こし、アマドリ付加化合物を生成する。時間の経過とともに、該付加化合物はさらなる転位、脱水素化、及び他のタンパク質との架橋形成を受けて、最終糖化産物（AGE）として知られる複合体を生成する。AGEの生成を促進する因子は、（アミロイドーシスにおけるような）遅延性のタンパク質ターンオーバー、リジン含量の高い巨大分子の蓄積、及び（糖尿病におけるような）高い血糖レベルを含む（Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761 (1995)）。AGEは、糖尿病に関連する合併症を含む様々な障害及び正常な老化に結び付けられてきた。
AGEは、単球、マクロファージ、微小脈管系の内皮細胞、平滑筋細胞、メサンギウム細胞及びニューロン上の細胞表面受容体への特異的かつ飽和性の結合を示す。最終糖化産物受容体（RAGE）は、分子のイムノグロブリンスーパーファミリーの一員である。RAGEの細胞外（N末端）ドメインは、3つのイムノグロブリン型領域：1つのV(可変)型ドメインに続く2つのC型（定常）ドメイン、を含む（Neeper et al., J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194(1997)）。1つの膜貫通ドメイン及び短い高度に荷電したサイトゾル側末端が細胞外ドメインに続いている。N末端細胞外ドメインは、RAGEのタンパク分解またはV及びCドメインから成る可溶性RAGE（sRAGE）を生成するための分子生物学的アプローチによって単離されることができる。
RAGEは、白血球、ニューロン、ミクログリア細胞及び血管内皮細胞を含む複数の細胞タイプ上に発現される（Hori et al., J. Biol. Chem. 270: 25752-761 (1995)）。増加したRAGEのレベルは、老化組織（Schleicher et al., J. Clin. Invest., 99(3): 457-468 (1997)）、並びに糖尿病性の網膜、脈管系及び腎臓（Schmidt et al., Nature Med., 1:1002-1004(1995)）においても見出される。
AGEに加えて、他の化合物もRAGEに結合し、そして調節することができる。RAGEは、アミロイドベータ（Aβ）、血清アミロイドA（SAA）、最終糖化産物（AGE）、S100（カルグラニュリンファミリーの前炎症性メンバー）、カルボキシメチルリジン（CML）、アンフォテリン及びCD11b/CD18を含む機能的及び構造的に異なる複数のリガンドに結合する（Bucciarelli et al., Cell Mol. Life Sci., 59:1117-128 (2002)；Chavakis et al., Microbes Infect., 6:1219-1225(2004)）；Kokkola et al., Scand. J. Immunol., 61:1-9(2005)；Schmidt et al., J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001)；Rocken et al., Am. J. Pathol., 162:1213-1220 (2003)）。
AGE、S100/カルグラニュリン、β−アミロイド、CML（Nε−カルボキシメチルリジン）及びアンフォテリンなどのリガンドのRAGEへの結合が、多様な遺伝子の発現を修飾することが示された。そして、これらの相互作用は、p38活性化、p21ras、MAPキナーゼ、Erk1-2リン酸化、及び炎症性シグナル伝達の転写メディエーター、NF-κBのシグナル伝達メカニズムを開始することができる（Yeh et al., Diabetes, 50:1495-1504(2001)）。例えば、多くの細胞タイプにおいて、RAGEとそのリガンドの間の相互作用は酸化的ストレスを生じることができ、それによってフリーラジカル感受性転写因子NF-κBの活性化をおこし、そして、サイトカインIL-1β及びTNF-アルファなどのNF-κBにより制御される遺伝子の活性化を引き起こす。さらに、RAGE発現は、NF-κBを介して上方制御され、そして炎症部位または酸化的ストレス部位における発現の増加を示す（Tanaka et al., J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)）。したがって上行性でかつしばしば有害であるスパイラルは、リガンドの結合によって開始されるポジティブフィードバックループによって刺激される。
異なる組織及び器官におけるRAGEの活性化は、多数の病態生理学的結論に導くことができる。RAGEは、急性及び慢性の炎症（Hofmann et al., Cell 97:889-901 (1999)）、増加した血管透過性などの遅発性の糖尿病合併症の発生（Wautier et al., J. Clin. Invest., 97: 238-243(1995)）、ニューロパチー（Teillet et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11:1488-1497(2000)）、動脈硬化（Vlassara et al., The Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med. 28:419-426(1996)）及び網膜症（Hammes et al., Diabetologia, 42: 603-607(1999)）を含む様々な状態に結び付けられてきた。RAGEは、アルツハイマー病（Yan et al., Nature, 382:685-691 (1996)）及び腫瘍の浸潤及び転移（Taguchi et al., Nature, 405:354-357 (2000)）にも結び付けられてきた。
RAGEの広範な発現及び複数の異なる病気のモデルにおけるそのみかけの多面的な役割にもかかわらず、RAGEは正常な発達に必須であるとは見えない。例えば、RAGEノックアウトマウスは明白な異常な表現型を有さず、これは慢性的に刺激された場合にRAGEが病気の病理において役割を演じる一方、RAGEの阻害がいかなる望まれない急性の表現型にも寄与しないように見えることを示唆している（Liliensiek et al., J. Clin. Invest., 113:1641-50(2004)）。
生理学的リガンドのRAGEへの結合をアンタゴナイズすることは、過剰濃度のAGE及び他のRAGEリガンドにより引き起こされる病態生理学的変化を下方制御することができる。内因性リガンドのRAGEへの結合を減少させることによって、RAGE介在性の障害に関連する症状が減少させられることができる。可溶性RAGE（sRAGE）は、RAGEリガンドのRAGEへの結合を有効にアンタゴナイズすることができる。しかしながら、sRAGEは、インビボで投与された場合、1つ以上の障害のために治療的に有用であるためには短すぎるかもしれない半減期を有するかもしれない。したがって、AGEや他の生理学的リガンドのRAGE受容体への結合をアンタゴナイズする化合物であって、所望の薬物動態プロフィールを有する化合物を開発する必要がある。
要約
本発明の実施態様は、RAGE融合タンパク質及びかかるタンパク質の使用方法を含む。本発明は、多様な方法で具体化されることができる。本発明の実施態様は、第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を含むことができる。1つの実施態様においては、該RAGE融合タンパク質はRAGEリガンド結合部位を含む。該RAGE融合タンパク質はさらに、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含むことができる。ある実施態様においては、RAGE融合蛋白質は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列、或いは、それに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。例えば、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一の配列は、C-末端のリジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む。
本発明は、また、RAGE融合タンパク質の作製方法も含む。1つの実施態様においては、該方法は、RAGEポリペプチドを、第二の非RAGEポリペプチドに連結することを含む。1つの実施態様においては、RAGEポリペプチドはRAGEリガンド結合部位を含む。該方法は、RAGEポリペプチドを、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結させることをふくんでよい。ある実施態様においては、RAGE融合蛋白質は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列、或いはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。例えば、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一の配列は、C-末端のリジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む。
他の実施態様においては、本発明は、対象においてRAGE介在性の障害を治療するための方法及び組成物を含んでよい。該方法は、本発明のRAGE融合タンパク質を対象に投与することを含んでよい。該組成物は、医薬として許容可能な担体中の本発明のRAGE融合タンパク質を含んでよい。
他の実施態様においては、本発明は、凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質、及び緩衝剤の凍結乾燥混合物を含む製剤も提供する。例えば、ある実施態様においては、本発明は、少なくとも５０mg/mLの量のRAGE融合タンパク質、及び希釈剤を含む、安定な再構成された製剤を含んでよく、ここで、再構成製剤は、RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護剤の凍結乾燥混合物から調製されている。
本発明の実施態様はまた、製造品も含んでよい。ある実施態様においては、製造品は、凍結乾燥されたRAGE融合タンパク質を含む製剤を保持する容器を含んでよい。製造品はまた、希釈剤で凍結乾燥製剤を再構成するための指示書も含んでよい。
他の実施態様においては、本発明はまた、RAGE融合タンパク質の安定な再構成製剤を調製するための方法も含んでよい。ある実施態様において該方法は、再構成された製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が少なくとも５０mg/mLであるように、RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護剤の凍結乾燥混合物を希釈剤中で再構成することも含んでよい。例えば、１つの実施態様においては、該方法は、RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤を含む混合物を凍結乾燥するステップ、及び該凍結乾燥混合物を希釈剤中で再構成するステップを含む。
本発明の特別な実施態様に関連する様々な利益がある。1つの実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、対象に投与された場合、代謝的に安定である。本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEリガンドへの高親和性の結合も示すことができる。ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、高ナノモル〜低マイクロモル範囲の親和性でRAGEリガンドに結合する。生理学的なRAGEリガンドへの高親和性の結合によって、本発明のRAGE融合タンパク質は、内因性のリガンドのRAGEへの結合を阻害するために使用されることができ、それによってRAGE介在性疾患を軽減する手段を提供する。
また、本発明のRAGE融合タンパク質は、タンパク質または核酸の形態で提供されてもよい。1つの例示的な実施例において、RAGE融合タンパク質は全身に投与され、そして脈管系に留まって、RAGEにより部分的に仲介される血管の病気を潜在的に治療する。他の例示的な実施態様においては、RAGE融合タンパク質は局所投与されて、RAGEリガンドがその病理に寄与する病気を治療することができる。或いは、RAGE融合タンパク質をコードする核酸構築物が、ウイルスなどの好適な担体を用いて又は裸のDNAとして、ある部位に送達されることができ、ここで、一過性の局所的な発現がRAGEリガンドと受容体との相互作用を局所的に阻害することができる。したがって、投与は（RAGE融合タンパク質が投与される場合などの）一過性に、または（RAGE融合タンパク質が組換えDNAとして投与される場合などの）本質的により持続性のものであることができる。
以下の本明細書において記載される本発明のさらなる特徴がある。本発明が以下の請求項、明細書及び図面において示される詳細に限って適用されるものでないことは理解されるべきである。本発明は他の実施態様及び多様な方法で実行または実施されることができる。
詳細な説明
反対に示されない限り、以下の明細書に記載された数のパラメータは、本発明によって得ることを追求される所望の性質に依存して変動することのできる近似値である。少なくとも、そして本願の原理の等価物を特許請求の範囲に限定することを試みるのではなく、各数のパラメータは、少なくとも報告された重要な数字に照らして、かつ通常の周辺技術を適用することによって解釈されるべきである。
本発明の広い範囲を示す数の範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例中に記載された数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、いかなる数値もそれらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含む。さらに、本明細書中に開示されるすべての範囲は、その中に包含される任意のそしてすべての部分的範囲を含むと理解されるべきである。例えば、記載された「１〜１０」という範囲は、最小値１及び最大値１０の間（そしてそれらの値を含めた）すべての部分的範囲、すなわち、１〜６．１などの１以上の最小値で始り、かつ、５．５〜１０などの１０以下の最大値で終わる、すべての部分的範囲を含むと考えられるべきである。さらに、「本明細書中に組み込まれる」とは、その全体が組み込まれていると理解されるべきである。
さらに、本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「the」は、明記され、そして明白に1つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことは留意される。「または」という用語は、内容が明らかにそうでない場合を除き、「及び／または」という用語と交換可能に使用される。
また、「部分」及び「断片」という用語は、ポリペプチド、核酸または他の分子構築物の部分を意味するために、交換可能に使用される。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、部分的な又は完全長のタンパク質のいずれかを含んでよいタンパク質分子を記述するために、本明細書中で交換可能に使用される。
本分野で知られているとおり、「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」は、１つのアミノ酸のアルファ炭素のカルボキシル基と他のアミノ酸のアルファ炭素のアミノ基の間の縮合反応によって形成されたペプチド結合によってそのアルファ炭素が連結された、アミノ酸（典型的にはL-アミノ酸）の鎖である。典型的には、タンパク質を作っているアミノ酸は、該タンパク質のアミノ末端残基から始まってカルボキシル末端残基に向かって順番に番号付けされている。
本明細書中で使用される「上流」という用語は、分子がタンパク質である場合には第二の残基のN−末端側、または分子が核酸である場合には第二の残基に対して５’側にある残基を意味する。また、本明細書中で使用される「下流」という用語は、該分子がタンパク質である場合には第二の残基のC-末端側、または該分子が核酸である場合には第二の残基の３’側にある残基を意味する。
別に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。熟練者は、本分野の定義及び用語については、特に「Current Protocols in Molecular Biology (例えば、Ausubel, F.M. et al., Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed., Chapter 2, John Wiley & Sons, N.Y.を参照のこと)」に注意を向ける。アミノ酸残基についての略語は、２０の一般的なL-アミノ酸のうちの1つを意味するために本分野において使用される標準的な３文字及び／または１文字のコードである。
「核酸」は、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドである。該用語は、一本鎖核酸、二本鎖核酸並びにヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログから作られるRNA及びDNAを含むように使用される。
「ベクター」という用語は、第二の核酸分子を細胞中に輸送するために使用されることのできる核酸分子を指す。1つの実施態様においては、ベクターは、該ベクター中に挿入されたDNA配列の複製を可能とする。ベクターは、少なくともいくつかの宿主細胞中での該核酸分子の発現を促進するためのプロモーターを含むことができる。ベクターは自発的に（染色体外で）複製することができるかまたは宿主細胞染色体中に組み込まれることができる。1つの実施態様において、該ベクターは、該ベクター中に挿入された核酸配列の少なくとも一部分に由来するタンパク質を産生することのできる発現ベクターを含むことができる。
本分野で知られているとおり、核酸配列を相互にハイブリダイズさせるための条件は、低〜高ストリンジェンシーにわたるものとして記述されることができる。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドを低塩緩衝液中で高温で洗浄することを意味する。ハイブリダーゼーションは、６５℃で０．５M NaHPO4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）などの本分野で標準的なハイブリダイゼーション溶液を用いて、結合したDNAを濾過し、そして0.25M NaHPO4、3.5％SDS中で洗浄し、続いて、プローブの長さによって室温〜６８℃の間の温度で０．１ｘSSC/0.1%SDSで洗浄することであってよい。例えば、高ストリンジェンシーな洗浄は、１４塩基オリゴヌクレオチドプローブのためには、３７℃で、または１７塩基オリゴヌクレオチドプローブのためには４８℃において、または２０塩基オリゴヌクレオチドプローブのためには５５℃において、または２５塩基オリゴヌクレオチドプローブの場合には６０℃において、または約２５０オリゴヌクレオチドの長さのヌクレオチドプローブのためには６５℃で６xSSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中で洗浄することを含む。核酸プローブは、［γ−32P］ATPなどの放射性ヌクレオチドで末端標識することによって、または［α−32P］dCTPなどの放射能標識ヌクレオチドをランダムプライマー標識によって取り込むことによって放射性ヌクレオチドで標識されることができる。或いは、プローブは、ビオチン標識またはフルオレセイン標識されたヌクレオチドの取り込みによって標識されることができ、そして該プローブは、ストレプトアビジンまたは抗−フルオレセイン抗体を用いて検出される。
本明細書中で使用される「小有機分子」は、少なくとも１つの炭素原子を含む、分子量２，０００ダルトン未満の分子である。
「融合タンパク質」という用語は、2つ以上のタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドをさす。融合タンパク質は、別々のタンパク質に由来するアミノ酸部分の間のアミノ酸連結領域も含むことができる。
本明細書中で使用される「非−RAGEポリペプチド」は、RAGEまたはその断片に由来しない任意のポリペプチドである。かかる非−RAGEポリペプチドは、イムノグロブリンペプチド、二量体化ポリペプチド、安定化ポリペプチド、両親媒性ペプチド或いはタンパク質の標的化または精製のための「タグ」を提供するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本明細書中で使用される「イムノグロブリンペプチド」は、イムノグロブリン重鎖またはその部分を含むことができる。1つの実施態様においては、重鎖の一部分は、Fc断片またはその一部分であることができる。本明細書中で使用されるFc断片は、重鎖ヒンジポリペプチド、並びに一量体または二量体形態いずれかのイムノグロブリンの重鎖のCH2及びCH3ドメインを含む。或いは、CH1及びFc断片は、イムノグロブリンポリペプチドとして使用されることができる。重鎖（又はその部分）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、またはIgA（α）の任意の1つに由来することができる。さらに、重鎖（又はその部分）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ１）、IgG2（γ２）、IgG3(γ３)、IgG4（γ４）、IgA1（α１）、IgA2(α２)、またはこれらのアイソタイプまたはサブタイプの生理活性の変化した変異体に由来することができる。変更されることのできる生理活性の例は、ヒンジ領域の修飾などによるいくつかのFc受容体へのアイソタイプの結合能の減少を含む。
「同一性」または「同一性パーセント」という用語は、2つのアミノ酸配列間または2つの核酸配列間の配列同一性をさす。同一性パーセントは2つの配列を整列化することによって決定されることができ、そして比較される配列に共通の位置における同一の残基（すなわち、アミノ酸またはヌクレオチド）の数をさす。配列の整列化及び比較は、本分野において標準的なアルゴリズム（例えば、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math,. 2:482; Needleman and Wunsch, 1970、J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444を参照のこと）或いはBLASTまたはFASTAとして公的に利用可能なこれらのアルゴリズムのコンピュータ化バージョン（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）を用いて実施されることができる。また、National Institute of Health, Bethesda MDを通して利用可能なENTREZも配列の比較に使用されることができる。1つの実施態様においては、2つの配列の同一性パーセントは、ギャップウェイト（gap weight）1のGCGを用いて、各アミノ酸ギャップが2つの配列間の単一のアミノ酸ミスマッチであるように重み付けされるように決定されることができる。
本明細書中で使用される用語「保存残基」は、同じ構造及び／または機能を有する複数のタンパク質の間で同一であるアミノ酸を意味する。保存残基の領域は、タンパク質の構造又は機能にとって重要であることができる。したがって、３次元のタンパク質中に同定された連続的な保存残基は、タンパク質の構造または機能にとって重要であることができる。保存残基または３−D構造の保存領域を発見するためには、異なる種からの同一または類似のタンパク質についての配列或いは同じ種の個体の配列の比較が行われることができる。
本明細書中で使用される用語「相同体」は、野生型アミノ酸配列とある程度の相同性又は同一性を有するポリペプチドを意味する。相同性の比較は、目視によって、またはより通常では容易に利用可能な配列比較プログラムの助けによって実行されることができる。これらの商業的に利用可能なコンピュータプログラムは、2つ以上の配列間の相同性パーセントを算出することができる（例えば、Wilbur, W.J. and Lipman, D. J. 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 726-730）。例えば、相同な配列は、別の実施態様では、お互いに少なくとも７０％同一、７５％同一、８５％同一、９０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むと解釈されることができる。
本明細書中で使用される、それに対して少なくとも９０％同一、という用語は、示された配列に対して９０〜９９．９９％同一である配列を含み、そして、その間のすべての範囲を含む。したがって、それに対して少なくとも９０％同一、という用語は、示された配列に対して９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、９９、９９．５％同一である配列を含む。同様に、「少なくとも７０％同一」という用語は、その間の全ての範囲とともに、７０〜９９．９９％同一の配列を含む。同一性パーセントの決定は、本明細書に記載のアルゴリズムを用いて決定される。
本明細書中で使用されるポリペプチドまたはタンパク質「ドメイン」は、独立した単位を含むポリペプチドまたはタンパク質に沿った領域を含む。ドメインは、構造、配列及び／または生理活性によって定義されることができる。1つの実施態様においては、ポリペプチドドメインは、タンパク質の残りの部分から実質的に独立した方法で折りたたんだタンパク質の領域を含むことができる。ドメインは、PFAM、PRODOM、PROSITE、BLOCKS、PRINTS、SBASE、ISREC PROFILES、SAMRT、及びPROCLASSなどの、しかしこれらに限られないドメインデータベースを用いて同定されることができる。
本明細書中で使用される「イムノグロブリンドメイン」は、イムノグロブリンのドメインに構造的に相同または同一なアミノ酸配列である。イムノグロブリンドメインのアミノ酸配列の長さは、任意の長さであってよい。1つの実施態様においては、イムノグロブリンドメインは、２５０アミノ酸未満であるかもしれない。例示的な実施例においては、イムノグロブリンドメインは約８０〜１５０アミノ酸の長さであるかもしれない。例えば、IgGの可変領域、並びにCH1、CH2、及びCH3領域はそれぞれイムノグロブリンドメインである。他の実施例においては、IgMの可変、CH1、CH2、CH3及びCH4領域はそれぞれイムノグロブリンドメインである。
本明細書中で使用される「RAGEイムノグロブリンドメイン」は、イムノグロブリンのドメインに構造的に相同または同一なRAGEタンパク質からのアミノ酸配列である。例えば、RAGEイムノグロブリンドメインは、RAGEV-ドメイン、RAGE Ig様C1-タイプ１ドメイン（「C1ドメイン」）またはRAGE Ig様C2-タイプ２ドメイン（「C2ドメイン」）を含むことができる。
本明細書中で使用される「ドメイン間リンカー」は、2つのドメインを一緒に結合させるポリペプチドを含む。Fcヒンジ領域は、IgG中のドメイン間リンカーの例である。
本明細書中で使用される「直接的に連結された」とは、（核酸配列、ポリペプチド、ポリペプチドドメインなどの）2つの異なる基の間の共有結合であって、連結された該２つの基の間にいかなる介在性原子も有さないものをさす。
本明細書中で使用される「リガンド結合ドメイン」は、リガンドの結合に関与するタンパク質のドメインをさす。リガンド結合ドメインという用語は、リガンド結合ドメインの相同体またはその部分の相同体を含む。この点で、リガンド結合ドメインの結合特異性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、または親水性における類似性に基づいて、リガンド結合部位における慎重なアミノ酸置換が行われることができる。
本明細書中で使用される「リガンド結合部位」は、リガンドと直接的に相互作用するタンパク質中の残基またはリガンドと直接的に相互作用する残基のごく近傍にリガンドを位置づけることに関与する残基を含む。リガンド結合部位中の残基の相互作用は、モデルまたは構造中のリガンドへの残基の空間的近接性によって定義されることができる。リガンド結合部位という用語は、リガンド結合部位の相同体またはその部分を含む。この点で、リガンド結合ドメインの結合特異性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、または親水性における類似性に基づいて、リガンド結合部位における慎重なアミノ酸置換が行われることができる。リガンド結合部位は、タンパク質またはポリペプチドの1つ以上のリガンド結合ドメイン中に存在することができる。
本明細書中で使用される用語「相互作用」は、リガンドまたは化合物、あるいはその部分または断片と、着目の第二の分子の部分との間の近接した状態をさす。相互作用は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電的若しくは疎水性相互作用などの結果としての非共有結合であってよく、或いは共有結合であってもよい。
本明細書中で使用される「リガンド」は、基質またはそのアナログ若しくは部分を含む、リガンド結合部位と相互作用する、分子または化合物または物質をさす。本明細書中で記載されるとおり、「リガンド」という用語は着目のタンパク質に結合する化合物をさすことができる。リガンドはアゴニスト、アンタゴニストまたは調節剤であることができる。或いは、リガンドは生物学的効果を有さなくてもよい。或いは、リガンドは他のリガンドの結合をブロックし、それによって生物学的効果を阻害してもよい。リガンドは、小分子阻害剤を含んでよいが、これに限られない。これらの小分子は、ペプチド、ペプチド模倣剤、有機化合物などを含んでよい。リガンドはポリペプチド及び／またはタンパク質も含んでよい。
本明細書中で使用される「調節剤化合物」は、着目の分子の生理活性を変化させるかまたは変更する分子をさす。調節剤化合物は、着目の分子の物理的または化学的特性或いは機能的または免疫学的性質を変化させることができる。RAGEについては、調節剤化合物は、RAGEまたはその部分の活性を増加または減少させ、或いは特性または機能的若しくは免疫学的性質を変化させることができる。調節剤化合物は、天然及び／または化学的に合成された若しくは人工的なペプチド、修飾されたペプチド（例えば、ホスホペプチド）、抗体、炭化水素、モノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、糖脂質、複素環式化合物、ヌクレオシドまたはヌクレオチドまたはその部分、及び有機小分子または無機小分子を含むことができる。調節剤化合物は、内因性の生理学的化合物であってよく、または天然若しくは合成の化合物であってよい。或いは、調節剤化合物は、有機小分子であってよい。「調節剤化合物」という用語は、化学的に修飾されたリガンドまたは化合物も含み、そして異性体及びラセミ体も含む。
「アゴニスト」は、受容体に結合して、関連する受容体に特異的な薬理学的応答を引き出す複合体を形成する化合物を含む。
「アンタゴニスト」は、アゴニストまたは受容体に結合して、実質的な薬理学的応答を起こさせず、かつアゴニストによって誘発された生物学的応答を阻害することのできる複合体を形成する、化合物を含む。
したがって、RAGEアゴニストは、RAGEに結合し、そしてRAGE−介在性細胞プロセスを刺激することができ、そしてRAGEアンタゴニストはRAGE介在性プロセスがRAGEアゴニストによって刺激されることを阻害することができる。例えば、1つの実施態様においては、RAGEアゴニストによって刺激される細胞プロセスはTNF-α遺伝子転写の活性化を含む。
「ペプチド模倣剤」という用語は、分子間の相互作用においてペプチドに対する置換基として働く構造体をさす（Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem. 24:243-252）。ペプチド模倣剤は、アミノ酸及び／またはペプチド結合をふくんでもまたは含まなくてもよいが、ペプチドまたは、アゴニストまたはアンタゴニストの構造的または機能的特徴を保持する合成構造体をさす。ペプチド模倣剤はペプトイド、オリゴペプトイド（Simon et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:9367）；及び本発明のペプチドまたはアゴニストまたはアンタゴニストに相当するすべての可能なアミノ酸配列を表す、設計された長さのペプチドを含むペプチドライブラリーも含む。
「治療すること」又は「治療する」という用語は、病気又は障害の症状を改善することをさし、そして該障害を治癒させること、該障害の発症を実質的に予防すること、又は対象の状態を改善することを含んでよい。本明細書中で使用される用語「治療」は、障害に起因する1つの症状又はほとんどの症状の軽減を含む、患者が罹っている所与の障害のためのすべてのスペクトルの治療、特定の障害の治癒、又は該障害の発症の予防をさす。
本明細書中で使用される用語「EC50」は、測定された生物学的効果の５０％を生じる剤の濃度として定義される。例えば、測定可能な生物学的効果を有する治療剤のEC50は、該剤が該生物学的効果の５０％を示す値を含んでよい。
本明細書中で使用される「IC50」という用語は、測定された効果の５０％の阻害を生じる剤の濃度として定義される。例えば、RAGE結合のアンタゴニストのIC50は、該アンタゴニストがRAGEのリガンド結合部位へのリガンドの結合を５０％減少させる値を含んでよい。
本明細書中で使用される「有効量」は、対象において所望の効果を生じるのに有効な剤の量を意味する。「治療的有効量」という用語は、動物又はヒトの求められている治療的応答を引き出すであろう、薬物又は医薬の量をさす。有効量を含む実際の用量は、投与経路、対象のサイズ又は健康、治療される障害などに依存してよい。
本明細書中で使用される「医薬として許容可能な担体」という用語は、例えば、RAGE-介在性の障害又は病気の治療のために投与される治療用組成物のために、ヒト又は動物対象において使用するのに好適な化合物及び組成物をさすことができる。
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、慣用の無毒性担体、希釈剤、アジュバント、ビヒクルなどを含む単位用量製剤として、哺乳動物宿主に、経口で、非経口で、局所に、吸入スプレーにより、鼻腔内、又は直腸などに投与されることのできる組成物をさす。
本明細書中で使用される「非経口」という用語は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、嚢内注射又は輸注技術を含む。
本明細書中で使用される「拒絶」は、細胞、組織又は器官の破壊をもたらすか或いは細胞、組織又は器官の損傷をもたらす、組織における免疫又は炎症反応をさす。拒絶された細胞、組織又は器官は、拒絶反応を起こしている対象と同じ対象に由来してよく、又は異なる対象から拒絶を示している対象へ移植されたものでもよい。
本明細書中で使用される用語「細胞」は、それぞれが独立した生物系を成す、哺乳動物生物系の構造的及び機能的単位をさす。本分野で知られている通り、細胞は、核、細胞質、細胞内オルガネラ、及び細胞を封入して細胞を他の細胞から独立させる細胞壁を含む。
本明細書中で使用される「組織」という用語は、類似の構造及び機能を有するか又は一緒に作用して特別な機能を発揮する、細胞の凝集体をさす。組織は、類似する細胞の集合体及び細胞を取り巻く細胞間物質を含んでよい。組織は、筋肉組織、神経組織及び骨を含むがこれらに限定されない。
本明細書中で使用される「器官」という用語は、何らかの特定の機能のために特化した、動物における完全に分化した構造的及び機能的単位をさす。器官は、特定の機能又は機能群を発揮する一群の組織を含みうる。器官は、心臓、肺、脳、眼、胃、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、皮膚、子宮、膀胱及び骨を含むが、これらに限定されない。
「安定な」製剤は、保存したとき、その中のRAGE融合タンパク質が本質的にその物理学的及び化学的安定性並びに生理活性を保持するものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術が本分野で利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及びJones, A Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)中に概説されている。安定性は、選択された温度において選択された時間の間測定されることができる。迅速なスクリーニングのためには、製剤は、４０℃で１週間〜１ヶ月間保持され、その間に安定性が測定される。例えば、凍結乾燥及び保存後の凝集の程度は、RAGE融合タンパク質の安定性の指標として使用可能である（本明細書中の実施例を参照のこと）。例えば、「安定な」製剤は、RAGE融合タンパク質の約１０％未満、そして好ましくは約５％未満が製剤中に凝集体として存在するものであってよい。他の実施態様においては、凍結乾燥および凍結乾燥製剤の保存後の凝集体の形成の増加が測定されることができる。例えば、「安定な」凍結乾燥製剤は、凍結乾燥製剤が少なくとも１週間、４０℃でインキュベートされた場合、凍結乾燥製剤中の凝集体の増加が、約５％未満又は約３％未満であるものであってよい。他の実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤の安定性は、本明細書中に記載の結合アッセイなどの生理活性アッセイ法を用いて測定されることができる。
「再構成」製剤は、凍結乾燥されたRAGE融合タンパク質製剤を、RAGE融合タンパク質が再構成された製剤中に分散及び／又は溶解されるように、希釈剤中に溶解することによって調製されたものである。再構成製剤は、融合タンパク質で治療される患者に（非経口投与などによって）投与されるのに好適であってよく、本発明の或る実施態様においては、皮下投与に好適なものであってよい。
「等張」によって、着目の製剤が約２４０〜約３４０mOsm/kgの浸透圧を有することが意味される。ある実施態様においては、等張の製剤は、ヒト血液（２８５〜３１０mOsm/kg）と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張性は、蒸気圧又は凝固点降下型浸透圧計を用いて測定可能である。
「凍結乾燥保護剤」は、RAGE融合タンパク質と併合したときに、凍結乾燥及びその後の保存による化学的及び／又は物理学的不安定性を顕著に防止するか又は減少させる分子である。例示的な凍結乾燥保護剤は、シュークロース又はトレハロースなどの糖；エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなどの糖アルコールのようなポリオール；又はそれらの組み合わせを含む。ある実施態様においては、凍結乾燥保護剤は糖を含んでよい。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤は非還元糖を含んでよい。さらなる実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、シュークロースなどの非還元糖を含んでよい。凍結乾燥保護剤は、「凍結乾燥保護量」で凍結乾燥前の製剤に加えられてよく、これは、凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤の存在下でのタンパク質の凍結乾燥の後、RAGE融合タンパク質が凍結乾燥および保存後に本質的にその物理学的及び化学的安定性並びに生理活性を保持するということを意味する。
本明細書における凍結乾燥製剤のための「希釈剤」は、医薬として許容可能であり（ヒトへの投与のために安全かつ無毒性）、そして再構成製剤の調製のために有用であるものである。例示的な希釈剤は、滅菌水、注射用の静菌水（BWFI）、pH緩衝溶液（リン酸緩衝食塩水など）、滅菌食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む。ある実施態様においては、希釈剤は、注射に好適な再構成製剤を提供する。他の実施態様においては、希釈剤が注射に好適な再構成製剤を提供する場合、希釈剤は注射用の水をふくんでよい。
再構成製剤のための「保存剤」は、希釈剤又は再構成製剤に添加されて、再構成製剤中の細菌作用を本質的に低下させることのできる化合物である。ある実施態様においては、多用途の再構成製剤の製造を容易化するために有用な量で保存剤が添加されてよい。潜在的な保存剤の例は、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（その中のアルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドの混合物）及びベンザルコニウムクロライドを含む。他の種類の保存剤は、フェノール、ブチル及びベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアリルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール及びｍ−クレゾールを含む。
凍結乾燥製剤のための「充填剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、（開口した孔構造を保持する、本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易化するなどの）凍結乾燥ケーキの物理学的構造に寄与する化合物である。例示的な充填剤は、マンニトール、グリシン、及びソルビトールを含むがこれらに限定されない。
RAGE融合タンパク質
本発明の実施態様は、RAGE融合タンパク質、かかる融合タンパク質の作製方法、及びかかる融合タンパク質の使用方法を含む。本発明は、さまざまな方法で具体化されることができる。
例えば、本発明の実施態様は、第二の非RAGEポリペプチドに連結したRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を提供する。1つの実施態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含んでよい。ある実施態様においては、該リガンド結合部位は、該RAGE融合タンパク質の最もN-末端のドメインを含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン、又はその部分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGEリガンド結合部位は、配列番号９又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号１０又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む（図１）。
ある実施態様においては、RAGEポリペプチドはイムノグロブリンドメイン又は（その断片などの）イムノグロブリンドメインの部分を含むポリペプチドに連結されることができる。1つの実施態様においては、イムノグロブリンドメインを含むポリペプチドは、少なくとも、ヒトIgGのCH2又はCH3ドメインのうちの少なくとも１つの部分を含む。
ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列、或いはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である配列を含む。例えば、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一である配列は、C末端リジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む。
RAGEタンパク質又はポリペプチドは、（配列番号１などの）完全長ヒトRAGEタンパク質；又はヒトRAGEの断片を含んでよい。本明細書中で使用されるRAGEポリペプチドの断片は、少なくとも５アミノ酸の長さであり、３０アミノ酸超の長さであることができるが、完全なアミノ酸配列よりは短い。本発明の融合タンパク質、組成物及び方法の別の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEに対して少なくとも約７０％、７５％、８０、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列又はその断片を含むことができる。例えば、ある実施態様においては、RAGEポリペプチドは、第一の残基としてメチオニンよりはグリシンを含む、ヒトRAGE又はその断片を含んでよい（Neeper et al., (1992)などを参照のこと）。或いは、ヒトRAGEはシグナル配列が除去された完全長RAGE（配列番号２又は配列番号３）（図１A及び１B）又はそのアミノ酸配列の部分を含んでよい。
本発明のRAGE融合タンパク質は、（配列番号４などの）sRAGE、sRAGEに対して少なくとも９０％同一のポリペプチド、又はsRAGEの断片も含んでよい。本明細書中で使用されるとおり、sRAGEは、膜貫通領域又は細胞質側末端を含まないRAGEタンパク質である（Park et al., Nature Med., 4:1025-1031 (1998)）。例えば、RAGEポリペプチドは、最初の残基としてメチオニンよりもグリシンを有する、ヒトsRAGE又はその断片を含む（例えば、Neeper et al., (1992)を参照のこと）。或いは、RAGEポリペプチドは、（図１中の配列番号５又は配列番号６又は配列番号４５などの）シグナル配列が除去されたヒトsRAGE又はそのアミノ酸配列の部分を含んでよい。
他の実施態様においては、RAGEタンパク質は、（図１中の配列番号７、配列番号８又は配列番号４６などの）RAGE Vドメイン（Neeper et al., (1992)；Schmidt et al., (1997)）を含んでよい。或いは、RAGE Vドメインに対して少なくとも９０％同一な配列又はその断片が使用されてよい。
或いは、RAGEタンパク質は、（図１中の配列番号９、配列番号１０又は配列番号４７などの）RAGE Vドメインの断片を含んでよい。1つの実施態様においては、RAGEタンパク質はリガンド結合部位を含んでよい。ある実施態様においては、リガンド結合部位は配列番号９又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号１０又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。さらに他の実施態様においては、RAGE断片は合成ペプチドである。
他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１（図１）のアミノ酸２３〜５３を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸２４〜５２を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸３１〜５２を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸３１〜１１６を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸１９〜５２を含んでよい。例えば、リガンド結合部位は、RAGE Vドメイン又はRAGEリガンド結合ドメインなどのその部分（配列番号１のアミノ酸１〜１１８、２３〜１１８、２４〜１１８、３１〜１１８、１〜１１６、２３〜１１６、２４〜１１６、３１〜１１６、１〜５４、２３〜５４、２４〜５４、３１〜５４、１〜５３、２３〜５３、２４〜５３、又は３１〜５３、或いはその断片など）を含んでよい。或いは、RAGEリガンドを機能的に結合するポリペプチドの断片が使用されてよい。或いは（上記のような）RAGE Vドメイン又はその断片に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％同一の配列も使用されてよい。さらに、本分野で知られるとおり、（アミノ酸２４〜１１８又は配列番号１を含むポリペプチドについてのQ24などの）配列番号１の残基１〜２３を含むシグナル配列の除去などにより融合タンパク質のN-末端がグルタミンである実施態様においては、グルタミンは環化してピログルタミン酸（pE）を形成しうる。
したがって、本発明のRAGE融合タンパク質中で使用されるRAGEポリペプチドは、完全長RAGEを含んでよい。本分野で知られているとおり、RAGEは、お互いにドメイン間リンカーによって連結されているVドメイン並びにC1及びC2ドメインである、3つのイムノグロブリン様ポリペプチドドメインを含む。完全長RAGEは、C2ドメインに連結されている、C2ドメインの下流の膜貫通ポリペプチド及び細胞質内末端（C末端）も含む。
ある実施態様においては、RAGEポリペプチドはいかなるシグナル配列残基も含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長RAGEの残基１〜２２又は残基１〜２３のいずれかを含んでよい。さらに、本分野で知られている通り、（シグナル配列が残基１〜２３を含むなどの）融合タンパク質のN-末端がグルタミンである実施態様においては、N-末端グルタミン（Q24）は、環化してピログルタミン酸（pＥ）を形成しうる。かかる分子の例示的な構築物は、配列番号４５、４６、４７、４８、４９、５０及び５１（図１）に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びに配列番号５６及び５７（図４）に示すアミノ酸配列を有するRAGE融合タンパク質である。
本分野で認識されるとおり、本発明のRAGE融合タンパク質のCH３領域は、一定の組換え系において発現されるときに翻訳後修飾を介して切断除去されるC-末端アミノ酸を有してよい（例えば、Li, et al., BioProcessing J., 4:23-30 (2005)を参照のこと）。ある実施態様においては、切断除去されるC-末端アミノ酸はリジン（K）である。したがって、別の実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、C-末端リジン（K）を含まない、配列番号３２〜３７、５６及び５７に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでよい。
したがって、様々な実施態様において、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメインに相当する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１１６（配列番号７）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１１６（配列番号８）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、Q24が環化してpＥを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜１１６（配列番号４６）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、RAGEのC1ドメインに相当する、ヒトRAGEのアミノ酸１２４〜２２１（配列番号１１）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。他の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、RAGEのC２ドメインに相当する、ヒトRAGEのアミノ酸２２７〜３１７（配列番号１２）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１２３（配列番号１３）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いはヒトRAGEのアミノ酸２４〜１２３（配列番号１４）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、Q24が環化してpEを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜１２３（配列番号４８）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、V-ドメイン、C1ドメイン及びこれら２つのドメインを連結するドメイン間リンカーに相当する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２２６（配列番号１７）又はそれに対して９０％同一の配列、或いはヒトRAGEのアミノ酸２４〜２２６（配列番号１８）又はそれに対して９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、Q24が環化してpEを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜２２６（配列番号５０）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、sRAGE（すなわち、V、C1及びC2ドメイン及びドメイン間リンカーをコードする）ヒトRAGEのアミノ酸２３〜３３９（配列番号５）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いはヒトRAGEのアミノ酸２４〜３３９（配列番号６）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、Q24が環化してpEを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜３３９（配列番号４５）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、これらの各配列の断片が使用されてよい。これらのポリペプチドのアミノ酸配列については、図１を参照のこと。
RAGE融合タンパク質は、RAGEまたはその断片に由来しないいくつかのタイプのペプチドを含んでもよい。RAGE融合タンパク質の第二のポリペプチドは、イムノグロブリンに由来するポリペプチドを含んでよい。１つの実施態様においては、該イムノグロブリンポリペプチドは、イムノグロブリン重鎖またはその部分（すなわち、断片）を含んでよい。例えば、重鎖断片は、イムノグロブリンのFc断片に由来するポリペプチドを含んでよく、ここで、該Fc断片は、重鎖ヒンジポリペプチド、並びにイムノグロブリン重鎖のCH2及びCH3ドメインをモノマーとして含む。重鎖（又はその部分）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM（μ）、IgD（δ）、IgE（ε）、またはIgA（α）のいずれに由来してもよい。さらに、重鎖（又はその部分）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1（γ1）、IgG2（γ2）、IgG3（γ３）、IgG4（γ4）、IgA1（α1）、IgA2（α2）、または生理活性を変化させるこれらのアイソタイプまたはサブタイプの突然変異体のいずれに由来してもよい。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン或いは、これらのドメインのいずれかまたは両方の部分を含んでよい。例示的な実施例として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号４０（図１）又はその部分を含んでよい。1つの実施態様においては、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチド又はその部分は、配列番号３８又はその断片を含んでよい。該イムノグロブリンペプチドは、配列番号３９又は配列番号４１（図１）の核酸配列によってコードされてよい。配列番号３８又は配列番号４０におけるイムノグロブリン配列も、配列番号５２又は配列番号５３（図１）によってコードされてよく、ここで、該配列のC-末端におけるプロリン（CCGからCCC）及びグリシン（GGTからGGG）をコードするコドンについてのサイレントな塩基の変化は、終止コドン近くの潜在的RNAスプライス部位を除去する（すなわち、配列番号３９のヌクレオチド６２２〜６２７が修飾されて配列番号５２を生成するか、又は配列番号４１のヌクレオチド６５２〜６５７が修飾されて配列番号５３を生成する）。
イムノグロブリン鎖のFc部分のヒンジ領域は、インビボで前炎症性であることができる。したがって１つの実施態様において、本発明のRAGE融合タンパク質は、イムノグロブリンに由来するドメイン間ヒンジポリペプチドよりもむしろRAGEに由来するドメイン間リンカーを含む。
したがって、ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、イムノグロブリンのCH2ドメイン或いはイムノグロブリンのCH2ドメインの断片または部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含んでよい。1つの実施態様においては、CH2ドメインまたはその断片は、配列番号４２（図１）を含む。１つの実施態様においては、配列番号４２の断片は、少なくともFcヒンジ領域の部分を含む最初の１０のアミノ酸が除去された配列番号４２を含む。1つの実施態様においては、RAGEポリペプチドは、リガンド結合部位を含んでよい。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメインまたはその部分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGEリガンド結合部位は、配列番号９またはそれに対して少なくとも９０％同一である配列、配列番号１０またはそれに対して少なくとも９０％同一である配列、或いは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一である配列を含む。
本発明のRAGE融合タンパク質中で使用されるRAGEポリペプチドは、RAGEイムノグロブリンドメインを含んでよい。さらにまたは或いは、RAGEの該断片は、ドメイン間リンカーを含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、ドメイン間リンカーの上流（すなわち、よりN-末端に近い）または下流（すなわち、よりC-末端に近い）に連結されたRAGEイムノグロブリンドメインを含んでよい。さらに他の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、それぞれがドメイン間リンカーでお互いに連結された2つ（またはそれ以上）のRAGEイムノグロブリンドメインを含んでよい。RAGEポリペプチドはさらに、１つ以上のドメイン間リンカーで相互に連結され、かつ、N-末端RAGEイムノグロブリンドメイン及び／またはC-末端イムノグロブリンドメインに結合した末端ドメイン間リンカーを有する、複数のRAGEイムノグロブリンドメインを含んでよい。RAGEイムノグロブリンドメイン及びドメイン間リンカーのさらなる組み合わせは、本発明の範囲内にある。
1つの実施態様において、RAGEポリペプチドは、RAGEイムノグロブリンドメインのC末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN末端アミノ酸に連結されており、かつRAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメイン又はその断片を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されているように、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを含む。イムノグロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、或いはこれらのドメインのどちらかまたは両方の部分を含んでよい。例示的な実施態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその部分を含むポリペプチドは、配列番号４０又はその部分を含む。１つの実施態様において、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８またはその断片を含んでよい。或いは、ヒトIgG1は、末端リジン（K）が除去された、配列番号３８又は配列番号４０を含んでよい。
上記のように、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGE由来の単一のまたは複数のドメインを含んでよい。また、RAGEポリペプチドドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに対応する完全長RAGEタンパク質の断片を含んでよい。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１３６（配列番号１５）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６（配列番号１６）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、Q24が環化してpＥを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６（配列番号４９）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン、これら2つのドメインを連結するドメイン間リンカー、及びC1の下流の第二のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２５１（配列番号１９）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２５１（配列番号２０）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、Q24が環化してpＥを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜２５１（配列番号５１）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。
例えば、1つの実施態様においては、RAGE融合タンパク質はRAGEタンパク質に由来する2つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチドに由来する2つのイムノグロブリンドメインを含んでよい。RAGE融合タンパク質は、第一のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC-末端に連結され、第二のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第二のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そしてRAGE第二ドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第一のRAGEドメイン間リンカーを含んでよい。別の実施態様においては、該４つのドメインのRAGE融合タンパク質は、配列番号３０又は配列番号５４（図２）によってコードされる。1つの実施態様において、4つのドメインのRAGE融合タンパク質は、配列番号３２（図４）を含んでよい。別の実施態様においては、４つのドメインのRAGE融合タンパク質は、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号５６（図４）を含む。
或いは、3つのドメインのRAGE融合タンパク質は、RAGEに由来する1つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチドに由来する2つのイムノグロブリンドメインを含んでよい。例えば、RAGE融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介して、CH2イムノグロブリンドメインまたはCH2イムノグロブリンドメインの部分のN-末端アミノ酸に連結された単一のRAGEイムノグロブリンドメインを含んでよい。別の実施態様においては、３つのドメインのRAGE融合タンパク質は、配列番号３１又は配列番号５５（図３）によってコードされる。1つの実施態様においては、3つのドメインのRAGE融合タンパク質は、配列番号３５（図５）を含んでよい。別の実施態様においては、３つのドメインのRAGE融合タンパク質は配列番号３６、配列番号３７又は配列番号５７（図５）を含んでよい。
RAGEドメイン間リンカー断片は、天然にRAGEイムノグロブリンドメインの下流にあり、そしてしたがってそれに連結されているペプチドの配列を含んでよい。例えば、RAGE Vドメインについては、該ドメイン間リンカーは、天然にVドメインよりも下流にあるアミノ酸配列を含んでよい。ある実施態様においては、リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸１１７〜１２３に対応する配列番号２１を含んでよい。或いは、リンカーは、天然のRAGE配列のさらなる部分を有するペプチドを含んでよい。例えば、配列番号２１の上流及び下流の（１〜３、１〜５、又は１〜１０或いは１〜１５アミノ酸などの）数個のアミノ酸を含むドメイン間リンカーが使用されることができる。したがって、1つの実施態様においては、ドメイン間リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸１１７〜１３６を含む配列番号２３を含む。或いは、例えば、リンカーのいずれかの末端から１、２または３アミノ酸を除去した配列番号２１の断片が使用されることができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号２１または配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるペプチドを含んでよい。
RAGE C1ドメインについては、リンカーは、天然にC1ドメインの下流にあるペプチド配列を含んでよい。ある実施態様においては、リンカーは完全長RAGEのアミノ酸２２２〜２５１に対応する配列番号２２を含んでよい。或いは、リンカーは、天然のRAGE配列のさらなる部分を有するペプチドを含んでよい。例えば、配列番号２２の上流または下流の数個の（１〜３、１〜５、又は１〜１０、又は１〜１５アミノ酸）を含むリンカーが使用されてよい。或いは、例えば、リンカーのいずれかの末端から１〜３、１〜５、または１〜１０、または１〜１５アミノ酸が除去された、配列番号２２の断片が使用されてよい。例えば、1つの実施態様においては、RAGEドメイン間リンカーは、アミノ酸２２２〜２２６に対応する配列番号２４を含んでよい。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号２２又は配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のペプチドを含んでよい。
或いは、ドメイン間リンカーは、RAGEアミノ酸３１８〜３４２に対応する、配列番号４４を含んでよい。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号４４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のペプチドを含んでよい。
さらに、当業者は、コードされた配列中で単一のアミノ酸又は（典型的には約５％未満、より典型的には約１％未満である）小さなパーセンテージのアミノ酸を変更、付加又は除去する、個々の置換、欠失又は付加が、該変更があるアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸に置換することとなる、保存的に改変された変形であることを理解するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する、保存的置換の表は、本分野で周知である。以下の例示的な群は、それぞれ、お互いにとって保存的置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）；
２）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
３）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
４）アルギニン（R）、リジン（K）；
５）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；及び
６）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）
保存的置換は、（天然又は改変された）置換アミノ酸が、置換されるアミノ酸に構造的に関連している、すなわち、置換されるアミノ酸とおよそ同じサイズ及び電子特性を有する、置換である。したがって、置換アミノ酸は、もとのアミノ酸と同じ又は類似した官能基を側鎖中に有する。「保存的置換」は、好適な保護基で側鎖中の官能基が保護される場合を除き、置換されるアミノ酸に同一の置換アミノ酸を利用することも意味する。
本分野で知られている通り、アミノ酸は、酵素的又は非酵素的反応メカニズムのいずれかによってそれらの自然の構造から化学的に修飾されることができる。例えば、１つの実施態様においては、N-末端のグルタミン酸又はグルタミンが、水を失って環化して、ピログルタミン酸（ピロE又はpＥ）を形成することができる（Chelius et al., Anal. Chem, 78:2370-2376(2006)及びBurstein et al., Procl National Acad. Sci., 73:2604-2608(1976)）。或いは、N-末端ピログルタミン酸を有する融合タンパク質は、タンパク質中のその位置に翻訳後プロセシングによりN-末端となるグルタミン酸をコードしている核酸配列を介して潜在的にアクセスされることができる（例えば、配列番号１の残基２４がグルタミンでなくグルタミン酸である）。
RAGE融合タンパク質の製造方法
本発明は、RAGE融合タンパク質の製造方法も含む。したがって、1つの実施態様においては、本発明は、RAGEリガンド結合部位を含むRAGEポリペプチドを第二の非RAGEポリペプチドに共有結合するステップを含む、RAGE融合タンパク質の製造方法を含む。例えば、連結されたRAGEポリペプチド及び第二の非RAGEポリペプチドは組換えDNAによりコードされてよい。該方法はさらに、DNA構築物を発現ベクター中に組み込むステップを含んでよい。また、該方法は、該発現ベクターを宿主細胞に挿入するステップを含んでよい。
例えば、本発明の実施態様は、第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を提供する。1つの実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含んでよい。ある実施態様においては、リガンド結合部位はRAGE融合タンパク質の最もN-末端のドメインを含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメインまたはその部分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGEリガンド結合部位は、配列番号９またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、配列番号１０またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む。
ある実施態様においては、RAGEポリペプチドは、イムノグロブリンドメインまたは（その断片などの）イムノグロブリンドメインの部分に連結されることができる。1つの実施態様においては、イムノグロブリンドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgGのCH2またはCH3ドメインのうちの少なくとも１つの部分を含む。
したがって、本発明の実施態様は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードする単離されたDNA分子を含みうる。ある実施態様においては、該DNA分子は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列、或いはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一の配列は、C-末端リジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を包含する。したがって、ある実施態様においては、本発明は、配列番号５４又は配列番号５５に示す配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を有するDNA分子を含みうる。
RAGE融合タンパク質は、組換えDNA技術によって設計されることができる。例えば、1つの実施態様においては、本発明は、第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むか、それに対して相補的であるか又はそれと顕著に同一性のある単離された核酸配列を含んでよい。ある実施態様においては、RAGEポリペプチドは、RAGEリガンド結合部位を含んでよい。
RAGEタンパク質またはポリペプチドは、（配列番号１などの）完全長ヒトRAGE、またはヒトRAGEの断片を含んでよい。ある実施態様においては、RAGEポリペプチドは、いかなるシグナル配列残基も含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長RAGE（配列番号１）の残基１〜２２または残基１〜２３を含んでよい。別の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、ヒトRAGEに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列またはその断片を含んでよい。例えば、1つの実施態様において、RAGEポリペプチドは、メチオニンよりもグリシンを第一の残基として含む、ヒトRAGEまたはその断片を含んでよい（例えば、Neeper et al., (1992)を参照のこと）。或いは、ヒトRAGEは、シグナル配列が除去された完全長RAGE（配列番号２または配列番号３）（図１A及び１B）またはそのアミノ酸配列の部分を含んでよい。本発明のRAGE融合タンパク質はまた、sRAGE（例えば、配列番号４）、sRAGEに対して少なくとも９０％同一のポリペプチド、またはsRAGEの断片を含んでよい。例えば、RAGEポリペプチドは、ヒトsRAGEまたはその断片であって、メチオニンよりもグリシンを第一の残基として含むものを含んでよい（例えば、Neeper et al., (1992)を参照のこと）。或いは、ヒトRAGEは、シグナル配列が除去されたsRAGE（例えば、図１中の配列番号５、配列番号６又は配列番号４５を参照のこと）またはそのアミノ酸配列の部分を含んでよい。他の実施態様においては、RAGEタンパク質はVドメインを含んでよい（例えば、図１中の配列番号７、配列番号８又は配列番号４６を参照のこと）。或いは、Vドメインまたはその断片に対して少なくとも９０％同一の配列が使用されてよい。或いは、RAGEタンパク質はVドメインの部分を含むRAGEの断片（例えば、図１中の配列番号９、配列番号１０又は配列番号４７を参照のこと）を含んでよい。ある実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号９またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、配列番号１０またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。さらに他の実施態様においては、RAGE断片は合成ペプチドである。
ある実施態様においては、核酸配列は、ヒトRAGEのアミノ酸１〜１１８をコードする配列番号２５またはその断片を含む。例えば、配列番号２５のヌクレオチド１〜３４８を含む配列は、ヒトRAGEのアミノ酸１〜１１６をコードするために使用されることができる。或いは、該核酸は、ヒトRAGEのアミノ酸１〜１２３をコードするために配列番号２６を含むことができる。或いは、該核酸は、ヒトRAGEのアミノ酸１〜１３６をコードするために配列番号２７を含むことができる。或いは、該核酸は、ヒトRAGEのアミノ酸１〜２３０をコードするために配列番号２８を含むことができる。或いは、該核酸は、ヒトRAGEのアミノ酸１〜２５１をコードするために配列番号２９を含むことができる。或いは、これらの核酸配列の断片は、RAGEポリペプチド断片をコードするために使用されることができる。
RAGE融合タンパク質は、RAGEまたはその断片に由来しないいくつかのタイプのペプチドを含んでよい。RAGE融合タンパク質の第二のポリペプチドは、イムノグロブリンに由来するポリペプチドを含んでよい。重鎖（又はその部分）は、知られた重鎖アイソタイプ：IgG（γ）、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)、またはIgA(α)のうちのいずれの１つに由来してもよい。さらに、重鎖（又はその部分）は、知られた重鎖サブタイプ：IgG1(γ１)、IgG2(γ２)、IgG3(γ３)、IgG4(γ４)、IgA1(α１)、IgA2(α２)、或いは生理活性を変更するこれらのアイソタイプまたはサブタイプの突然変異体に由来してもよい。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはこれらのドメインのいずれか若しくは両方の部分を含んでもよい。例示的な実施態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８または配列番号４０を含んでよい。1つの実施態様においては、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８又はその部分を含んでよい。イムノグロブリンペプチドは、配列番号３９または配列番号４１の核酸配列によってコードされることができる。別の実施態様においては、配列番号３８又は配列番号４０におけるイムノグロブリン配列は、配列番号５２又は配列番号５３によってそれぞれコードされてもよい。
イムノグロブリン鎖のFc部分のヒンジ領域はインビボにおいて前炎症性であることができる。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質は、イムノグロブリン由来のドメイン間ヒンジポリペプチドよりも、RAGE由来のドメイン間リンカーを含んでよい。
したがって、1つの実施態様においては、本発明は、RAGEポリペプチドをイムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに共有結合させるステップを含む、RAGE融合タンパク質の製造方法を含む。1つの実施態様において、RAGE融合タンパク質はRAGEリガンド結合部位を含んでよい。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメインまたはその部分を含んでよい。ある実施態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号９またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、配列番号１０またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む。
1つの実施態様においては、RAGE融合タンパク質は組換えDNA構築物によってコードされてよい。該方法は、該DNA構築物を発現ベクターに組み込むステップを含んでよい。該方法はまた、発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることを含んでよい。したがって、本発明の実施態様は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードするDNA分子をコードする発現ベクターも含む。ある実施態様においては、DNA分子は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列或いはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に少なくとも９０％同一の配列は、C-末端リジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む。
本発明のさらに他の実施態様は、本発明のRAGE融合タンパク質をコードするDNA分子をコードする発現ベクターでトランスフェクトされた細胞も含む。ある実施態様においては、該DNA分子は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列、或いはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質をコードする。例えば、いくつかの実施態様においては、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に少なくとも９０％同一の配列は、C-末端リジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む。
例えば、1つの実施態様において、本発明は、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはその断片を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドをコードする核酸を含む。1つの実施態様において、CH2ドメインまたはその断片は、配列番号４２を含む。ある実施態様においては、配列番号４２の断片は、最初の１０アミノ酸が除去された配列番号４２を含む。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含んでよい。例示的な実施態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインを含むポリペプチドは、配列番号３８又は配列番号４０を含んでよい。１つの実施態様においては、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン又はその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８又はその断片を含んでよい。イムノグロブリンペプチドは、配列番号３９または配列番号４１の核酸配列によってコードされることができる。配列番号３８又は配列番号４０に示すイムノグロブリン配列は、配列番号５２又は配列番号５３によってもコードされることができ、ここで、配列のC-末端においてプロリン（CCGからCCC）及びグリシン（GGTからGGG）をコードするコドンについてのサイレントな塩基の変更は、終止コドン近くの潜在的RNAスプライス部位を除去する（すなわち、配列番号３９のヌクレオチド６２２〜６２７が修飾されて配列番号５２を生成するか、又は配列番号４１のヌクレオチド６５２〜６５７が修飾されて配列番号５３を生成する）。
1つの実施態様においては、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメインまたはその断片を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGEポリペプチドは、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを含んでよい。イムノグロブリンのCH2ドメイン又はその断片を含むポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはこれらのドメインのいずれかまたは両方の部分を含むポリペプチドを含んでよい。例示的な実施態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８または配列番号４０を含んでよい。１つの実施態様において、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８またはその断片を含んでよい。ある実施態様においては、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はその部分を含むポリペプチドは、C-末端リジン（K）が除去された、配列番号３８又は配列番号４０を含みうる。
本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEからの単一または複数のドメインを含んでよい。また、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長RAGEタンパク質の断片を含んでよい。例えば、1つの実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、RAGEタンパク質由来の2つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチド由来の2つのイムノグロブリンドメインを含んでよい。第一のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸がRAGEの第二のイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そして、RAGEの第二のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGE融合タンパク質は、第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第一のドメイン間リンカーを含んでよい。例えば、RAGEポリペプチドは、V-ドメイン、C1ドメイン、これら２つのドメインを連結するドメイン間リンカー及びC1の下流の第二のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２５１（配列番号１９）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２５１（配列番号２０）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いはQ24が環化してpＥを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４−２５１（配列番号５１）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。1つの実施態様において、配列番号３０またはその断片を含む核酸構築物は、4つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができる（図２A）。他の実施態様においては、配列番号５４（図２B）を含む核酸構築物は、4つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができ、ここで、配列のC-末端においてプロリン（CCGからCCC）及びグリシン（GGTからGGG）をコードするコドンについてのサイレントな塩基変化（すなわち、配列番号３０のヌクレオチド１３７５〜１３８０が修飾されて配列番号５４を生成する）が、終止コドン近くの潜在的RNAスプライス部位を除去するために導入される。
或いは、3つのドメインのRAGE融合タンパク質は、RAGE由来の1つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチド由来の2つのイムノグロブリンドメインを含んでよい。例えば、RAGE融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介してCH2イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に連結された単一のRAGEイムノグロブリンドメインを含んでよい。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１３６（配列番号１５）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６（配列番号１６）又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いはQ24が環化してpEを形成しているヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい（図１）。1つの実施態様において、配列番号３１またはその断片を含む核酸構築物は、３つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができる（図３A）。他の実施態様においては、配列番号５５を含む核酸構築物は、3つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができ、ここで、配列のC-末端においてプロリン（CCGからCCC）及びグリシン（GGTからGGG）をコードするコドンについてのサイレントな塩基変化（すなわち、配列番号３１のヌクレオチド１０３０〜１０３５が修飾されて配列番号５５を生成する）が、終止コドン近くの潜在的RNAスプライス部位を除去する。
RAGEドメイン間リンカー断片は、天然にRAGEイムノグロブリンドメインの下流にあり、そしてしたがってそれに連結されたペプチド配列を含んでよい。例えば、RAGE Vドメインについては、ドメイン間リンカーは天然にVドメインの下流にあるアミノ酸配列を含んでよい。ある実施態様においては、リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸１１７〜１２３に対応する配列番号２１を含んでよい。或いは、該リンカーは天然のRAGE配列のさらなる部分を有するペプチドを含んでよい。例えば、配列番号２１の上流及び下流にある数個のアミノ酸（例えば、１〜３、１〜５、又は１〜１０又は１〜１５アミノ酸）を含むドメイン間リンカーが使用されることができる。したがって、1つの実施態様においては、ドメイン間リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸１１７〜１３６を含む配列番号２３を含む。或いは、例えば、リンカーのいずれかの末端から１、２、または３個のアミノ酸を除去した配列番号２１の断片が使用されることができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号２１または配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むことができる。
RAGE C1ドメインについては、リンカーは、天然にC1ドメインの下流にあるペプチド配列を含んでよい。ある実施態様においては、リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸２２２〜２５１に対応する、配列番号２２を含んでよい。或いは、リンカーは、天然のRAGE配列のさらなる部分を有するペプチドを含んでよい。例えば、配列番号２２の上流及び下流の数個のアミノ酸（１〜３、１〜５、又は１〜１０、又は１〜１５アミノ酸）を含むリンカーが使用されることができる。或いは、リンカーのいずれかの末端から１〜３、１〜５または１〜１０、または１〜１５のアミノ酸が除去された、配列番号２２の断片が使用されることができる。例えば、１つの実施態様においては、RAGEドメイン間リンカーは、アミノ酸２２２〜２２６に対応する、配列番号２４を含むことができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号２２又は配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むことができる。
或いは、ドメイン間リンカーはRAGEアミノ酸３１８〜３４２に対応する、配列番号４４を含むことができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号４４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むことができる。
該方法はさらに、DNA構築物を発現ベクター中に取り込むステップを含んでよい。したがって、ある実施態様においては、本発明は、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質をコードする発現ベクターを含む。ある実施態様においては、RAGEポリペプチドは、本明細書中に記載されたもののような、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメインを含むポリペプチドまたはその部分のN-末端に直接連結されるように、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを有する構築物を含む。例えば、細胞をトランスフェクトするために使用される発現ベクターは、配列番号３０またはその断片、配列番号５４又はその断片、配列番号３１又はその断片、或いは配列番号５５またはその断片の核酸配列を含んでよい。
該方法はさらに、本発明の発現ベクターで細胞をトランスフェクトするステップを含んでよい。したがって、ある実施態様においては、本発明は、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を細胞が発現するように、本発明のRAGE融合タンパク質を発現する発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を含む。ある実施態様において、RAGEポリペプチドは、本明細書中に記載されたもののような、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメインまたはその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを有する構築物を含む。例えば、発現ベクターは、配列番号３０またはその断片、配列番号５４又はその断片、配列番号３１またはその断片、或いは配列番号５５又はその断片の核酸配列を含んでよい。
例えば、RAGE-IgG融合タンパク質を発現するために、ヒトRAGEの異なる長さの５’cDNA配列とヒトIgG1 Fc(γ１)の３’cDNA配列を融合させることによって、プラスミドが構築されることができる。発現カセット配列は、標準的な組換え技術を用いて、pcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen, CA）などの発現ベクター中に挿入されることができる。
また、該方法は、発現ベクターを宿主細胞中にトランスフェクトすることを含んでよい。RAGE融合タンパク質は、その中でレトロウイルス又はアデノウイルスなどのウイルスを用いて発現構築物が哺乳動物細胞中に導入される系を含む、哺乳動物発現系において発現されてよい。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は本分野で知られており、そしてAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。これらは、中でも、チャイニーズハムスター卵母（CHO）細胞、NS0、SP2細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（Hep C2など）、A549細胞及び多くの他の細胞系を含む。細胞系は、どの細胞系がRAGE融合タンパク質発現レベルが高いかを決定することによって選択されることができる。使用されることのできる他の細胞系は、Sf9細胞などの昆虫細胞系である。植物宿主細胞は、ニコチアナ（Nicotiana）、アラビドプシス（Arabidopsis）、ウキクサ（duckweed）、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどを含む。細菌宿主細胞は、E.コリ及びストレプトミセス種を含む。酵母宿主細胞は、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス、セレビシアエ及びピキア・パストリスを含む。RAGE融合タンパク質遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入された場合、RAGE融合タンパク質は、宿主細胞中でのRAGE融合タンパク質の発現又は宿主細胞が培養される培地中へのRAGE融合タンパク質の分泌を可能とするのに十分な時間、宿主細胞を培養することによって産生される。RAGE融合タンパク質は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収されることができる。
RAGE融合タンパク質をコードする核酸分子及びこれらの核酸分子を含む発現ベクターは、好適な哺乳動物、植物、細菌又は酵母宿主細胞のトランスフェクションのために使用されることができる。形質転換は、宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入のための任意の知られた方法によってよい。哺乳動物細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入方法は、本分野で周知であり、そしてデキストランを介するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレンを介するトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポーレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの封入、及び核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。さらに、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞中へ導入されることができる。植物細胞の形質転換法は、本分野で周知であり、アグロバクテリウムを介する形質転換、遺伝子銃による形質転換、直接注入、エレクトロポーレーション、及びウイルスによる形質転換などを含む。細菌及び酵母細胞を形質転換する方法も本分野で周知である。
発現ベクターは、DNA遺伝子銃を用いて発現系に送達されることもでき、ここで、プラスミドは、好ましくは金である顕微鏡的粒子上に沈殿され、該粒子は標的細胞又は発現系中に推進される。DNA遺伝子銃の技術は、本分野で周知であり、「遺伝子銃」などの装置は、細胞中（例えば、Helios Gene Gun, Bio-Rad Labs., Hercules, CA）又は皮膚中（PMED Device, PowderMed Ltd., Oxford, UK）へのマイクロ粒子の送達のために商業的に入手可能である。
産生細胞系からのRAGE融合タンパク質の発現は、多数の知られた技術を用いて促進されることができる。例えば、グルタミンシンセターゼ遺伝子発現系（GS系）及びプラズマコード化ネオマイシン耐性系は、一定の条件下で発現を促進するための一般的なアプローチである。
異なる細胞系により発現されたRAGE融合タンパク質は、お互いに異なるグリコシル化パターンを有しうる。しかしながら、本明細書において提供される核酸分子によってコードされるすべてのRAGE融合タンパク質又は本明細書中に提供されるアミノ酸配列を含むすべてのRAGE融合タンパク質は、RAGE融合タンパク質のグリコシル化に関わらず、本発明の一部である。
1つの実施態様においては、発現ベクター組換え体は、チャイニーズハムスター卵母（CHO）細胞中にトランスフェクトされ、そして発現最適化されることができる。別の実施態様においては、細胞は０．１〜２０グラム／リッター、または０．５〜１０グラム／リッター、または約１〜２グラム／リッターを産生することができる。
本分野で知られているように、かかる核酸構築物は、例えば、着目の突然変異を含むプライマーで核酸テンプレートをPCR増幅することによって、突然変異によって修飾されることができる。こうして、RAGEリガンドに対する多様な親和性を含むポリペプチドが設計されることができる。１つの実施態様においては、突然変異配列は、出発DNAに対して９０％以上の同一であることができる。したがって、変異体は、ストリンジェントな条件下（すなわち、1モルの塩中、DNA二量体の融解温度（TM）よりも約２０〜２７℃低いことに等価である）でハイブリダイズする核酸配列を含むことができる。
コード配列は、発現ベクターを適切な宿主中にトランスフェクトすることによって発現されることができる。例えば、組換えベクターは、チャイニーズハムスター卵母（CHO）細胞中に安定にトランスフェクトされることができ、RAGE融合タンパク質を発現する細胞が選択されそしてクローン化される。ある実施態様においては、組換え構築体を発現する細胞は、抗生物質G418を適用することによって、プラスミドにコードされたネオマイシン耐性について選択される。個々のクローンが選択され、そして、細胞上清のウエスタンブロット分析によって検出された高レベルの組換えタンパク質を発現するクローンが増殖され、そしてProtein Aカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって遺伝子産物が精製されることができる。
本発明のRAGE融合タンパク質をコードする組換え核酸の見本としての実施例を図２及び３に示す。例えば、上記のように、組換えDNA構築物によって産生されたRAGE融合タンパク質は、第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドを含んでよい。RAGE融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する２つのドメイン及びイムノグロブリンに由来する２つのドメインを含むことができる。RAGE融合タンパク質TTP-4000（TT4）をコードする、このタイプの構造を有する例示的な核酸構築物を図２（配列番号３０及び配列番号５４）に示す。配列番号３０及び配列番号５４に示すように、（太字で強調された）コード配列１〜７５３は、RAGE N-末端タンパク質配列をコードするが、７５４〜１３８６の配列はヒンジを含まないIgG Fcタンパク質配列をコードする。
配列番号３０もしくは配列番号５４またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列に由来する場合、RAGE融合タンパク質は配列番号３２の4つのドメインのアミノ酸配列またはシグナル配列が除去された該ポリペプチド（例えば、図４中の配列番号３３、配列番号３４又は配列番号５６を参照のこと）を含むことができる。配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号５６においては、RAGEアミノ酸配列は太字で強調されている。イムノグロブリン配列は、ヒンジ領域を含まないIgGのCH2及びCH3イムノグロブリンドメインである。
図６は、RAGE及びIgG中に見出されるポリペプチドドメイン（図６A）並びにRAGE融合タンパク質TTP-3000及びTTP-4000のドメイン構造の比較を示す。図６Bに示すように、完全長TTP-4000RAGE融合タンパク質の最初の２５１アミノ酸は、RAGEポリペプチド配列として、アミノ酸１〜２２／２３を含むシグナル配列、アミノ酸２３／２４〜１１６を含む（リガンド結合部位を含む）Vイムノグロブリンドメイン、アミノ酸１１７〜１２３を含むドメイン間リンカー、アミノ酸１２４−２２１を含む第二のイムノグロブリンドメイン（C1）、及びアミノ酸２２２〜２５１を含む下流のドメイン間リンカーを含む。
ある実施態様において、RAGE融合タンパク質は第二のRAGEイムノグロブリンドメインを必ずしも含まなくてよい。例えば、RAGE融合タンパク質はRAGE由来の１つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチド由来の２つのイムノグロブリンドメインを含んでよい。このタイプのRAGE融合タンパク質をコードする核酸構築物の例を図３（配列番号３１及び配列番号５５）に示す。配列番号３１及び配列番号５５に示すように、（太字で強調された）ヌクレオチド１〜４０８のコード配列はRAGE N-末端タンパク質配列をコードするが、４０９〜１０４１の配列はIgG1 Fc（γ１）タンパク質配列をコードする。
配列番号３１もしくは配列番号５５又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列に由来する場合、RAGE融合タンパク質は配列番号３５の３つのドメインのアミノ酸配列または（図５中の配列番号３６、配列番号３７又は配列番号５７などの）シグナル配列が除去されたポリペプチドを含むことができる。図５中の配列番号３６、配列番号３７又は配列番号５７においては、RAGEアミノ酸配列は太字で強調されている。図６Bに示すように、完全長TTP-3000RAGE融合タンパク質の最初の１３６アミノ酸は、アミノ酸１〜２２／２３を含むシグナル配列、アミノ酸２３／２４〜１１６を含む（リガンド結合部位を含む）Vイムノグロブリンドメイン、及びアミノ酸１１７〜１３６を含むドメイン間リンカーをRAGEポリペプチドとして含む。１３７〜３４６の配列は、ヒンジ領域を含まないIgGのCH2及びCH3イムノグロブリンドメインを含む。
本発明のRAGE融合タンパク質は、第二のポリペプチドを含まないRAGEポリペプチドよりも改善されたインビボ安定性を含むことができる。RAGE融合タンパク質は、さらに修飾されて安定性、有効性、力価及びバイオアベイラビリティーが改善されることができる。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質は、翻訳後プロセシングまたは化学的修飾によって修飾されてよい。例えば、RAGE融合タンパク質は、L-、D-、または非天然のアミノ酸、α−二置換アミノ酸、またはN-アルキルアミノ酸を含むために合成により調製されてよい。さらに、タンパク質はアセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、ホスファチジルイノシトールなどの脂質の結合、ジスルフィド結合の形成などによって修飾されることができる。RAGE融合タンパク質の生物学的安定性を増加させるために、さらにポリエチレングリコールが付加されてもよい。
RAGEアンタゴニストのRAGE融合タンパク質への結合
本発明のRAGE融合タンパク質は、多数の適用がある。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEアゴニスト、アンタゴニストまたは調節剤などのRAGEリガンドを同定するための結合アッセイに使用されることができる。
例えば、1つの実施態様においては、本発明は以下の：（ａ）第二の非ＲＡＧＥポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を提供し、ここで、該ＲＡＧＥポリペプチドはリガンド結合部位を含み；（ｂ）着目の化合物とRAGEに対する既知の結合親和性を有するリガンドを上記RAGE融合タンパク質と混合し；そして（ｃ）着目の化合物の存在下における、上記知られたRAGEリガンドのRAGE融合タンパク質への結合を測定する、を含むRAGE調節剤の検出方法を提供する。ある実施態様においては、リガンド結合部位は、RAGE融合タンパク質の最もN-末端のドメインを含む。
RAGE融合タンパク質は、RAGE調節剤の検出のためのキットも提供することができる。例えば、1つの実施態様においては、本発明のキットは、以下の：（ａ）陽性対照としての、RAGEに対する知られた結合親和性を有する化合物；（ｂ）第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質、ここで、該RAGEポリペプチドはRAGEリガンド結合部位を含み；そして（ｃ）使用のための指示書、を含むことができる。ある実施態様においては、該リガンド結合部位は、RAGE融合タンパク質の最もN-末端のドメインを含む。
例えば、RAGE融合タンパク質は、潜在的なRAGEリガンドを同定するための結合アッセイにおいて使用されることができる。かかる結合アッセイの1つの例示的な実施態様においては、知られたRAGEリガンドは、１ウエルあたり約５マイクログラムの濃度で（Maxisorbプレートなどの）固体基材上にコーティングされることができ、ここで、各ウエルは約１００マイクロリッター（μL）の総体積を含む。リガンドを基材に吸着又は結合させるために、プレートは４℃で一夜インキュベートされる。或いは、（室温などの）より高温においてより短いインキュベーション時間が使用されてよい。リガンドの基材への吸着を可能とする時間の後、アッセイウエルは吸引され、そして（５０mMイミダゾール緩衝液、pH７．２中、１％BSAなどの）ブロッキング緩衝液が、非特異的結合をブロックするために添加されてよい。例えば、ブロッキング緩衝液は、室温で１時間プレートに加えられることができる。そして、プレートは吸引され、及び／または洗浄緩衝液で洗浄されてよい。1つの実施態様において、２０mMイミダゾール、１５０mM NaCl、０．０５％Tween-20、５mM CaCl2及び５mM MgCl2を含むpH７．２の緩衝液が洗浄緩衝液として使用されてよい。そして、RAGE融合タンパク質は希釈率を増加させながら、アッセイウエルに添加されることができる。そして、RAGE融合タンパク質は、結合が平衡に達することができるように、アッセイウエル中の固定化リガンドとともにインキュベートされる。1つの実施態様において、RAGE融合タンパク質は、固定化リガンドとともに約１時間、３７℃でインキュベートされる。別の実施態様において、より低い温度でのより長いインキュベーション時間が使用されることができる。RAGE融合タンパク質と固定化リガンドがインキュベートされた後、いかなるRAGE未結合融合タンパク質も除去するために、プレートは洗浄されてよい。固定化リガンドに結合したRAGE融合タンパク質は様々な方法で検出されることができる。1つの実施態様においては、検出はELISAを採用する。したがって、1つの実施態様においては、抗ヒトIgG1マウスモノクローナル抗体、ビオチン化抗マウスIgGヤギ抗体、及びアビジン結合アルカリホスファターゼを含む免疫検出複合体がアッセイウエル中に固定化されたRAGE融合タンパク質に添加されることができる。免疫検出複合体は、RAGE融合タンパク質と免疫検出複合体間の結合が平衡に達するように、固定化RAGE融合タンパク質に結合させられる。例えば、該複合体は、RAGE融合タンパク質に室温で１時間結合させられる。その時点で、いかなる未結合複合体もアッセイウエルを洗浄緩衝液で洗浄することによって除去されることができる。結合複合体は、アルカリホスファターゼの基質、パラ−ニトロフェニルホスフェート（PNPP）を加え、そしてPNPPのパラ−ニトロフェノール（PNP）への変換を４０５nmの吸収の増加として測定することによって、検出されることができる。
ある実施態様において、RAGEリガンドは、ナノモル（nM）またはマイクロモル（μM）の親和性をもってRAGE融合タンパク質に結合する。RAGEリガンドの本発明のRAGE融合タンパク質への結合を例解する実験を図７に示す。初期濃度がそれぞれ１．０８２mg/mL及び３７０μg/mLである、TTP-3000（TT3）及びTTP-4000（TT4）溶液を調製した。図７に示すように、様々な希釈率においてRAGE融合タンパク質TTP-3000及びTTP-4000は固定化されたRAGEリガンドAmyloid-beta（Abeta）（BiosourceからのAmyloid Beta (1-40)）、S100b（S100）、及びアンフォテリン（Ampho）に結合することができ、吸収が増加する。（BSAのみによるコーティングなどの）リガンドの非存在下では、吸収は増加しない。
本発明の結合アッセイは、RAGEへのリガンドの結合を定量するために使用可能である。別の実施態様において、RAGEリガンドは、本発明のRAGE融合タンパク質に、０．１〜１０００ナノモル（nM）、または１〜５００nM、または１０〜８０nMの範囲の結合親和性をもって結合することができる。
本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEに結合する能力を有する化合物を同定するために使用されることもできる。図８及び９にそれぞれしめすとおり、RAGEリガンドは、TTP-3000（TT3）またはTTP-4000（TT4）RAGE融合タンパク質への結合に関して固定化されたアミロイドベータと競合するその能力についてアッセイされることができる。したがって、１０μMの最終アッセイ濃度（FAC）のRAGEリガンドは、アミロイド−ベータへのRAGE融合タンパク質の結合を、最初のTTP-4000溶液（図８）またはTTP-3000（図９）の１：３、１：１０、１：３０及び１：１００の濃度において置換することができることがわかる。
細胞エフェクターの調節
本発明のRAGE融合タンパク質の実施態様は、RAGEによって仲介される生物学的応答を調節するために使用されることができる。例えば、RAGE融合タンパク質は、RAGE誘発性の遺伝子発現の増加を調節するために設計されることができる。したがって、ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は生物学的酵素の機能を調節するために使用されることができる。例えば、RAGE及びそのリガンドとの相互作用は、酸化的ストレス及びNF-κBの活性化を生じさせ、そしてNF-κβはIL-1β、TNF-αなどのサイトカインの遺伝子を制御する。さらに、p21ras、MAPキナーゼ、ERK1、及びERK2を含むいくつかの他の制御経路が、AGE及び他のリガンドのRAGEへの結合によって活性化されることが示されている。
細胞エフェクターTNF-αの発現を調節するための本発明のRAGE融合タンパク質の使用を図１０に示す。THP-1骨髄細胞は、１０％FBSを補充したRPMI-1640培地中で培養されることができ、S100bによるRAGEの刺激を介してTNF-αを分泌するように誘導される。かかる刺激がRAGE融合タンパク質の存在下で起こる場合、RAGEへのS100bの結合によるTNF-αの誘導は阻害されることができる。したがって、図１０に示すように、１０μgのTTP-3000（TT3）またはTTP-4000（TT4）RAGE融合タンパク質の添加は、S100bによるTNF-αの誘導を約５０％〜７５％減少させる。RAGE融合タンパク質TTP-4000は、TNF-αのS100bによる誘導をブロックすることにおいて、少なくともsRAGEと同様に有効である（図１０）。TTP-4000及びTTP-3000のRAGE配列についての阻害特異性は、IgGのみがS100b刺激細胞に添加された実験によって示される。IgGとS100bのアッセイへの添加は、S100b単独と同じTNF-αレベルを示す。
他の細胞ベースのアッセイにおいては、RAGEリガンドHMGB1がRAGE及び他のHMGB1受容体と相互作用することを妨害するTTP-4000の能力が評価された。RAGEに結合してRAGEリガンドとRAGEとの相互作用を妨害する、RAGE抗体とは異なり、TTP-4000は、RAGEリガンドに結合することによってRAGEリガンドとRAGEの相互作用をブロックしうる。HMGB1は、RAGEのリガンド及びトル様受容体２及び４のためのリガンドとして報告されてきた（Park et al., J Biol Chem., 2004, 279(9):7370-7）。これらの３つの受容体すべては（RAGE、トル様受容体２及びトル様受容体４）、THP-1細胞上で発現される（Parker et al., J Immunol., 2004,172(8):4977-86）。
この実験においては、TTP-4000又は抗RAGE抗体いずれかの存在下又は非存在下でHMGB1（５０mg/ml）によってTHP-1細胞が刺激されて、TNF-αを産生した。このアッセイにおいて使用した条件下では、HMGB1のみがTNF-αの誘導物質であるべきである。図１１の結果は、抗RAGE抗体及びRAGE融合タンパク質TTP-4000がTHP-1細胞上に発現されたRAGEとの相互作用からHMGB1をブロックし、そしてTTP-4000がHMGB1誘導性のTNF-α産生を、抗RAGE抗体よりもより大きく阻害することを実証する。したがって、データは、TTP-4000が、HMGB1がTHP-1細胞上に存在するトル様受容体２及び4並びにRAGEと相互作用することを阻害することによって、抗RAGE抗体よりもより大きくHMGB1活性を阻害しうることを示唆している。
RAGE融合タンパク質の生理学的特性
sRAGEがRAGE-介在性疾患の調節において治療的利益を有することができる一方、ヒトsRAGEは血漿中のsRAGEの比較的短い半減期に基づく独立型の治療剤としての限界を有するかもしれない。例えば、sRAGE免疫反応性の保持によって評価される場合、げっ歯類のsRAGEが正常及び糖尿病ラットで約２０時間である一方、ヒトsRAGEは２時間未満の半減期を有する（Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)）。
sRAGEに類似の結合特性を有するが、より安定な薬物動態プロフィールを有するRAGE治療剤を作るために、１つ以上のヒトイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEリガンド結合部位を含むRAGE融合タンパク質が使用されることができる。本分野で知られている通り、イムノグロブリンドメインはイムノグロブリン重鎖のFc部分を含んでよい。
イムノグロブリンFc部分は、RAGE融合タンパク質にいくつかの寄与をすることができる。例えば、Fc融合タンパク質は、かかる融合タンパク質の血清半減期をしばしば数時間から数日まで増加させることができる。薬物動態における安定性は一般に、Fc断片のCH2及びCH3領域間のリンカーとFcRn受容体との相互作用の結果である（Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318(2000)）。
イムノグロブリンFcポリペプチドを含む融合タンパク質が増加した安定性という利益を与えることができるにもかかわらず、イムノグロブリン融合タンパク質は、宿主中に導入された場合、炎症反応を引き出すことができる。炎症反応は、その大部分が、融合タンパク質のイムノグロブリンのFc部分によることができる。前炎症性反応は、標的が（がん細胞、自己免疫疾患を引き起こすリンパ球集団などの）除去される必要のある病気の細胞種上に発現される場合、望ましい機能であるかもしれない。ほとんどの可溶性タンパク質がイムノグロブリンを活性化しないため、標的が可溶性タンパク質である場合、前炎症性反応は中立的な機能であることができる。しかしながら、その破壊が厄介な副作用に導くタイプの細胞上に標的が発現された場合、前炎症性反応はネガティブな機能であるかもしれない。また、炎症カスケードが融合タンパク質が組織標的に結合する部位において構築された場合にも、前炎症性反応はネガティブな機能であることができる。なぜなら、炎症の多くのメディエーターが周囲の組織に対して有害であり、及び／または全身的な影響を及ぼすことができるからである。
イムノグロブリンFc断片上の主要な前炎症性部位は、CH1及びCH2の間のヒンジ領域上にある。このヒンジ領域は、多様な白血球上のFcR1-3と相互作用し、これらの細胞が標的を攻撃する引き金となる（Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318 (2000)）。
RAGE介在性疾患のための治療剤として、RAGE融合タンパク質は前炎症性反応が起こることを必要としない。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質の実施態様は、イムノグロブリンドメインに連結されたRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を含むことができ、ここで、イムノグロブリン由来のFcヒンジ領域が除去されてRAGEポリペプチドで置換される。こうして、炎症細胞上でのRAGE融合タンパク質とFc受容体の間の相互作用が最小化されることができる。しかしながら、RAGE融合タンパク質の様々なイムノグロブリンドメイン間の適切なスタッキング及び他の３次元構造の相互作用を維持することは重要であるだろう。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質の実施態様は、生物学的に不活性であるが、構造的に類似した、RAGEのV及びC1ドメインを分離するRAGEドメイン間リンカー、またはRAGEのC1及びC2ドメインを分離するリンカーをイムノグロブリン重鎖の正常なヒンジ領域の代わりに置換することができる。したがって、RAGE融合タンパク質のRAGEポリペプチドは、天然にはRAGEイムノグロブリンドメインの下流に見出されてRAGEイムノグロブリンドメイン／リンカー断片を形成する、ドメイン間リンカー配列を含むことができる。こうして、RAGEまたはイムノグロブリンのいずれかの寄与による、イムノグロブリンドメイン間の３次元相互作用が維持されることができる。
ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、sRAGEに比べて実質的に増加した薬物動態の安定性を含むことができる。例えば、図１２は、RAGE融合タンパク質TTP-4000がそのリガンドを飽和したら、その半減期は３００時間を超えることができることを示す。これは、ヒト血漿中でわずか数時間であるsRAGEの半減期とは対照的である。
したがって、ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、許容できない量の炎症を生じさせずにRAGE介在性疾患を治療するための手段として、生理学的リガンドのRAGEへの結合をアンタゴナイズするために使用されることができる。本発明のRAGE融合タンパク質は、IgGに比べて、実質的に減少した前炎症性反応を生じることを示す。例えば、図１３に示すように、RAGE融合タンパク質TTP-4000は、ヒトIgG刺激によるTNF-α放出が検出される条件下ではTNF-αの細胞からの放出を刺激しない。
RAGE融合タンパク質による病気の治療
本発明は、ヒト対象におけるRAGE介在性疾患の治療方法も含む。ある実施態様においては、該方法は、第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEリガンド結合部位を含むRAGEポリペプチドを含むRAGE融合タンパク質を対象に投与することを含むことができる。
ある実施態様においては、RAGE製剤は凍結乾燥されたRAGE融合タンパク質を含む。ある実施態様においては、本発明は、対象におけるRAGE介在性疾患の治療方法であって、RAGE融合タンパク質、凍結乾燥保護剤及び緩衝液を含む、再構成製剤の治療的有効量を対象に投与することを含むものを含んでよい。
本明細書に記載のRAGE融合タンパク質のいかなる実施態様も、本発明の治療用組成物及び製剤中で、病気の治療のために使用されてよい。したがって、RAGE融合タンパク質は、イムノグロブリンポリペプチドに連結されたRAGEリガンド結合部位由来の配列を含んでよい。RAGE融合タンパク質の実施態様は、イムノグロブリンのCH2ドメイン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含んでよい。ある実施態様においては、RAGEポリペプチドは、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN-末端に連結され、そしてRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメイン又はその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGEイムノグロブリンドメインに直接連結されたRAGEドメイン間リンカーを含んでよい。例えば、融合タンパク質のある実施態様は、第一のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第二のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そして第二のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2イムノグロブリンドメイン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分に直接連結されるように、第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第一のRAGEドメイン間リンカーを含んでよい。
この多領域融合タンパク質の他の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、配列番号１０に示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７に示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含んでよい。他の実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６若しくは５７のうちの少なくとも１つに示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含んでよい。例えば、ある実施態様においては、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７又は５７に対して少なくとも９０％同一の配列は、C末端リジンを含まない配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７のポリペプチドを含む。或いは、本明細書に記載の他の実施態様は、本発明の製剤中で使用されるRAGE融合タンパク質を構成する。
凍結乾燥RAGE融合タンパク質においては、様々な凍結乾燥保護剤が使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。例えば、非還元糖は、シュークロース、マンニトール、又はトレハロースを含んでよい。様々な緩衝剤も、凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンを含みうる。
凍結乾燥RAGE融合タンパク質は、追加の成分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤は、界面活性剤、キレート剤又は充填剤のうちの少なくとも１つをさらに含んでよい。ある実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、４０〜１００mg/mlの配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７又は５７に示す配列を含むRAGE融合たんぱく質；約２mM〜約５０mMのヒスチジン；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTweem80；及び約６．０〜６．５のpHを含む。例えば、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、ある実施態様において、４０〜５０mg/mlの配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７又は５７に示す配列を含むRAGE融合たんぱく質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTweem80；及び約６．０のpHを含む。或いは、RAGE融合タンパク質の他の濃度が、必要に応じて、RAGE介在性疾患の治療のための製剤中で使用されてよい。
RAGE融合タンパク質製剤は、クリニックで使用されるために又は処方薬として製剤される安定な治療剤を含んでよい。例えば、ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤は、４０℃で１週間の後に１０％未満、又は５％未満、又は３％未満の分解を示すことができる。
また、RAGE融合タンパク質製剤は、希釈剤中での再構成後にも安定であることができる。ある実施態様においては、約１０％、約５％、又は約４％又は約３％、又は約２％、又は約１％未満のRAGE融合タンパク質が、RAGE融合タンパク質製剤中に凝集体として存在する。
再構成RAGE融合タンパク質製剤は多様な経路による、そして着目のRAGE介在性疾患の治療に必要とされる投与に適したものであることができる。本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、腹腔内（IP）注射を採用することができる。或いは、RAGE融合タンパク質は、経口で、鼻腔内に、またはエアロゾルとして投与されることができる。他の実施態様においては、投与は静脈内（IV）である。RAGE融合タンパク質はまた、皮下に注射されることもできる。他の実施態様においては、RAGE融合タンパク質の投与は動脈内である。他の実施態様においては、投与は舌下である。また、投与は徐放性カプセルを採用することもできる。さらなる実施態様においては、投与は、坐剤などによるような経直腸的であることができる。例えば、自己投与が望ましい場合、皮下投与は慢性の障害を治療するために有用であることができる。
本明細書中でより詳細に記載されるとおり、RAGEは様々な病気の状態の病因に関係があるとされており、本発明のRAGE融合タンパク質は、かかる病気の状態を緩和することにおいて有効であることがわかった。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、様々なRAGE介在性疾患を治療するために使用されることができる。
ある実施態様においては、本発明の再構成RAGE融合タンパク質製剤は、糖尿病の症状又は糖尿病の後期合併症を治療するために使用されることができる。例えば、糖尿病又は糖尿病の後期合併症は、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性の脚の潰瘍、循環器合併症、又は糖尿病性ニューロパチーのうちの少なくとも１つを含む。
他の実施態様においては、本発明の再構成RAGE融合タンパク質製剤は、アミロイドーシス、アルツハイマー病、癌、腎障害、又は自己免疫に関連する炎症、炎症性腸疾患、リューマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、低酸素症、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、器官移植、又は創傷治癒の障害のうちの少なくとも１つを治療するために使用されることができる。
或いは、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、骨粗鬆症を治療するために使用されることができる。例えば、ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質製剤の投与は、対象の骨密度を増加させるか又は対象の骨密度の減少速度を低下させる。
いくつかの実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質製剤を用いて治療される自己免疫は、皮膚細胞、膵臓細胞、神経細胞、筋肉細胞、内皮細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、心臓、骨髄細胞、骨、血液細胞、動脈細胞、静脈細胞、軟骨細胞、甲状腺細胞又は幹細胞のうちの少なくとも１つの拒絶を含みうる。或いは、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、腎障害を治療するために使用されることができる。
ある実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、少なくとも１つの器官、組織又は複数の細胞の第１の部位から第２の部位への移植に伴う炎症及び／又は拒絶を治療するために使用されることができる。第１及び第２の部位は、異なる対象中であっても又は同じ対象中にあってもよい。様々な異なる細胞タイプの移植は、本発明のRAGE融合タンパク質製剤を用いることによって改善されうる。例えば、移植された細胞、組織又は器官は、膵臓、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、骨髄、血液、骨、筋肉、動脈、静脈、軟骨、甲状腺、神経系又は幹細胞の細胞、組織又は器官を含むことができる。
本発明のRAGE融合タンパク質をかかる病気及び障害の治療において使用する例が、本明細書中に開示される。
例えば、RAGEを調節する化合物の治療剤としての用途を立証するために、様々な動物モデルが使用されてきた。これらのモデルの例は以下のようなものである：
ａ）糖尿病及び正常ラットの両方における動脈損傷後の再狭窄のラットモデルにおいて、RAGEを介して内皮、平滑筋及びマクロファージの活性化を阻害することによって、sRAGEは新生内膜の形成を阻害し（Zhou et al., Circulation 107:2238-2243 (2003)）；
ｂ）sRAGEまたは抗RAGE抗体を用いる、RAGE／リガンド相互作用の阻害は、全身性のアミロイドーシスのマウスモデルにおいてアミロイドプラーク形成を減少させた（Yan et al., Nat. Med., 6:643-651(2000)）。アミロイドプラークの減少に付随して、炎症性サイトカイン、インターロイキン−６（IL-6）及びマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）が減少し、並びに治療された動物におけるNF-κBの活性化が減少し；
ｃ）（RAGEを過剰発現し、かつRAGEをドミナントネガティブに発現する）RAGEトランスジェニックマウスは、ADのマウスモデルにおいてプラーク形成及び認知障害を示し（Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105 (2004)）；
ｄ）sRAGEによる糖尿病ラットの治療は、血管透過性を減少させ（Bonnardel-Phu et al., Diabetes, 48: 2052-2058 (1999)）；
ｅ）sRAGEによる治療は、糖尿病性アポリポタンパク質E-ヌルマウスにおける動脈硬化病変を減少させ、そしてdb/dbマウスにおける糖尿病性腎症の機能的及び形態学的指数を減少させ（Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)）；そして
ｆ）sRAGEはコラーゲン誘発性の関節炎のマウスモデル（Hofmann et al., Genes Immunol., 3:123-135 (2002)）、実験的アレルギー性脳脊髄炎のマウスモデル（Yan et al., Nat. Med. 9:28-293 (2003)）、及び炎症性腸疾患のマウスモデル（Hofmann et al., Cell. 97:889-901 (1999)）において、炎症の重篤度を軽減した。
したがって、ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEにより仲介される糖尿病及び／または糖尿病の結果としての合併症を治療するために使用されることができる。別の実施態様においては、糖尿病または糖尿病の後期合併症の症状は、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性の脚の潰瘍、糖尿病の循環器合併症または糖尿病性ニューロパチーを含むことができる。
その発現が糖尿病の病理に関連する分子の受容体としてもともと同定されたRAGE自体は糖尿病の合併症の病理生理学に必須である。インビボにおいて、RAGEとそのリガンドとの相互作用の阻害は、糖尿病の合併症及び炎症の複数のモデルにおいて治療的であることが示された（Hudson et al., Arch Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)）。例えば、抗RAGE抗体による２ヶ月の治療は、糖尿病マウスにおいて腎臓機能を正常化し、異常な腎臓の病理組織診断を減少させた（Flyvbjerg et al, Diabetes 53:166-172 (2004)）。さらに、RAGEリガンドに結合し、RAGE／リガンド相互作用を阻害する可溶性形態のRAGE（sRAGE）による治療は、糖尿病性アポリポタンパク質E-ヌルマウスにおける動脈硬化病変を減少させ、そしてdb/dbマウスにおける糖尿病性腎症の機能的及び形態学的病理を軽減した（Bucciarelli et al., Circulation 106: 2827-2835 (2002)）。
また、高血糖症及び全身的または局所的な酸化物ストレスに関連する他の状態の存在下、究極的に糖化最終産物（AGE）を形成する、巨大分子の非酵素的な糖酸化が、腎障害における炎症部位で亢進されることが示された（Dyer et al., J. Clin. Invest., 91:2463-2469 (1993)；Reddy et al., Biochem., 34:10872-10878 (1995)；Dyer et al., J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991)；Degenhardt et al., Cell Mol. Biol., 44:1139-1145 (1998)）。透析に関連するアミロイドーシスの患者において見出されるAGE-β2-ミクログロブリンからなる関節のアミロイド（Miyata et al., J. Clin. Invest. 92:1243-1252 (1993)；Miyata et al., J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996)）におけるように、或いは一般に、糖尿病患者の脈管構造及び組織（Schmidt et al., Nature Med. 1:1002-1004 (1995)）によって例示されるように、AGEの脈管構造中での蓄積は局所的に発生することができる。糖尿病患者における経時的なAGEの進行性の蓄積は、内因性のクリアランスメカニズムは、AGE蓄積部位において有効に機能することができないことを示唆する。かかる蓄積したAGEは、多くのメカニズムによって細胞の性質を変化させる能力を有する。RAGEが正常な脈管構造及び組織中では低いレベルで発現されるにもかかわらず、受容体のリガンドが蓄積する環境においては、RAGEが上方調節されることが示された（Li et al., J. Biol. Chem. 272:16498-16506 (1997)；Li et al., J. Biol. Chem. 273:30870-30878 (1998)；Tanaka et al., J.Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)。RAGEの発現は、糖尿病の脈管構造中の内皮、平滑筋細胞及び浸潤性の単核食細胞において増加する。細胞培養における研究も、AGE-RAGE相互作用が血管の恒常性に重要な細胞の性質を変化させることを示している。
糖尿病に関連する病理の治療におけるRAGE融合タンパク質の使用を図１４に示す。RAGE融合タンパク質TTP-4000が、血管損傷後の平滑筋の増殖と血管内膜の拡張を含む、再狭窄の糖尿病ラットモデルにおいて評価された。図１４に示されるように、TTP-4000治療は、糖尿病に関連する再狭窄における内膜／中膜（I/M）比を用量応答性に顕著に減少させることができる（図１４A；表１）。また、TTP-4000治療は、再狭窄に関連する血管平滑筋細胞の増殖を用量応答性に顕著に減少させることができる（図１４B）。
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他の実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、アミロイドーシス及びアルツハイマー病を治療または逆行させるためにも使用されることができる。RAGEは、アミロイドベータ（Aβ）並びにSAA及びアミリンを含む他のアミロイド生成性のタンパク質の受容体である（Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996)；Yan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)；Yan et al., Nat. Med., 6:643-651 (2000)；Sousa et al., Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)）。また、AGE、S100b及びAβタンパク質を含むRAGEリガンドは、ヒトにおける老人斑の周囲の組織中に見出される（Luth et al., Cereb. Cortex 15:211-220 (2005)；Petzold et al., Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003)；Sasaki et al., Brain Res., 12:256-262 (2001)；Yan et al., Restor. Neurol Neurpsci., 12:167-173 (1998)）。サブユニットの組成（アミロイド−βペプチド、アミリン、血清アミロイドA、プリオン由来のペプチド）に関係なくRAGEがβシート繊維状物質に結合することが示された（Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996)；Yan et al., Nat. Med. 6:643-651 (2000)）。さらに、アミロイドの沈着は、RAGE発現を亢進させることが示された。例えば、アルツハイマー病（AD）患者の脳においては、ニューロン及びグリアにおいてRAGEの発現が増加する（Yan et al., Nature 382:685-691 (1996)）。RAGEリガンドの発現と同時に、RAGEはADを有する個人の海馬中の星状細胞およびミクログリア細胞において上方調節される（Lue et al., Exp. Neurol., 171:29-45 (2001)）。これらの発見は、RAGEを発現する細胞が老人斑の近傍においてRAGE／RAGEリガンド相互作用を介して活性化されることを示唆する。インビトロにおいても、ミクログリア細胞のAβ介在性の活性化が、RAGEのリガンド結合ドメインに対する抗体でブロックされることができる（Yan et al., Proc. Natl, Acad. Sci., USA, 94:5296-5301 (1997)）。RAGEが線維の集合の中心としての役割を果たすことが可能であることも実証された（Deane et al., Nat. Med. 9:907-913 (2003)）。
sRAGEまたは抗RAGE抗体のいずれかを用いるRAGE／リガンド相互作用のインビボでの阻害も、全身性のアミロイドーシスのマウスモデルにおいてアミロイドプラーク形成を減少させることができる（Yan et al., Nat. Med. 6:643-651 (2000)）。ニューロンにおいてヒトRAGE及びSweden変異及びLondon変異（突然変異体hAPP）を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質（APP）を過剰発現する、ダブルトランスジェニックマウスは、それらのシングルミュータントhAPPトランスジェニック対応物よりも速く学習障害及び神経病理学的な異常を発生した。対照的に、同じミュータントhAPPバックグラウンドにおいて、ドミナントネガティブな形態のRAGEを発現するニューロンによりAβシグナリング能力が低下したダブルトランスジェニックマウスは、それらのシングルAPPトランスジェニック対応物に比べて、遅い、神経病理学的異常及び学習異常を生じた（Arancio et al., EMBO J., 23:4096-4105(2004)）。
さらに、RAGE−アミロイド相互作用の阻害は、細胞性RAGE及び細胞ストレスマーカーの発現（並びにNF-κBの活性化）を低下させ、そしてアミロイド沈着を減少させることが示され（Yan et al., Nat Med. 6:643-651 (2000)）、（初期段階においても）アミロイドに富む環境、並びにアミロイドの蓄積という両方の心配な細胞の性質におけるRAGE-アミロイド相互作用の役割を示唆している。
したがって、本発明のRAGE融合タンパク質は、アミロイドーシスを治療し、そしてアルツハイマー病（AD）に関連するアミロイドプラーク及び認知障害を減少させることにも使用されることができる。上記のように、sRAGEは、ADの動物モデルにおける脳内のアミロイドプラーク形成及び引き続く炎症性マーカーの増加を減少させることが示された。図１５A及び１５Bは、ADを有し、そしてTTP-4000またはマウスsRAGEで３ヶ月間治療されたマウスは、ビヒクルまたはヒトIgG陰性対照（IgG1）を受容したマウスよりも、少ないアミロイドベータ（Aβ）プラーク及びより低度の認知障害を有したことを示す。sRAGEのように、TTP-4000もまた、ADに関連する炎症性サイトカインIL-1及びTNF-αを減少させることができる（データは示さない）。
本発明のRAGE融合タンパク質は、動脈硬化及び他の循環器障害を治療するためにも使用されることができる。したがって、虚血性心疾患が糖尿病患者において特に高いことが示されている（Robertson, et al., Lab Invest., 18:538-551 (1968)；Kannel et al., J. Am. Med. Assoc., 241:2035-2038 (1979)；Kannel et al., Diab. Care, 2:120-126 (1979)）。さらに、糖尿病患者における動脈硬化が、糖尿病にかかっていない患者よりもより加速され、広範囲に及ぶことを研究が示した（例えば、Waller et al., Am. J. Med., 69:498-506 (1980)；Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978)；Hamby et al., Chest, 2:251-257 (1976)；及びPyorala et al., Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)を参照のこと）。糖尿病の状況下での加速された動脈硬化に多くの理由があるにもかかわらず、AGEの減少がプラーク形成を低下させうることが示された。
例えば、本発明のRAGE融合タンパク質は、脳卒中を治療することにも使用されることができる。病気に関連した脳卒中の動物モデルにおいて、TTP-4000をsRAGEと比較した場合、TTP-4000は、梗塞体積の顕著な減少を提供することがわかった。このモデルにおいて、マウスの中部頚動脈（middle carotid artery）を結紮し、梗塞を形成するために再かん流した。RAGE融合タンパク質の脳卒中の治療または予防における有効性を評価するために、再かん流の直前にマウスをsRAGEまたはTTP-4000または対照イムノグロブリンで処置した。表２からわかるように、これらの動物において梗塞領域を制限することにおいてTTP-4000がsRAGEよりも有効であったことは、そのより良い血漿中半減期によってTTP-4000がsRAGEよりも有効であり、sRAGEよりも大きな保護を維持することができたことを示唆している。
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他の実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は癌を治療するために使用されることができる。1つの実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質を用いて治療される癌は、RAGEを発現する癌細胞を含む。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質で治療されることのできる癌は、いくつかの肺癌、いくつかの神経膠腫、いくつかの乳頭腫などを含む。アンフォテリンは、RAGEと相互作用することがわかっている、高移動度群Iの非ヒストン染色体DNA結合タンパク質である（Rauvala et al., J. Biol. Chem. 262:16625-16635 (1987)；Parkikinen et al., J. Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993)）。アンフォテリンが神経突起の伸長を促進し、並びに（細胞移動性に寄与することでも知られている）線溶系におけるプロテアーゼ複合体の集合のための表面としての役割を果たすことが示されている。さらに、RAGEをブロックすることの局所的な腫瘍成長の阻害効果は、原発腫瘍モデル（C6神経膠腫）、ルイス肺癌転移モデル（Taguchi et al., Nature 405:354-360 (2000)）、及びv-Ha-rasトランス遺伝子を発現するマウスにおける自然発生的乳頭腫（Leder et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9178-9182 (1990)）において観察されている。
さらに他の実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、炎症を治療するために使用されることができる。別の実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は自己免疫に関連した炎症、炎症性腸疾患に関連した炎症、リューマチ関節炎に関連した炎症、乾癬に関連した炎症、多発性硬化症に関連した炎症、低酸素症に関連した炎症、脳卒中に関連した炎症、心臓発作に関連した炎症、出血性ショックに関連した炎症、敗血症に関連した炎症、器官の移植に関連した炎症、創傷治癒の障害に関連した炎症、又は自己の（例えば、自己免疫）若しくは非自己（例えば、移植された）細胞、組織若しくは器官の拒絶に関連した炎症を治療するために使用される。
例えば、血栓溶解療法のあと、顆粒球などの炎症性細胞は虚血組織に浸潤し、そして低酸素症によって死滅させられるよりも多くの細胞を破壊することのできる酸素ラジカルを生成する。抗体または他のタンパク質アンタゴニストによる、好中球が組織に浸潤することができることを担う好中球上の受容体の阻害は、反応を軽減することが示されている。RAGEがこの好中球受容体のリガンドであるため、RAGEの断片を含むRAGE融合タンパク質は、おとりとして作用し、そして好中球が再かん流部位に移動することを防ぎ、そしてさらなる組織の破壊を予防する。炎症の予防におけるRAGEの役割は、sRAGEが、おそらくRAGEを介する内皮、平滑筋細胞の増殖及びマクロファージの活性化を阻害することによって、糖尿病ラット及び正常ラットの動脈損傷後の再狭窄のラットモデルにおける新内膜の増殖を阻害することを示す研究によって示されることができる（Zhou et al., Circulation, 107:2238-2243 (2003)）。さらに、sRAGEは、遅延型過敏症、実験的自己免疫性脳炎及び炎症性腸疾患を含む炎症のモデルを阻害した（Hofman et al., Cell, 97:889-901 (1991)）。
ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、自己免疫に基づく障害を治療するために使用されることができる。例えば、ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、腎障害を治療するために使用されることができる。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質は、全身性のループス腎炎または炎症性のループス腎炎を治療するために使用されることができる。例えば、S100/カルグラニュリンは、結合ペプチドによって結合された2つのEF-ハンド領に特徴を有する、密接に関連したカルシウム結合ポリペプチドのファミリーを含むことが示されている（Schafer et al., TIBS, 21:134-140 (1996)；Zimmer et al., Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995)；Rammes et al., J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997)：Lugering et al., Eur. J. Clin. Invest., 25:659-664 (1995)）。それらがシグナルペプチドを有さないにもかかわらず、嚢胞性線維症及びリューマチ関節炎におけるように、S100/カルグラニュリンは、特に慢性の免疫／炎症性反応部位において、細胞外空間へのアクセスを得ていることがずっと前から知られている。RAGEは、S100／カルグラニュリンファミリーの多くのメンバーの受容体であり、リンパ球及び単核食細胞などの細胞に対するそれらの前炎症性効果を仲介する。また、遅発性過敏症反応、IL-10ヌルマウスにおける大腸炎、コラーゲン誘発性関節炎及び実験的自己免疫性脳炎モデルについての研究も、（おそらく、S-100／カルグラニュリンとの）RAGE-リガンド相互作用が炎症カスケードにおいて近接した役割を果たすことを示唆する。
I 型糖尿病は、本発明のRAGE融合タンパク質による治療によって予防または緩和されることのできる自己免疫疾患である。例えば、sRAGEが、非肥満糖尿病（NOD）マウス由来の脾細胞の重い免疫不全合併症を有するNODマウス（NOD-scidマウス）への移植を可能とすることが示された。NOD-scidマウスは自然発生的な糖尿病を表さないが、糖尿病が誘発されるように島細胞を破壊することのできる免疫細胞の存在を必要とする。sRAGEで治療されたNOD-scidレシピエントが、sRAGEで治療されないNOD-scidレシピエントに比べて、糖尿病（NOD）マウスから移植された脾細胞によって誘発される糖尿病の発生の減少を示すことが見出された（米国特許出願公開第2002/0122799号）。米国特許出願公開第2002/0122799号にのべられるとおり、このモデルにおいてsRAGEを用いて得られた実験結果は、将来的な免疫治療及び島細胞移植が行われるかもしれない臨床設定などのヒト疾患に関連している。
したがって、ある実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、少なくとも１つの器官、組織、又は第１の部位から第２の部位への複数の細胞の移植に伴う炎症を治療するために使用されることができる。第１及び第２の部位は異なる対象でも、同じ対象におけるものでもよい。別の実施態様においては、移植された細胞、組織または器官は、膵臓、皮膚、肝臓、心臓、肺、骨髄、血液、骨、筋肉、内皮細胞、動脈、静脈、軟骨、甲状腺、神経系、又は幹細胞の細胞を含む。例えば、本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、第１の糖尿病を有さない対象から第２の糖尿病の対象への島細胞の移植を促進するために使用されることができる。
他の実施態様においては、本発明は、本発明のRAGE融合タンパク質の治療的有効量を対象に投与することによって骨粗鬆症を治療する方法を提供することができる（Zhou et a.., J. Exp. Med., 203:1067-1080(2006)）。ある実施態様においては、骨粗鬆症の治療法はさらに、対象の骨密度を増加させること又は対象の骨密度の減少速度を低下させることを含んでよい。
したがって、さまざまな選ばれた実施態様において、本発明は、対象に治療的有効量の本発明のRAGE融合タンパク質を投与することによって、対象におけるAGEとRAGEの相互作用を阻害する方法を提供することができる。本発明のRAGE融合タンパク質を用いて治療される対象は、動物であってよい。ある実施態様においては、該対象はヒトである。対象は、糖尿病、腎症、ニューロパチー、網膜症、脚の潰瘍、アミロイドーシスまたは腎障害などの糖尿病の合併症、及び炎症などのAGE関連疾患に罹患していてよい。或いは、対象はアルツハイマー病を有する個人であってよい。別の実施態様においては、対象は癌を有する個人であってよい。さらに他の実施態様においては、対象は全身性のループスエリテマトーデスまたは炎症性ループス腎炎に罹患していてよい。他の病気はRAGEにより仲介され、そして本発明のRAGE融合タンパク質を用いて治療されることができる。したがって、本発明のさらなる別な実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、ヒトまたは動物対象におけるクローン病、関節炎、血管炎、腎症、網膜症、及びニューロパチーの治療のために使用されることができる。他の実施態様においては、自己免疫応答（たとえば、自己の拒絶）及び非自己免疫応答（たとえば、非自己の拒絶）の両方を含む炎症は、RAGEにより仲介されることができ、そしてしたがって、本発明のRAGE融合タンパク質を用いて治療されうる。
治療的有効量は、RAGEと対象中のAGEまたは他の種類の内因性RAGEリガンドとの相互作用を防ぐことができる量を含んでよい。したがって、該量は治療される対象によって変化するであろう。化合物の投与は、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年または1回の事象であってよい。様々な他の実施態様において、RAGE融合タンパク質の有効量は、約１ng/kg体重〜約１００mg/kg体重、または約１０μg/kg体重〜約５０mg/kg体重、または約１００μg/kg体重〜約２０mg/kg体重であることができる。実際の有効量は、本分野で標準的な方法を用いる、用量／応答アッセイによって確立されることができる（Johnson et al., Diabetes.42:1179,(1993)）。したがって、本分野で知られているとおり、有効量は化合物のバイオアベイラビリティー、生物活性、及び生分解性に依存することができる。
組成物
本発明は、医薬として許容可能な担体と混合された本発明のRAGE融合タンパク質を含む組成物を包含することができる。RAGE融合タンパク質は、第二の非RAGEポリペプチドに連結されたRAGEポリペプチドを含むことができる。1つの実施態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGEリガンド結合部位を含むことができる。ある実施態様において、リガンド結合部位はRAGE融合タンパク質の最もN-末端のドメインを含む。RAGEリガンド結合部位は、RAGEのVドメイン、またはその部分を含むことができる。ある実施態様において、RAGEリガンド結合部位は、配列番号９またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号１０またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或るいは配列番号４７又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む。
ある実施態様において、RAGEポリペプチドは、イムノグロブリンドメインまたは（その断片などの）イムノグロブリンドメインの部分を含むポリペプチドに連結されることができる。1つの実施態様において、イムノグロブリンドメインを含むポリペプチドは、ヒトIgGのCH2またはCH3ドメインのうちの少なくとも１つの少なくとも１部分を含む。
ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、配列番号５６又は配列番号５７に示すアミノ酸配列、あるいは、それに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の配列を含む。例えば、いくつかの実施態様においては、配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一の配列は、C-末端リジンを含まない、配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む。
RAGEタンパク質またはポリペプチドは、（配列番号１などの）完全長ヒトRAGE、またはヒトRAGEの断片を含むことができる。ある実施態様において、RAGEポリペプチドはいかなるシグナル配列残基も含まない。RAGEのシグナル配列は、完全長RAGE（配列番号１）の残基１〜２２または残基１〜２３を含むことができる。別の実施態様においては、RAGEポリペプチドはヒトRAGEに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列またはその断片を含むことができる。例えば、1つの実施態様においては、RAGEポリペプチドは、第一の残基としてメチオニンよりもグリシンを含む、ヒトRAGEまたはその断片を含むことができる（Neeper et al., (1992)）。或いは、ヒトRAGEは、（配列番号２または配列番号３などの）（図１A及び１B）シグナル配列が除去された完全長RAGE或いはそのアミノ酸配列の部分を含むことができる。
本発明のRAGE融合タンパク質は、（配列番号４などの）sRAGE、sRAGEに対して少なくとも９０％同一のポリペプチド、またはsRAGEの断片を含むこともできる。例えば、RAGEポリペプチドは、第一の残基としてメチオニンよりもグリシンを含む、ヒトsRAGE、またはその断片を含むことができる（Neeper et al., (1992)）。或いは、ヒトRAGEは、（図１の配列番号５、配列番号６又は配列番号４５などを参照のこと）シグナル配列が除去されたsRAGEまたはそのアミノ酸配列の一部分を含むことができる。他の実施態様においては、RAGEタンパク質は、（図１の配列番号７、配列番号８または配列番号４６などを参照のこと）Vドメインを含むことができる。或いは、Vドメインに対して少なくとも９０％同一の配列またはその断片が使用されることができる。或いは、RAGEタンパク質は、（図１の配列番号９、配列番号１０又は配列番号４７を参照のこと）Vドメインの部分を含むRAGEの断片を含んでもよい。ある実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号９またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号１０またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは配列番号４７またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。さらに他の実施態様においては、RAGE断片は合成ペプチドである。
例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメインに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１１６（配列番号７）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いはヒトRAGEのアミノ酸２４〜１１６（配列番号８）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、Q24が環化してpEを形成する、ヒトRAGEのアミノ酸配列２４−１１６（配列番号４６）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むことができる。或いは、RAGEポリペプチドは、RAGEのC1ドメインに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸１２４〜２２１（配列番号１１）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むことができる。他の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、RAGEのC2ドメインに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２２７〜３１７（配列番号１２）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列含むことができる。或いは、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１２３（配列番号１３）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１２３（配列番号１４）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むことができる。或いは、RAGEポリペプチドは、Q24が環化してpEを形成する、RAGEのアミノ酸２４−１２３（配列番号４８）、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、Vドメイン、C1ドメイン及びこれら２つのドメインを連結するドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２２６（配列番号１７）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２２６（配列番号１８）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むことができる。或いはRAGEポリペプチドは、Q24が環化してpEを形成する、ヒトRAGEのアミノ酸２４−２２６（配列番号５０）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、RAGEポリペプチドは、sRAGE（すなわち、V、C1、及びC2ドメイン及びドメイン間リンカーをコードする）に対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜３３９（配列番号５）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いヒトRAGEのアミノ酸２４〜３３９（配列番号６）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むことができる。或いは、RAGEポリペプチドは、Q24が環化してpEを形成する、ヒトRAGEのアミノ酸２４−３３９（配列番号４５）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含んでよい。或いは、これらの配列それぞれの断片が使用されることができる。
他の実施態様においては、リガンド結合部位は配列番号１のアミノ酸２２〜５１を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸２３〜５１を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸３１〜５１を含んでよい。他の実施態様においては、リガンド結合部位は、配列番号１のアミノ酸３１〜１１６を含んでよい。例えば、リガンド結合部位は、RAGEリガンド結合ドメイン（たとえば、配列番号１のアミノ酸１〜１１８、２３〜１１８、２４〜１１８、３１〜１１８、１〜１１６、２３〜１１６、２４〜１１６、３１〜１１６、１〜５４、２３〜５４、２４〜５４、又は３１〜５４、あるいはその断片）などのその部分を含んでよい（図１）。或いは、RAGEリガンドに機能的に結合するポリペプチドの断片が使用されてよい。或いは、RAGE Vドメイン又は（上記したような）その断片に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の配列が使用されてよい。さらに、本分野で知られているとおり、融合タンパク質のN-末端が、配列番号１の残基１〜２３を含むシグナル配列の除去などによって融合タンパク質のN-末端がグルタミンである実施態様（たとえば、配列番号１のアミノ酸１〜２３を含むポリペプチドについてのQ24）においては、グルタミンが環化してピログルタミン酸（pE）を形成することができる。
RAGE融合タンパク質は、RAGEまたはその断片に由来しない数種のペプチドを含むことができる。RAGE融合タンパク質の第二のポリペプチドは、イムノグロブリンに由来するポリペプチドを含むことができる。重鎖（又はその部分）は、既知の重鎖アイソタイプ：IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)、またはIgA(α)のいずれに由来してもよい。さらに、重鎖（又はその部分）は、既知の重鎖サブタイプ：IgG1(γ１)、IgG2(γ２)、IgG3(γ３)、IgG4(γ４)、IgA1(α１)、IgA2(α２)、または生理活性を変更するこれらのアイソタイプまたはサブタイプの突然変異体のいずれに由来することもできる。第二のポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはこれらのドメインのいずれかまたは両方の部分を含んでもよい。例示的な実施例として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはそれらの部分を含むポリペプチドは、配列番号４０またはその部分を含んでよい。ある実施態様においては、ヒトIgG1のヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはそれらの部分を含むポリペプチドは、配列番号３８又はその部分を含んでよい。例えば、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはそれらの部分を含むポリペプチドは、末端リジン（K）が除去された、配列番号３８又は配列番号４０を含んでよい。イムノグロブリンペプチドは、配列番号３９または配列番号４１の核酸配列によってコードされることができる。配列番号３８又は配列番号４０中のイムノグロブリン配列は、配列番号５２又は配列番号５３によってもそれぞれコードされることができる。
イムノグロブリン鎖のFc部分はインビボにおいて前炎症性であることができる。したがって、１つの実施態様においては、本発明のRAGE融合タンパク質はイムノグロブリンに由来するドメイン間ヒンジポリペプチドよりもRAGEに由来するドメイン間リンカーを含む。
したがって、1つの実施態様においては、RAGE融合タンパク質はさらに、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはその断片を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含むことができる。1つの実施態様において、CH2ドメインまたはその断片は配列番号４２を含む。１つの実施態様において、配列番号４２の断片は、最初の１０のアミノ酸が除去された配列番号４２を含む。
1つの実施態様においては、RAGEポリペプチドは、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、かつ、RAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメインまたはその断片を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを含む。イムノグロブリンのCH2ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメイン、又はこれらのドメインの両方またはいずれかの部分を含むことができる。例示的な実施態様として、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはそれらの部分を含むポリペプチドは、配列番号４０またはその部分を含んでよい。ある実施態様においては、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはその部分を含むポリペプチドは、配列番号３８又はその部分を含んでよい。例えば、ヒトIgG1のCH2及びCH3ドメインまたはそれらの部分を含むポリペプチドは、末端のリジン（K）が除去された、配列番号３８または配列番号４０を含むことができる。
本発明のRAGE融合タンパク質は、RAGEの単一または複数のドメインを含むことができる。また、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたドメイン間リンカーを含むRAGEポリペプチドは、完全長RAGEタンパク質の断片も含むことができる。例えば、1つの実施態様において、RAGE融合タンパク質は、RAGEタンパク質に由来する2つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチドに由来する２つのイムノグロブリンドメインを含むことができる。RAGE融合タンパク質は、第一のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸がRAGEの第二のイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そしてRAGEの第二のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第一のドメイン間リンカーを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、V-ドメイン、C1ドメイン、これら２つのドメインを連結するドメイン間リンカー、及びC1の下流の第二のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２５１（配列番号１９）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２５１（配列番号２０）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、Q24が環化してpEを形成する、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２５１、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列（配列番号５１）を含むことができる。1つの実施態様において、配列番号３０又はその断片を含む核酸構築物は、4つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができる。他の実施態様においては、配列番号５４を含む核酸構築物は、４つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができ、ここで、該配列のC末端におけるプロリンおよびグリシンをそれぞれコードする塩基のサイレントな変更（CCGからCCC）及び（GGTからGGG）は、末端コドン近くの潜在的RNAスプライス部位を除去するために入れられる（すなわち、配列番号３０のヌクレオチド１３７５〜１３８０が修飾されて配列番号５４を生成する）。
或いは、3つのドメインのRAGE融合タンパク質は、RAGE由来の1つのイムノグロブリンドメイン及びヒトFcポリペプチド由来の2つのイムノグロブリンドメインを含むことができる。例えば、RAGE融合タンパク質は、RAGEドメイン間リンカーを介してCH2イムノグロブリンドメインまたはその断片を含むポリペプチドのN-末端に連結された単一のRAGEイムノグロブリンドメインを含むことができる。例えば、RAGEポリペプチドは、RAGEのVドメイン及び下流のドメイン間リンカーに対応する、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１３６（配列番号１５）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６（配列番号１６）またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、Q24が環化してpEを形成する、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列（配列番号４９）を含むことができる。1つの実施態様において、配列番号３１またはその断片を含む核酸構築物は、３つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができる。他の実施態様においては、配列番号５５を含む核酸構築物は、３つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードすることができ、ここで、該配列のC末端におけるプロリンおよびグリシンをそれぞれコードする塩基のサイレントな変更（CCGからCCC）及び（GGTからGGG）は、末端コドン近くの潜在的RNAスプライス部位を除去するために入れられる（すなわち、配列番号３１のヌクレオチド１０３０〜１０３５が修飾されて配列番号５５を生成する）。
RAGEドメイン間リンカー断片は、天然にRAGEイムノグロブリンドメインの下流にあり、そしてしたがってそれに連結したペプチド配列を含むことができる。例えば、RAGE Vドメインについては、ドメイン間リンカーは天然にVドメインの下流にあるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施態様においては、該リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸１１７〜１２３に対応する配列番号２１を含むことができる。或いは、該リンカーは、天然のRAGE配列のさらなる部分を有するペプチドを含むことができる。例えば、配列番号２１の上流及び下流の数個のアミノ酸（１〜３、１〜５、又は１〜１０又は１〜１５アミノ酸など）を含むドメイン間リンカーが使用されてよい。したがって、１つの実施態様において、該ドメイン間リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸１１７〜１３６を含む配列番号２３を含む。或いは、例えば、リンカーのいずれかの末端から１、２または３個のアミノ酸が除去された配列番号２１の断片が使用されることができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号２１または配列番号２３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むことができる。
RAGE C1ドメインについては、リンカーは、天然にC1ドメインの下流にあるペプチド配列を含むことができる。ある実施態様においては、該リンカーは、完全長RAGEのアミノ酸２２２〜２５１に対応する配列番号２２を含むことができる。或いは、該リンカーは、天然のRAGE配列のさらなる部分を有するペプチドを含むことができる。例えば、配列番号２２の上流及び下流の（１〜３、１〜５、又は１〜１０、又は１〜１５アミノ酸である）数個のアミノ酸を含むリンカーが使用可能である。或いは、例えば、リンカーのいずれかの末端から例えば、１〜３、１〜５、または１〜１０、または１〜１５のアミノ酸が除去された、配列番号２２の断片が使用可能である。例えば、1つの実施態様においては、RAGEドメイン間リンカーは、アミノ酸２２２〜２２６に対応する配列番号２４を含むことができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号２２又は配列番号２４に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むことができる。
あるいは、ドメイン間リンカーは、RAGEアミノ酸３１８〜３４２に対応する、配列番号４４を含むことができる。別の実施態様においては、リンカーは、配列番号４４に対して７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むことができる。
医薬として許容可能な担体は、本分野で知られた標準的な医薬として許容可能な担体のいずれを含むこともできる。1つの実施態様においては、医薬担体は液体であることができ、そしてRAGE融合タンパク質または核酸構築物は溶液の形態であることができる。他の実施態様においては、医薬として許容可能な担体は、粉末、凍結乾燥粉末または錠剤の形態の固体であることができる。或いは、医薬担体は、ゲル、坐剤またはクリームであってよい。別の実施態様においては、担体はリポソーム、マイクロカプセル、ポリマーに封入された細胞またはウイルスであってよい。したがって、医薬として許容可能な担体という用語は、水、アルコール、リン酸緩衝生理食塩水、（シュークロース又はマンニトールなどの）糖、油脂または油脂／水エマルジョン若しくはトリグリセライドエマルジョンなどのエマルジョン、多様な種類の湿潤剤、錠剤、被覆錠剤及びカプセルを包含するが、これらに限定されない、任意の標準的な医薬として許容可能な担体を含むことができる。
ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、（両性イオン形態を含む）中性のの形態で、又は陽性に若しくは陰性に荷電した種として存在することができる。いくつかの実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、対イオンと複合化されて医薬として許容可能な塩を形成することができる。
「医薬として許容可能な塩」という用語は、１つ以上のRAGE融合タンパク質および１つ以上の対イオンを含む錯体をさし、ここで、対イオンは医薬として許容可能な無機および有機の酸及び塩基に由来する。
医薬として許容可能な無機塩基は、金属イオンを含む。より好ましい金属イオンは、好適なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及び生理学的に許容可能な他の金属イオンを含むが、これらに限定されない。無機塩基由来の塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレニウム、錫、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、二価マンガン塩、三価マンガン、カリウム、ルビジウム、ナトリウム及び亜鉛塩及びそれらの通常の原子価のものを含む。
本発明のRAGE融合タンパク質の医薬として許容可能な酸付加塩は、以下の：蟻酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、カンファー酸、カルボン酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンディゾール酸（fendizoic acid）、メタホスホン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リジン酸、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アンスラニリン酸、メシリン酸、オロト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニリン酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシブチル酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、カンファースルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサル５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸を制限なしに含む酸から調製可能である。
医薬として許容可能な有機塩基は、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノルアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、４級アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチラミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジミウム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コール酸、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノ−及びジカルボン酸、フェニル−置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセタミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）ジハイドレート、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、及びトロメタモールを含む。
本発明のRAGE融合タンパク質の投与はさまざまな経路を使用することができる。したがって、本発明のRAGE融合タンパク質の投与は、腹腔内（IP）注射を使用することができる。或いは、RAGE融合タンパク質は、経口で、鼻腔内に、またはエアロゾルとして投与されることができる。他の実施態様においては、投与は静脈内（IV）である。RAGE融合タンパク質は、皮下注射されることもできる。他の実施態様においては、RAGE融合タンパク質の投与は動脈内である。他の実施態様においては、投与は舌下である。また、投与は徐放性カプセルを使用することもできる。例えば、自己投与が望ましい場合、慢性の障害を治療するために皮下投与が有用であることができる。
本発明のさらなる側面においては、本発明のRAGE融合タンパク質は、アジュバント治療剤または他の知られた治療剤との併用治療剤による治療において利用されることができる。以下は、本発明のRAGE融合タンパク質調節剤と併用して利用されることのできるアジュバント及び追加の治療剤の完全でないリストである；
抗癌剤の薬理学的分類：
１．アルキル化剤：シクロホスファミド、ニトロソウレア、カルボプラチン、シスプラチン、プロカルバジン
２．抗生物質：ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン
３．代謝拮抗剤：メトトレキセート、シタラビン、フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、及び細胞毒性を有する抗癌化学療法剤
４．植物アルカロイド：ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、パクリタキセル
５．ホルモン：タモキシフェン、酢酸オクトレオチド、フィナステリド、フルタミド
６．生物学的反応修飾剤：インターフェロン、インターロイキン
リューマチ関節炎の治療薬の薬理学的分類：
１．鎮痛剤：アスピリン
２．NSAID（非ステロイド系抗炎症剤）：イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナック
３．DMARD（疾患修飾性抗リューマチ薬）：メトトレキセート、金製剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン
４．生物学的反応修飾剤、DMARD：エタネルセプト、インフリキシマブ、ベクロメタゾン、メチルプレドニソロン、ベタメタゾン、プレドニソン、デキサメタゾンおよびハイドロコルチゾンなどのグルココルチコイド
糖尿病の治療薬の薬理学的分類：
１．スルホニルウレア：トルブタミド、トラザミド、グリブリド、グリピジド
２．ビグアニド：メトホルミン
３．混合型の経口剤：アカルボース、トログリタゾン
４．インスリン
アルツハイマー病の治療薬の薬理学的分類：
１．コリンエステラーゼ阻害剤：タクリン、ドネペジル
２．抗精神病剤：ハロペリドール、チオリダジン
３．抗うつ薬：デシプラミン、フルオキセチン、トラゾドン、パロキセチン
４．抗けいれん薬：カルバマゼピン、バルプロン酸
ある実施態様においては、本発明の組成物は、単一または複数の追加の治療剤と組み合わせた、治療的有効量のRAGE融合タンパク質を含んでよい。これまで記載した剤に加えて、以下の治療剤：シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン及び他のFK-506型の免疫抑制剤などの免疫抑制剤、が本発明のRAGE融合タンパク質と組み合わせて使用されることができる。
1つの実施態様においては、本発明はしたがって、RAGE介在性疾患の治療方法であって、そのような治療を必要とする対象に、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物学的反応修飾剤、鎮痛剤、NSAID、DMARD、（グルココルチコイドなどの）生物学的反応修飾剤、スルホニルウレア、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬、抗けいれん薬、及びシクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、及び他のFK-506型の免疫抑制剤などの免疫抑制剤からなる群から選ばれる治療剤と併用したRAGE融合タンパク質の治療的有効量を投与することを含む上記方法を提供することができる。さらなる実施態様においては、本発明は、さらに、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗生物質、ホルモン、生物学的反応修飾剤、鎮痛剤、NSAID、DMARD、（グルココルチコイドなどの）生物学的反応修飾剤、スルホニルウレア、ビグアニド、インスリン、コリンエステラーゼ阻害剤、抗精神病薬、抗うつ薬、及び抗けいれん薬から成る群から選らばれる、１つ以上の治療剤を含む、上記の本発明の医薬組成物を提供する。
凍結乾燥製剤
他の実施態様においては、本発明はまた、RAGE融合タンパク質を含む製剤も提供する。該製剤の実施態様は、凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質及び緩衝剤の凍結乾燥混合物も含むことができる。
さまざまな凍結乾燥保護剤が、本発明のRAGE融合タンパク質の凍結乾燥製剤中で使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。例えば、該非還元糖は、シュークロース、マンニトール、又はトレハロースを含んでよい。また、さまざまな緩衝剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されうる。ある実施態様において、緩衝剤はヒスチジンを含んでよい。
凍結乾燥RAGE融合タンパク質は、追加の成分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤は、界面活性剤、キレート剤または充填剤のうちの少なくとも１つをさらに含んでよい。1つの実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７又は５７に示す配列を含む、約４０〜１００mg/mLのRAGE融合タンパク質；約２mM〜約５０mMのヒスチジン；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween 8；及び約６．０〜６．５のpHを含む。例えば、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、ある実施態様において、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７又は５７に示す配列を含む、約４０〜５０mg/mLのRAGE融合タンパク質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTween 80；及び約６．０のpHを含んでよい。或いは、本明細書中でさらに記載されるように、RAGE融合タンパク質の他の濃度も使用されてよい。
１つの実施態様においては、本発明は、希釈剤中で再構成された凍結乾燥RAGE融合タンパク質を含む再構成製剤を含み、ここで、再構成製剤中の該RAGE融合タンパク質濃度は、約１mg/mL〜約４００mg/mLの範囲である。あるいは、本明細書に記載のRAGE融合タンパク質の他の濃度も使用されてよい。
他の実施態様においては、本発明は、RAGE融合タンパク質の安定な再構成製剤の調製方法も含む。該再構成製剤は、（対象への直接投与などの）直接的使用に好適な濃度を含んでよく、又はさらにデリバリー剤で希釈され及び／又はこれと混合されてよい。
ある実施態様においては、該方法は、RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護剤の凍結乾燥混合物中のRAGE融合タンパク質の濃度が約１mg/mL〜約４００mg/mLの範囲となるように、上記凍結乾燥混合物を希釈剤中で再構成することを含んでよい。あるいは、本明細書に記載の他の濃度も、本明細書に記載のとおりに使用されてよい。
さまざまな凍結乾燥保護剤が本発明の再構成RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。たとえば、非還元糖は、シュークロース、マンニトール、又はトレハロースを含んでよい。また、さまざまな緩衝剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンを含んでよい。
再構成RAGE融合タンパク質製剤は、追加の成分を含んでよい。ある実施態様においては、RAGE融合タンパク質製剤は、さらに、少なくとも１つの界面活性剤、キレート剤、又は充填剤を含んでよい。１つの実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、約４０〜１００mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約２mM〜約５０mMのヒスチジン；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween 80；及び約６．０〜６．５のpHを含む。たとえば、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、ある実施態様において、約４０〜５０mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTween 80；及び約６．０のpHを含む。
医薬に好適なさまざまな希釈剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質を再構成するために使用されてよい。ある実施態様においては、凍結乾燥RAGE融合タンパク質は滅菌されている。また、ある実施態様においては、希釈剤は滅菌されている。１つの実施態様においては、希釈剤は注射用の水（WFI）を含んでよい。また、ある実施態様においては、添加される希釈剤の量は、RAGE融合タンパク質の治療量及び薬物動態プロフィール、並びに製剤及び投与される担体の生物適合性に基づく。ある実施態様においては、再構成製剤は等張である。
RAGE融合タンパク質製剤は、クリニックでの使用のため、又は処方薬として製剤される安定な治療剤を含んでよい。たとえば、ある実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、４０℃での１週間の後、１０％未満、又は５％未満、又は３％未満の分解を示すことができる。
また、RAGE融合タンパク質製剤は、希釈剤中での再構成後に安定であることができる。ある実施態様においては、約１０％、約５％、又は約４％又は約３％、又は約２％、又は約１％未満のRAGE融合タンパク質が、RAGE融合タンパク質製剤中で凝集体として存在する。
再構成RAGE融合タンパク質製剤は、さまざまな経路による投与に好適であることができ、そして着目のRAGE介在性疾患の治療に必要とされる。ある実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、製剤の対象への静脈内、腹腔内、または皮下投与のうちの少なくとも１つに好適である。
たとえば、ある実施態様においては、本発明は、少なくとも１０mg/mL、又は少なくとも２０mg/mL、又は少なくとも５０mg/mLの濃度のRAGE融合タンパク質と希釈剤を含む、安定な再構成製剤を含んでよく、ここで、該再構成製剤は、RAGE融合タンパク質及び凍結乾燥保護剤の凍結乾燥混合物から調製されている。別の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１００mg/mL、又は少なくとも２００mg/mL、又は少なくとも４００mg/mLであってよい。さらに別の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約０．５mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１mg/mL〜約２００mg/mL、又は約１mg/mL〜約２００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約４００mg/mL、約４０〜１００mg/mL、約４０〜５０mg/mの範囲内の量である。製剤は緩衝剤も含んでよい。
さらに他の実施態様においては、本発明は、RAGE融合タンパク質を含む製造品を含んでよい。たとえば、ある実施態様においては、該製造品は、凍結乾燥RAGE融合タンパク質を保持する容器、及び希釈剤で凍結乾燥製剤を再構成するための指示書を含んでよい。ある実施態様においては、該製造品は、凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質、及び緩衝剤の凍結乾燥混合物を含む製剤を保持する容器を含んでよい。該製造品は、凍結乾燥製剤を希釈剤中で再構成するための指示書も含んでよい。
さまざまな凍結乾燥保護剤が本発明の製造品中で使用されてよい。いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含んでよい。たとえば、非還元糖は、シュークロース、マンニトール又はトレハロースを含んでよい。また、さまざまな緩衝剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤中で使用されてよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンを含んでよい。
本発明の製造品のRAGE融合タンパク質製剤は、更なる成分を含んでよい。ある実施態様においては、凍結乾燥RAGE融合タンパク質製剤は、さらに、界面活性剤、キレート剤、または充填剤のうちの少なくとも１つを含んでよい。本発明の製造品の１つの実施態様においては、提供された指示書による再構成後、RAGE融合タンパク質製剤は、約４０〜１００mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約２mM〜約５０mMのヒスチジン；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween 80；及び約６．０〜６．５のpHを含む。たとえば、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、ある実施態様において、約４０〜５０mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTween 80；及び約６．０のpHを含む。あるいは、RAGE融合タンパク質の他の濃度が、本明細書に記載のとおりに使用されてよい。
医薬に好適なさまざまな希釈剤が凍結乾燥RAGE融合タンパク質を再構成するために使用されてよい。ある実施態様においては、凍結乾燥製剤は滅菌されている。その代わりに又はそれに加えて、希釈剤は滅菌されていてよい。１つの実施態様においては、希釈剤は注射用の水（WFI）を含んでよい。したがって、製造品は、凍結乾燥製剤を再構成するための希釈剤を保持する第２の容器をさらに含んでよく、ここで、希釈剤は注射用の水（WFI）である。ある実施態様においては、再構成製剤は等張である。
また、ある実施態様においては、添加される希釈剤の量は、RAGE融合タンパク質の治療量及び薬物動態プロフィール、並びに製剤及び投与される担体の生物適合性に基づく。別の実施態様においては、指示書は、凍結乾燥製剤を再構成を本明細書に記載の濃度とするためものである。たとえば、ある実施態様においては、指示書は、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約４０mg/mL〜約１００mg/mLの範囲内となるように凍結乾燥製剤を再構成するためのものである。
製造品として提供されるRAGE融合タンパク質製剤は、クリニックにおいて使用するため、又は処方薬として製剤される安定な治療剤を含む。たとえば、ある実施態様においては、提供された指示書に従って再構成される場合、RAGE融合タンパク質は、４０℃での１週間の後、１０％未満、又は５％未満、又は３％未満の分解を示すことができる。また、RAGE融合タンパク質製剤は、希釈剤中での再構成後に安定であることができる。ある実施態様においては、約１０％、約５％、約４％、約３％、又は約２％若しくは約１％未満のRAGE融合タンパク質が、RAGE融合タンパク質製剤中に凝集体として存在する。
また、ある実施態様においては、提供された指示書にしたがって再構成された場合、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、着目のRAGE介在性疾患の治療に必要とされ、さまざまな投与経路によって投与されるのに好適であることができる。ある実施態様においては、再構成RAGE融合タンパク質製剤は、製剤の対象への静脈内、腹腔内又は皮下投与のうちの少なくとも１つに好適である。
RAGE融合タンパク質を含む、製剤、製造品、及び製剤の製造方法のある実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１０mg/mL、少なくとも２０mg/mL、又は少なくとも５０mg/mLであってよい。別の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１００mg/mL、又は２００mg/mL、又は４００mg/mLであってよい。たとえば、別の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも約０．５mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１mg/mL〜約２００mg/mL、又は４０mg/mL〜４００mg/mL、５０mg/mL〜４００mg/mL、４０〜１００mg/mL、５０〜１００mg/mL、又は約４０〜５０mg/mLである。たとえば、１つの実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、約５．０〜６．５のpHを有する滅菌水溶液としての製剤中で投与され、約１mg/mL〜約２００mg/mLのRAGE融合タンパク質、約１ミリモル〜約１００ミリモルのヒスチジン緩衝剤、約０．０１mg/mL〜約１０mg/mLのポリソルベート８０、約１００ミリモル〜約４００ミリモルのトレハロース、及び約０．０１ミリモル〜約１．０ミリモルの二ナトリウムEDTA二水和物を含む。
本明細書に記載のいずれの実施態様も、本発明の製剤中のRAGE融合タンパク質として使用されることができる。したがって、凍結乾燥製剤、又は再構成凍結乾燥製剤、又は凍結乾燥製剤若しくは再構成凍結乾燥製剤のいずれかの製造方法、又は本発明の凍結乾燥製剤若しくは再構成凍結乾燥製剤のいずれかを含む製造品のそれぞれについて、RAGE融合タンパク質は、イムノグロブリンポリペプチドに連結されたRAGEリガンド結合部位に由来する配列を含んでよい。
したがって、RAGE融合タンパク質の実施態様は、本明細書に記載のイムノグロブリンのCH2ドメイン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分に直接連結されたRAGEポリペプチドを含んでよい。ある実施態様においては、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そして、RAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメイン又はその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、RAGEイムノグロブリンドメインに連結されたRAGEドメイン間リンカーを含んでよい。たとえば、融合タンパク質のある実施態様は、第一のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が第一のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第二のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そして、RAGE第二ドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメイン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分のN-末端アミノ酸に直接連結されるように、第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び第一のRAGEドメイン間リンカーを含んでよい。
たとえば、RAGE融合タンパク質の別の実施態様においては、RAGEポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列、或いは、配列番号４７にしめされるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含んでよい。他の実施態様においては、RAGE融合タンパク質は、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７に示すアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含んでよい。たとえば、ある実施態様においては、配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７に対して少なくとも９０％同一の配列は、C-末端リジンを含まない配列番号３２、３３、３４、５６、３５、３６、３７、又は５７のポリペプチドを含む。
凍結乾燥製剤の調製
他の実施態様においては、本発明は、凍結乾燥前製剤、凍結乾燥製剤、再構成製剤及びそれらの調製方法を提供する。
上記の着目のRAGE融合タンパク質の調製後、「凍結乾燥前製剤」が製造されることができる。凍結乾燥前製剤中に存在するRAGE融合タンパク質の量は、所望の用量体積、投与様式などを考慮して決定されることができる。ある実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の融合タンパク質量は、１mg/mL超であってよい。また、ある実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の融合タンパク質量は、約５mg/mL、１０mg/mL、５０mg/mL、１００mg/mL又は２００mg/mL未満であってよい。
さらなる実施態様においては、凍結乾燥前製剤は、約４〜８のpHのpH緩衝溶液であってよい。他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤は、約５〜７のpHのpH緩衝溶液であってよい。他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤は、約６．７未満のpHのpH緩衝溶液であってよい。他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤は、約６．０のpHのpH緩衝溶液であってよい。例示的な緩衝剤は、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸及び本明細書に記載の他の有機酸を含む。緩衝剤濃度は、たとえば、緩衝剤及び（再構成製剤などの）製剤の所望の等張性に依存して、約１mM〜約１００mM、又は約５０mM未満、又は約２mM〜約５０mM、又は約１５mM未満、又は約３mM〜約１５mMであってよい。ある実施態様においては、緩衝剤はヒスチジンである。
凍結乾燥保護剤が、凍結乾燥前製剤に添加されることができる。ある実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、糖を含む。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、非還元糖を含む。或いは、非還元糖は、マンニトールを含む。或いは、非還元糖は、トレハロースを含む。凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤の量は一般に、再構成後に、得られた製剤が等張となるようなものである。しかしながら、たとえば、末梢非経口投与のための製剤におけるなど、高張な再構成製剤も好適である。さらに、凍結乾燥保護剤の量は、許容不能な量のタンパク質の分解及び／又は凝集が凍結乾燥によっておこるほど低くてはならない。別の実施態様においては、許容不能な量の凝集は、製剤中に２０％、又は１０％、又は５％以上のRAGE融合タンパク質が凝集体として存在する場合である。凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤濃度の例示的範囲は、約４００mM未満であることができる。他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤濃度の範囲は、約１００mM未満である。したがって、他の実施態様においては、凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤濃度の範囲は、約０．５mM〜４００mM、又は約２mM〜２００mM、又は約３０mM〜約１５０mM、又は約６０〜６５mMである。また、いくつかの実施態様においては、凍結乾燥保護剤は、再構成製剤を等張とする量で添加される。
RAGE融合タンパク質の凍結乾燥前製剤中の凍結乾燥保護剤に対する比は、各RAGE融合タンパク質と凍結乾燥保護剤との組み合わせについて選択される。高濃度（すなわち、約５０mg/mL以上）のRAGE融合たんぱく質を含む等張の再構成製剤のある実施態様においては、凍結乾燥保護剤のRAGE融合タンパク質に対するモル比は、約５０〜約１５００モルの凍結乾燥保護剤に対して１モルのRAGE融合タンパク質であることができる。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤のRAGE融合タンパク質に対するモル比は、約１５０〜約１０００モルの凍結乾燥保護剤に対して１モルのRAGE融合タンパク質であることができる。他の実施態様においては、凍結乾燥保護剤のRAGE融合タンパク質に対するモル比は、約１５０〜約３００モルの凍結乾燥保護剤に対して１モルのRAGE融合タンパク質であることができる。たとえば、これらの範囲は、凍結乾燥保護剤がシュークロース、トレハロース、又はマンニトールなどの非還元糖である場合に好適であることができる。
本発明の他の実施態様においては、界面活性剤が凍結乾燥前製剤に添加されてよい。或いは又はそれに加えて、界面活性剤は、凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤に添加されてよい。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート２０又は８０）（Tween20（商標）又はTween80（商標））；ポロキサマー（たとえば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤を含む。添加される界面活性剤の量は、再構成されたタンパク質の凝集を低下させ、そして再構成後の粒子の形成を最小化するものである。たとえば、界面活性剤は、約０．００１％〜０．５％の量で凍結乾燥前製剤中に存在してよい。たとえば、界面活性剤がポリソルベート８０を含む実施態様においては、該界面活性剤は、約０．００５％〜０．０５％、又は約０．００８％〜０．０１２％、又は約０．０１％の量で凍結乾燥前製剤中に存在してよい。或いは、界面活性剤は、０．００１mg/mL〜約１００mg/mL、又は約０．０１mg/mL〜約１０mg/mLの範囲の最終濃度をなすように製剤中に存在してもよい。
本発明のある実施態様においては、（シュークロース又はヒスチジンなどの）凍結乾燥保護剤及び（マンニトール又はグリシンなどの）充填剤が、凍結乾燥前製剤の調製において使用されてよい。充填剤は、過剰のポケットをその中に含まない、均一な凍結乾燥ケーキの製造を可能とする。
Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中に記載されたような他の医薬として許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤が、それらが製剤の所望の特性を害さないという条件で、凍結乾燥前製剤（及び／又は凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤）中に含まれてよい。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される用量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、追加の緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；EDTAなどのキレート剤；（Zn-タンパク質錯体などの）金属錯体；ポリエステルなどの生物分解性ポリマー；及び／又はナトリウムなどの塩を形成する対イオンを含む。
本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、治療される特定の適応症のために必要な追加のタンパク質も含んでよい。追加のタンパク質は、該タンパク質のそれぞれがお互いに、又はRAGE融合タンパク質に対して有害な影響を与えない、補完的な活性を有するように選択されることができる。かかるタンパク質は、意図された目的のために有効な量で好適に併用されて存在する。
本発明のRAGE融合タンパク質製剤は、インビボ投与のために滅菌されることができる。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって達成されることができる。
RAGE融合タンパク質、凍結乾燥保護剤及び他の任意の成分が一緒に混合された後、製剤は凍結乾燥されてよい。Hull50（商標）（Hull, USA）又はGT20（商標）（Leybold-Heraeus, Germany）凍結乾燥機などの多くの異なる凍結乾燥機がこの目的のために利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結し、そして次に、一次乾燥に適した温度で凍結内容物から氷を昇華させることによって達成される。この条件下で、生成物の温度は、共融点又は製剤の崩壊温度未満である。典型的には、一次乾燥のための棚温度は、約５０〜２５０mTorrの好適な圧力において（生成物が一次乾燥の間凍結したままであるという条件で）約−５０〜２５℃の範囲であろう。ある実施態様において、圧力は約１００mTorrであり、サンプルは約−３０〜２５℃で凍結乾燥されることができる。製剤、サンプルを保持する容器の種類（たとえば、ガラスバイアル）及び液体の体積は、乾燥に必要な時間を決定づけ、これは、２、３時間〜数日（たとえば、４０〜６０時間）の範囲であることができる。凍結乾燥条件は、製剤及びバイアルサイズによって異なる。
いくつかの場合には、移動ステップをさけるために、その中でタンパク質の再構成が行われるべき容器中でタンパク質製剤が凍結乾燥されることが望ましい。この場合の容器は、たとえば、２、３、５、１０、２０、５０、１００、又は２５０ｃｃのバイアルであってよい。ある実施態様においては、容器は、１００mL以下の体積の再構成製剤を調製するのに好適な任意の容器である。
一般命題として、凍結乾燥は、その水分含量が約５％未満である凍結乾燥製剤を生じるであろう。ある実施態様においては、凍結乾燥製剤の水分含量は、約３％未満である。他の実施態様においては、凍結乾燥製剤の水分含量は、約１％未満である。
凍結乾燥製剤の再構成
所望の段階、典型的には、患者又は対象にRAGE融合タンパク質を投与する時点、で凍結乾燥製剤は、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約１０mg/mL超、又は２０mg/mL超、又は５０mg/mL超、又は約３０〜５０mg/mL、又は約５０mg/mLであるように、希釈剤で再構成される。別の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１００mg/mL、又は２００mg/mL、又は４００mg/mLである。例えば、別の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約１mg/mL〜約６００mg/mL、又は約１mg/mL〜約５００mg/mL、又は約１mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１mg/mL〜約２００mg/mL、又は約１０mg/mL〜約４００mg/mL、又は約１０mg/mL〜約２００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約４００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約２００mg/mL、又は約５０mg/mL〜約４００mg/mL、又は約５０mg/mL〜約２００mg/mLの範囲内であってよい。他の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約４０mg/mL〜約１００mg/mL、又は約５０mg/mL〜約１００mg/mL、又は約４０mg/mL〜約５０mg/mLである。再構成製剤中のかかるRAGE融合タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下デリバリーを目的とする場合には、特別に有用であると考えられる。しかしながら、静脈内投与などの他の投与経路のためには、再構成製剤中の低濃度のタンパク質が望ましいかもしれない（たとえば、再構成製剤中の約５〜５０mg/mL、又は約１０〜４０mg/mLのRAGE融合タンパク質）。したがって、いくつかの実施態様においては、再構成製剤中の融合タンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤中の融合タンパク質濃度の２倍以下であることができる。
ある実施態様においては、再構成製剤中の融合タンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤中のそれよりも顕著に高い。たとえば、再構成製剤中の融合タンパク質濃度は、ある実施態様においては、凍結乾燥前製剤のそれの約２〜４０、又は２〜１０、又は３〜８倍であることができる。ある実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤のそれの約３〜６倍であることができる。凍結乾燥前製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約１５mg/mLである他の実施態様においては、再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度は、約５０mg/mL以上である（例えば、少なくとも３倍又は少なくとも４倍高い）。
高濃度のタンパク質のデリバリーは、体積制限（１．５mL以下）及び投薬の必要条件（１００mg以上）のために、しばしば皮下投与において有利又は必要とされる。しかしながら、タンパク質濃度（５０mg/mL以上）は、製造過程で達成することは困難である。それは、高濃度では、タンパク質は加工中に凝集する傾向があり、かつ操作（ポンプなど）及び滅菌ろ過が困難であるからである。或いは、凍結乾燥過程は、タンパク質の濃縮を可能とする方法を提供することができる。たとえば、RAGE融合タンパク質は、体積（Vf）でバイアル中に充填され、そして凍結乾燥されてよい。凍結乾燥されたRAGE融合タンパク質は、もとの体積（たとえば、Vr=０．２５Vf）よりもより小さな体積（Vr）の水又は保存剤（たとえば、BWFI）で再構成され、再構成溶液中でより高濃度のRAGE融合タンパク質を生じる。この過程は、緩衝剤及び賦形剤の濃縮も起こす。皮下投与のためには、溶液は滅菌されていることが望ましい。
再構成は通常、完全な水和を確実にするために、約２５℃の温度で行われるが、所望により他の温度も使用可能である。再構成に必要な時間は、たとえば、希釈剤の種類、賦形剤及びタンパク質の量に依存しうる。例示的な希釈剤は、注射用の滅菌水、静菌水（BWFI）、pH緩衝溶液（リン酸緩衝食塩水など）、滅菌食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含む。ある実施態様においては、希釈剤は、注射に好適な再構成製剤を提供する。他の実施態様においては、希釈剤が注射に好適な再構成製剤を提供する場合、希釈剤は注射用の水（WFI）をふくんでよい。場合により、希釈剤は保存剤を含む。使用される保存剤の量は、タンパク質との適合性及び保存効率試験について異なる保存剤濃度を評価することによって決定されることができる。
別の実施態様においては、再構成製剤は、５０mL容器あたり、１０μm以上のサイズの粒子を、８，０００個未満、又は６，０００個未満、又は４，０００個未満、又は２，０００個未満、又は１，０００個未満、又は６００個未満、又は４００個未満、または２００個未満、または１００個未満、又は５０個未満有する。他の実施態様においては、再構成製剤は、５０mL容器あたり、２５μm以上のサイズの粒子を、８，０００個未満、又は６，０００個未満、又は４，０００個未満、又は２，０００個未満、又は１，０００個未満、又は６００個未満、又は４００個未満、または２００個未満、または１００個未満、又は５０個未満有する。
再構成製剤の投与
再構成製剤は、RAGE融合タンパク質による治療を必要とする、ヒトなどの哺乳動物に、ボーラス又は経時的な持続的輸注による静脈内投与による、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所又は吸入経路によるなどの知られた方法にしたがって投与されることができる。
実施態様においては、再構成製剤は、皮下（すなわち、皮膚の下への）投与によって哺乳動物に投与されることができる。かかる目的のためには、再構成製剤は、シリンジを用いて注射されてよい。しかしながら、（Inject-ease（商標）及びGenject（商標）装置などの）注入装置；（GenPen（商標）などの）インジェクターペン；（MediJector（商標）及びBioJector（商標）などの）無針装置；及び皮下パッチデリバリーシステムなどの、再構成製剤の投与のための他の装置が利用可能である。
RAGE融合タンパク質の適切な用量又は治療的有効量は、たとえば、治療される状態、該状態の重篤度及び経過、RAGE融合タンパク質が予防的又は治療的目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴及びRAGE融合タンパク質への応答、並びに担当医師の判断に依存するであろう。RAGE融合タンパク質は、（患者などの）対象に、一度に又は一連の治療にわたって投与されてよく、或いは、診断以降の任意の時点で患者に投与されてもよい。RAGE融合タンパク質は、唯一の治療として又は問題の状態の治療に有用な他の薬物又は治療とともに投与されてもよい。ある実施態様においては、たとえば、１又はそれ以上の別々の投与により、約０．１〜２０mg/kgの用量が対象への最初の候補用量である。上記のとおり、他の投与計画も有用である。
製造品
本発明の他の実施態様においては、本発明の凍結乾燥製剤を含み、かつ、その再構成及び／又は使用についての指示書を提供する製造品が提供される。製造品は、容器を含んでよい。好適な容器は、たとえば、ボトル、（デュアルチャンバーバイアルなどの）バイアル、（デュアルチャンバーシリンジなどの）シリンジ及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどのさまざまな材料で形成されてよい。容器は、凍結乾燥製剤を保持することができる。ある実施態様においては、容器に取り付けられた、又は結合したラベルがある。ラベルは、再構成及び／又は使用のための指示を示すことができる。たとえば、ある実施態様においては、ラベルは、凍結乾燥製剤が上記のタンパク質濃度に再構成されることを示すことができる。ラベルはさらに、製剤が皮下投与に有用又はそれを目的とするものであることを示すことができる。
製剤を保持する容器は、多用途バイアルであってよく、これは、再構成製剤の（２〜６、または２〜１０又は２〜５０回の投与などの）反復投与を可能とする。製造品はさらに、（WFIなどの）好適な希釈剤を含む第２の容器を含んでよい。希釈剤と凍結乾燥製剤の混合により、一般に、再構成製剤中の最終的なRAGE融合タンパク質濃度は少なくとも１０mg/mLとなる。１つの実施態様においては、再構成製剤中の最終的なRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも約２０mg/mLである。他の実施態様においては、再構成製剤中の最終的なRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも約５０mg/mLである。別の実施態様においては、再構成製剤中の最終的なRAGE融合タンパク質濃度は、少なくとも１００mg/mL、又は２００mg/mL、又は４００mg/mLである。他の実施態様においては、再構成製剤中の最終的なRAGE融合タンパク質濃度は、約１〜４００mg/mL、又は１〜２００mg/mL、又は１〜１００mg/mL、又は１０〜４００mg/mL、又は１０〜２００mg/mL、又は１０〜１００mg/mL、又は４０〜４００mg/mL、又は４０〜２００mg/mL、又は４０〜１００mg/mL、又は５０〜４００mg/mL、又は５０〜２００mg/mL、又は５０〜１００mg/mL、又は４０mg/mL〜５０mg/mLの範囲内にある。製造品はさらに、商業的及び使用者の観点から望ましい、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ及び使用のための指示を含む添付文書を含む他のものも含んでよい。
本発明の対象である本発明の概念の特徴及び利益を、以下の実施例においてさらに例解する。
実施例１A：RAGE融合タンパク質の生成
RAGE-IgG融合タンパク質を発現させるために２つのプラスミドを構築した。両プラスミドを、ヒトRAGEからの異なる長さの５’cDNA配列と、ヒトIgG Fc(γ１)からの同じ３’cDNA配列をライゲーションすることによって構築した。これらの発現配列（すなわち、ライゲーション産物）を次に、pcDNA3.1発現ベクター（Invitrogen, CA）中に挿入した。RAGE融合タンパク質のコード領域をコードする核酸配列を図２及び３に示す。TTP-4000RAGE融合タンパク質については、（太字で強調された）１〜７５３の核酸配列はRAGE N-末端タンパク質配列をコードするが、７５４〜１３８６の核酸配列は、ヒンジを含まないIgG Fcタンパク質配列をコードする（図２）。TTP-3000については、（太字で強調された）１〜４０８の核酸配列は、RAGE N-末端タンパク質配列をコードするが、４０９〜１０４１の核酸配列は、ヒンジを含まないIgG Fcタンパク質配列をコードする（図３）。
RAGE融合タンパク質を生成するために、配列番号３０または配列番号３１のいずれかの核酸配列を含む発現ベクターを、安定にCHO細胞中にトランスフェクトした。陽性の形質転換体を、プラスミドによって付与されたネオマイシン耐性について選択し、そしてクローン化した。上清のウエスタンブロット分析によって検出した高生産性クローンを増殖させ、そして遺伝子産物をProtein Aカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞が組換えTTP-4000をリッター当たり約１．３グラムのレベルで産生するように、発現を最適化した。
実施例１B:4つのドメインのRAGE融合タンパク質の別の生産
RAGE-IgG融合タンパク質を発現するためにプラスミドを構築した。プラスミドは、ヒトRAGEからの5’cDNA配列をヒトIgG Fc(γ1)からのヒンジ領域を含まない3’cDNA配列とライゲーションした。cDNAを増幅するためにPCRを用いた。さらに、５‘末端においては、PCRプライマーが、クローニングからのEcoR1制限酵素部位及びKozakコンセンサス転写開始配列を加えた。３’末端においては、PCRプライマーは、終末コドンのすぐ先にXhoI制限を加えた。３‘末端においては、PCRプライマーは、終末コドンの近くのイムノグロブリン部分内の潜在的RNAスプライス部位を除去する、２つのサイレントな塩基の変更も含んだ。プロリン（配列番号３２中のタンパク質配列の番号付で残基４５９）をコードするコドンは、CCGからCCCに、そしてグリシン（配列番号３２中のタンパク質配列の番号付で残基４６０）をコードするコドンは、GGTからGGGに変更された。EcoRI及びXhoIでPCR断片を消化し、そしてMfe Iで消化した（てEco RIとcompatableな末端を形成し）レトロベクタープラスミド（Gala, Incから入手可能なｐCNS-newMCS-WPRE（new ori））中に挿入し、そしてXho Iで消化した。クローン化されたプラスミドの挿入部分及びクローニングジャンクションを配列決定して、クローニングの間に何の突然変異もおこらなかったことを確認した。
RAGE-IgG融合タンパク質を生産するために、配列番号５４の核酸配列を含む発現ベクターを、CHO細胞中に安定にトランスフェクトした。
トランスフェクトされた細胞によって発現された、単離されたRAGE融合タンパク質TTP-4000の配列を、さまざまな特徴付け試験によって、配列番号３４又は配列番号５６のいずれか、あるいは配列番号３４及び配列番号５６の両方であるか確認した。したがって、配列番号３２の最初の２３アミノ酸によってコードされるシグナル配列を切断し、そしてN-末端残基はグルタミン（Q）またはピログルタミン酸（pE）またはそれらの混合物であった。特徴付け試験はまた、（配列番号３４又は配列番号５６の番号付に基づいて）N2及びN288におけるグリコシル化部位も示し、そして、この組換え系中で発現したときに、RAGE融合タンパク質のCH3領域が翻訳後修飾を通じてC末端残基が切断されうるということを示した。
実施例１C：３つのドメインのRAGE融合タンパク質の別の生産
TTP-4000について上記したやり方でTTP-3000などの3つのドメインのRAGE融合タンパク質（たとえば、1つのRAGEドメインと２つのIgGドメイン）を発現するためにプラスミドを構築することができる。ヒトRAGEのアミノ酸１〜１３６をコードするヒトRAGEからの5'cDNA配列を、Fcヒンジ領域を含まないヒトIgG Fc（γ1）からの3'cDNA配列とライゲーションすることによってプラスミドを構築した。cDNAの増幅のためにPCRが使用可能である。5'末端においてPCRプライマーは、クローニングのための（TTP-4000のために使用されるEco RI制限酵素部位などの）制限部位およびKozakコンセンサス翻訳開始配列を付加することができる。3'末端においてPCRプライマーは、（Xho I制限部位などの）制限部位を終止コドンのすぐ向こうに含んでよい。実施例１Bに記載したように、PCRプライマーは、イムノグロブリンCH２ドメインの3'末端に位置する潜在的RNAスプライス部位などの任意の潜在的RNAスプライス部位を除去するために必要であるかもしれないサイレントな塩基の変化も含んでよい。これらの潜在的スプライス部位を除去するためには、配列番号３５のプロリン３４４をコードするコドン（すなわち、配列番号３１のDNA配列中の番号付けに基づく残基１０３０〜１０３２）を、CCGからCCCに変更し、そして配列番号３５のグリシン３４５をコードするコドン（配列番号３１のDNA配列中の番号付けに基づく残基１０３３〜１０３５）をGGTからGGGに変更してよい。そして、PCR断片を好適な制限酵素（たとえば、Eco RI及びXho I）で消化し、レトロベクタープラスミドpCNS-newMCS-WPRE（new ori;Gala, Inc.から入手可能）中に挿入することができる。ベクターをMfe Iで消化して、Eco RIに適合する末端を形成し、そしてXho Iで消化する。クローン化プラスミドの挿入された部分及びクローニングジャンクションを配列決定して、クローニングの間に突然変異がおこっていないことを確認することができる。
RAGE-IgG融合タンパク質を生産するために、配列番号５５の核酸配列（すなわち、潜在的スプライス部位を除去するためのDNA配列の変更を含む）を含む発現ベクターを、実施例１A及び１Bに記載したとおりに、CHO細胞中へ安定にトランスフェクトすることができる。
トランスフェクトされた細胞により発現されたRAGE融合タンパク質TTP-3000の単離物の配列は、配列番号３６、配列番号３７又は配列番号５７又は配列番号３６、配列番号３６及び／又は配列番号５７の組み合わせであることができる。したがって、配列番号３５の最初の２２及び／又は２３アミノ酸によってコードされるシグナル配列を切断することができ、そして、N-末端残基はグルタミン（Q）又はピログルタミン酸（pE）又はそれらの混合物であることができる。グリコシル化は、（配列番号３７又は配列番号５７の番号付けに基づいて）N2及びN174の部位において起こることができ、及び／又は他のグリコシル化部位が存在するかもしれない。この組み換え系において発現されたとき、RAGE融合タンパク質のCH3領域は、翻訳後修飾によってC-末端残基が切断されているかもしれない。
実施例２：RAGE-IgG1融合タンパク質の活性の試験方法
A．インビトロのリガンド結合：
知られたRAGEリガンドを、1ウエルあたり５マイクログラムの濃度でMaxisorbプレートの表面上にコーティングした。プレートを４℃で一夜インキュベートした。リガンドのインキュベーション後、プレートを吸引し、そして５０mM イミダゾール緩衝液（pH７．２）中１％BSAのブロッキング緩衝液を室温で１時間、プレートに加えた。そして、プレートを吸引し、及び／または洗浄緩衝液（２０mM イミダゾール、150mM NaCl、０．０５％Tween-20、5mＭ CaCl2、及び５ｍM MgCl2、pH７．２）で洗浄した。初期濃度が１．０８２mg/mlのTTP-3000(TT3)溶液及び初期濃度が３７０μg/mlのTTP-4000(TT4)溶液を調製した。RAGE融合タンパク質を最初のサンプルの希釈度を増加させて加えた。RAGE融合タンパク質を３７℃で１時間、固定化リガンドとともにインキュベートし、その後、プレートを洗浄し、RAGE融合タンパク質の結合についてアッセイした。２１ng/１００μLの最終アッセイ濃度（FAC）まで１：１１，０００に希釈した抗ヒトIgG1マウスモノクローナル抗体、５００ng/μLのFACまで１：５００に希釈したビオチン化抗マウスIgGヤギ抗体、及びアビジン結合アルカリホスファターゼを含む免疫検出複合体を添加することによって、結合を検出した。該複合体は、１時間室温で固定化RAGE融合タンパク質とともにインキュベートし、その後、プレートを洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ基質であるパラ−ニトロフェニルホスフェート（PNPP）を加えた。複合体の固定化RAGE融合タンパク質への結合を、PNPPのパラニトロフェノール（PNP）への転換を、４０５nmにおいて分光光学的に測定することによって定量化した。
図７に示すように、RAGE融合タンパク質TTP-4000（TT4）及びTTP-3000（TT3）は、知られたRAGEリガンド、アミロイドベータ（Aベータ）、S100b（S100）、及びアンフォテリン（Ampho）と特異的に相互作用する。リガンドの非存在下、すなわち、BSAコーティングのみ（BSAまたはBSA＋洗浄）では、免疫検出複合体の非特異的結合に寄与しうるレベルを超える吸収の増加はなかった。アミロイドベータを標識リガンドとして使用する場合、アッセイの前にアミロイドベータをプレインキュベートすることが必要であるかもしれない。プレインキュベーションは、アミロイドベータが折りたたみシートの形態でRAGEに優先的に結合するため、アミロイドベータを折りたたみシート形態に自己凝集させることができる。
RAGE融合タンパク質TTP-4000及びTTP-3000とRAGEリガンドとの特異的相互作用のさらなる証拠は、RAGE融合タンパク質への結合に関して、RAGEリガンドが知られたRAGEリガンドと有効に競合することができることを示す研究によって実証される。これらの研究においては、アミロイド−β（A-ベータ）をMaxisorbプレート上に固定化し、そしてRAGE融合タンパク質を上記のように加えた。さらに、RAGEリガンドを、RAGE融合タンパク質と同時にいくつかのウエルに添加した。
TTP-4000（TT4）が123μg/mL（１：３希釈、図８）で存在した場合、RAGEリガンドはTTP-4000の結合を約２５％〜３０％ブロックしたことがわかった。TTP-4000の最初の溶液を１０または３０のファクターで希釈した場合（１：１０又は１：３０）、RAGE融合タンパク質の固定化リガンドへの結合はRAGEリガンドによって完全に阻害された。同様に、TTP-3000（TT3）が３６０μg/mLで存在した場合（１：３希釈、図９）、RAGEリガンドはTTP-3000の結合を約５０％ブロックした。TTP-3000の最初の溶液を１０のファクターで希釈した場合（１：１０）、RAGE融合タンパク質の固定化リガンドへの結合はRAGEリガンドによって完全に阻害された。したがって、RAGE融合タンパク質のRAGEリガンドへの結合の特異性は用量依存的であった。また、図８及び９に示すように、RAGE融合タンパク質の非存在下、すなわち、免疫検出複合体のみを用いた場合（「複合体のみ」）、本質的に結合は検出されなかった。
B．細胞に基づくアッセイにおけるRAGE融合タンパク質の効果
先の研究は、骨髄THP-1細胞がTNF-αをRAGEリガンドに応答して分泌することを示した。このアッセイにおいては、THP-1細胞を、１０％FBSを補充したRPMI-1640培地中で、ATCCにより提供されたプロトコールを用いて培養した。RAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）またはTTP-4000（TT4）（１０μg）、sRAGE（１０μg）、及びヒトIgG（１０μg）（すなわち、陰性対照）の存在下または非存在下で、０．１mg/ml のS100bによるRAGEの刺激を介してTNF-αを分泌するように細胞を誘発した。THP-1細胞により分泌されたTNF-αの量を、タンパク質の細胞培養への添加の２４時間後に、商業的に入手可能なTNF-αのためのELISAキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて測定した。図１０中の結果は、RAGE融合タンパク質がS100b/RAGE誘発性のTHF-αの産生をこれらの細胞において阻害することを実証する。図１０に示すように、１０μgのTTP-3000またはTTP-4000RAGE融合タンパク質の添加により、S100b（０．１mg/mlのFAC）によるTNF-αの誘導はそれぞれ約４５％〜７０％減少した。融合タンパク質TTP-4000は、Ｓ100bによるTNF-αの誘導をブロックすることにおいて、少なくともsRAGEと同等に効果的であることができる（図１０）。TTP-4000及びTTP-3000のRAGE配列についての阻害特異性を、IgGのみをS100b刺激した細胞に添加した実験によって示す。IgG及びS100bのアッセイへの添加は、S100b単独と同じレベルのTNF-αを示す。RAGE融合タンパク質のRAGE配列についてのTTP-4000及びTTP-3000によるTNF-α誘導の阻害特異性を、IgGのみをS100b刺激した細胞に添加した実験によって示す。IgG、すなわち、RAGE配列を含まないヒトIgG（１０μg/ウエルで添加したSigmaヒトIgG）、及びS100bのアッセイへの添加が、S100b単独と同レベルのTNF-αを示すことがわかる。
細胞に基づく他のアッセイにおいては、RAGEリガンドHMGB1がRAGE及び他のHMGB1受容体と相互作用することを妨害する、TTP-4000の能力を評価した。RAGEリガンドに結合し、かつRAGEリガンドとRAGEの結合を妨害する抗−RAGE抗体とは異なり、TTP-4000は、RAGEに結合することによってRAGEリガンドとRAGEの総合作用をブロックすることができる。HMGB1は、RAGEのためのリガンド及びトル様受容体２及び４として報告されている（Park et al., J. Biol. Chem., 2004;279(9):7370-7）。これら３つの受容体のすべて（RAGE、トル様受容体２及びトル様受容体４）が、THP-1細胞上で発現される（Parker et al., J. Immunol., 2004, 172(8):4977-86）。
この実験においては、TTP4000又は抗−RAGE抗体のいずれかの存在下又は非存在下で、HMGB1によりTNF-αを産生するようにTHP-1細胞を刺激する。このアッセイに用いた条件下では、HMGB1はTNF-αの唯一の誘導物質である。商業的に入手可能なTNF-アルファのためのELISAキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて、THP-1細胞により分泌されたTNF-αの量を、細胞培養にタンパク質を添加した２４時間後に測定した。図１１の結果は、抗−RAGE抗体及びRAGE融合タンパク質TTP4000が、HMGB1とTHP−1細胞上に発現されたRAGEとの相互作用することをブロックするが、TTP-4000がHMGB1により誘導されたTNF-αの産生を、抗−RAGE抗体よりも大きく阻害することを示す。したがって、データは、TTP4-000が、HMGB1がトル様受容体２及び４並びにTHP-1細胞上に存在するRAGEと相互作用することを阻害することによって、抗−RAGE抗体よりも大きく阻害しうることを示す。
実施例３：TTP-4000の薬物動態プロフィール
TTP-4000がヒトsRAGEに比べて優れた薬物動態プロフィールを有するか否かを決定するために、ラット及び非ヒト霊長類にTTP-4000（５mg/kg）を静脈内（IV）注射し、そしてTTP-4000の存在について血漿をアッセイした。これらの実験において、2匹の実験未使用の雄性のサルが末梢静脈中にIVボーラス投与のTTP-4000（５mg/ml/kg）を受容し、続いて約１．０ミリリッター（mL）の生理食塩水を流した。血液サンプル（約１．０mL）を投薬前（すなわち、TTP-4000の注射の前）、または投薬の０．０８３、０．２５、０．５、２、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、２８８、及び３３６時間後に（リチウムヘパリンを含む）チューブ中に採取した。採取の後、チューブを冷蔵下（２℃〜８℃）での1500×ｇで１５分間の遠心分離まで、湿った氷の上に置いた（最大３０分）。採取された各血漿サンプルを、実施例６に記載のように注射後のさまざまな時点におけるRAGEポリペプチドについてELISAを用いてアッセイするまで、凍結保存した（−７０℃±１０℃）。
図１２に示す速度プロフィールは、2匹の動物におけるアルファ相のかなり急勾配のスロープによって証明されるように、一旦TTP-4000がそのリガンドを飽和したら、それは３００時間超の最終半減期を保持することを明らかにする。この半減期は、血漿中のヒトsRAGEの半減期（一般に約２時間）よりも顕著に長く、そして急性及び半慢性の適応症のための単回注射の機会を提供する。図１２においては、各曲線は、同じ実験条件下での異なる動物を表す。
実施例４：TTP-4000のFcの活性化
ヒトIgGに比較した、RAGE融合タンパク質TTP-4000によるFc受容体の活性化を測定するために実験を行った。Fc受容体の活性化を、Fc受容体を発現するTHP-1細胞からのTNF-αの分泌を測定することによって測定した。これらの実験において、９６ウエルプレートを１０μg／ウエルのTTP-4000またはヒトIgGでコーティングした。Fc刺激は、TNF-α分泌を引き起こす。TNF-αの量を、酵素免疫測定法（ELISA）によって測定した。
したがって、このアッセイにおいては、骨髄細胞株、THP-1（ATCC#TIB-202）を、ATCCの指示にしたがって１０％ウシ胎児血清を補充したRPIM-1640培地中に維持した。典型的には、ウエルを１０μg／ウエルの熱凝集（６３℃で３０分）したTTP-4000またはヒトIgG1のいずれかでプレコーティングすることによるFc受容体刺激を介して、ウエルあたり４０，０００〜８０，０００細胞がTNF-アルファを分泌するよう誘導した。THP-1細胞によって分泌されたTNF-アルファの量を、処理ウエル中の細胞を２４時間培養したものから集めた上清中で、商業的に入手可能なTNF ELISAキット（R&D Systems, Minneapolis, MN#DTA00C）を使用説明書にしたがって使用して測定した。
結果を図１３に示し、ここで、TTP-4000は２ng/ウエル未満のTNFを生成し、IgGは４０ng/ウエル超を生成した。
実施例５：TTP-4000のインビボ活性
ヒト疾患のいくつかのインビボモデルにおいて、TTP-4000の活性をsRAGEに比較した。
A．再狭窄の動物モデルにおけるTTP-4000
RAGE融合タンパク質TTP-4000を、血管の損傷後の２１日間、平滑筋の増殖及び内膜の拡張を測定することを含む、再狭窄の糖尿病ラットモデルにおいて評価した。これらの実験において、左総頚動脈のバルーンによる損傷を、標準的な手順を用いてZucker糖尿病ラット及び非糖尿病ラットにおいて実施した。初期量（３mg/ラット）のIgG、TTP-4000またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を、損傷の１日前に腹腔内（IP）投与した。損傷の７日後まで、1日おき（すなわち、損傷の１、３、５及び７日後）に維持量を送達した。維持量は、1つの群については１mg/動物の高い量、または第二の群については０．３mg/動物の低い量であった。血管平滑筋細胞（VSMC）の増殖を測定するために、動物を損傷の４日および２１日後にと殺した。
細胞増殖の測定のために、４日の動物はブロモデオキシウリジン（BrDdU）５０mg/kgの腹腔内注射を、安楽死の１８、１２及び２時間前に受けた。と殺後、左及び右頚動脈の全体を採取した。標本を包埋の少なくとも２４時間前にHistochoice中に保存した。VSMC増殖の評価を、抗BrdUマウスモノクローナル抗体を用いて実施した。蛍光標識抗マウスヤギ二次抗体を適用した。切片当たりのBrdU陽性の核の数を治療計画に対してブラインドの二人の観察者が計測した。
残りのラットを形態計測分析のために２１日目にと殺した。形態計測分析は、Van Gieson染色した（５ｍｍ離れた）一連の頚動脈切片について、コンピュータ化されたデジタル顕微鏡面積測定ソフトウエアImage-Pro Plusを用いて、試験群についてブラインドの観察者が実施した。すべてのデータを平均±SDとして表した。SPSSソフトウエアを用いて統計学的分析を実施した。連続的な変数を、対応のないｔ検定を用いて比較した。０．０５以下のP値を、統計学的に有意であるとした。
図１４A及び１４Bに見られるように、TTP−４０００治療は、用量応答性に、内膜／中膜比及び血管平滑筋細胞増殖を有意に減少させた。図１４Bにおいては、ｙ軸はBrdU増殖性細胞の数を表す。
B．ADの動物モデルにおけるTTP4000
TTP-4000が、ADのマウスモデルにおいてアミロイド生成及び認知障害に影響することができるか否かを評価するために実験を行った。PDGF-B鎖プロモーターの制御下で、ヒトSweden突然変異体アミロイド前駆体タンパク質（APP）を発現するトランスジェニックマウスを利用した。経時的に、これらのマウスは高レベルのRAGEリガンド、アミロイドベータ（Aβ）を産生する。先に、このモデルにおいて、３ヶ月間のsRAGE治療が脳中のアミロイドプラークの形成及び関連する炎症性マーカーの増加を減少させることが示された。
この実験において使用したAPPマウス（雄性）は、血小板由来増殖因子B（PDGF-B）鎖遺伝子プロモーターの制御下で（Sweden 及びLondon突然変異を有する）ヒトAPP遺伝子のマウス卵子へのマイクロインジェクションによって設計した。該マウスは、C57BL/6バックグラウンドにおいて作製され、Molecular Therapeutics Inc.によって開発されたものである。動物に餌を自由摂取させ、そして同胞交配によって維持した。この構築物から作出したマウスは６月齢にアミロイド沈着をはじめた。動物は６ヶ月間老化させ、そして９０日間維持し、アミロイド定量のためにと殺した。
APPトランスジェニックマウスに、６月齢時に開始して９０日間、ビヒクルまたはTTP4000を1日おきに[qod(i.p.)]投与した。実験の最後に、動物をと殺し、そして脳中のAβプラーク負荷（すなわち、プラーク数）をについて調べた。６ヶ月の対照APP群を、アミロイド沈着のベースラインを決定するためにと殺した。さらに、試験の最後に、動物を（モーリス水迷路）行動分析に供した。研究者らは、試験化合物についてはブラインドであった。一日おきに、０．２５ml/マウスのサンプルをマウスに与えた。さらに、一群のマウスには、ヒトsRAGEを２００μg/日で与えた。
１．アミロイドベータの沈着
組織学的試験のために、動物をペントバルビタールナトリウム（５０mg/kg）の腹腔内注射（IP）によって麻酔した。動物を、４℃のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、続いて４％パラホルムアルデヒドで経心的にかん流した。脳を切除し、４％パラホルムアルデヒド中に一夜置いた。脳をパラフィン処理し、そして包埋した。脳から１０個の一連の３０μmの厚さの切片を得た。トランスジェニック動物の脳中でのアミロイド沈着を検出するために、４℃で一夜、切片を一次抗体（Aβペプチド抗体）に供した（Guo et al., J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)）。切片を、トリス緩衝生理食塩水（TBS）で洗浄し、そして二次抗体を加えて、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、切片を、Vector ABC Eliteキット（Vector Laboratories）により指示されたようにインキュベートし、そしてジアミノ安息香酸（DAB）で染色した。反応を水中で停止させ、そしてキシレン処理後にカバーガラスを載せた。各切片中のアミロイド面積を、Quick Captureフレームグラバーカードを備えたPower Macintosh（登録商標）コンピュータ、Olympus顕微鏡上に搭載したHitachi CCDカメラ及びカメラスタンドから成る、コンピュータ支援画像分析システムによって決定した。NIH Image Analysis Software、v.1.55を使用した。画像を捕捉し、そしてアミロイドの総面積を１０個の切片にわたって決定した。治療状態についてブラインドの一人のオペレーターがすべての測定を行った。切片のアミロイド体積を合計し、切片全体で割って、アミロイド体積を計算した。
定量分析のためには、APPトランスジェニックマウス（Biosource International, Camarillo, CA）の脳中のヒト総AβであるAβtotal及びAβ1-42を測定するために、酵素免疫測定法（ELISA）を使用した。Aβtotal及びAβ1-42は、塩酸グアニジンによってマウス脳から抽出し、そして製造者の記載のとおりに定量した。このアッセイは、脳からの（可溶性及び凝集した両方の）Aβペプチド全体を抽出する。
２．認知機能
モーリス水迷路試験を以下のように実施した：すべてのマウスを、実験の最後にモーリス水迷路試験で一回、試験した。マウスには、１．２ｍのオープンフィールド水迷路でトレーニングした。プールに、深さ３０cmの水を満たし、そして２５℃に維持した。逃避プラットフォーム（１０cm平方）を水表面の１cm下に置いた。トライアルの間、プラットフォームをプールから除去した。いかなる迷路外の手がかりも隠すために、白いカーテンで囲ったプール中で手がかり試験を行った。すべての動物が連続して３日間、非空間的なプレトレーニング（NSP）を受けた。これらは、プラットフォームを見つけるための記憶の保持を測定するための最終的な行動試験用の動物を準備するためのトライアルである。これらのトライアルは記録されず、トレーニングのみを目的とするものである。トレーニング及び学習の試験のためには、迷路外の手がかりに対してカーテンを取り除いた（これは、泳ぎの障害を有する動物を同定することを可能とする）。第１日において、マウスを隠れたプラットフォーム上に２０秒間置き（トライアル１）、トライアル２〜３のためには、動物を手がかりのあるプラットフォームまたは隠れたプラットフォーム（トライアル４）から１０cm離れたところで放した。トライアルの第２日において、プールの中心または各四分円の中心の間に、隠れたプラットフォームを無作為に移動させた。無作為に壁に向かって動物をプール中に放し、プラットフォームに到達するために６０秒間を許容した（３つのトライアル）。第３のトライアルにおいて、動物に３つのトライアル、２つは隠れたプラットフォーム、そして１つは手がかりのあるプラットフォームによる、を与えた。NSPの２日後、動物を最後の行動トライアル（モーリス水迷路試験）に供した。これらのトライアルについては（動物につき３回）、プラットフォームは、プールの１つの四分円の中心におき、無作為に、壁に向かって動物を放した。動物は、６０秒間（潜期、プラットフォームを見つけるのにかかる時間）、プラットフォームを探し、または泳ぐことが可能である。すべての動物を投薬の４〜６時間以内に試験し、試験群に対してブラインドのオペレーターが、試験のために無作為に選択した。
結果を、平均±標準偏差（SD）として表した。アミロイドと行動試験における相違の有意性をｔ−検定法を用いて分析した。６月齢のAPP対照群とTTP-4000処置動物、並びに９月齢のAPPビヒクル処理群及びTTP-4000処置動物の間で比較を行った。０．０５未満の相違を有意であると考えた。アミロイド及び行動における変化のパーセントを、各群におけるデータを合計し、そして対照で割ることによって決定した（すなわち、１、i.p./6月対照＝変化の％）。
図１４A及び１４Bは、TTP-4000またはsRAGEのいずれかで３ヶ月治療したマウスがビヒクル及び陰性対照ヒトIgG1（IgG1）で治療した動物よりもより少ないAβプラーク及びより少ない認知障害を有したことを示す。sRAGEのように、TTP-4000が炎症性サイトカインIL-1及びTNF-αを減少させることができることもわかった（データは示さない）。
C．脳卒中の動物モデルにおけるTTP-4000の有効性
脳卒中の病気に関連した動物モデルにおいても、TTP-4000をsRAGEと比較した。このモデルにおいては、マウスの中部頚動脈を１時間結紮し、その後２３時間再かん流し、その時点でと殺して脳内の梗塞領域を評価した。マウスを再かん流の直前にsRAGEまたはTTP-4000または対照イムノグロブリンで処置した。
これらの実験において、雄性C57BL/6に、２５０μl／マウスのビヒクルまたは（２５０μl／マウスのTTP-3000、TTP-4000の）TTP試験品を注射した。虚血の開始１時間後にマウスに腹腔内注射した。２４時間の再かん流後、１時間の脳虚血にマウスを供した。虚血を誘発するために、各マウスを麻酔し、そして外部から温めることによって体温を３６〜３７℃に維持した。首の正中線切開によって左総頚動脈（CCA）を露出させた。マイクロサージカルクリップを内頚動脈（ICA）の起点の周囲に設置した。ECAの遠位末端をシルクで結紮し、そして横切開した。６−０シルクをECAの切開口の周りに緩く結んだ。先端熱加工したナイロン縫合糸をそっとECAの切開口に挿入した。６−０シルクのループを切開口の周りにきつく締め、そしてナイロン縫合糸を、前大脳動脈に達して前交通動脈及び中部脳大動脈を閉塞するまで、内頚動脈（ICA）を通して進めた。ナイロン縫合糸を所定の位置に１時間おいた後、動物を再麻酔し、直腸温度を記録し、そして縫合糸を除去し、切開を閉じた。
動物をペントバルビタールナトリウム（５０mg/kg）を腹腔内注射して麻酔し、そして脳を切除することによって、梗塞体積を測定した。そして、梗塞領域全体を通じて、脳を４つの２mm切片に切断し、そして２％塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）中に３０分間置いた。その後、切片を４％パラホルムアルデヒド中に一夜置いた。各切片中の梗塞面積を、Quick Captureフレームグラバーカードを備えたPower Macintosh（登録商標）コンピュータ、Olympus顕微鏡上に搭載したHitachi CCDカメラ及びカメラスタンドから成る、コンピュータ支援画像分析システムを用いて決定した。NIH Image Analysis Software、v.1.55を使用した。画像を捕捉し、そしてアミロイドの総面積を１０個の切片にわたって測定した。治療状態についてブラインドの一人のオペレーターがすべての測定を行った。切片の梗塞体積を合計し、総梗塞体積を計算した。結果は、平均±標準偏差（SD）で表す。梗塞体積データにおける相違の有意性を、ｔ−検定を用いて分析した。
表２中のデータに例解されるように、TTP-4000は、これらの動物における梗塞領域を制限することにおいてsRAGEよりもより有効であったことは、TTP-4000がそのより良い血漿中半減期により、これらのマウスにおいてより大きな保護を維持することができることを示唆している。
実施例６：ELISAによるRAGE融合タンパク質の検出
最初に、１XPBS pH 7.3中、１０μg/mlの濃度のRAGE特異的モノクローナル抗体1HB１０１１の５０μLを、一夜インキュベーションすることによってプレート上にコーティングした。使用の準備ができたら、プレートを３００μLの１Xイミダゾール−Tween洗浄緩衝液で３回洗浄し、そして１％BSAでブロッキングした。（希釈）サンプルと既知の希釈率のTTP-4000の標準希釈液を、最終体積１００μLで加えた。サンプルを室温で１時間インキュベートする。インキュベート後、プレートを３回洗浄する。１％BSAを含む１X PBS中の抗ヒトIgG1１ヤギ抗体（Sigma A3312）APコンジュゲートを加え、室温で１時間インキュベートする。プレートを３回洗浄する。パラニトロフェニルホスフェートで色を明確にする。
実施例７：RAGE融合タンパク質に対するRAGEリガンドの結合の定量
図１５は、TTP-4000によるさまざまな固定化された既知のRAGEリガンドへの飽和−結合曲線を示す。リガンドをマイクロタイタープレート上に固定化し、０〜３６０nMで増加する濃度の融合タンパク質の存在下でインキュベートした。融合タンパク質−リガンド相互作用を、アルカリホスファターゼと結合した、融合キメラのIgG部分に特異的なポリクローナル抗体を用いて検出する。相対的Kdを、Graphpad Prizmソフトウエアを用いて計算し、そしてRAGE-RAGEリガンド値の確立された文献値とマッチさせた。HMG1B＝アンフォテリン、CML=カルボキシメチルリジン、Aベータ＝アミロイドベータ１〜４０。
以上は、本発明の原理を例示するのみであると考えられる。当業者は多くの修飾及び変更に容易に想到するため、以上は、本発明を示されそして記載された実施態様そのものに限定することを意図せず、かつ、添付された請求項の範囲に属するすべての好適な修飾及び等価物は本発明の概念内にある。
実施例８：同種異系移植拒絶の予防のためのRAGE融合タンパク質の使用
RAGEのブロックは、同種異系移植拒絶をブロックすることが期待される。これらの実験は、本発明のRAGE融合タンパク質を用いるリガンド−RAGE相互作用の封鎖が、移植を受けた動物が標的濃度未満に血中グルコースレベルを維持する時間の長さによって測定した、健康なドナーから糖尿病動物に移植された島細胞の拒絶を減弱するかを解明した。本明細書において検討するとおり、島細胞移植を受けた糖尿病動物への（TTP-4000などの）RAGE融合タンパク質の投与が、高血糖症の再発、そしてしたがって、2つの（同種異系及び同系）移植動物モデルにおいて移植された島細胞の拒絶を遅らせたことがわかった。
Ａ．マウスにおける同種異系島細胞移植
第１組の実験は、RAGE融合タンパク質（TTP-4000）の投与が、移植された島細胞の同種異系拒絶及び糖尿病のC57BL/6J（B6）マウスモデルにおける糖尿病の再発を調節するかを試験した。
糖尿病の動物モデル
C57BL/6J（６〜８週齢）（B6）マウスを、ストレプトゾトシン（STZ）（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）の２００mg/kgでの単回静脈内注射によって糖尿病とした。BALB/cJ（６〜８週齢）（BALB）マウスは島細胞のドナーの役割をはたし、したがって、島細胞移植の同種異系不適合（allo-mismatch）を提供する。
島細胞の単離
マウス（BALB/c）をケタミンHCl/キシラジンHCl溶液（Sigma, St. Louis MO）で麻酔した。１．５mg/mlのコラゲナーゼP（Roche Diagnostics, Branchburg, NJ）を含む冷Hank's緩衝液（HBSS, Gibco, Grand Island NY）３mlの管内注射後に、膵臓を手術によって得て、そして３７℃で２０分間消化した。島細胞をHBSSで洗浄し、４つの異なる密度（２６％、２３％、２０％及び１１％）を有するPolysucrose 400（Cellgro, Herndon VA）を用いる不連続な密度勾配遠心分離によって精製した。２０％及び２３％の層の界面にある組織断片を集め、洗浄し、そしてHBSS中に再懸濁した。結合腺房、血管及び管組織のない個々の島細胞を倒立顕微鏡下で選び、移植のための高度に精製された島細胞を得た。
島細胞移植
ストレプトゾトシンにより誘発された糖尿病C57BL/6（B6）マウスは、糖尿病の診断から２日以内に島細胞の移植を受けた。BALB/cJ（６〜８週齢）（BALB）マウスは同種異系島細胞移植のドナーとしての役割を果たした。移植のために、ドナーマウスからの５００〜６００個の新たに単離された島細胞（すなわち、約５５０個の島細胞等価物）を輸注セットで取り出し、そしてレシピエントの右腎臓の莢膜下スペース中に移植した。
試験化合物による治療
島細胞が移植されたらすぐに試験化合物を投与し；対照動物がどのようにうまくいくかによって、約６０日間投与を持続した。マウスに０．２５mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）、PBS中TTP-4000、又はPBS中IgGを以下の治療計画に従って注射した（表３）。
Figure 2009536201
島細胞移植片の機能のモニタリング
島細胞移植片の機能を、島細胞移植後最初の２週間の毎日、その後は１日おきの、一連の血中グルコースの測定によってモニターした。糖尿病の回復は、２つの連続した測定における２００mg/dl未満の血中グルコースレベルによって定義した。血中グルコースレベルが２つの連続した測定において２５０mg/dlを超えたときに、移植片機能損失と定義した。結果を表４に示す。
Figure 2009536201
B6マウスにおけるBALB/c島細胞についての同種異系拒絶に対するTTP-4000投与の効果を、図１７中のKaplan-Meier累積生存率プロットとして示す。まったく治療されない動物（対照）又はビヒクル（PBS）若しくはヒトIgG1で治療された動物とは対照的に、TTP-4000（群１及び３）で治療された動物については移植片機能損失の検出までの時間の増加が見られた。さまざまな統計学的分析（Mantel-Cox Logrank、Breslow-Gehan-Wilcoxon；Tarone-Ware、Peto-Peto-Wilcoxin；及びHarrington-Fleming）を用いて対照及びTTP-4000（群１及び３）の間の相違は有意であった（表５）。
Figure 2009536201
Ｂ．自己免疫疾患のモデルとしてのＮＯＤ−マウスにおける島細胞移植
RAGE融合タンパク質（すなわち、TTP-4000又はTTP-3000）の投与がNODマウスにおいて再発性糖尿病の経過を変更させるか否かを試験するために、同系NOD移植モデルを用いて第二の実験セットを行った。
糖尿病の動物モデル
自然発症自己免疫非肥満糖尿病マウス（NOD/LtJ）（１２〜２５週齢）は島細胞のレシピエントとしての役割を果たし、一方、若い前糖尿病性NOD/LtJマウス（６〜７週齢）は、同系島細胞移植のドナーとしての役割を果たした。移植のための島細胞は、セクションA（同種異系島細胞移植）に上記したとおりに単離した。
島細胞移植
糖尿病NOD/LtJマウスは、糖尿病の診断から２日以内に島細胞移植片を受容した。ドナーマウスからの５００〜６００個の新たに単離された島細胞（約５５０個の島細胞等価物）を輸注セットで取り出し、そしてレシピエントの右腎臓の莢膜下スペース中に移植した。
試験化合物による治療
島細胞が移植されたらすぐに試験化合物を投与し、そして約８週間持続した。マウスに０．２５mlのPBS、PBS中TTP-4000、又はPBS中TTP-3000を、以下の治療計画（表６）にしたがって注射した。
Figure 2009536201
島細胞移植片機能のモニタリング
島細胞移植片の機能を、島細胞移植後最初の２週間の毎日、その後は１日おきの、一連の血中グルコースの測定によってモニターした。糖尿病の回復は、２つの連続した測定における２００mg/dl未満の血中グルコースレベルによって定義した。血中グルコースが２つの連続した測定において２５０mg/dlを超えたときに、移植片機能損失のパーセンテージを決定した。結果を表７に示す。
Figure 2009536201
糖尿病NODマウスにおける同系移植された島細胞の拒絶に対するTTP-4000投与の効果を、図１８中のKaplan-Meier累積生存率プロットとして示す。表７のデータに示すとおり、まったく治療されない動物（対照）とは対照的に、TTP-4000（群１）及びTTP-3000（群２）で治療された動物については移植片機能損失の検出までの時間の増加が見られた。図１８は、TTP-4000（群１）で治療された動物及びまったく治療されなかった動物についての移植片機能損失の検出までの時間の増加を示す。さまざまな統計学的分析（Mantel-Cox Logrank、Breslow-Gehan-Wilcoxon；Tarone-Ware、Peto-Peto-Wilcoxin；及びHarrington-Fleming）を用いて対照及びTTP-4000（群１）及びTTP-3000（群２）の間の相違は有意であった（表８）。
Figure 2009536201
実施例９−RAGE融合タンパク質凍結乾燥製剤
RAGE融合タンパク質TTP-4000を用いて凍結乾燥製剤の開発において、凍結乾燥および再構成後のタンパク質の安定性を測定することによって凍結乾燥保護剤及び緩衝剤を最初にスクリーニングした。各製剤中の凍結乾燥タンパク質は、その品質保持期間にわたるタンパク質の潜在的安定性を決定するために、安定性加速試験にも供した。
最初のスクリーニング試験においては、凍結バルクとして製剤されたTTP-4000の適切な溶解性及び安定性を提供し、約５０mg/mL以上のRAGE融合タンパク質濃度を有する再構成製剤を提供しうる製剤条件を評価するために実験を設計した。酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン及び塩化ナトリウムを含む製剤を、シュークロース及びマンニトールとともに試験した。５．５及び７．０の間のさまざまなpHも評価した。
TTP-4000の生物物理学的及び化学的安定性を、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、SDS-Page、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、円二色性（CD）、ペプチドマッピング及び紫外−可視光吸収（UV-Vis）を用いて評価した。
クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、シュークロース、マンニトール及びTween80のうちの１つ以上を含む製剤中のRAGE融合タンパク質のpH７．０以下における溶解度に基づいて、これらの緩衝剤、凍結乾燥保護剤又は界面活性剤のうちの１つ以上を含む製剤を更なる試験のために選んだ。
実施例１０−RAGE融合タンパク質凍結乾燥製剤
実施例９において収集した情報に基づいて、TTP-4000のさらなる製剤について試験した。凍結乾燥過程を通じて安定な製品を維持し、再構成後に高濃度のTTP-4000（すなわち、約５０mg/mL以上）を潜在的に達成するために有用な緩衝剤及び／又は凍結乾燥保護剤を同定することに試験の焦点を当てた。２週間の安定性加速試験の間に６つの製剤について試験した。製剤を表９に要約する。試験は、以下に記載するように、より高い用量のTTP-4000（２５０mg）のための凍結乾燥サイクルを開発することにも焦点を当てた。
凍結乾燥後に、製剤開発用サンプルバイアルを圧着し、４０℃のチャンバーに２週間置いた。スケールアップした開発サンプルを、試験の実施まで２〜８℃で貯蔵した。
サンプル分析法
サンプル中のTTP-4000の濃度を、UV-Vis分光法によって測定した。Aglient UV-Visを、タンパク質スペクトル及び緩衝液ブランクスペクトルを得るために使用した。吸光度値が得られたら、該値を任意のタンパク質凝集の結果として発生しうる光散乱について補正した。
Karl Fisher滴定法を用いて残留水分を分析した。凍結乾燥製剤開発用サンプルを、適切な量のWFIで再構成した。再構成のための時間は、水が添加されるときから可視的な固体がなくなるときまでの時間とする。適切に較正されたセミマイクロプローブを用いて各サンプルのpHを再構成後に測定した。
凍結乾燥および加速条件下での貯蔵中のTTP-4000の物理学的安定性（分解及び可溶性凝集物の生成）を分析し、モニターするために、TSKgel Super SW2000カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を実施した。サンプルを、2つのTSKgel Super SW2000、４．６×３００mm、４μmカラムを取り付けたAglient 1100シリーズLC中に注入した。
粒子カウントを測定するために、１mLのサンプルを２０mLに２０倍希釈した。サンプルを約３０秒間の超音波処理によってガス抜きし、泡を入れないようにして手動で回転させることによって穏やかに攪拌した。各５mLの体積の３つのアリコートを光遮断型カウンタセンサー中に引き込んだ。蓄積モードにセットした装置で、１０μm以上及び２５μm以上の設定で粒子を集めた。
結果
実施例９の予備処方試験に基づいて、２つの緩衝剤、クエン酸ナトリウム及びL-ヒスチジン、を最初に調べた。遠心分離濃縮装置を用いて濃縮製剤１〜６（表９）を調製した。表９の製剤１〜６中の最終タンパク質濃度は、約４〜１５mg/mLの範囲内にあった。
Figure 2009536201
表９中の製剤１〜６を用いて、０．７mLの充填体積でバイアル（２mL）を用いた。バイアルの上部空間を空気で満たした。乾燥の前に、−５０℃〜−２０℃の棚温度でサンプルを凍結した。１００mTorrの減圧下および−２０℃〜−１０℃の棚温度で約３６時間、続いて、２０℃の棚温度で約１２時間、サンプルを乾燥させた。凍結乾燥の後、バイアルに栓をして、頂部を圧着した。凹凸のあるケーキが製剤１〜６から作られた。
製剤の化学的安定性を調べるために凍結乾燥生成物を安定性加速化試験に供した。凍結乾燥生成物を、４０℃、相対湿度７０％で２週間おいた。
凍結乾燥生成物を０．２０６mLの水で再構成した。すべての凍結乾燥生成物を２０秒以内で再構成した。２週間の保存期間の間中、すべての再構成製剤のpHは一定であった。凍結乾燥生成物についての０及び２週間時点で測定した残留水分値は、３．０％〜０．８％であり、凍結乾燥サイクルが凍結乾燥前製剤を十分に乾燥させることができた。すべての再構成製剤のモル浸透圧濃度は、２５０mOsm/kg〜４００mOsm/kgの望ましい等張性範囲内にあった（表１０を参照のこと）。各再構成製剤の粘度は、３．７cP（センチポアズ）未満であった。
Figure 2009536201
凍結乾燥過程の様々な工程で得た表１０中の製剤５のサンプルについてSEC分析を実施し、これらの製剤においては、TTP-4000は凍結乾燥過程のどの工程に対しても特に感受性でなかったことを、凝集体及び分解種の低いレベルに基づいて示唆した。
SEC分析を、凍結乾燥前の凍結乾燥前製剤並びに０時点及び２週間の安定性加速化試験後の再構成製剤についても実施した。不純物（凝集体又は分解生成物）の量は、一致して低かった（すなわち、４％未満）（表１１）。
Figure 2009536201
ペプチドマッピングにより、凍結乾燥及び加速化条件下での保存によるTTP-4000の酸化または脱アミド化がないことが明らかとなった。
製剤１、３、４、及び６についてSDS-PAGEを実施し、凍結乾燥及び保存過程の間中、これらの製剤中でTTP-4000が物理学的に安定であったことを示した。
５０mL凍結乾燥バイアル及び２５０ｍｇのTTP-4000の用量で使用するために凍結乾燥過程をスケールアップするために、限外濾過を用いて溶液を１５mg/mLのTTP-4000に濃縮し、そしてpH６．０の１０mMヒスチジンおよび６５mMシュークロースに対して溶液をダイアフィルトレーションした。最終量０．０１％(vol/vol)のTween80を添加した。
凍結乾燥前製剤（１６．６７mL）を５０mLバイアルのそれぞれに加えた。サンプルを凍結乾燥サイクルに曝露し、ここで、サンプルを５℃〜−５℃の棚温度で３０分間冷却し、その後、約３時間、−５０℃の棚温度で冷却した。１００mTorrの減圧下及び−２０℃〜−１０℃の棚温度で約３４時間、その後、５℃〜２０℃の棚温度で約１１時間、乾燥した。凍結乾燥後、バイアルに栓をして、頂部を圧着した。医薬として美しい白色のケーキが生成した。ケーキは凹凸があり、取扱い及び保存の間にその構造を損なわなかったようである。
２８０nmの吸収により測定した再構成サンプルのTTP-4000濃度は、４０．５mg/mLであった。追加の試験においては、同様の条件下で、再構成サンプル中のTTP-4000濃度は一貫して５０mg/mLであった。
再構成サンプルを、室温での０、２及び６時間の保存における微粒子成分について測定した。表１２の結果は、再構成サンプルが低い量の微粒子成分を有したことを示す。
Figure 2009536201
要約すると、シュークロース、マンニトール及びTween80のうちの１つ以上を含む、クエン酸及びヒスチジン緩衝液中でTTP-4000を製剤化した。試験は、クエン酸ナトリウムまたはヒスチジンを含む製剤が類似の性能特性を有し、TTP-4000がヒスチジンを含む製剤中でより安定であることができることを示した。
ヒスチジンを含む製剤をさらなるスケールアップ試験にかけた。凍結乾燥サイクル後、TTP-4000の化学的及び物理学的安定性を評価し、ヒスチジン製剤間で有意な相違は検出されなかった。また、マンニトールを製剤から除外した。製剤開発試験から選ばれた最終的な製剤は、１０mMのヒスチジン、６０mMのシュークロース、及び０．０１％のTween80をpH６．０において含有した。この製剤は、凍結乾燥及び保存の間、TTP-4000を安定に保つ優れた能力を有し、試験の間、最も高いTTP-4000濃度を提供した。スケールアップ試験においては、製剤のモル浸透圧濃度を等張に近づけるために、シュークロースレベルを６５mMに上げた。スケールアップ試験の間、TTP-4000凍結乾燥前製剤及び再構成製剤のpHを約pH６．０から６．７未満に維持することが、タンパク質の沈殿または凝集を減少させるのに有用であることもわかった。
上記は、本発明の原理を例解するにすぎないものと考えられる。当業者は多数の改変及び変更に容易に想到するであろうから、本発明を示されそして記載された実施態様そのものに限定することを目的とせず、添付の請求項の範囲内に含まれるすべての好適な改変及び等価物は本発明の概念のうちにあると認められる。
本発明のさまざまな特徴、側面及び利益は、以下の図を参照することでより明らかとなるであろう。
図１Ａは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列およびイムノグロブリン配列を示す：配列番号１、ヒトRAGEのアミノ酸配列；及び配列番号２、アミノ酸１〜２２のシグナル配列を含まないヒトRAGEのアミノ酸配列。 図１Ｂは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号３、アミノ酸１〜２３のシグナル配列を含まないヒトRAGEのアミノ酸配列。 図１Ｃは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号４、ヒトsRAGEのアミノ酸配列；配列番号５、アミノ酸１〜２２のシグナル配列を含まないヒトsRAGEのアミノ酸配列；及び配列番号６、アミノ酸１〜２３のシグナル配列を含まないヒトsRAGEのアミノ酸配列。 図１Ｄは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号７、ヒトRAGEのV-ドメインを含むアミノ酸配列；配列番号８、ヒトRAGEのV-ドメインを含む別のアミノ酸配列；配列番号９、ヒトRAGEのV-ドメインのN-末端断片；配列番号１０、ヒトRAGEのV-ドメインの別のN-末端断片；配列番号１１、ヒトRAGEのアミノ酸１２４〜２２１のアミノ酸配列；配列番号１２、ヒトRAGEのアミノ酸２２７〜３１７のアミノ酸配列；配列番号１３、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１２３のアミノ酸配列。 図１Ｅは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号１４、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１２３のアミノ酸配列；配列番号１５、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜１３６のアミノ酸配列；配列番号１６、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６のアミノ酸配列；配列番号１７、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２２６のアミノ酸配列；配列番号１８、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２２６のアミノ酸配列。 図１Ｆは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号１９、ヒトRAGEのアミノ酸２３〜２５１のアミノ酸配列；配列番号２０、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜２５１のアミノ酸配列；配列番号２１、RAGEドメイン間リンカー；配列番号２２、第二のRAGEドメイン間リンカー；配列番号２３、第三のRAGEドメイン間リンカー；配列番号２４、第四のRAGEドメイン間リンカー。 図１Ｇは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号２５、ヒトRAGEアミノ酸１〜１１８をコードするDNA；配列番号２６、ヒトRAGEアミノ酸１〜１２３をコードするDNA；配列番号２７、ヒトRAGEアミノ酸１〜１３６をコードするDNA。 図１Ｈは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号２８、ヒトRAGEアミノ酸１〜２３０をコードするDNA；及び配列番号２９、ヒトRAGEアミノ酸１〜２５１をコードするDNA。 図１Ｉは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号３８、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインの部分的アミノ酸配列；配列番号３９、ヒトIgGのヒトCH2及びCH3ドメインの部分をコードするDNA；配列番号４０、ヒトIgGのCH2及びCH3ドメインのアミノ酸配列。 図１Ｊは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号４１、ヒトIgGのヒトCH2及びCH3ドメインをコードするDNA；配列番号４２、ヒトIgGのCH2ドメインのアミノ酸配列；配列番号４３、ヒトIgGのCH3ドメインのアミノ酸配列；及び配列番号４４、第五のRAGEドメイン間リンカー。 図１Ｋは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列を示す：配列番号４５、アミノ酸１〜２３のシグナル配列を含まないヒトSrageのアミノ酸配列であって、ここで、Ｎ−末端のグルタミン残基が環化してピログルタミン酸を形成している；配列番号４６、ヒトsRAGEのV-ドメインを含む別のアミノ酸配列、ここで、N-末端のグルタミン残基は環化してピログルタミン酸を形成している；配列番号４７、ヒトsRAGEのV-ドメインを含む別のアミノ酸配列、ここで、N-末端のグルタミン残基は環化してピログルタミン酸を形成している；配列番号４８、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６のためのアミノ酸配列、ここで、N-末端にあるグルタミン残基は環化してピログルタミン酸を形成している。 図１Lは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列およびイムノグロブリン配列を示す：配列番号４９、ヒトRAGEのアミノ酸２４〜１３６のためのアミノ酸配列、ここで、N-末端のグルタミン酸残基は環化してピログルタミン酸を形成している。配列番号５０、ヒトRAGEのアミノ酸配列２４〜２２６のためのアミノ酸配列、ここで、、N-末端のグルタミンサン残基は環化してピログルタミン酸を形成している。配列番号５１、ヒトRAGEのアミノ酸配列２４〜２５１のためのアミノ酸配列、ここで、、N-末端のグルタミンサン残基は環化してピログルタミン酸を形成している。 図１Ｍは、本発明の別々の実施態様による多様なRAGE配列およびイムノグロブリン配列を示す：配列番号５２、配列番号３８中のヒトＩｇＧのCH2及びCH3ドメインの部分をコードする別のDNA配列。配列番号５３、配列番号４０中のヒトＩｇＧのCH2及びCH3ドメインの部分をコードする別のDNA配列。 図２Ａは、本発明の実施態様による第一のRAGE融合タンパク質（TTP-4000）をコードする別のDNA配列（配列番号３０（図２Ａ））を示す。太字で強調したコード配列１〜７５３は、RAGE N末端タンパク質配列をコードし、配列７５４〜１３８６は、ヒンジ領域を含まないヒトIgG Fc（γ１）タンパク質配列をコードする。 図２Ｂは、本発明の実施態様による第一のRAGE融合タンパク質（TTP-4000）をコードする別のDNA配列（配列番号５４（図２Ｂ））を示す。太字で強調したコード配列１〜７５３は、RAGE N末端タンパク質配列をコードし、配列７５４〜１３８６は、ヒンジ領域を含まないヒトIgG Fc（γ１）タンパク質配列をコードする。 図３Ａは、本発明の実施態様による、別のRAGE融合タンパク質（TTP-3000）コードする別のDNA配列（配列番号３１（図３Ａ））を示す。太字で強調したコード配列１〜４０８は、RAGE N-末端タンパク質配列をコードし、配列４０９〜１０４１はヒンジ領域を含まないヒトIgG Fc（γ1）タンパク質配列をコードする。 図３Ｂは、本発明の実施態様による、別のRAGE融合タンパク質（TTP-3000）コードする別のDNA配列（配列番号５５（図３Ｂ））を示す。太字で強調したコード配列１〜４０８は、RAGE N-末端タンパク質配列をコードし、配列４０９〜１０４１はヒンジ領域を含まないヒトIgG Fc（γ1）タンパク質配列をコードする。 図４は、それぞれ、本発明の別々の実施態様による、４つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードする、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号５６のアミノ酸配列を示す。RAGE配列は、太字で強調されている。 図５は、それぞれ、本発明の別々の実施態様による、３つのドメインのRAGE融合タンパク質をコードする、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号５７のアミノ酸配列を示す。RAGE配列は、太字で強調されている。 図６Aは、ヒトRAGE及びヒトIgガンマ-1 Fcタンパク質中のたんぱく質ドメインの比較、並びに本発明の別々の実施態様によるTTP-3000（１３６位）及びTTP-4000（２５１位）を作製するために使用される切断ポイントを示す。 図６Bは、本発明の別々の実施態様によるTTP-3000及びTTP-4000のドメイン構造を示す。 図７は、本発明の実施態様による、RAGEリガンドであるアミロイド−ベータ（A-ベータ）、S100b（S100）及びアンフォテリン（Ampho）へのsRAGE及び第一のRAGE融合タンパク質TTP-4000（TT4）及び第二のRAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）のインビトロの結合アッセイの結果を示す。 図８は、本発明の実施態様による、第一のRAGE融合タンパク質TTP-4000（TT4）（「タンパク質」）の、免疫検出試薬のみを含む（「複合体のみ」）陰性対照に比較した、アミロイド−ベータに対するインビトロの結合アッセイの結果、及びRAGEアンタゴニスト（「RAGEリガンド」）によるかかる結合のアンタゴニズムを示す。 図９は、本発明の実施態様による、第二のRAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）（「タンパク質」）の、免疫検出試薬のみを含む（「複合体のみ」）陰性対照に比較した、アミロイド−ベータに対するインビトロの結合アッセイの結果、及びRAGEアンタゴニスト（「RAGEリガンド」）によるかかる結合のアンタゴニズムを示す。 図１０は、本発明の実施態様による、S100b-RAGE誘発性のTNF-α産生の、RAGE融合タンパク質TTP-3000（TT3）及びTTP-4000（TT4）、並びにsRAGEによる阻害を測定する、細胞に基づくアッセイの結果を示す。 図１１は、本発明の実施態様による、HMGB1-RAGE誘発性のTNF-α産生の、RAGE融合タンパク質TTP-4000及び抗-RAGE抗体による阻害を測定する、細胞に基づくアッセイの結果を示す。 図１２は、本発明の実施態様による、RAGE融合タンパク質TTP-4000の薬物動態プロフィールを示し、ここで、各曲線は同じ実験条件下での異なる動物を表す。 図１３は、本発明の実施態様による、炎症反応の尺度としての、RAGE融合タンパク質TTP-4000による刺激及びヒトIgG刺激によるTHP-1細胞からのTNF-α放出の相対的レベルを示す。 図１４Ａは、本発明の別々の実施態様による、糖尿病の動物における再狭窄を減少させるためのRAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示し、ここで、TTP-4000RAGE-融合タンパク質が、陰性対照（IgG）に比べて、内膜／中膜比を減少させたことを示す。 図１４Ｂは、本発明の別々の実施態様による、糖尿病の動物における再狭窄を減少させるためのRAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示し、ここで、TTP-4000RAGE-融合タンパク質が、用量依存的に血管平滑筋細胞の増殖を減少させたことを示す。 図１５Ａは、本発明の別々の実施態様による、アルツハイマー病（AD）を有する動物におけるアミロイド形成を減少させるための、RAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示し、ここで、TTP-4000RAGE融合タンパク質は脳中のアミロイド負荷を減少させた。 図１５Ｂは、本発明の実施態様による、アルツハイマー病（AD）を有する動物における認知障害を減少させるための、RAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示し、ここで、TTP-4000RAGE融合タンパク質は、認知障害を改善した。 図１６は、本発明の実施態様による、さまざまな固定化された既知のRAGEリガンドに対するTTP-4000による飽和−結合曲線を示す。 図１７は、本発明の別の実施態様による、同種異系膵臓島細胞移植の拒絶を減少させるための、RAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示し、ここで、白丸は、未処理対照動物を表し；斜め線の入った丸は第一の用量のTTP-4000で処置された動物を表し；波線の入った丸は第二の用量のTTP-4000で処置された動物を表し；ひし形の入った丸は対照PBSで処置された動物を表し；そして黒丸は対照IgGで処置された動物を表す。 図１８は、本発明の別の実施態様による、同系膵臓島細胞移植の拒絶を減少させるための、RAGE融合タンパク質TTP-4000の使用を示し、ここで、白丸は、未処理対照動物を表し；そして黒丸はTTP-4000で処置された動物を表す。

Claims (93)

  1. 配列番号５６若しくは配列番号５７に示すアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、RAGE融合タンパク質。
  2. 配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む、請求項１に記載のRAGE融合タンパク質。
  3. 請求項１に記載のRAGE融合タンパク質をコードする、単離されたDNA分子。
  4. 請求項３に記載の単離されたDNA分子であって、該DNAが配列番号５４若しくは配列番号５５に示す配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、前記DNA分子。
  5. 請求項１に記載のRAGE融合タンパク質をコードする発現ベクター。
  6. 請求項５に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた細胞であって、配列番号５６若しくは配列番号５７に示すアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質を発現する、前記細胞。
  7. 配列番号５６又は配列番号５７に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない配列番号５６又は配列番号５７の配列を含む、請求項６に記載の細胞。
  8. 凍結乾燥保護剤、RAGE融合タンパク質及び緩衝剤の凍結乾燥された混合物を含む、製剤。
  9. 前記凍結乾燥保護剤が非還元糖を含む、請求項８に記載の製剤。
  10. 前記非還元糖がシュークロース、マンニトール又はトレハロースのうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の製剤。
  11. 前記緩衝剤がヒスチジンを含む、請求項８に記載の製剤。
  12. 前記RAGE融合タンパク質が、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含む、請求項８に記載の製剤。
  13. 前記RAGEポリペプチドが、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、前記RAGEドメイン間リンカーのC末端アミノ酸がRAGEイムノグロブリンのCH2ドメインまたはその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記RAGEイムノグロブリンドメインに連結された前記RAGEドメイン間リンカーを含む、請求項１２に記載の製剤。
  14. 前記RAGE融合タンパク質が、第一のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が前記第一のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が前記第二のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そして前記第二のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分のN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された前記第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第一のRAGEドメイン間リンカーを含む、請求項１２に記載の製剤。
  15. 前記RAGEポリペプチドが、配列番号１０に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、又は配列番号４７に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGEリガンド結合部位を含む、請求項１２に記載の製剤。
  16. 前記RAGE融合タンパク質が、配列番号３２、３３，３４，３５、３６、３７、５６若しくは５７に示すアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項８に記載の製剤。
  17. 配列番号３２、３３，３４，３５、３６、３７、５６若しくは５７に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない配列番号３２、３３，３４，３５、３６、３７、５６若しくは５７のポリペプチドを含む、請求項１６に記載の製剤。
  18. 界面活性剤、キレート剤、又は充填剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載の製剤。
  19. 希釈剤中で再構成された、凍結乾燥RAGE融合タンパク質を含む再構成製剤であって、該再構成製剤中のRAGE融合タンパク質の濃度が約１mg/mL〜約４００mg/mLの範囲内である、前記再構成製剤。
  20. 前記RAGE融合タンパク質が、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  21. 前記RAGEポリペプチドが、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そして前記RAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメインまたはその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記RAGEイムノグロブリンドメインに連結された前記RAGEドメイン間リンカーを含む、請求項２０に記載の再構成製剤。
  22. 前記RAGE融合タンパク質が、第一のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が前記第一のドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が前記第二のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そして前記第二のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分のN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された前記第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第一のRAGEドメイン間リンカーを含む、請求項２０に記載の再構成製剤。
  23. 前記RAGEポリペプチドが、配列番号１０に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、又は配列番号４７に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGEリガンド結合部位を含む、請求項２０に記載の再構成製剤。
  24. 前記RAGE融合タンパク質が、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、若しくは５７に示すアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  25. 配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６又は５７に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６又は５７のポリペプチドを含む、請求項２４に記載の再構成製剤。
  26. 前記希釈剤が注射用の水（WFI）を含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  27. 前記再構成製剤が皮下又は筋肉内投与に好適である、請求項１９に記載の再構成製剤。
  28. 前記再構成製剤が等張である、請求項１９に記載の再構成製剤。
  29. 前記製剤が、約１〜４００mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６若しくは５７に示す配列またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質；約１mM〜約１００mMのヒスチジン緩衝剤；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween80；及び約６．０〜６．５のpHを含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  30. 前記製剤が、約４０〜５０mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６若しくは５７に示す配列またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTween80；及び約６．０のpHを含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  31. 前記製剤が、４０℃で１週間おいた後、５％未満の分解を示す、請求項１９に記載の再構成製剤。
  32. 再構成後の前記製剤中に、前記RAGE融合タンパク質の約１０％未満が凝集体として存在する、請求項１９に記載の再構成製剤。
  33. 前記RAGE融合タンパク質の凍結乾燥製剤が凍結乾燥保護剤を含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  34. 前記凍結乾燥保護剤が非還元糖を含む、請求項３３に記載の再構成製剤。
  35. 前記非還元糖が、シュークロース、マンニトール、又はトレハロースのうちの少なくとも１つを含む、請求項３４に記載の再構成製剤。
  36. 前記RAGE融合タンパク質の凍結乾燥製剤が、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤または充填剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の再構成製剤。
  37. 凍結乾燥RAGE融合タンパク質を保持する容器、及び前記凍結乾燥製剤を希釈剤で再構成するための指示書を含む、製造品。
  38. 前記RAGE融合タンパク質が、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含む、請求項３７に記載の製造品。
  39. 前記RAGEポリペプチドが、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そして前記RAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメインまたはその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記RAGEイムノグロブリンドメインに連結された前記RAGEドメイン間リンカーを含む、請求項３８に記載の製造品。
  40. 前記RAGE融合タンパク質が、第一のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が前記第一のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が前記第二のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、そして前記第二のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分のN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された、前記第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第一のRAGEドメイン間リンカーを含む、請求項３８に記載の製造品。
  41. 前記RAGEポリペプチドが、配列番号１０に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、又は配列番号４７に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGEリガンド結合部位をふくむ、請求項３８に記載の製造品。
  42. 前記RAGE融合タンパク質が、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７のうちの少なくとも１つに示すアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項３７に記載の製造品。
  43. 配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７のポリペプチドを含む、請求項４２に記載の製造品。
  44. 前記希釈剤が注射用の水（WFI）を含む、請求項３７に記載の製造品。
  45. 前記再構成製剤が、皮下又は筋肉内投与のために好適である、請求項３７に記載の製造品。
  46. 前記再構成製剤が等張である、請求項３７に記載の製造品。
  47. 指示書に従った再構成後に、約１〜４００mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６若しくは５７に示す配列またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質；約１mM〜約１００mMのヒスチジン緩衝剤；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween80；及び約６．０〜６．５のpHを含む、請求項３７に記載の製造品。
  48. 前記製剤が再構成後に、約４０〜５０mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６若しくは５７に示す配列またはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含むRAGE融合タンパク質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTween80；及び約６．０のpHを含む、請求項３７に記載の製造品。
  49. 前記指示書が、前記再構成製剤中の前記RAGE融合タンパク質濃度が約４０mg/mL〜約１００mg/mLの範囲内であるように、前記凍結乾燥製剤を再構成するためにものである、請求項３７に記載の製造品。
  50. 前記凍結乾燥製剤が等張である、請求項３７に記載の製造品。
  51. 前記凍結乾燥製剤を再構成するための希釈剤を保持する第二の容器をさらに含み、ここで、該希釈剤が注射用の水（WFI）である、請求項３７に記載の製造品。
  52. 前記指示書に従った再構成後に、前記製剤が４０℃で１週間おいた後に５％未満の分解を示す、請求項３７に記載の製造品。
  53. 前記RAGE融合タンパク質の約１０％未満が、再構成後の前記製剤中に凝集体として存在する、請求項３７に記載の製造品。
  54. 前記凍結乾燥RAGE融合タンパク質が凍結乾燥保護剤を含む、請求項３７に記載の製造品。
  55. 前記凍結乾燥保護剤が非還元糖を含む、請求項５４に記載の製造品。
  56. 前記非還元糖が、シュークロース、マンニトール又はトレハロースのうちの少なくとも１つを含む、請求項５４に記載の製造品。
  57. 前記凍結乾燥RAGE融合タンパク質が、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤または充填剤のうちの少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の製造品。
  58. 前記再構成製剤中のRAGE融合タンパク質濃度が約１mg/mL〜約４００mg/mLの範囲内であるように、希釈剤中で前記RAGE融合タンパク質及び凍結乾燥保護剤の凍結乾燥混合物を再構成することを含む、RAGE融合タンパク質の安定な再構成製剤を調製するための方法。
  59. 前記RAGE融合タンパク質が、イムノグロブリンのCH2ドメイン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記凍結乾燥保護剤が非還元糖を含む、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記凍結乾燥保護剤が、シュークロース、マンニトール又はトレハロースのうちの少なくとも１つを含む、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記凍結乾燥混合物が、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤又は充填剤をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  63. 前記RAGE融合タンパク質が、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、若しくは５７のうちの少なくとも１つに示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項５８に記載の方法。
  64. 配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７のポリペプチドを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記再構成製剤が、約４０〜１００mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約２mM〜約６０mMのヒスチジン；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween80；及び約６．０〜６．５のpHを含む、請求項５８に記載の方法。
  66. RAGE融合タンパク質及び凍結乾燥保護量の凍結乾燥保護剤を含む混合物を凍結乾燥することによって前記凍結乾燥RAGE融合タンパク質を調製することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  67. 対象においてRAGE介在性疾患を治療するための方法であって、RAGE融合タンパク質、凍結乾燥保護剤及び緩衝剤を含む再構成製剤の治療的有効量を上記対象に投与することを含む、前記方法。
  68. 前記凍結乾燥保護剤が非還元糖を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記非還元糖が、シュークロース、マンニトール、又はトレハロースを含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記緩衝剤がヒスチジンを含む、請求項６７に記載の方法。
  71. 前記RAGE融合タンパク質が、イムノグロブリンのCH2ドメインまたはイムノグロブリンのCH2ドメインの部分を含むポリペプチドに直接連結されたRAGEポリペプチドを含む、請求項６７に記載の方法。
  72. 前記RAGEポリペプチドが、RAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸がRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸に連結され、そして前記RAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がイムノグロブリンのCH2ドメイン又はその部分を含むポリペプチドのN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記RAGEイムノグロブリンドメインに連結された前記RAGEドメイン間リンカーを含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 第一のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が第一のRAGEイムノグロブリンドメインのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEイムノグロブリンドメインのN-末端アミノ酸が前記第一のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸に連結され、第二のRAGEドメイン間リンカーのN-末端アミノ酸が前記第二のRAGEイムノグロブリンのC-末端アミノ酸に連結され、そして前記第二のRAGEドメイン間リンカーのC-末端アミノ酸がCH2イムノグロブリンドメイン又はイムノグロブリンのCH2ドメインの部分のN-末端アミノ酸に直接連結されるように、前記第二のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第二のRAGEドメイン間リンカーに連結された前記第一のRAGEイムノグロブリンドメイン及び前記第一のRAGEドメイン間リンカーを含む、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記RAGEポリペプチドが、配列番号１０に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列、又は配列番号４７に示すアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項７１に記載の方法。
  75. 前記RAGE融合タンパク質が、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、若しくは５７のうちの少なくとも１つに示すアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項６７に記載の方法。
  76. 配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７に対して少なくとも９０％同一の配列が、C-末端リジンを含まない３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６、又は５７のポリペプチドを含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記RAGE融合タンパク質製剤がさらに、界面活性剤、キレート剤または充填剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
  78. 前記RAGE融合タンパク質製剤が、４０℃で１週間おいた後に５％未満の分解を示す、請求項６７に記載の方法。
  79. 前記RAGE融合タンパク質の約１０％未満が、前記RAGE融合タンパク質製剤中で凝集体として存在する、請求項６７に記載の方法。
  80. 前記対象への前記RAGE融合タンパク質製剤の静脈内、腹腔内、又は皮下投与のうちの少なくとも１つを含む、請求項６７に記載の方法。
  81. 前記再構成RAGE融合タンパク質製剤が、約４０〜１００mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約２mM〜約５０mMのヒスチジン；約６０mM〜約６５mMのシュークロース；約０．００１％〜約０．０５％のTween80；及び約６．０〜６．５のpHを含む、請求項６７に記載の方法。
  82. 前記再構成RAGE融合タンパク質製剤が、約４０〜５０mg/mLの、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、５６又は５７に示す配列を含むRAGE融合タンパク質；約１０mMのヒスチジン；約６５mMのシュークロース；約０．０１％のTween80；及び約６．０のpHを含む、請求項６７に記載の方法。
  83. 前記再構成RAGE 融合タンパク質製剤が、糖尿病の症状又は糖尿病の後期合併症を治療するために使用される、請求項６７に記載の方法。
  84. 前記糖尿病又は糖尿病の後期合併症が、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性の脚の潰瘍、循環器合併症、又は糖尿病性ニューロパチーのうちの少なくとも１つを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記再構成RAGE融合タンパク質製剤が、アミロイドーシス、アルツハイマー病、癌、腎障害、又は自己免疫に関連する炎症、炎症性腸疾患、リューマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、低酸素症、脳卒中、心臓発作、出血性ショック、敗血症、器官移植又は創傷治癒の障害のうちの少なくとも１つを治療するために使用される、請求項６７に記載の方法。
  86. 前記再構成RAGE融合タンパク質製剤が、骨粗鬆症を治療するために使用される、請求項６７に記載の方法。
  87. 前記方法が、対象の骨密度を増加させるかことか又は対象の骨密度の減少速度を低下させることを含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記自己免疫が、皮膚細胞、膵臓細胞、神経細胞、筋肉細胞、内皮細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、心臓、骨髄細胞、骨、血液細胞、動脈細胞、静脈細胞、軟骨細胞、甲状腺細胞または幹細胞のうちの少なくとも1つの拒絶を含む、請求項８５に記載の方法。
  89. 前記再構成RAGE融合タンパク質製剤が、腎障害を治療するために使用される、請求項６７に記載の方法。
  90. 前記再構成RAGE融合タンパク質製剤が、器官、組織、複数の細胞のうちの少なくとも１つの、第一の部位から第二の部位への移植に伴う炎症及び／又は拒絶を治療するために使用される、請求項６７に記載の方法。
  91. 前記第一の部位及び第二の部位が異なる対象中にある、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記第一の部位及び第二の部位が同じ対象中にある、請求項９０に記載の方法。
  93. 前記移植された細胞、組織または器官が、膵臓、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、骨髄、血液、骨、筋肉、動脈、静脈、軟骨、甲状腺、神経系の細胞、組織又は器官、又は幹細胞を含む、請求項９０に記載の方法。
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