PT1949915E - Método e sistema para remover rfnt1,rfnt2, e ril2 solúveis em pacientes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO E SISTEMA PARA REMOVER RFNT1,RFNT2, E RIL2 SOLÚVEIS EM PACIENTES"

Antecedentes da Invenção

Esta aplicação reivindica prioridade sobre U.S.S.N. 60/566,741 registada em 30 de abril, 2004. A presente invenção é geralmente na área do aumento de uma resposta imunitária, e relaciona-se particularmente com a remoção dos recetores do fator de necrose tumoral solúveis ("RFNTls", "RFNT2s") e dos recetores da interleucina 2 solúveis ("RIL2s") num paciente, tal como um paciente com cancro, para promover a inflamação e desse modo induzir a remissão do cancro. A terapia convencional do cancro é baseada no uso de medicamentos e/ou radiação que matam células replicantes, esperançosamente mais rápido do que os agentes matam as células normais do paciente. É usada cirurgia para reduzir o volume do tumor, mas tem pouco impacto logo que o cancro se tenha metastizado. A radiação é eficaz somente numa área localizada.

Os tratamentos podem em si mesmos matar o paciente, na ausência de terapia de manutenção. Por exemplo, para alguns tipos de cancro, têm sido usados transplantes da medula óssea para manter o paciente depois do tratamento com de outro modo quantidades fatais de quimioterapia. Não foi comprovada a eficácia para o tratamento de tumores sólidos, contudo. Têm sido usadas "misturas" de diferentes agentes quimioterapêuticos e combinações de dosagens muito altas de quimioterapia com agentes restauradores, por exemplo, fator 2 estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos ("FEC-GM") , eritropoetina, trombopoetina, fator estimulador de granulócitos ("FEC-G") , fator estimulador de colónias de macrófagos ("FEC-M") e fator de células estaminais ("FEE") para restaurar os niveis de plaquetas e de glóbulos brancos, para tratar cancros agressivos. Mesmo com a terapia de suporte ou restritiva, os efeitos secundários são severos.

Outros tratamentos têm sido experimentados numa tentativa de melhorar a mortalidade e a morbilidade. Têm sido tentadas vacinas para estimular o sistema imunitário do paciente, mas sem grande sucesso. Têm sido usadas várias citocinas, sozinhas ou em combinação, tais como fator de necrose tumoral, interferão gama, e interleucina-2 ("IL-2") para matar cancros, mas não produziram respostas clinicas significativas. Mais recentemente têm sido experimentados compostos antiangiogénicos tal como a talidomida em casos de uso compassivo e mostraram que causam a remissão do tumor. Em estudos animais, têm sido usados compostos induzindo um estado procoagulante, tal como um inibidor da proteina C, para causar a remissão do tumor. A Patente E.U.A. No. 4,708,713 de Lentz descreve um método alternativo para o tratamento do cancro, envolvendo ultraferese para remover compostos baseada no peso molecular, a qual promove um ataque imunitário aos tumores pelos próprios glóbulos brancos do paciente. A Patente E.U.A. No. 6,620,382 de Lentz descreve um método de remoção das moléculas de menos do que 120.000 daltons para provocar uma resposta imunitária para induzir a remissão. As moléculas são removidas quer usando um filtro com um limite de exclusão de peso molecular de 120.000 daltons ou menor através do qual o plasma é circulado, quer usando uma coluna de imunoglobulina, contendo anticorpos para RsFNTs 3 ou outros inibidores de citosina. Ambas a ultraferese e a remoção seletiva das citocinas solúveis têm demonstrado redução na massa tumoral em pacientes com cancro. A WO-Ol/37873 descreve a ultraferese para remover o recetor do FNT 1 solúvel e o recetor do FNT 2 solúvel do plasma de um paciente para tratar o cancro. É um objeto da presente invenção proporcionar um método e um sistema para o tratamento de tumores sólidos através da remoção seletiva de moléculas do recetor da citocina solúveis produzindo uma maior redução do tumor.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a um dispositivo estéril para remoção do recetor do fator de necrose tumoral 1 solúvel (RFNTls), do recetor do fator de necrose tumoral 2 solúvel (RFNT2s), e do recetor da interleucina 2 solúvel (RIL2s) do sangue ou do plasma, o referido dispositivo compreendendo uma composição compreendendo parceiros de ligação ligando-se ao recetor do fator de necrose tumoral 1 solúvel (RFNTls), ao recetor do fator de necrose tumoral 2 solúvel (RFNT2s), e ao recetor da interleucina 2 solúvel (RIL2s) imobilizados num material polimérico numa coluna ou num filtro.

Foi desenvolvido um método, e um sistema, para induzir remissão em doenças caracterizadas pela produção excessiva de RNTs e de R da interleucina 2. 0 sistema inclui um meio para a separação do sangue em plasma e nas células do sangue, tal como uma máquina de plasmaferese, onde o plasma é depois tratado usando uma coluna ou um filtro tendo imobilizados neles parceiros de ligação tais como anticorpos para RFNTls, RFNT2s e RIL2s, ou as citocinas ou 4 suas porções que se liguem a estes recetores, até os níveis dos recetores da citocina solúveis serem reduzidos até abaixo do normal, e o plasma tratado devolvido ao paciente. Esta seleção dos parceiros de ligação representa uma melhoria significativa em relação aos sistemas anteriores que incluíam somente os parceiros de ligação ao RFNTs, e estreita significativamente as opções previamente discutidas no que diz respeito à larga gama de outros materiais que pode ser desejável que sejam removidos. Na forma de realização preferencial, o sistema inclui um filtro que separa os componentes do sangue do plasma, ou filtrado, o qual é então passado através de uma coluna contendo anticorpos monoclonais para os recetores de citocina solúveis selecionados que estão imobilizados numa coluna contendo um material tal como SEPHAROSE™. 0 plasma é circulado através da coluna até se alcançar a redução desejada nos níveis de RFNTls, RFNT2s, e RIL2s. No método preferencial, os pacientes são tratados três a cinco vezes por semana durante quatro semanas, mais preferencialmente diariamente. 0 processo pode ser realizado sozinho ou em combinação com outras terapias, incluindo radiação, quimioterapia (local ou sistémica, por exemplo, tratamentos usando agentes alquilantes, doxirubicina, carboplatina, cisplatina, e taxol).

Na forma de realização preferencial, o plasma é tratado de modo a serem alcançados níveis normais dos recetores de citocina solúveis circulantes (referidos aqui como "inibidores") dentro da primeira hora de tratamento. 0 tratamento é então continuado de modo a que os níveis sejam reduzidos abaixo do normal e mantidos a menos do que os níveis normais durante um período de pelo menos quatro a cinco horas. Estudos clínicos têm demonstrado que é importante controlar o caudal do plasma através da coluna. Caudais típicos de plasma através da coluna são entre 10 e 5 100 mL/min, preferencialmente entre 50 e 100 mL/min. Isto é baseado numa separação de 100 mL de plasma (filtrado)/min de sangue passando através do sistema de plasmaferese a uma taxa de 300 mL/min a 500 mL/min.

Descrição Breve dos Desenhos A Figura 1 é uma vista em perspetiva de uma coluna contendo anticorpos imobilizados. A Figura 2 é um esquema do processo de ultraferese. A Figura 3a é um gráfico dos niveis de RFNTls pré- e pós-tratamento durante o ciclo de tratamento e da quantidade de recetor eluido das colunas após cada procedimento (apresentados em ng/10), n=132. A Figura 3b é um gráfico dos níveis de RFNT2s pré- e pós-tratamento durante o ciclo de tratamento e da quantidade de recetor eluido das colunas após cada procedimento (apresentados em ng/10), (n=132). A Figura 3c é um gráfico dos níveis de RIL2s pré- e pós-tratamento durante o ciclo de tratamento inteiro e da quantidade de recetor removido das colunas após cada procedimento (apresentados em ng/10), (n=55). A Figura 4 é um gráfico da remoção de RFNTls, RFNT2s, e RIL2s durante os procedimentos com um desempenho do dispositivo estável (procedimentos 3 a 12). A Figura 5a é um gráfico das concentrações de RFNTls e de RFNT2s durante a terapia (n=8). A Figura 5b é um gráfico das concentrações de RFNTls no plasma filtrado antes e depois de passar através da coluna de imunoferese (n=59). A Figura 5c é um gráfico das concentrações de RFNT2s no 6 plasma filtrado antes e depois de passar através da coluna de imunoferese (n=59).

Descrição Detalhada da Invenção I. Sistemas 0 sistema para o tratamento de pacientes para reduzir o nivel do recetor do fator de necrose tumoral solúvel (RFNTs) 1, do RFNT2s, e do recetor da interleucina 2 solúvel (IL-2s) circulantes inclui:

Um dispositivo tal como um sistema de plasmaferese para remoção do sangue de um paciente;

Meios para a separação do sangue em plasma e nos elementos celulares tais como os glóbulos vermelhos e brancos, tais como um filtro ou um centrifugador;

Meios contendo parceiros de ligação imobilizados para os recetores de citocina solúveis, para o RFNTls, para o RFNT2s, e para o IL-2s, os quais podem ser ou uma coluna ou um filtro;

Meios para a devolução do plasma e do plasma separado e tratado ao paciente, os quais usualmente consistem de um conjunto de tubagem. A. Sistemas de Plasmaferese

Embora seja possivel tratar o sangue inteiro para remover os inibidores do recetor de citocina solúvel, pode ser preferível separar primeiramente os elementos formados e o plasma e tratar o plasma. Isto proporciona menos problemas potenciais devidos ao dano aos glóbulos vermelhos ou à ativação dos glóbulos brancos à medida que eles passam através da coluna ou do filtro para remoção dos inibidores. 7

Sistemas para separação do sangue nos componentes celulares e no plasma estão comercialmente disponíveis. Um sistema adequado é o controlador de profusão de plasma/troca de plasma Diapact CCRT da B. Braun com tubagem de profusão de plasma. Outros sistemas de tratamento de sangue extracorpóreos incluem o sistema de Aferese da Fresenius Hemocare, o Sistema da Gambro Prisma e os controladores de filtração de sangue da Asahi e Kurray e os Sistemas de Imunoadsorção da Exorim. 1. Filtros

Na forma de realização preferencial, o plasma é separado por um filtro. 0 filtro tem de ser biocompatível, e adequado para o contato com sangue, sem causar ativação excessiva das plaquetas ou coagulação. Os dispositivos serão tipicamente ou filtros de prato paralelo ou filtros de membrana capilar. Estes podem ser adaptados de dispositivos correntemente em uso para a diálise renal. Os filtros de membrana capilar terão tipicamente uma área superficial de entre cerca de 0,25 a 1 m2 para uso com crianças e entre cerca de 1 e 3 m2 para uso com adultos. Os filtros de prato paralelo terão tipicamente uma área superficial na gama de 0,1 e 2 cm2/mL de sangue a ser filtrado.

As membranas do filtro serão tipicamente um termoplástico biocompatível ou inerte tais como policarbonato, politetrafluoretileno (TeflonR) , polipropileno, álcool polivinílico de etileno ou polisulfona. É por vezes desejável profusar proteínas na fração de peso molecular mais baixa do plasma, e evitar a profusão de grandes proteínas macromoleculares, tais como fibrinogénio, macroglobulina alfa 2, e macroglobulinas tais como crioglobulinas, por cima do adsorvente. Portanto, são desejáveis membranas que possuam uma discriminação de crivação molecular nestes tamanhos moleculares. Tais membranas têm idealmente um tamanho de poro tipicamente de entre 0,02 e 0,05 microns num filtro de membrana capilar e de entre 0,04 e 0,08 microns num filtro de prato paralelo. A polisulfona é preferencial em relação ao acetato vinilico de etileno uma vez que é mais suave para as células do sangue. O tamanho de poro efetivo que rende o limite de exclusão desejado é determinado com base na geometria de fluxo do fluido, nas forças de cisalhamento, nas taxas de fluxo, e na área superficial. O limite de exclusão eficaz para um filtro de membrana capilar com um tamanho de poro de 0,03 microns é 150.000 daltons, com um coeficiente de crivação de entre 10 e 30%. A membrana do filtro deve ter menos do que cerca de 25 microns, preferencialmente menos do que cerca de 10 microns, de espessura. A membrana permeável não deverá causar coagulação do sangue ou de outro modo reagir com o sangue.

Numa forma de realização preferencial na qual somente as moléculas tendo um peso molecular de aproximadamente 120.000-150.000 daltons ou menos são removidas do sangue, o filtro tem um coeficiente de crivação que remove zero % do f ibrinogénio; 10-50% da IgG; 80-100% da TGOS e da LDI (100.000 pm), e 100% do RFNTls (74.000 à medida que circula como um dimero ou um agregado).

Dispositivos adequados podem ser obtidos da Asahi Chemical Company, Japão, e da Kuraray Co., Ltd, 1-12-39, Umeda, ite-ku, Osaca 530, Japão. O separador de plasma 4A ou 5A da Kuraray é o separador de plasma mais preferencial. Outros filtros preferenciais incluem o filtro de polisulfona da Frezenius e os filtros 3A e 2A da Kuraray. Podem também ser usados filtros de andares, os quais têm diferentes tamanhos de poro e/ou geometrias ou áreas superficiais, para 9 proporcionar uma remoção "escalonada" dos materiais do sangue. 0 caudal de plasma destes sistemas depende do caudal do sangue e do filtro. A um caudal de 300 mL de sangue/min (com uma gama de entre 150 e 500 mL/min) , os sistemas de plasmaferese rendem tipicamente um caudal de plasma de 100 mL de filtrado (plasma)/min. A gama preferencial de caudais é entre 10 e 100 mL/min, com uma gama mais preferencial de entre 50 e 100 mL. 2. Outros Meios de Separação

Alternativamente, embora não neste momento preferencial, pode-se usar centrifugação diferencial, para proporcionar uma separação apropriada dos componentes do sangue. 3. Outro Sistema de Tratamento do Sangue

Alternativamente, a matriz da coluna adsorvente pode ser construída na sua geometria de modo a acoplar os ligandos de ligação inibidores em poços microscópicos na superfície da esférula de modo a permitir que as proteínas do plasma entrem em contato com o ligando de ligação (anticorpo ou péptido) mas evitar que as células do sangue entrem em contato com o ligando de ligação. Este sistema permite a remoção dos inibidores desejados do sangue inteiro e torna o uso de um filtro desnecessário. B. Controlos do Processo e Manuseamento do Fluido O paciente será tipicamente conectado ao dispositivo de processamento do sangue usando um cateter venoso interior e tubagem intravenosa padrão, com conexões similares àquelas usadas para outros sistemas de tratamento do sangue extracorpóreos, de modo a que o sangue possa ser removido do e devolvido ao paciente. A tubagem é conectada a uma 10 bomba de sangue que controla o caudal de modo a que na forma de realização preferencial um volume de sangue (baseado em aproximadamente 7% do peso corporal total) seja processado durante um período de aproximadamente 15-20 minutos. Depois de passar através do filtro de sangue, o filtrado de plasma é direcionado à coluna ou ao filtro de remoção do inibidor, depois devolvido destes dispositivos ao paciente quer num local de cateter único, quer num segundo local. Podem ser usados controlos de microprocessador padrão para regular o fluxo de sangue, por exemplo, pela monitorização do volume de produtos do sangue a serem removidos, em combinação com monitores do caudal e velocidade da bomba. O sistema inteiro deve primeiramente ser enxaguado com salino e depois tratado com anticoagulante ou com um agente anticoagulante, tal como heparina sódica ou dextrose de citrato anticoagulante ("DCA"), para se ter a certeza de que não existem localizações dentro do sistema onde possa ocorrer coagulação do sangue. Além disso, pequenas quantidades de anticoagulantes devem ser continuamente introduzidas na corrente sanguínea direcionadas ao filtro de sangue para assegurar que nenhuma coagulação ocorre durante o processo de filtração. Todas as superfícies do sistema que entrem em contato com o sangue e com os fluidos que são infundidos no paciente têm de ser ou esterilizadas ou preparadas asseticamente antes de se iniciar o tratamento. C. Colunas ou Filtros para a Remoção do Inibidor 1. Parceiros de Ligação

Os inibidores podem ser removidos pela ligação quer a anticorpos para os inibidores, quer a citocinas que normalmente se liguem aos recetores. A remoção seletiva ou 11 a neutralização dos recetores de citocina solúveis (os quais funcionam como inibidores da citocina) é usada para promover uma resposta inflamatória segura, seletiva contra células transformadas, doentes ou autoimunes.

Os recetores podem ser removidos ligando-se à citocina imobilizada, um epitopo ou seu fragmento que se ligue seletivamente ao recetor de citocina solúvel, ou um anticorpo para o recetor. Como usado aqui, o termo "liga-se seletivamente" significa que uma molécula se liga a um tipo de molécula alvo, mas não substancialmente a outros tipos de moléculas. 0 termo "liga-se especificamente" é usado alternadamente aqui com "liga-se seletivamente". Como usado aqui, o termo "parceiro de ligação" destina-se a incluir qualquer molécula escolhida pela sua capacidade de se ligar seletivamente ao inibidor alvo do sistema imunitário. 0 parceiro de ligação pode ser um que se ligue naturalmente ao inibidor alvo do sistema imunitário. Por exemplo, o fator de necrose tumoral alfa ou beta pode ser usado como um parceiro de ligação para RFNTls. Alternativamente, podem ser usados outros parceiros de ligação, escolhidos pela sua capacidade de se ligarem seletivamente ao inibidor alvo do sistema imunitário. Estes incluem fragmentos do parceiro de ligação natural, preparações de anticorpo policlonal ou monoclonal ou seus fragmentos, ou péptidos sintéticos.

Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais, recombinantes, sintéticos ou humanizados. Podem também ser usados fragmentos de anticorpos ou anticorpos de cadeia única que se liguem ao inibidor a ser removido. Os anticorpos policlonais são preferenciais uma vez que estes têm uma gama de reatividade mais ampla e não é necessário ter anticorpos humanos uma vez que os anticorpos são imobilizados, não administrados ao paciente. Tipicamente, a pequena quantidade de lixiviação que é observada não cria 12 um risco significativo. Os anticorpos descritos no seguinte estudo clinico foram obtidos pela imunização de coelhos com RFNTls, RFNT2s ou RIL2s. Os anticorpos serão tipicamente reativos com ambas as formas solúvel e imobilizada do recetor, do recetor do fator de necrose tumoral solúvel (R-FNTs) 1 e 2 e do recetor da interleucina-2 solúvel (RIL-2s) .

Os anticorpos para os recetores podem ser imobilizados num filtro, numa coluna, ou usando outras técnicas padrão para reações de ligação para remover proteínas do sangue ou do plasma de um paciente, ou administrados diretamente ao paciente num transportador farmaceuticamente aceitável tal como o salino. Como usado aqui, anticorpo refere-se ao anticorpo, ou fragmentos de anticorpo (de cadeia única, recombinante, ou humanizado), imunorreativo com as moléculas do recetor.

Os anticorpos podem ser obtidos de várias fontes comerciais tais como a Genzyme Pharmaceuticals. Estes são preferencialmente humanizados para administração direta a um humano, mas podem ser de origem animal se imobilizados num dispositivo extracorpóreo. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. Os anticorpos e o dispositivo devem ser preparados asseticamente de modo a não conterem endotoxinas ou outros materiais não aceitáveis para administração a um paciente.

Podem ser gerados anticorpos para as proteínas do recetor por técnicas padrão, usando proteínas do recetor humanas ou seus fragmentos antigénicos. Os anticorpos são tipicamente gerados pela imunização de um animal, depois isolados do soro, ou usados para fabricar hibridomas que expressem os anticorpos em cultura. Porque os métodos para imunização de animais rendem um anticorpo que não é de origem humana, os 13 anticorpos podem provocar um efeito adverso se administrados a humanos. Métodos para "humanizar" anticorpos, ou gerar menos fragmentos imunogénicos de anticorpos não humanos, são bem conhecidos. Um anticorpo humanizado é um no qual somente os locais reconhecidos pelo antigénio, ou regiões hipervariáveis determinadoras de complementaridade (RDC), são de origem não humana, enquanto todas as regiões de estrutura (RE) dos domínios variáveis são produtos de genes humanos. Estes anticorpos "humanizados" apresentam um menor estímulo de rejeição xenográfica quando introduzidos num recipiente humano.

Para realizar a humanização de um anticorpo monoclonal de camundongo selecionado, pode ser usado o método de enxertia do RDC descrito por Daugherty et al., (1991) Nucl. Acids Res., 19:2471-247 6, incorporado aqui por referência. Brevemente, a região de ADN variável de um FvcU antiidiotípico recombinante animal selecionado é sequenciada pelo método de Clackson, T., et al., (1991) Nature, 352:624-688, incorporado aqui por referência. Usando esta sequência, as RDCs animais são distinguidas das regiões de estrutura (RE) animais com base em localizações das RDCs em sequências conhecidas de genes animais variáveis. Kabat, H.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed. (Dept. Saúde e Serviços Humanos dos E.U.A., Bethesda, MD, 1987). Assim que as RDCs e as RE animais sejam identificadas, as RDCs são enxertadas na estrutura da região variável de cadeia pesada humana pelo uso de oligonucleótidos sintéticos e pela recombinação da reação em cadeia da polimerase (RCP). Os codões para as RDCs animais de cadeia longa, bem como a estrutura da região variável humana de cadeia pesada disponível, são construídos em quatro (cada um com 100 bases de comprimento) oligonucleótidos. Usando RCP, é formada uma 14 sequência de ADN enxertada de 400 bases que codifica para a proteção da RE de cadeia pesada humana/RDC animal recombinante. O estimulo imunogénico apresentado pelos anticorpos monoclonais assim produzidos pode ser ainda diminuído pelo uso do "Sistema de Anticorpo de Fago Recombinante" (SAFR) da Pharmacia (Pharmacia LKB Biotechnology, Suécia), o qual gerou um fragmento Fv de cadeia única (FvCu) o qual incorpora o domínio de ligação ao antigénio completo do anticorpo. No SAFR, os genes variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo são separadamente amplificados a partir do hibridoma de mRNA e clonados num vetor de expressão. Os domínios de cadeia leve e pesada são coexpressos na mesma cadeia polipeptídica depois de se juntarem com um pequeno ligante de ADN que codifique para um péptido flexível. Esta montagem gerou um fragmento Fv de cadeia única (FvCu) o qual incorpora o domínio de ligação ao antigénio completo do anticorpo. Comparado com o anticorpo monoclonal intacto, o FvCu recombinante inclui um número consideravelmente menor de epítopos, e assim apresenta um estímulo imunogénico muito mais fraco quando injetado em humanos. A citocina, tal com FNT ou IL-2, pode ser imobilizada e usada para remover o RFNTs e a IL-2s. Estes são os parceiros de ligação naturais para os recetores. Podem também ser usados fragmentos ou "epítopos" (fragmentos de péptidos de pelo menos quatro a sete aminoácidos em comprimento que podem provocar e ligar-se a anticorpos para a proteína intacta) das citocinas que se ligam aos recetores. Eles podem ser isolados de fontes naturais ou mais preferencialmente preparados usando tecnologia recombinante padrão. Pequenos péptidos ou fragmentos podem também ser preparados usando tecnologia sintética 15 recombinante. As sequências de aminoácidos e as sequências génicas codificando a proteína são bem conhecidas. 2. Substratos de Imobilização

Na forma de realização preferencial, o plasma é circulado através de uma matriz polimérica inerte, tal como SEPHAROSE™, vendida pela Amersham-Biosciences, Upsala, Suécia, dentro de uma caixa de policarbonato de grau médico com aproximadamente 325 mL de volume, fornecido pela Tacoma Plastics, como ilustrado na Figura 1. Outros materiais equivalentes podem ser usados. Estes devem ser esterilizáveis ou produzidos asseticamente e ser adequados para conexão usando conjuntos de tubagem de aferese padrão. Materiais típicos incluem acrilamida e partículas ou esférulas de agarose.

Outras matrizes adequadas estão disponíveis, e podem ser formadas de acrilamida ou outro material polimérico inerte ao qual o anticorpo possa ser ligado. Técnicas padrão para acoplamento de anticorpos ao material de gel são usadas.

Noutra forma de realização, os parceiros de ligação são imobilizados em membranas do filtro ou na tubagem de diálise capilar, onde o plasma passa adjacente às, ou através das, membranas às quais os parceiros de ligação estão ligados. Filtros adequados incluem aqueles discutidos acima no que diz respeito à separação dos componentes do sangue. Estes podem ser os mesmos filtros, tendo parceiros de ligação imobilizados ligados a eles, ou podem ser arranjados em sequência, de modo a que o filtro inicial separe os componentes do sangue e o filtro subsequente remova os inibidores.

Numa ainda terceira forma de realização, os parceiros de ligação imobilizados são ligados a partículas que estão 16 expostas ao sangue ou ao plasma dentro de uma malha ou de um reator tendo meios de retenção. Numa forma de realização particularmente preferencial, as partículas são altamente irregulares, de modo que os parceiros de ligação são ligados dentro das invaginações (poços microscópicos), quer diretamente usando uma técnica tal como o acoplamento do brometo de cianogénio, quer indiretamente através de um ligante tal como um ligante de polietileno glicol ou um par de ligação tal como avidina e estrepavidina, permitindo que as células passem sobre as partículas sem o risco de reação com os parceiros de ligação ligados. 3. Colunas e Filtros

Existem três formas de realização principais do dispositivo para remoção seletiva dos inibidores: uma coluna, um filtro, ou um reator, todos os quais contém parceiros de ligação imobilizados para os inibidores. As colunas ou os filtros são feitos de um material inerte de grau médico, preferencialmente um termoplástico tal como um policarbonato, um polietileno ou um polipropileno. Os filtros são os mesmos do que aqueles discutidos acima no que diz respeito à separação dos componentes do sangue.

Os parceiros de ligação podem ser ligados ao material matricial tal como esférulas para empacotamento da coluna ou às membranas do filtro, em um ou em ambos os lados das membranas. A Figura 1 ilustra a coluna usada em estudos clínicos para tratar pacientes com cancro, como discutido nos seguintes exemplos. A coluna 10 inclui uma caixa 12, filtros 14 em ambas as portas de entrada 16 e de saída 18, e vedantes de junta tórica 20 em ambas as portas para vedar as tampas 22 à caixa da coluna 12. Os tampões 24 vedam as portas em ambas as extremidades da coluna. 17 0 parceiro de ligação imobilizado é empacotado na coluna depois de esterilização ou de tratamento assético do material. 0 acoplamento do anticorpo à matriz usando uma técnica tal como brometo de cianogénio reduz significativamente os virus devido quer à remoção do virus não ligado durante a lavagem, quer ao acoplamento do virus ao material matricial, o qual inativa o virus ligado. Devido a recentes preocupações sobre o potencial dos virus dos animais usados para fabricar anticorpos policlonais, tais como os coelhos usados para fabricar os anticorpos nos seguintes exemplos, o anticorpo é ligado ao material matricial, o material matricial é colocado num saco o qual é depois espalhado para proporcionar uma área superficial exposta máxima e tratado com radiação com feixe-e estacionária (24 centi). Isto pode causar até 25% de perda de atividade e as quantidades de anticorpo poderão ter de ser aumentadas em conformidade. Outras técnicas de esterilização conhecidas que podem ser usadas, sozinhas ou em combinação, incluem a lavagem do material matricial contendo o parceiro de ligação imobilizado com glicina a um pH de 2,8 a qual destrói os virus envelopados (redução log de dois a três); irradiação ultravioleta a qual causa uma redução log de quatro a cinco de todos os virus com somente cerca de 2% de perda da atividade do anticorpo. 0 material matricial esterilizado ou preparado asseticamente é transferido do saco através de uma porta estéril no saco diretamente para a porta da coluna esterilizada.

As caixas da coluna são esterilizadas antes do empacotamento com o anticorpo imobilizado, o que é feito usando condições asséticas. As colunas são enchidas com 0,1% de azida de sódio em tampão fosfato salino ("TFS") como um conservante, embora outros tampões medicamente equivalentes possam ser usados. Estes são armazenados sob refrigeração até uso. 18

As colunas podem ser regeneradas pela lavagem com salino estéril normal, eluição com 200 mM de glicina-HCl pH 2,8, lavagem com salino estéril normal, depois lavagem com TFS. Outras soluções de lavagem equivalentes podem ser usadas. A coluna é enxaguada com múltiplos volumes de salino estéril antes do uso. C. Sistema de Tratamento A Figura 2 é um esquema do sistema de ultraferese incluindo coluna. O sangue é inicialmente passado através de um filtro de plasma 30; o plasma é passado através da coluna contendo os parceiros de ligação 32, e depois o plasma tratado é recombinado com as células do sangue em 34 para administração de volta ao paciente. As bombas 36 e 38 regulam o caudal através da coluna 32 e do filtro separador do plasma 30, respetivamente. Um aquecedor 40 mantém o controlo da temperatura. II. Método de Tratamento

Os pacientes a serem tratados são aqueles adultos caracterizados por tumores cancerosos, ou outras doenças caracterizadas pela produção excessiva e niveis elevados de RFNTls, RFNT2s e RIL2s, os quais podem incluir indivíduos com doença autoimune, virai, parasítica, ou outra. Os ciclos de tratamento consistem tipicamente em três ou mais tratamentos por semana e/ou um total de doze ou mais tratamentos, durante um período de tempo de até cinco semanas. Os ciclos de tratamento podem ser repetidos conforme necessário.

O paciente requer tipicamente um cateter de diálise ou outro dispositivo que permita um acesso vascular adequado para o tratamento. O cateter é conectado ao equipamento de aferese, o qual separa o plasma dos elementos formados. O 19 plasma é então passado através do filtro e devolvido ao paciente. 0 sistema e o processo são representados na Figura 2. Numa forma de realização preferencial, o plasma é separado através de um filtro. 0 paciente é tratado durante um periodo de tempo suficiente para diminuir os niveis de RFNTls, RFNT2s, e RIL2s circulantes. Os objetivos clinicos estão nas gamas de nivel normal baixo para estes recetores, aproximadamente 750 pg/mL para RFNTls e 1250 pg/mL para RFNT2s, e menos do que aproximadamente 190 pg/mL para IL-2s.

Numa forma de realização, os niveis são reduzidos até pelo menos 5% menos do que os valores normais; numa outra forma de realização, os niveis são reduzidos até pelo menos 10% menos do que os valores normais. Os niveis circulantes dos inibidores frequentemente aumentam significativamente a seguir ao tratamento, o que pode ser devido a derramamento pelos tumores.

Na forma de realização preferencial, o plasma é tratado de modo a que se alcancem niveis normais de inibidores circulantes dentro da primeira hora de tratamento. O tratamento é depois continuado de modo a que os níveis sejam reduzidos abaixo do normal e mantidos a menos do que os níveis normais durante um período de pelo menos quatro a cinco horas. No entanto, o grau de redução nos níveis dos inibidores tem de ser balanceado pelo tipo de tumor a ser tratado e pela carga tumoral. A diminuição da concentração destes recetores induz uma resposta inflamatória contra as células do tumor. A evidência de uma resposta inflamatória inclui febre, dor inflamatória específica do tumor, inchaço do tumor e necrose do tumor. Outros problemas que podem ocorrer 20 incluem sindrome de lise tumoral, a qual pode ser tratada com gestão médica padrão por médicos qualificados.

Os pacientes podem ser tratados com terapia de combinação. Numa forma de realização preferencial, a remoção seletiva dos inibidores é combinada com um imunoestimulante, tal como uma vacina contra os antigénios do tumor, uma citocina para estimular o sistema imunitário ou ativar as células dendriticas, ou compostos que bloqueiem fatores tais como o fator de crescimento derivado de fibroblasto (FCDF) , o FCT beta, ou o EFCE. A ativação do sistema imunitário pode também ser alcançada pela remoção seletiva de IL-4 e/ou de IL-10 para acionar o mecanismo celular. Outros tratamentos incluem a administração de hipertermia, radiação ou agentes quimioterapêuticos, embora os últimos dois não sejam tipicamente preferenciais uma vez que estes podem reduzir a capacidade do sistema imunitário de matar os tumores. A presente invenção será melhor compreendida por referência ao seguinte relatório de estudo clinico.

Exemplo 1: Estudo Clinico do tratamento de pacientes com cancro com plasmaferese usando Anticorpos Anti-RFNTl, Anti-RFNT2, e Anti-RIL-2 Imobilizados numa Coluna. A seleção do FNTa e da interleucina-2 que se ligam através de recetores específicos à célula do tumor e induzem a morte celular por apoptose é a resposta normal do sistema imunitário na sua luta constante contra o crescimento do cancro. No entanto, acredita-se que a secreção local de altos niveis de recetores solúveis para o fator de necrose tumoral alfa (RFNTls e RFNT2s) e para a interleucina-2 (RIL-2s) é um mecanismo eficaz da célula do tumor para bloquear localmente o ataque e destruição pelo sistema imunitário. A remoção sistémica destes inibidores por meio 21 da aferese extracorpórea com o objetivo de reduzir as concentrações locais do inibidor abaixo do limite protetor do tumor tem sido, portanto, considerada como sendo uma potencial medida terapêutica para o tratamento do cancro.

Enquanto esta abordagem tenha sido primariamente seguida no passado pela remoção não especifica de proteinas como definida pelas gamas de peso molecular por meio de um método chamado "Ultraferese", uma abordagem mais especifica é o uso de anticorpos imobilizados para RFNTls, RFNT2s, e RIL2s no procedimento de aferese. Uma coluna de adsorção de aferese contendo anticorpos especificos ligados a uma matriz polimérica foi desenvolvida para esta abordagem. Um tal dispositivo terá de demonstrar a sua eficácia na ligação ao recetor e deverá também apresentar um perfil de risco-beneficio aceitável. 0 propósito deste estudo foi avaliar a eficácia e segurança da nova coluna da Biopheresis para reduzir RFNTls, RFNT2s, e RIL2s circulantes no plasma de pacientes com cancro durante o procedimento de aferese. A coluna IAC122 A coluna de Imunoferese IAC122 é um produto adsorvente imune estéril desenhado para remover inibidores solúveis das citocinas pró-inflamatórias do sangue. É desenhada para ser usada em conjunto com sistemas de tratamento de sangue extracorpóreos aprovados comercialmente disponíveis (e.g. dispositivo CCRRT Diapact, B. Braun, Aferese da Fresenius Hemocare, Sistemas de Imunoadsorção da Exorim). 0 dispositivo destina-se somente a ser vendido por ordem de e usado somente por médicos com experiência no uso de técnicas de Imunoadsorção. A coluna de Imunoadsorção destina-se a remover citocinas pró-inflamatórias solúveis as quais são conhecidas por serem produzidas em excesso em 22 certos estados de doença como cancros, onde elas são uma das causas principais da tolerância imunitária do neo-antigénio associado ao tumor. Na aplicação clinica em pacientes com cancro, a remoção destes inibidores/recetores derramadores pode produzir inflamação especifica do tumor a qual pode levar à destruição do tumor. A caixa da coluna é um dispositivo de policarbonato de grau médico com 325 mL de volume (PNS-400146-Fresenius Hemocare, INC). A matriz da coluna é composta de esférulas de Sepharose 4B e anticorpos policlonais de coelho contra inibidores da citocina pró-inflamatória (recetores solúveis para o fator de necrose tumoral alfa (FNT) e para a interleucina 2 (IL2)). Portanto, os componentes essenciais para o fabrico são Sepharose, comprada como produto estéril da Amersham-Biosciences (Upsala, Suécia), anticorpos para os recetores de FNT e para o recetor de IL2 que são esterilizados por filtração (Eurogentec, Liége, Bélgica), e uma caixa de policarbonato (Fresenius, St. Walin), esterilizada por autoclave. Componentes estéreis e técnica assética durante a produção, bem como o teste final do produto de cada coluna ou lote de produção da coluna, são centrais para a segurança deste dispositivo medicinal. Cada coluna é construída sob condições asséticas de acordo com as BPF. Cada coluna é individualmente testada quanto à esterilidade e ao nivel de endotoxinas após o fabrico. Cada coluna é enchida com 0,1% de Azida de Sódio (NaAzida) em TFS e mantida entre 4-8°C antes do uso clinico. Uma imagem do dispositivo é mostrada na Figura 1. O propósito pretendido do dispositivo é servir como uma coluna de adsorção em procedimentos de aferese clínicos. A coluna é parte de um circuito extracorpóreo usando uma máquina de perfusão de plasma padrão que remove sangue dos pacientes, separa o plasma por filtração, passa o plasma 23 filtrado através de uma coluna de adsorção e depois devolve o plasma combinado e as frações das células ao paciente num sistema em circuito continuo (ver também Figura 2). 0 material adsorvente na coluna é construído para se ligar especificamente a dois tipos de recetores solúveis do Fator de Necrose Tumoral α (RFNTls e RFNT2s) e também para se ligar a recetores solúveis da interleucina 2 (RIL2s). 0 objetivo de se usar estas colunas em procedimentos de aferese é a remoção destes inibidores do sangue que são conhecidos por protegerem as células do tumor contra a destruição pelo sistema imunitário do hospedeiro.

As indicações para o uso do dispositivo são condições de doença onde os pacientes podem ter um beneficio clinico da remoção de RFNTls, RFNT2s, e RIL2s (e.g. cancro metastático) .

Se usado de acordo com as Instruções para Uso, não existem contraindicações para o uso deste dispositivo.

Tem sido mostrado em estudos clinicos e laboratoriais que o dispositivo remove eficazmente RFNTls, RFNT2s e RIL2s do plasma filtrado. A diminuição da concentração destes recetores durante um procedimento de aferese deve resultar na indução de uma resposta inflamatória contra as células do tumor. Portanto, sinais e sintomas de inflamação do tumor têm sido relatados do estudo clinico (e.g. febre, dor inflamatória especifica do tumor, inchaço do tumor e necrose do tumor, ver também 5.5 Análise de Segurança). 0 uso prolongado do dispositivo ou o tratamento de grandes tumores (>500 g) pode no caso de indução com sucesso da resposta inflamatória levar a uma sobrecarga excessiva de proteínas resultantes da destruição do tumor, o qual pode resultar na sindrome de lise tumoral com o risco de insuficiência renal, necrose tubular aguda, sindrome de 24 deficiência respiratória aguda, coagulação intravascular disseminada, e morte.

Objetivos do Estudo 0 objetivo primário deste estudo foi diminuir os niveis no plasma de R-FNTls e de R-FNT2s até à extremidade inferior da gama normal (750 pg/mL para recetores de RI e 1250 pg/mL para recetores de R2 em plasma de citrato) durante o procedimento. A quantidade de plasma processado para alcançar este nivel de redução teve de ser empiricamente derivada para cada paciente mas foi estimada como sendo uma quantidade de plasma aproximadamente equivalente a um volume de água extracelular. Isto foi calculado usando a massa corporal (aproximadamente 20% da massa corporal em quilogramas expressos em litros). 0 objetivo secundário foi descrever todos os efeitos clínicos resultantes da imunoadsorção (IA) em pacientes com cancro metastático usando o sistema de profusão de plasma Diapact da B. Braun com a coluna de imunoafinidade inserida no circuito do plasma. Outro objetivo secundário foi recolher especificamente evidência subjetiva e objetiva da inflamação do tumor e da necrose e/ou resolução do tumor como medida por scan de TAC, RMN, e/ou scan do osso ou raios-X de lesões metastáticas ósseas de tumores viscerais, ou medição direta de tumores superficiais. O nível de soro do recetor-IL2s solúvel foi registado para documentar possíveis mudanças destes níveis após os tratamentos de aferese.

Outro objetivo secundário foi avaliar a segurança do uso do dispositivo pela documentação de todos os eventos adversos associados aos procedimentos de tratamento. 25

Metodologia

Este foi um estudo de local único, aberto e não aleatório para observar e documentar a diminuição das concentrações no plasma de RFNT-ls e de RFNT-2s e o possivel efeito na massa tumoral em pacientes com cancro metastático. 0 estudo consistiu num total de doze tratamentos que tiveram lugar dentro de cinco semanas. Cerca de 1-10 dias após a visita de Referência (VI), foi conduzida uma Visita de colocação do cateter (V2). Esta visita foi seguida por 12 visitas de tratamento (V3-V14), as quais tiveram lugar dentro de quatro semanas, três visitas por semana. A visita Final (V15) foi realizada um dia após a última visita de tratamento.

Depois da visita final, todos os dados laboratoriais e os dados de avaliação do tumor foram avaliados e foi dada uma recomendação médica ao paciente pelo investigador. Caso o procedimento de aferese mostrasse mudanças positivas contra o tumor, foi dada ao paciente a oportunidade de repetir o tratamento até três ciclos. Foi permitido um período de tempo de um a três meses entre dois procedimentos de tratamento.

Desenho do Estudo: segunda •«•«•η ♦ » —~.....» Í^10< 1 d priíeira seiana

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V12 V13 V15 iM jt VI V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 5 semanas VI * Tisita de Referência (L* dia V2 * Colocação do cateter Vc Visita V3-V14: visitas de Tratamento VIS ; Visita Final 26

Elegibilidade e Inscrição

Para ser considerado elegível para participar no estudo, um paciente tinha de cumprir os seguintes critérios de inclusão e exclusão:

Critérios de inclusão 1. Pacientes com cancro metastático ou recorrente comprovado por biopsia que tenha falhado em responder a quimioterapia sistémica e/ou terapia hormonal padrão. 2. Pacientes com tumor que é unidimensionalmente mensurável. 3. Pacientes com Estado de Kamofsky de 70% ou maior (ver Apêndice A). 4. Pacientes com esperança de vida maior do que 3 meses. 5. Pacientes com idade > 18 anos. 6. Pacientes com concentrações no plasma de RFNT-ls mensuráveis e/ou concentrações de RFNT-2s que sejam mensuráveis. 7. Pacientes com a capacidade de perceber a natureza investigacional do ensaio e de assinar o consentimento informado antes de quaisquer procedimentos do estudo. 8. Pacientes que tiveram progressão ou recorrência da doença após terem recebido terapia convencional, ou que recusaram estas terapias sob consentimento informado. 9. Os pacientes têm de ter um assistente (amigo ou membro da família) que os acompanhe durante cada visita de tratamento em todos os ciclos de tratamento de quatro semanas. O consentimento informado escrito tem de ser obtido de todos os pacientes.

Critérios de exclusão 27 1. Pacientes com massa tumoral cumulativa aproximada maior do que 100 gms estimada por scan de TAC ou exame fisico à discrição do investigador, para diminuir o risco de sindrome de lise tumoral. 2. Pacientes com função renal e hepática inadequadas como evidenciada pela creatinina do soro maior do que o valor normal ou pela bilirrubina do soro maior do que o valor normal. 3. Pacientes com um resultado positivo, quando rastreados para infeção com Hepatite A, Hepatite B, Hepatite C, e VIH. 4. Pacientes com radiação, quimioterapia, terapia hormonal ou imunitária prévias dentro de 30 dias após a entrada do protocolo. 5. Mulheres que estejam grávidas ou a amamentar.

Adicionalmente, mulheres em idade fértil que não concordem em usar um método apropriado de controlo da natalidade. Métodos apropriados de controlo da natalidade incluem abstinência, contracetivos orais, contracetivos hormonais implantáveis (Norplant), ou método da barreira dupla (e.g., diafragma mais preservativo). 6. Pacientes com uma história de ou comprovados radiograficamente tumores ativos crescendo no S.N.C. apesar da terapia de radiação serão excluídos. 7. Pacientes com insuficiência cardíaca congestiva serão excluídos. 8. Pacientes com doenças infecciosas ativas requerendo antibióticos dentro de 30 dias após a entrada do protocolo serão excluídos. 9. Pacientes com segundas malignidades coexistentes serão excluídos. 10. Pacientes que não tenham recebido tratamento convencional prévio ou que não tenham recusado o mesmo sob consentimento informado. 28 11. Pacientes com hipotensão clinicamente significativa, pressão arterial sistólica em repouso < 100 mmHg, serão excluídos. 12. Pacientes com uma história de infarto de miocárdio nos últimos 6 meses ou com angina incontrolável. 13. Pacientes com hipersensibilidade ou alergia conhecidas a coelhos, a látex e ao meio de contraste de raio-X. 14. Pacientes com hematócrito menor do que 30%, CGB menores do que 2500/pr, e contagens de plaquetas menores do que 100.000/pr serão excluídos. 15. Pacientes com tumor mensurável somente em locais de terapia de radiação prévia serão excluídos. 16. Pacientes com tumor associado com vísceras ocas serão excluídos. 17. Pacientes com hipersensibilidade conhecida à heparina. 18. Pacientes que participaram no ensaio três vezes. 19. Pacientes com uma história de alergias severas ou múltiplas.

Foram recrutados 12 pacientes. Três destes pacientes completaram um segundo ciclo de tratamento. Portanto, 15 ciclos de tratamento podem ser avaliados quanto à eficácia. As características dos pacientes serão dadas na seção dos resultados.

Aquisição de Dados O estudo foi conduzido em conformidade com a declaração de Helsínquia, todas as regulações legais e éticas, e de acordo com as diretrizes das Boas Práticas Clínicas. As histórias dos pacientes foram proporcionadas pelos próprios pacientes ou pelo seu oncologista tratador. Os dados originais e os resultados laboratoriais originais foram introduzidos nos Formulários de Relatório do Caso pelo investigador. Os dados usados nesta análise interina foram recolhidos após monitorização apropriada pela IKFE CRO e 29 clarificação das dúvidas. Os dados foram introduzidos numa base de dados e analisados descritivamente como dado abaixo. Métodos estatísticos

Os dados proporcionados pela IKFE CRO foram analisados por meio de métodos de estatística descritiva, i.e. os dados são apresentados em tabelas e gráficos apropriados. Uma intenção do estudo foi demonstrar a eficácia das colunas IAC na redução das concentrações de RFNTls, de RFNT2s e de RILs no plasma durante os procedimentos de imunoferese. Portanto, os valores médios dos valores de recetor normalmente distribuídos antes e imediatamente depois do procedimento do estudo foram calculados e comparados por meio do teste-T de Student. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Em alguns casos, foram tomadas amostras adicionais para permitir o estabelecimento das curvas de diminuição do recetor durante os procedimentos. Os dados nominais (e.g. caracteristicas do paciente e eventos adversos) foram listados e são apresentados em tabelas.

Visita de rastreio (VI)

Antes de qualquer procedimento do estudo, um consentimento informado assinado foi obtido de cada paciente e um número de paciente único foi designado. Para avaliar a elegibilidade do paciente, ele/ela foi avaliado(a) quanto aos critérios de inclusão/exclusão; foi tomada uma anamnese completa e foram conduzidos exames físicos e laboratoriais (ver abaixo "Variáveis Clínicas" e "Parâmetros Laboratoriais"). Foram documentados os dados demográficos, a natureza de quaisquer condições presentes no momento do exame físico, quaisquer condições pre-existentes, e medicações e tratamentos concomitantes. 30

Uma avaliação do tumor foi conduzida por scan de TAC, RMN ou medição direta dos tumores superficiais. Foi pedido aos pacientes que proporcionassem tais dados se possível do seu médico tratador. Os parâmetros laboratoriais ou os ECGs que haviam sido determinados dentro dos 10 dias antes da visita de rastreio foram aceitáveis à discrição do investigador para evitar coletas de sangue desnecessárias.

Os pacientes receberam um cartão de identidade do paciente e o número de telefone de socorro 24 horas no final da visita.

Visita de colocação do cateter (V2)

Os pacientes cumprindo os requerimentos de elegibilidade tiveram acesso vascular através da veia subclávia. Os cateteres usados foram cateteres de acesso vascular de diálise padrão HEMOACESS (15-20 cm, Hospal, Lyon, França), ou equivalente. Quando a hemostasia da colocação do cateter foi assegurada e quando a posição correta do cateter foi verificada por raio-X ao peito, idealmente 24 horas após a colocação, o procedimento de imunoferese inicial foi realizado.

Visitas de tratamento (V3-V14)*

Um tratamento de imunoferese foi usualmente realizado 3 vezes por semana. Até um volume de água extracelular calculado (onde VAEC = 20% do peso corporal total em quilogramas expressos em litros) foi tratado diariamente num esforço para reduzir o RFNT-ls a um normal baixo (750 pg/mL em plasma de citrato), e um RFNT-2s a uma gama normal (1250 pg/mL em plasma de citrato). Foram obtidos níveis de R-FNT-1 e R-FNT-2 pré- e pós-tratamento. Medições adicionais destes dois parâmetros estiveram à discrição do Investigador. O objetivo era reduzir estes níveis durante 31 os procedimentos durante 3 de 7 horas em todas as quatro semanas. Os níveis de soro do recetor-IL2s foram obtidos pré- e pós-tratamento todas as segundas visitas (V3, V5, V7, V9, Vil, V14). Uma vez por semana, um painel químico de sangue foi medido e uma avaliação do tumor foi realizada por investigação clínica. Toda a informação sobre eventos Adversos foi documentada e o diário do estudo foi revisto em cada dia do tratamento.

Um esquema da definição do tratamento de um procedimento de imunoferese usando a Máquina-CCRT Diapact (BBraun Medizintechnik, Melsungen, Alemanha) e o filtro de plasma Evaflux (MPS Medicai Product Services GmbH, Braunfels, Alemanha) é dado na Figura 2. 0 seguinte foi monitorizado durante os tratamentos dos pacientes. Medições adicionais podiam ser realizadas à discrição do investigador. a) Frequência cardíaca aproximadamente a cada 60 minutos b) Tempo de coagulação aproximadamente a cada 60 minutos c) Temperatura aproximadamente a cada 60 minutos d) Frequência respiratória pré- e pós-tratamento e) Pressão sanguínea aproximadamente a cada 60 minutos f) Pressões, caudais, volume do filtrato e da solução de substituição, condições de alarme (se algumas) dentro do circuito extracorpóreo, aproximadamente a cada 30 minutos g) Amostras de sangue para a concentração do inibidor serão recolhidas no início do tratamento , e no final do tratamento 32

Ao longo do procedimento, foi por vezes necessário regenerar a coluna. As colunas foram regeneradas durante um procedimento de imunoferese após 9 litros de plasma terem corrido sobre a coluna. As colunas de 325 mL foram lavadas com 1 litro de salino estéril, eluidas com 1 litro de 200 mM de glicina-HCl (pH 2,8), e depois relavadas com 1 litro de salino estéril antes de se reiniciar o procedimento de aferese. Todas as colunas foram regeneradas como o último passo no procedimento de aferese diário. Este último passo de regeneração requereu uma lavagem inicial com 2 litros de salino estéril normal, eluição com 1 litro de 200 mM de glicina-HCl (pH 2,8), uma relavagem com 2 litros de salino estéril normal, e finalmente uma lavagem com 1 litro de TFS mais 0,01% de azida de sódio. A coluna foi então armazenada a 2 a 8°C em TFS mais 0,01% de solução de azida de sódio até ao próximo uso. Antes da aplicação clinica, a coluna contendo TFS mais 0,01% de azida de sódio foi enxaguada com 9 volumes de coluna de salino estéril normal.

Os pacientes foram monitorizados durante 1-3 horas (média de 2 horas) depois do término do procedimento de aferese na unidade clinica. Foram registados os sinais vitais e o paciente visto pelo médico antes da alta. Antes de o paciente receber alta depois do primeiro dia de tratamento, ele/ela e o seu membro da família foram instruídos, quem eles poderiam contatar em caso de emergência.

Depois, o paciente recebeu alta para o ambiente doméstico com o seu acompanhante. O membro da família observou a temperatura, a dor, e a saúde geral até à próxima visita de tratamento. Esta informação foi registada num diário do paciente e relatada ao e registada pelo médico na próxima vista do estudo. Os pacientes relataram todas as queixas físicas ao pessoal clínico de plantão. O médico assistente foi responsável por todos os aspetos do bem-estar médico 33 dos pacientes pós-procedimento e fez todos os esforços para documentar todos os efeitos do procedimento adversos ou não nas suas notas de progresso diárias. Enfermeiras, pacientes ou os seus assistentes familiares à noite registaram a temperatura do paciente a cada 4 horas no diário do paciente.

Na visita final, o paciente submeteu-se aos seguintes exames, similares à visita de Referência: exame fisico avaliação laboratorial Parâmetros vitais Remoção do cateter 0 paciente recebeu uma carta do seu médico primário, onde era dada a ordem de que a avaliação do tumor (scan de CAT, ou RMN ou avaliação do tumor por exame fisico, níveis de R-FNTls e R-2) teria de ser conduzida nas seguintes quatro semanas. Pediu-se ao paciente e ao médico primário que informassem o investigador sobre os resultados desta avaliação do tumor logo que fosse possível. 0 investigador teve de analisar todos os dados disponíveis (dados laboratoriais, dados de avaliação do tumor) nas semanas seguintes. A determinação da atividade tumoral foi feita pela medição da doença objetivamente, usando scan de TAC, RMNs, e medições diretas dos tumores superficiais. Caso o procedimento de aferese mostrasse qualquer sinal de efeitos positivos na massa das células tumorais, o paciente foi contatado e perguntavam-lhe, se ele/ela gostaria de começar com um segundo (ou terceiro) tratamento de estudo.

Se o paciente tivesse completado o procedimento de estudo, iniciar-se-ia um seguimento: 34 a) Os pacientes cujos tumores falharam em responder regressaram aos seus médicos assistentes para consideração de outras terapias. 0 médico tratador ou o seu designado contataram o médico do paciente mensalmente e fizeram uma nota no quadro de pesquisa do paciente para determinar o tempo até à progressão e data da morte. b) Os pacientes que completaram com sucesso o protocolo de tratamento com uma avaliação de pelo menos uma resposta minima foram avaliados durante pelo menos 5 meses para avaliar a durabilidade (definida como tempo até à progressão do doença e sobrevida global) do tratamento.

Medições laboratoriais

As variáveis de eficácia (R-FNTls, R-FNT2s e IL-2s) foram determinadas do soro dos pacientes antes e depois do procedimento de tratamento no laboratório central (ikfe Lab) por meio dos seguintes métodos validados pelas BPF:

Imunoensaios de RFNTls e RFNT2s humanos (R&D Systems Inc., 614 McKinley Place NE, Mineápolis, MN 55413, EUA), para a determinação quantitativa das concentrações do recetor do fator de necrose tumoral 1 & 2 solúvel humano (RFNTls e RFNT2s) no sobrenadante da cultura de células, no soro, no plasma, e na urina. ELISA do recetor de IL-2s humana (R&D Systems Inc., 614 McKinley Place NE, Mineápolis, MN 55413, EUA). 0 ensaio é um imunoensaio de sensibilidade amplificada de enzima em estado sólido (IASAE) para a determinação dos niveis de recetores de IL-2 solúveis no soro humano, no plasma ou no sobrenadante da cultura de células. 35

Resultados conformidade com a locais e nacionais, diretrizes das Boas 0 estudo foi conduzido em estrita Declaração de Helsínquia, regulações legais e éticas, e de acordo com as Práticas Clinicas.

Ao todo, os dados dos 12 pacientes e dos 15 ciclos de tratamentos planeados (180 procedimentos de tratamento planeados) foram incluídos nesta análise. A análise da eficácia foi realizada com os dados de todos os procedimentos de tratamento completados (150 procedimentos) . A análise de mudanças dos RsFNTs ao longo do tempo relaciona-se com a quantidade de procedimentos de tratamento consecutivos e foi possível com os dados de 11 ciclos de tratamento completados por protocolo (132 procedimentos de tratamento). Todos os dados de todos os pacientes foram incluídos na análise de segurança e para a avaliação de beneficio-risco.

Os dados demográficos de todos os pacientes estão listados na tabela 1. Todos os pacientes exceto um sofriam de cancro metastático severo de fase terminal e foram pré-tratados quer com quimioterapia, cirurgia, terapia de radiação, quer com suas combinações na sua história.

Tabela 1: Caracteristicas dos Pacientes

Pac. No. Iniciais Sexo Idade Tipo de Cancro Observações 1 RK F 55 Cancro do Pulmão de Não-pequenas Células Abandono (5 procedimentos) 2 ST F 41 Cancro da Mama 2 Ciclos 3 CB M 47 Carcinoma das Células Renais 2 Ciclos 4 RN M 54 Carcinoma do Pâncreas Abandono (4 procedimentos) 36 5 DP M 59 Carcinoma das Células Escamosas 2 Ciclos 6 RB F 53 Cancro da Mama 1 Ciclo 7 KK M 34 Melanoma Maligno Abandono (9 procedimentos) 8 AB F 34 Cancro da Mama 1 Ciclo 9 NO F 59 Cancro da Mama 1 Ciclo 10 JD F 56 Cancro da Mama 1 Ciclo 11 GA F 46 Cancro da Mama Abandono (nenhum procedimento) 12 MD F 49 Cancro da Mama 1 Ciclo Total 8 F/4 M 48,8+8,8 A doença subjacente foi cancro da mama em 7 casos, um cancro do pulmão, um cancro renal, um cancro do pâncreas, um cancro das células escamosas, e um melanoma maligno. Sumários narrativos das histórias dos pacientes são dados na seção 5.5. As razões para o término antecipado foram morte (paciente 1) , decisão do paciente (paciente 4), e deteção de um critério de exclusão (pacientes 7 e 11) . Informação detalhada sobre os eventos adversos sérios neste estudo é dada na seção 5.4.

Um total de 150 procedimentos pôde ser incluído na análise de eficácia. As concentrações no plasma de todos os três recetores antes e depois de todos os procedimentos são dadas na Tabela 2. Uma apresentação gráfica das concentrações do recetor por número de tratamento é dada nas Figuras 3a-3c. Houve uma relação clara entre o número de procedimentos terapêuticos consecutivamente aplicados e o efeito na diminuição das concentrações no plasma de RFNTls, de RFNT2s e de RIL2s. Enquanto a resposta clínica do tumor à tentativa agressiva de diminuir os recetores solúveis leve a um aumento significativo nos níveis de recetor pós-tratamento no final do primeiro dia de tratamento, tal efeito não pôde ser visto no segundo dia de tratamento. Após o terceiro dia de tratamento, as 37 concentrações no plasma foram consistentemente diminuídas para todos os recetores até ao final do ciclo de tratamento. A média das concentrações de recetor antes e depois do tratamento para o período de desempenho estável (tratamento 3 a tratamento 12) é dada na Tabela 3. Não surpreendentemente, as células tumorais recuperaram entre os tratamentos e os níveis de pré-tratamento estavam usualmente nos mesmos níveis ao longo dos procedimentos. No total, puderam ser avaliados para esta análise 128 procedimentos de tratamento completados.

Tabela 2 Concentrações dos recetores em todos os procedimentos de tratamento (n=150)

Recetor Antes do tratamento Depois do tratamento valor-p RFNTls [pg/mL] 1919+828 1346+1033 p<0,001 RFNT2 s [pg/mL] 3074+1151 1870+1291 p<0,001 RIL2s [pg/mL] 4745+1692 2611+1766 p<0,001

Tabela 3 Concentrações dos recetores nos procedimentos de tratamento 3 a 12 (n=128)

Recetor Antes do tratamento Depois do tratamento valor-p O "õ RFNTls [pg/mL] 1948+853 1023+466 p<0,001 -47,5 RFNT2s [pg/mL] 3153+1153 1479+894 p<0,001 -53,1 RIL2s [pg/mL] 4845+2711 1219+998 p<0,001 -74,8 A quantidade de recetores removidos do plasma do paciente foi dependente do volume de plasma filtrado. Por razões médicas (desenvolvimento de resposta inflamatória com sintomas correspondentes) , o tratamento inicial foi levado a cabo cuidadosamente e com baixos caudais de plasma e volumes. Na fase de tratamento posterior, podiam-se alcançar volumes de plasma de até 18 L. Após cada 9 L de plasma filtrado, era realizada uma regeneração das colunas. 38 0 material ligado era eluido das colunas pelo tampão de glicina-HCl (pH 2,8). A fração combinada destas soluções de limpeza para cada paciente e procedimento era analisada por imunoensaio para calcular a quantidade global de recetores removidos. A quantidade de recetores removidos das colunas por regeneração depois de cada procedimento de tratamento é dada na Tabela 4 e nas Figuras 3a-3c.

Tabela 4: Cálculo das quantidades de recetor removido por ciclo de tratamento e volume de filtração de plasma alcançado

Procedimento No Volume de Plasma [L] RFNTls removido [ng] RFNT2s removido [ng] RIL2s removido [ng] 1 4,12+5,31 2950 1335 6997 2 4,95+3,20 6755 2044 — 3 9,59+5,97 6453 2811 12058 4 11,68+5,35 6403 3099 — 5 12,56+5,19 6436 2786 10927 6 13,11+4,88 5714 2400 — 7 14,56+3,61 7439 3009 10499 8 15,31+3,19 7314 3683 — 9 15,47+3,24 5894 2810 10368 10 15,64+3,12 5474 2273 — 11 15,11+4,54 6807 2368 — 12 14,56+4,45 6815 2864 — Média±DP 12,22+4,02 6204+1184 2623+594 10170+1984 A análise mostrou que a capacidade das colunas em remover os três inibidores do FNT-α e da IL-2 permaneceu estável e não declinou durante os ciclos de tratamento. Devido à dependência do número de procedimentos no efeito de diminuição do recetor, foi realizada uma análise adicional para avaliar a eficácia das colunas durante os períodos de remoção estável do recetor (i.e. durante os procedimentos 3 39 a 12). Assume-se que o sistema imunitário alcançou um tipo de estabilização na sua luta contra as células tumorais. Esta análise podia ser realizada com todos os dados do procedimento adequados (n=122 para RFNTls e para RFNT2s, e n=51 para RIL2s).

Durante o período de estabilização do sistema imunitário (procedimentos 3 a 12), as colunas foram capazes de diminuir a quantidade de recetores significativamente em 44% para RFNTls, 52% para RFNT2s, e 77% para RIL2s. Ver Figura 4. Adicionalmente às amostras recolhidas como dado no protocolo, foram tiradas amostras adicionais durante oito procedimentos para avaliar a cinética do decréscimo de RFNTls e de RFNT2s no plasma do paciente durante o curso de tempo inicial dos procedimentos de tratamento. Para ambos os recetores, um decréscimo estável podia ser mostrado em correlação com o volume de plasma filtrado. Os resultados são dados na Figura 5a.

Foram também tiradas amostras do plasma filtrado na máquina antes de o plasma ter entrado na coluna de adsorção e imediatamente depois disso. Os resultados destas investigações são dados nas Figuras 5b e 5c. Podia ser mostrado que ambos os RsFNTs são ligados eficazmente durante o procedimento de imunoferese, o que levou a um decréscimo constante ao longo do tempo no plasma dos pacientes. Mesmo depois de grandes quantidades de plasma filtrado terem passado através da coluna de adsorção, ainda manteve eficácia significativa na ligação do recetor. No entanto, concluiu-se destes resultados que uma regeneração da coluna é recomendada depois de 9 L de plasma filtrado para aumentar a eficácia do procedimento.

Como pode ser esperado pela natureza das doenças severas subjacentes, numerosos eventos adversos foram documentados 40 durante o estudo. Os eventos adversos podem estar parcialmente relacionados com a terapia e a maioria destes eventos são indicadores da eficácia clinica do procedimento de tratamento do estudo em induzir uma resposta imunitária (e.g. febre, tremores, etc). A maioria dos eventos adversos globais, no entanto, está relacionada com os cancros subjacentes requerendo medicação para a dor e outros medicamentos para aliviar a carga dos pacientes. No total, foram observados 244 eventos adversos (EA) e 3 eventos adversos sérios (EAS) incluindo dois casos de morte. No total, foram vistos quatro abandonos no estudo (pacientes 1, 4, 7, 11). As razões para o abandono foram morte (paciente 1), decisão do paciente seguida de morte rápida (paciente 4), desenvolvimento de metástase no sistema nervoso central (paciente 7) , e não conformidade com os critérios de inclusão (creatinina >1,1 mg/L, paciente 11).

Todas as concentrações do recetor (RFNTls, RFNT2s, e RIL2s) foram significativamente reduzidas durante o procedimento de aferese pelo envolvimento das novas colunas de imunoferese IAC122 (em 44%, 52%, e 77%, respetivamente). As colunas provaram ser confiáveis no seu desempenho durante os ciclos de tratamento inteiros. A frequente regeneração das colunas durante e após os procedimentos de tratamento não resultou numa perda da capacidade de remoção do recetor. Nenhuma coluna teve de ser removida por razões de ineficácia ou outras questões técnicas. Em todos os pacientes, a redução do recetor levou a sintomas clínicos de inflamação e algumas indicações foram recolhidas que de isso pode levar a uma melhoria para a doença subjacente.

Lisboa, 12 de Novembro de 2012

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um dispositivo estéril para a remoção do recetor do fator de necrose tumoral solúvel 1 (RFNTls), do recetor do fator de necrose tumoral solúvel 2 (RFNT2s) , e do recetor da interleucina 2 solúvel (RIL2s) do sangue ou do plasma, o referido dispositivo compreendendo uma composição compreendendo parceiros de ligação ligando-se ao recetor do fator de necrose tumoral solúvel 1 (RFNTls), ao recetor do fator de necrose tumoral solúvel 2 (RFNT2s), e ao recetor da interleucina 2 solúvel (RIL2s) imobilizados numa material polimérico numa coluna ou num filtro.

2. 0 dispositivo da reivindicação 1, em que o parceiro de ligação é selecionado do grupo consistindo em a) anticorpo policlonal ou monoclonal ligando-se ao RFNTls, ao RFNT2s, ou ao RIL2s; b) fragmento de anticorpo (anticorpo de cadeia única, recombinante, ou humanizado) ligando-se ao RFNTls, ao RFNT2s, ou ao RIL2s; c) citocina ligando-se ao RFNTls, ao RFNT2s, ou ao RIL2s; d) fragmento de citocina ligando-se ao RFNTls, ao RFNT2s, ou ao RIL2s; e) péptido sintético ligando-se ao RFNTls, ao RFNT2s, ou ao RIL2s.

3. 0 dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que o material polimérico é selecionado do grupo consistindo em a) uma coluna; b) esférulas para empacotamento de uma coluna; 2 c) um filtro; d) uma membrana de filtro, em um ou em ambos os lados da membrana; e) uma tubagem de diálise capilar; f) uma matriz; e g) um reator.

4. 0 dispositivo da reivindicação 1, compreendendo ainda meios para separação do sangue em plasma ou ultrafiltrado.

5. 0 dispositivo da reivindicação 1, em que o material polimérico tendo parceiros de ligação imobilizados nele foi tratado para reduzir os virus viáveis ou infecciosos.

6. 0 dispositivo da reivindicação 5, em que o material tenha sido tratado com esterilização por feixe-e para inativar ou reticular partículas virais ou seus componentes. Lisboa, 12 de Novembro de 2012