JPWO2009051109A1 - 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
近年、抗体や生理活性タンパク質などの多くのバイオ医薬品が輩出されているが、組換えタンパク質を効率よく動物細胞に生産させる技術は、バイオ医薬品の低コスト化につながり、患者への安定な供給を約束するものである。
従って、より生産効率の高いタンパク質の製造方法が望まれている。
本発明の要旨は以下の通りである。
(2)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードするDNAが導入されている細胞である(1)記載の方法。
(4)所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードするDNAとを含む1つの分子が、ベクターである(3)記載の方法。
(5)タウリントランスポーターを強発現する細胞がさらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼを強発現する(1)乃至(4)記載の方法。
(7)(6)記載の細胞を培養することを含む、所望のポリペプチドの製造方法。
(8)所望のポリペプチドが、抗体である(7)記載の製造方法。
(10)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
(11)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である(10)記載の方法。
(12)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である(11)記載の方法。
(13)タウリントランスポーターを強発現する細胞がさらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼを強発現する(10)乃至(12)記載の方法。
(14)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
(15)タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2007‐267384の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
本発明は、TauTを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度MTXの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法を提供する。
本発明の方法において、TauTを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度MTXの存在下で培養する。
TauTを強発現する細胞には、所望のポリペプチドをコードするDNAが導入される。
TauTを強発現する細胞は、天然の細胞と比較してTauTの発現量が増加している細胞であれば特に限定されない。天然の細胞は特に限定されないが、例えばCHO細胞など組換えタンパク質を製造する際に宿主として用いられている細胞を挙げることができる。
さらに、細胞に強発現させるTauT遺伝子としては、TauTをコードする以下の(a)〜(e)のいずれかのDNAを挙げることもできる。
(b) 配列番号2のアミノ酸配列又はUniProt KnowledgebaseのSC6A6_RAT (P31643)、SC6A6_MOUSE (O35316)、SC6A6_HUMAN (P31641)、SC6A6_BOVIN (Q9MZ34)若しくはSC6A6_CANFA (Q00589)のアミノ酸配列において、1又は複数(例えば、数個)のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列からなり、かつTauT活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c) 配列番号2のアミノ酸配列又はUniProt KnowledgebaseのSC6A6_RAT (P31643)、SC6A6_MOUSE (O35316)、SC6A6_HUMAN (P31641)、SC6A6_BOVIN (Q9MZ34)若しくはSC6A6_CANFA (Q00589)のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつTauT活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d) 配列番号1のヌクレオチド配列又はGenBankのM96601、L03292、Z18956、AF260239若しくはM95495のヌクレオチド配列からなるDNA
(e) 配列番号1のヌクレオチド配列又はGenBankのM96601、L03292、Z18956、AF260239若しくはM95495のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTauT活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(b)のDNAは、ハムスター、ラット、マウス、ヒト、ウシ又はイヌTauTと機能的に同等なポリペプチドであり、ハムスター、ラット、マウス、ヒト、ウシ又はイヌTauTのアミノ酸配列中の1又は2個以上、好ましくは、1個以上30個以下、より好ましくは1個以上10個以下のアミノ酸が欠失したもの、ハムスター、ラット、マウス、ヒト、ウシ又はイヌTauTのアミノ酸配列に1又は2個以上、好ましくは、1個以上30個以下、より好ましくは1個以上10個以下のアミノ酸が付加したもの、ハムスター、ラット、マウス、ヒト、ウシ又はイヌTauTのアミノ酸配列中の1又は2個以上、好ましくは、1個以上30個以下、より好ましくは1個以上10個以下のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等をコードするDNAが例示される。
TauTを強発現する細胞は、さらに、CSADを強発現してもよい。
細胞に導入するCSAD遺伝子としては、以下の(a1)〜(e1)のいずれかのDNAを挙げることができる。
(b1) 配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt KnowledgebaseのCSAD_RAT (Q64611)、CSAD_MOUSE (Q9DBE0)若しくはCSAD_HUMAN (Q9Y600)のアミノ酸配列において、1又は複数(例えば、数個)のアミノ酸が置換、欠失、付加又は/及び挿入されたアミノ酸配列からなり、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(c1) 配列番号4のアミノ酸配列又はUniProt KnowledgebaseのCSAD_RAT (Q64611)、CSAD_MOUSE (Q9DBE0)若しくはCSAD_HUMAN (Q9Y600)のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(d1) 配列番号3のヌクレオチド配列又はGenBankのM64755、AK005015若しくはAF116546のヌクレオチド配列からなるDNA
(e1) 配列番号3のヌクレオチド配列又はGenBankのM64755、AK005015若しくはAF116546のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCSAD活性を有するポリペプチドをコードするDNA
また、上記DNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる(Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74 )。また、DNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン(ATG)及び/又は終止コドン(TAA、TGA、又はTAG)の挿入等が挙げられる。
TauT遺伝子(場合によっては、CSAD遺伝子も)及び所望のポリペプチドをコードするDNAの導入は単一のベクターにより同時に導入してもよいし、複数のベクターを用いて別々に導入してもよい。
MTXの濃度を変えて培養する工程毎に、高産生細胞株を選択するとよい。また、MTXを高濃度で添加した培地で培養することによって細胞増殖がみられなくなった場合には、MTXを低濃度で添加した培地に戻して培養を続けることによって細胞増殖を回復させるとよい。
このように高濃度のMTXを処理して得られた本発明の細胞群から、通常のMTX処理では得ることのできない、或いは得ることの非常に難しい、所望のポリペプチドの高産生株を効率よく多数得ることができる。よって、本発明のTauT強発現細胞は、MTX選抜に用いる形質転換細胞として極めて有用である。
したがって、本発明は、上記の方法により作製された、所望のポリペプチドを高産生する細胞も提供する。細胞は不均一な細胞群であってもよいし、クローン化された均一な細胞株であってもよい。
細胞の培養には、通常の細胞(好ましくは、動物細胞)培養で使用されている培地を用いることができる。これらには通常、アミノ酸、ビタミン類、脂質因子、エネルギー源、浸透圧調節剤、鉄源、pH緩衝剤を含む。これらの成分の含量は、通常、アミノ酸は0.05−1500mg/L、ビタミン類は0.001−10mg/L、脂質因子は0−200mg/L、エネルギー源は1−20g/L、浸透圧調節剤は0.1−10000mg/L、鉄源は0.1−500mg/L、pH緩衝剤は1−10000mg/Lの範囲が適当であるが、これらに限定されず、培養する細胞の種類、所望のポリペプチドの種類などにより適宜決定できる。
培地は、市販の動物細胞培養用培地、例えば、D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)、 D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12)、 RPMI1640、CHO-S-SFM II(Invitrogen社)、 CHO-SF (Sigma-Aldrich社)、 EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、CD-CHO (Invitrogen社)、 IS CHO-V (Irvine Scientific社)、 PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地を用いることも可能である。又、培地は無血清培地であってもよい。
後述の実施例からも明らかなように、TauTを強発現する細胞においては、細胞の生育阻害物質となる乳酸などの老廃物の産生が抑制されうる。その結果、細胞は高い生存率維持効果を示すこととなり、細胞は3ヶ月或いはそれ以上もの長期間の培養が可能である。
所望のポリペプチドを産生するために適当な細胞の培養期間は、通常1日〜3ヶ月であり、好ましくは1日〜2ヶ月、さらに好ましくは1日〜1ヶ月である。
培養は、バッチ培養(batch culture)、流加培養(fed-batch culture)、連続培養(continuous culture)などのいずれの方法を用いてもよいが、流加培養又は連続培養が好ましく、流加培養がより好ましい。
本発明の方法により製造されたポリペプチドが医薬として利用可能な生物学的活性を有する場合には、このポリペプチドを医薬的に許容される担体又は添加剤と混合して製剤化することにより、医薬品を製造することができる。
医薬的に許容される担体及び添加剤の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン(HSA)、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたポリペプチドを溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
ポリペプチドの有効投与量は、ポリペプチドの種類、治療や予防の対象とする疾患の種類、患者の年齢、疾患の重篤度などにより適宜選択される。例えば、ポリペプチドが抗グリピカン抗体である場合、抗グリピカン抗体の有効投与量(例えば、抗癌剤)は、一回につき体重1kgあたり0.001mgから1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。しかしながら、これらの投与量に制限されるものではない。
ポリペプチドの投与方法は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射(例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによる全身又は局所投与)、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。
本発明の他の実施態様として、TauTを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度MTXで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法が提供される。
なお、本発明において、「DNAが導入された細胞」とは、遺伝子組み換え技術により外来性DNAが組み込まれた細胞の他、遺伝子活性化技術(例えば、国際公開第WO94/12650号パンフレット参照)により内因性DNAが活性化され、その結果、当該DNAに対応する蛋白質の発現もしくは当該DNAの転写が開始或いは増加した細胞も包含する概念である。
まず、ヒト化抗ヒトグリピカン-3抗体のH鎖遺伝子を以下のようにして調製した。グリピカン−3断片(PCRによりGSTとの融合タンパク遺伝子を発現させて取得した)をマウス(MRL/lpr,日本チャールスリバー)に免疫した。このマウスの脾臓細胞を用いハイブリドーマを作製した。グリピカン−3を抗原に用いるELISAによりハイブリドーマをスクリーニングし、グリピカン−3結合抗体を産生するクローンを選択した。ハイブリドーマよりmRNAを抽出し,逆転写酵素を用いる逆転写反応によりcDNAを作製した。マウスH鎖可変領域遺伝子と相補塩基配列を持つプライマー(CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATG)(配列番号7)とcDNAを用いるPCRによりマウス抗グリピカン−3H鎖可変領域遺伝子を増幅し,pGEM-T Easy(Promega)と結合することにより取得した。マウス抗グリピカン−3H鎖可変領域遺伝子のフレームワーク領域とホモロジーを有するヒト抗体H鎖可変領域遺伝子をKabat databaseより検索し同定した。同定したヒト抗体H鎖可変領域遺伝子の各フレームワーク部分とマウス抗グリピカン−3抗体H鎖可変領域遺伝子の各CDR部分を結合したヒト化抗グリピカン−3H鎖可変領域遺伝子の塩基配列をデザインし,PCRにより合成した。ヒト化抗グリピカン−3H鎖可変領域遺伝子をヒトIgG1定常領域遺伝子と結合し,アミノ酸置換による最適化を行いヒト化抗グリピカン−3H鎖遺伝子を作製した(WO06/06693参照)。CAGプロモーターの下流にヒト化抗ヒトグリピカン-3抗体のH鎖遺伝子を結合し,更に下流にマウスβグロビンpolyAシグナルを結合する事によりH鎖発現ユニットを作成した。H鎖発現ユニットの上流のBamHI及びHindIIIと,下流のXhoIによりH鎖発現ユニットを切り出すことが出来る。
〔実施例1〕ハムスタータウリントランスポーター(TauT)導入によるMTX耐性獲得
pHyg-TauT発現プラスミド(後述の参考例2参照、図5)を宿主細胞であるCHO DXB11s細胞にエレクトロポレーション法で導入し、TauTを強発現させたDXB11s/TauT宿主細胞と親株であるDXB11s宿主細胞のMTX感受性を比較した。DXB11s/TauT宿主細胞とDXB11s宿主細胞はどちらもDHFR遺伝子欠損である(HT要求性である)ため、HT不含のCHO-S-SFM II /CD-CHO混合培地で培養することにより、MTXを添加しない場合には、同様に生存率が減少した(図1の「0nM MTX添加」)。10nMあるいは20nMのMTXを添加した場合、DXB11s宿主細胞ではMTXの毒性作用により生存率の減少が早まる傾向が見られた。一方、DXB11s/TauT宿主細胞では、MTXを添加しない場合と同程度に、生存率の低下が抑えられた(図1の「10nM, 20nM MTX添加」)。この結果はDXB11s/TauT宿主細胞がDXB11s宿主細胞に比べてMTX耐性を有することを示す。
次に、pHyg-TauT発現プラスミドを、親株である抗グリピカン-3抗体産生CHO細胞(調製例1で作製した、CAGプロモーター、抗グリピカン-3抗体遺伝子及びマウスベータグロビンプロモーター、DHFR遺伝子を挿入した発現ベクターphGC33CAG1を導入したdhfr欠失CHO細胞)にエレクトロポレーション法で導入し、TauTを強発現させたGC33/DXB11s/TauT株、さらにpPur-CSAD発現プラスミド(後述の参考例4参照、図6)を共導入し、CSADを強発現させたGC33/DXB11s/TauT/CSAD株のMTX感受性を親株のGC33/DXB11s株と比較した。親株は20nM MTX処理によって抗体遺伝子が20コピー以上に増幅(MTX処理前に対する相対値)された抗体産生株であるので20nM MTXを添加したCHO-S-SFM II /CD-CHO混合培地で安定に増殖できるが、MTX添加濃度を10倍過剰の200nM に上げたCHO-S-SFM II /CD-CHO混合培地においては、いずれもMTXの毒性により生存率が低下した。この実験系においても、TauTを強発現させた2株が親株以上のMTX耐性を示した(図2)。
実施例1で最もMTX耐性であったGC33/DXB11s/TauT/CSAD株を初発密度2x105cells/mLで高濃度MTX(100nMあるいは 200nM)を加えた CHO-S-SFM II /CD-CHO混合培地を用いて、3−5日おきに培地を交換して、遠心継代を28日間続けた。図3に示したように、継代28日目においても細胞の増殖はみられなかったため、MTX濃度をもとの20nMに戻して遠心継代を続けたところ、その時点から14日後の42日目には増殖するようになった。希釈継代によって生存率が回復した上記2株(100nMあるいは 200nM MTX処理細胞)を初発密度1x105cells/mLで20nM MTX存在下CHO-S-SFM II /CD-CHO混合培地を用いて15mLチューブ培養をおこなうと、高濃度MTX処理前後のGC33/DXB11s/TauT/CSAD株の細胞増殖に相違がみられ、200nM MTX処理細胞株の産生能がもっとも高く(生細胞数:18.0x105cells/mL、抗体産生量:144mg/L)、100nM MTX処理株(生細胞数:22.3x105cells/mL、抗体産生量:162mg/L)も高濃度MTX処理前のTauT/CSAD株(生細胞数:13.5x105cells/mL、抗体産生量:66mg/L)以上に抗体を高産生するポテンシャルを示した(図4)。また、高濃度MTX処理前のTauT/CSAD株は、生細胞数が19.6x105cells/mLと伸びた場合も、抗体産生量が86mg/Lであり、産生能はもっとも低かった。
以上の結果は、タウリントランスポーター(TauT)を人為的に強発現させることで細胞がMTX耐性を獲得し、TauT強発現細胞を宿主細胞とする場合、高濃度MTX処理により抗体をさらに高産生できる細胞が得られることを示唆している。
本発明は、あらゆる所望のポリペプチド(好ましくは抗体)産生細胞へ応用可能である。
CHO DXB11細胞に抗IL-6レセプター抗体遺伝子を導入した抗IL-6レセプター抗体産生細胞(特開平8-99902号公報)からtotal RNA抽出をおこなったのち、ポリAに依存するcDNAを合成した。SalI、XhoI、EcoRIの三種類の制限酵素で断片化したcDNAを鋳型することで、Hamsterタウリントランスポーター(TauT)遺伝子をPCRにより得た。PCRプライマーは 既知であるRat/Mouse TauT間で遺伝子配列が保存されている5’,3’を含むものを設計して用いた。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、既知の生物種のTauT との相同性から Hamster TauTをコードしていることを確認した(図7)。Hamster TauTアミノ酸配列はMouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(93% Identity) TauTに対して高い相同性を有しており、12の膜貫通領域をもつトランスポーターであることが予想された(図8)。ハムスターのTauTの塩基配列を配列番号1に示す。ハムスターのTauTのアミノ酸配列を配列番号2に示す。
参考例1のクローニングにより取得したHamster TauT(以下TauT)遺伝子にKozak配列を加え、CMVプロモーター発現プラスミドpHyg/TauT(図5)を構築した。pHyg/TauTあるいはTauT遺伝子を除いたコントロールプラスミドpHygを、親株である抗グリピカン-3抗体産生CHO細胞(国際公開第WO 2006/006693号パンフレットを参照)にエレクトロポレーション法で導入した。発現プラスミド導入細胞をHygromycin(400μg/ml)存在下で選抜したのち、安定して増殖する細胞株すべてを拡大した(pHyg/TauT:8株, pHyg:7株)。TauT mRNAを調製ののちTaqMan法により、親株に対して優位な発現を確認できる7株をpHyg/TauT導入細胞とした。導入細胞(7株)のmRNA平均発現量はコントロール(7株)の約40倍であった。計14株の細胞は2x105cells/mLの初発密度で50mlシェーカーフラスコによるバッチ(batch)培養および流加(Fed-batch)培養をおこない、培養後期7日目における生細胞密度、乳酸産生量、抗グリピカン-3抗体産生量を比較した。バッチ培養においては細胞増殖にともない培養液中に乳酸などの生育阻害物質が蓄積し、増殖が抑制されるが、pHyg/TauT導入細胞の生細胞密度(9.28±3.27 x 105 cells/ml)および乳酸産生量(1.54±0.20 g/L)はpHyg導入細胞(生細胞密度:5.69±2.09 x 105 cells/ml、乳酸産生量:1.75±0.15 g/L)に対して優位であった(t検定 P<0.05)。抗グリピカン-3抗体産生量に関しては、pHyg/TauT導入細胞の7株中4株(平均抗体産生量:440.6 mg/L)がpHyg導入細胞の最高値(389.6 mg/L)以上であった。さらにpHyg/TauT導入細胞の抗グリピカン-3抗体産生量の優位性(t検定 P<0.01)が流加培養により明らかになったため、上記4株中で最も増殖能が高かったpHyg/TauT導入細胞(T10)と親株の1L ジャーによる流加培養をおこなったところ、T10は培養32日目においても生存率が80%以上に維持されており、乳酸産生が抑制されていた。その結果、抗グリピカン-3抗体産生量は、培養35日目において2.9g/Lを達成した。TauT導入T10細胞が細胞膜上にTauT分子を発現していることはフローサイトメトリー分析で確認した。以上の結果は、Hamster TauTを人為的に発現させることによって抗体産生細胞のポテンシャルが上がり、抗体高産生株が得られることを示唆している。
CHO DXB11細胞に抗IL-6レセプター抗体遺伝子を導入した抗IL-6レセプター抗体産生細胞(特開平8-99902号公報)からtotal RNA抽出をおこなったのち、ポリAに依存するcDNAを合成した。SalI、XhoI、EcoRIの三種類の制限酵素で断片化したcDNAを鋳型とすることで、Hamster CSAD遺伝子をPCRにより得た。PCRプライマーは 既知であるRatとMouse間で遺伝子配列が保存されている5’,3’を含むものを設計して用いた。クローニングされた遺伝子は塩基配列を決定し、既知の生物種のCSADとの相同性から Hamster CSAD(図9)をコードしていることを確認した。 Hamster CSADはMouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(91% Identity)と既知のアミノ酸配列に対して高い相同性を有しており、同様の活性をもつ酵素であることが予想された。ハムスターのCSADの塩基配列を配列番号3に示す。ハムスターのCSADのアミノ酸配列を配列番号4に示す。
参考例3のクローニングにより取得したHamster CSAD(以下CSAD)遺伝子にKozak配列を加え、CMVプロモーター発現プラスミドpPur/CSAD(図6)を構築した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号1は、ハムスターTauTをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号2>
配列番号2は、ハムスターTauTのアミノ酸配列を示す。
<配列番号3>
配列番号3は、ハムスターCSADをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
<配列番号4>
配列番号4は、ハムスターCSADのアミノ酸配列を示す。
<配列番号5>
配列番号5は、Kozak配列を示す。
<配列番号6>
配列番号6は、分泌シグナルペプチド配列を示す。
<配列番号7>
配列番号7は、マウスH鎖可変領域遺伝子と相補塩基配列を持つプライマーの配列を示す。
<配列番号8>
配列番号8は、マウスL鎖可変領域遺伝子と相補塩基配列を持つプライマーの配列を示す。
Claims (15)
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である請求項1記載の方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である請求項2記載の方法。
- 所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子が、ベクターである請求項3記載の方法。
- タウリントランスポーターを強発現する細胞がさらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼを強発現する請求項1乃至4記載の方法。
- 請求項1乃至5記載の方法により作製された細胞。
- 請求項6記載の細胞を培養することを含む、所望のポリペプチドの製造方法。
- 所望のポリペプチドが、抗体である請求項7記載の製造方法。
- 請求項7乃至8記載の方法で製造されたポリペプチドを含有する医薬品を製造する方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞を高濃度メトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、さらにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAが導入されている細胞である請求項10記載の方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞が、所望のポリペプチドをコードするDNAとジヒドロ葉酸還元酵素をコードするDNAとを含む1つの分子によって共形質転換された細胞である請求項11記載の方法。
- タウリントランスポーターを強発現する細胞がさらにシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼを強発現する請求項10乃至12記載の方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートの存在下で培養し、生存する細胞から所望のポリペプチドを高産生する細胞を選択することを含む、所望のポリペプチドを高産生する細胞の作製方法。
- タウリントランスポーターを強発現し、且つ所望のポリペプチドをコードするDNAが導入された細胞をメトトレキセートで処理することにより、該細胞によるポリペプチド産生量を増強する方法。
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