ES2621546T3 - Anticuerpos dirigidos a HER-3 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se une a HER-3, que comprende una CDR1 de la cadena pesada representada por GGSFSGYYWS, una CDR2 de la cadena pesada representada por EINHSGSTNYNPSLKS y una CDR3 de la cadena pesada representada por DKWTWYFDL, y una CDR1 de la cadena ligera representada por RSSQSVLYSSSNRNYLA, una CDR2 de la cadena ligera representada por WASTRES y una CDR3 de la cadena ligera representada por QQYYSTPRT.

Description

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DESCRIPCION
Anticuerpos dirigidos a HER-3 y usos de los mismos Antecedentes de la invencion
1. Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a anticuerpos y sus fragmentos de union que se unen a HER-3 y a polinucleotidos que codifican los mismos. Tambien se proporcionan vectores de expresion y celulas hospedadoras que comprenden los mismos para la produccion del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la invencion. Ademas, la invencion proporciona composiciones y metodos para diagnosticar y tratar enfermedades asociadas con la transduccion de senales mediada por HER-3 y/o su ligando heregulina.
2. Antecedentes de la tecnologfa
El receptor 3 del factor de crecimiento epidermico humano (HER-3, tambien conocido como ErbB3) es una protema tirosina cinasa receptora y pertenece a la subfamilia de receptores del factor de crecimiento epidermico (EGFR) de protema tirosina cinasas receptoras, que tambien incluye hER-1 (tambien conocido como EGFR), HER-2 y HER-4 (Plowman y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (l989), 9l93-9197; y Kraus y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). Como el receptor del factor de crecimiento epidermico prototfpico, el receptor transmembranario HER-3 consiste en un dominio de union a ligando extracelular (ECD), un dominio de dimerizacion dentro del ECD, un dominio transmembranario, un dominio de protema tirosina cinasa (TKD) intracelular y un dominio de fosforilacion C-terminal.
El ligando heregulina (HRG) se une al dominio extracelular de HER-3 y activa la ruta de senalizacion mediada por receptor al promover la dimerizacion con otros miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento epidermico humanos (HER) y la transfosforilacion de su dominio intracelular. La formacion de dfmeros entre miembros de la familia de hEr expande el potencial de senalizacion de HER-3 y es un medio no solo para la diversificacion de senales sino tambien la amplificacion de senales. Por ejemplo, el heterodfmero HER-2/HER-3 induce una de las senales mitogenicas mas importantes entre los miembros de la familia de HER.
Se ha encontrado que HER-3 se sobreexpresa en varios tipos de cancer tales como cancer de mama, gastrointestinal y pancreatico. De forma interesante, se ha mostrado una correlacion entre la expresion de HER- 2/HER-3 y la progresion desde un estadio no invasivo a uno invasivo (Alimandi y cols., Oncogene 10,1813-1821; deFazio y cols., Cancer 87, 487-498; Naidu y cols., Br. J. Cancer 78, 1385-1390). Segun esto, son deseables agentes que interfieran con la senalizacion mediada por HER-3. Se han presentado anticuerpos para HER-3 murinos o quimericos, tal como en los documentos US5968511, US5480968 y WO03013602. El documento US 2004/071696 divulga anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra el dominio extracelular de HER-3 y su uso para tratar el cancer.
Se ha mostrado que un anticuerpo monoclonal humanizado contra HER-2, Herceptin®, interfiere con la senalizacion mediada por HER-2 y es terapeuticamente eficaz en seres humanos (Fendly y cols., Hybridoma 6, 359-370; Hudziak y cols., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172; Stebbing y cols., Cancer Treat. Rev. 26, 287-290). Se ha mostrado que Herceptin® actua a traves de dos mecanismos diferentes, es decir, la asociacion de las celulas efectoras del sistema inmunitario asf como un efecto inductor de la apoptosis citotoxico directo.
Sin embargo, solo los pacientes con HER-2 muy amplificado responden significativamente a la terapia con Herceptin®, limitando asf el numeros de pacientes adecuados para la terapia. Ademas, el desarrollo de resistencia a farmacos o un cambio en la expresion o la secuencia epitopica de HER-2 sobre celulas tumorales pueden convertir incluso a los pacientes accesibles en no reactivos con el anticuerpo y de ese modo anular sus efectos terapeuticos. Por lo tanto, se necesitan mas farmacos para terapias basadas en dianas que se enfoquen a miembros adicionales de la familia de HER, tales como HER-3.
Breve descripcion de las figuras de los dibujos
La Fig. 1 muestra el nivel de expresion de HER-3 en un grupo de lmeas celulares cancerosas humanas y demuestra que HER-3 se expresa en una variedad de canceres humanos.
La Fig. 2 muestra los resultados del analisis por FACS de un anticuerpo para HER-3 que se une bien a celulas Ratl que expresan establemente los diferentes miembros de la familia de HER o bien solamente al vector vacm.
La Fig. 3 muestra compartimentos de union a anticuerpo cartografiados para dominios de HER3.
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La Fig. 4. muestra los resultados del analisis de afinidad de anticuerpos de Scatchard por FACS indirecta realizado con anticuerpos anti-HER-3 de la invencion. El analisis indica que los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion poseen grandes afinidades y fuertes constantes de union para HER-3 expresado sobre la superficie celular.
La Fig. 5 muestra la endocitosis acelerada de HER-3 inducida por anticuerpos anti-HER-3 de la invencion.
Las Figs. 6a-e muestran los resultados de un ensayo de competicion de ligandos realizado con anticuerpos anti- HER-3 de la invencion. Los resultados demuestran que los anticuerpos de la invencion reducen espedficamente la union de [125I]-a-HRG/[125I]-p-HRG a celulas que expresan HER-3 endogeno.
La Fig. 7a muestra los resultados de un ELISA de fosfotirosina de HER-3 realizado con anticuerpos anti-HER-3 de la invencion. Los anticuerpos segun la presente invencion eran capaces de inhibir la activacion de HER-3 mediada por p-HRG segun se indica por un incremento en la fosforilacion de tirosina del receptor. Por otra parte, la fig. 7b muestra resultados representativos de este experimento con anticuerpo valorado.
La Fig. 8 muestra el resultado de un ELISA de p42/p44 MAP-cinasa realizado con anticuerpos anti-HER-3 de la invencion. Los anticuerpos segun la presente invencion eran capaces de reducir la activacion de p42/p44 MAP- cinasa mediada por p-HRG segun se indica por un incremento en la fosforilacion de MAP-cinasa.
La Fig. 9 muestra el resultado de un ELISA de fosfo-AKT realizado con anticuerpos anti-HER-3 de la invencion. Los anticuerpos segun la presente invencion eran capaces de reducir la activacion de AKT mediada por p-HRG segun se indica por la fosforilacion de AKT.
La Fig. 10 muestra la inhibicion de la proliferacion de celulas MCF7 por anticuerpos anti-HER-3 humanos de la invencion. Los anticuerpos segun la presente invencion inhiben el crecimiento celular inducido por HRG en celulas cancerosas humanas.
La Fig. 11 muestra la transmigracion de celulas MCF7 inhibida por anticuerpos anti-HER-3 humanos de la invencion.
Las Figs. 12a-i muestran la inhibicion del crecimiento celular independiente del anclaje por anticuerpos para HER-3 humanos de la invencion.
La Fig. 13 muestra la inhibicion del crecimiento de xenoinjertos de celulas de cancer de mama humano T47D por un anticuerpo anti-HER-3 humano de la invencion.
La Fig. 14 muestra la reduccion de celulas de cancer de pancreas humano BxPC3 en ratones despues de la administracion de anticuerpos anti Her3 (U1-59 y U1-53) o anti EGFR (Erbitux).
La Fig. 15 muestra la reduccion del crecimiento de xenoinjertos de celulas de cancer de pancreas humano BxPC3 por un anticuerpo anti-HER-3 humano de la invencion y en combinacion con anticuerpos anti EGFR (Erbitux).
La Fig. 16 demuestra que los anticuerpos de la invencion retrasan el crecimiento de celulas de melanoma humano (HT144) en ratones nu/nu.
La Fig. 17 muestra la reduccion del crecimiento de xenoinjertos de celulas de carcinoma de colon humano HT-29 por anticuerpos para HER-3 humanos de la invencion (U1-53, U1-59 y U1-7).
La Fig. 18 muestra la reduccion del crecimiento de xenoinjertos de celulas de cancer de pulmon humano Calu-3 por anticuerpos anti-HER-3 humanos de la invencion (U1-59, U1-53 y U1-7).
La Fig. 19 muestra la reduccion del crecimiento de xenoinjertos de celulas de cancer de pancreas humano BxPC-3 por anticuerpos anti-HER-3 humanos de la invencion (U1-7, U1-59 y U1-53).
La Fig. 20 demuestra que un anticuerpo de la invencion (U1-59) provoca la supresion de HER-3 en xenoinjertos de cancer de pancreas humano BxPC3.
Sumario de la invencion
Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se une a HER-3, que comprende una CDR1 de la cadena pesada representadas por GGSFSGYYWS, una CDR2 de la
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cadena pesada representada por EINHSGSTNYNPSLKS y una CDR3 de la cadena pesada representada por DKWTWYFDL, y una CDR1 de la cadena ligera representada por RSSQSVLYSSSnRnYLA, una CDR2 de la cadena ligera representada por WASTRES y una CDR3 de la cadena ligera representada por QQYYSTPRT.
En una realizacion de la presente invencion, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la invencion comprende una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de SEQ ID N°: 70 y una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de SEQ ID NO 72.
Segun la presente invencion, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que es capaz de unirse a HER-3 interactua con al menos un epftopo en la parte extracelular de HER-3. Los epftopos estan situados preferiblemente en el dominio L1 (aa 19-184) que es el dominio aminoterminal, en el dominio Si (aa 185-327) y S2 (aa 500-632) que son los dos dominios ricos en cistema, o en el dominio L2 (328-499) que esta flanqueado por los dos dominios ricos en cistema. Los epftopos tambien pueden estar situados en combinaciones de dominios tales como, pero no limitadas a, un epftopo comprendido por partes de Li y Si. Se prefiere mas un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se una a una estructura tridimensional formada por los residuos de aminoacido 1-160, 161-358, 359575, 1-358 y/o 359-604 de HER-3 maduro, particularmente de HER-3 humano maduro.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-HER-3 es U1-59 (SEQ ID N°: 70/72) o un anticuerpo que tiene al menos una cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo.
Ademas, realizaciones adicionales de la presente invencion proporcionan un anticuerpo o fragmento de anticuerpo acoplado a un grupo de etiquetaje o un grupo efector. Preferiblemente, tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo es util para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, particularmente enfermedades oncologicas tales como cancer de mama, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de estomago, cancer endometrial, cancer de las glandulas salivares, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de tiroides, cancer de vejiga urinaria, glioma, melanoma, cancer de testmulo, sarcoma de tejidos blandos, cancer de cabeza y cuello, u otros canceres que expresan o sobreexpresan HER-3, y la formacion de metastasis tumorales.
Otros aspectos de la presente invencion se refieren a una molecula de acido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion, un vector que tiene una molecula de acido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion, y una celula hospedadora, p. ej. una celula CHO, una celula de mieloma NS/0, transformada con tal molecula de acido nucleico o vector.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion al preparar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a partir de una celula hospedadora que secrete el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se prepara a partir de una lrnea celular de hibridoma que secreta un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o una celula CHO u otro tipo de celula transformado con una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para producir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion al preparar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a partir de un tejido, producto o secrecion de un animal, una planta o un hongo transgenico para una molecula de acido nucleico o moleculas de acido nucleico que codifican el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion. Preferiblemente, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se prepara a partir del tejido, producto o secrecion de un animal transgenico tal como una vaca, una oveja, un conejo, un pollo u otra especie de mairftfero o ave, una planta transgenica tal como mafz, tabaco u otra planta, o un hongo transgenico tal como Aspergillus, Pichia u otra especie de hongo.
Otro aspecto de la presente invencion trata de una composicion farmaceutica que comprende como un agente activo al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion mezclado con portadores, diluyentes y/o adyuvantes farmaceuticamente aceptables. En otra realizacion preferida de la presente invencion, la composicion farmaceutica de la invencion contiene adicionalmente al menos otro agente activo, p. ej. al menos un agente antineoplastico. Otro aspecto mas de la presente invencion trata del uso de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion, y opcionalmente al menos otro agente activo, p. ej. al menos un agente antineoplastico, mezclados con portadores, diluyentes y/o adyuvantes farmaceuticamente aceptables para la preparacion de una composicion farmaceutica. La composicion farmaceutica es adecuada para diagnosticar, prevenir o tratar una enfermedad hiperproliferativa, particularmente una enfermedad oncologica tal como cancer de mama, cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de estomago, cancer endometrial, cancer de las glandulas salivares, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de tiroides, cancer de vejiga urinaria, glioma, melanoma u otros canceres que expresan o sobreexpresan HER-3, y la formacion de metastasis tumorales.
Por otra parte, la presente invencion se refiere en un aspecto adicional al uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion en un metodo para diagnosticar enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3, comprendiendo el metodo poner en contacto una muestra con al menos un anticuerpo o fragmento de
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anticuerpo de la invencion, bajo condiciones adecuadas para permitir la union de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a HER-3 e identificar la union de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a HER-3. Enfermedades o afecciones preferidas incluyen las enfermedades hiperproliferativas mencionadas anteriormente.
Otro aspecto mas de la presente invencion es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para el uso en un metodo para prevenir o tratar enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3 en un paciente que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar al paciente una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion y opcionalmente al menos otro agente activo, p. ej. al menos un agente neoplastico. Preferiblemente, el paciente es un paciente mairnfero, mas preferiblemente un paciente humano. Enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3 preferidas son las enfermedades hiperproliferativas mencionadas anteriormente.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a un estuche para el diagnostico, la prevencion o el tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3, que comprende al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y/o molecula de acido nucleico y/o vector de la invencion. Opcionalmente, el estuche de la invencion puede comprender ademas al menos otro agente activo, p. ej. al menos un agente antineoplastico. Preferiblemente, las enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3 son las enfermedades hiperproliferativas mencionadas anteriormente.
Descripcion detallada
Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a HER-
3.
En una realizacion de la presente invencion, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la invencion comprende una secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de SEQ ID NO 70 y una secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de SEQ ID NO 72.
Segun la presente invencion, se ha de entender que la secuencia de aminoacidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion no se limita a los veinte aminoacidos convencionales (Vease Immunology - A Synthesis (2a Edicion, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Por ejemplo, los aminoacidos pueden incluir estereoisomeros (p. ej. D-aminoacidos) de los veinte aminoacidos convencionales, aminoacidos no naturales tales como aminoacidos a-,a-disustituidos, N-alquilaminoacidos, acido lactico y otros aminoacidos no convencionales. Ejemplos de aminoacidos no convencionales, que tambien pueden ser componentes adecuados para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion, incluyen: 4-hidroxiprolina, y- carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3- metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoacidos e iminoacidos similares, p. ej. 4-hidroxiprolina.
Por otra parte, segun la presente invencion, se contempla que variaciones pequenas en las secuencias de aminoacidos esten abarcadas por la presente invencion, con la condicion de que las variaciones en la secuencia de aminoacidos mantengan al menos 75%, mas preferiblemente al menos 80%, 90%, 95%, y lo mas preferiblemente 99% de las secuencias mostradas en SEQ ID N°: 70 y 72. Las variaciones se pueden producir en las regiones de armazon (es decir fuera de las CDR), pero no dentro de las CDR. Las variaciones preferidas en las secuencias de aminoacidos mostradas en SEQ ID N°: 70 y 72, es decir supresiones, inserciones y/o sustituciones de al menos un aminoacido, se producen cerca de los lfmites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante comparacion de los datos de la secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos con bases de datos de secuencias publicas o patentadas. Se pueden usar metodos de comparacion informaticos para identificar motivos de secuencia o dominios de conformacion protemicos predichos que se presentan en otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo de estructura y/o funcion conocida. Se conocen metodos para identificar secuencias protemicas que se pliegan en una estructura tridimensional. Veanse, p. ej., Bowie y cols., Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton y cols., Nature 354, 105 (1991). Asf, los expertos en la especialidad pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se pueden usar para definir dominios estructurales y funcionales segun la invencion.
Variaciones especialmente preferidas en las secuencias de aminoacidos mostradas en SEQ ID N°: 70 y 72 son las que conducen a una reduccion de la sensibilidad a la proteolisis o la oxidacion, alteran los patrones de glicosilacion o alteran las afinidades de union o confieren o modifican otras propiedades fisicoqmmicas o funcionales del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En particular, se contemplan sustituciones de aminoacidos conservativas. Las sustituciones conservativas son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que estan relacionados en sus cadenas laterales. Familias de aminoacidos preferidas son las siguientes: familia acida = aspartato, glutamato; familia basica = lisina, arginina, histidina; familia no polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y familia polar no cargada = glicina, asparagina, glutamina, cistema, serina, treonina, tirosina. Familias mas preferidas son: familia alifatica-hidroxilada = serina y treonina; familia que contiene amida = asparagina y glutamina; familia alifatica = alanina, valina, leucina e isoleucina; y familia aromatica =
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fenilalanina, triptofano y tirosina. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitucion aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamate, una treonina por una serina, o una sustitucion similar de un aminoacido por un aminoacido relacionado estructuralmente, no tenga un efecto importante sobre la union o las propiedades del anticuerpo o fragmento de anticuerpo resultante, especialmente si la sustitucion no implica a un aminoacido dentro de un sitio de armazon. Sin embargo, todas las otras posibles sustituciones de aminoacidos tambien son abarcadas por la presente invencion. Si un cambio de aminoacido da como resultado un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional, es decir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a HER-3 y reduce la transduccion de senales de miembros de la familia de HER, se puede determinar facilmente al ensayar la actividad espedfica del anticuerpo o fragmento de anticuerpo resultante en ELISA o FACS con respecto a la union a HER-3 o un ensayo funcional in vitro o in vivo.
Segun la presente invencion, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion interactua con al menos un epftopo en la parte extracelular de HER-3. Los epftopos estan situados preferiblemente en el dominio L1 (aa 19184), que es el dominio aminoterminal, en el dominio S1 (aa 185-327) y S2 (aa 500-632), que son los dos dominios ricos en cistema, en el dominio L2 (328-499), que esta flanqueado por los dos dominios ricos en cistema, o en una combinacion de dominios de HER-3. Los epftopos tambien pueden estar situados en combinaciones de dominios tales como, pero no limitados a, un epftopo comprendido por partes de L1 y S1. Por otra parte, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se caracteriza ademas por que su union a HER-3 reduce la transduccion de senales mediada por HER-3. Segun la presente invencion, una reduccion de la transduccion de senales mediada por HER-3 puede estar provocada, p. ej., por una regulacion a la baja de HER-3 que da como resultado la desaparicion al menos parcial de moleculas de HER-3 de la superficie celular o por una estabilizacion de HER-3 sobre la superficie celular en una forma sustancialmente inactiva, es decir una forma que exhibe una transduccion de senales menor en comparacion con la forma no estabilizada. Alternativamente, una reduccion de la transduccion de senales mediada por HER-3 tambien se puede provocar al influir, p. ej. disminuir o inhibir, la union de un ligando u otro miembro de la familia de HER a HeR-3, de GRB2 a HER-2 o de GRB2 a SHC, al inhibir la fosforilacion de tirosinas receptoras, la fosforilacion de AKT, la fosforilacion de la tirosina PYK2 o la fosforilacion de ERK2, o al disminuir la invasividad tumoral. Alternativamente, una reduccion de las transduccion de senales mediada por HER-3 tambien se puede provocar al influir, p. ej., disminuir o inhibir, la formacion de dfmeros que contienen HER-3 con otros miembros de la familia de HER. Un ejemplo entre otros puede ser la disminucion o la inhibicion de la formacion de complejos protemicos de HER3-EGFR.
El termino "anticuerpo" o "anticuerpo anti-HER-3", segun se usa en la presente, significa un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinarte, un anticuerpo humanizado (Jones y cols., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann y cols., Nature 332 (1988), 323-329; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596), un anticuerpo quimerico (Morrison y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), un anticuerpo multiespedfico (p. ej. un anticuerpo biespedfico) formado por al menos dos anticuerpos, o un fragmento de anticuerpo de los mismos. El termino "fragmento de anticuerpo" comprende cualquier porcion de los susodichos anticuerpos, preferiblemente sus regiones de union a antfgeno variables. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, diacuerpos (Hollinger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), moleculas de anticuerpo monocatenarias (Pluckthun en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg y Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) y otros fragmentos con tal de que exhiban la capacidad deseada de union a HER-3.
Ademas, el termino "anticuerpo" o "anticuerpo anti-HER-3", segun se usa en la presente, puede incluir moleculas similares a anticuerpo que contienen subdominios manipulados de anticuerpos o variantes de anticuerpos presentes en la naturaleza. Estas moleculas similares a anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio tales como dominios solamente VH o solamente VL derivados bien de fuentes naturales tales como camelidos (Muyldermans y cols., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302) o a traves de exposicion in vitro de bibliotecas procedentes de seres humanos, camelidos u otras especies (Holt y cols., Trends Biotechnol., 21,484-90).
Segun la presente invencion, el "fragmento Fv" es el fragmento de anticuerpo mmimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de y union a antfgeno. Esta region consiste en un dfmero de un dominio variable de la cadena pesada y uno de la ligera en asociacion no covalente estrecha. Es en esta configuracion que las tres CDR de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union a antfgeno sobre la superficie del dfmero Vh-Vl. Colectivamente, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de union a antfgeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR espedficas para un antfgeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antfgeno, aunque habitualmente con una afinidad inferior que el sitio de union entero. El "fragmento Fab" tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. El "fragmento Fab" difiere del "fragmento Fab'" por la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio de la cadena pesada CH1 incluyendo una o mas cistemas procedentes de la region bisagra del anticuerpo. El "fragmento F(ab')2" se produce originalmente como un par de “fragmentos Fab'" que tienen cistemas de bisagra entre ellos. Metodos para preparar tales fragmentos de anticuerpo, tales como digestion con papama o pepsina, son conocidos por los expertos en la especialidad.
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En una realizacion preferida de la presente invencion, el anticuerpo anti-HER-3 de la invencion es del tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, preferiblemente del tipo IgG o IBM, incluyendo, pero no limitados a, el tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 e IgM2. En las realizaciones mas preferidas, el anticuerpo es del tipo IgG1, IgG2 o IgG4.
En otra realizacion preferida de la presente invencion, el anticuerpo anti-HER-3 de la invencion es anti-HER-3 dirigido contra el dominio extracelular (ECD) de HER-3.
En ciertos aspectos, p. ej. en relacion con la generacion de anticuerpos como candidatos terapeuticos contra HER-3, puede ser deseable que el anticuerpo anti-HER-3 de la invencion sea capaz de fijar el complemento y participar en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Existe un numero de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo, sin limitaciones, los siguientes: IBM murina, IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IBM humana, IgG1 humana, IgG3 humana e IgA humana. Se apreciara que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente tal isotipo sino que, en cambio, el anticuerpo segun se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede cambiar de isotipo al adjuntar los genes o ADNc de la region V molecularmente clonados a genes o ADNc de la region constante molecularmente clonados en vectores de expresion apropiados usando tecnicas de biologfa molecular convencionales que son muy conocidas en la especialidad y a continuacion expresar los anticuerpos en celulas hospedadoras usando tecnicas conocidas en la especialidad. El anticuerpo con isotipo cambiando tambien puede poseer una region Fc que se ha manipulado molecularmente para poseer CDC superior sobre las variantes presentes en la naturaleza (Idusogie y cols., J Immunol., 166, 2571-2575) y se ha expresado recombinantemente en celulas hospedadoras usando tecnicas conocidas en la especialidad. Tales tecnicas incluyen el uso de tecnicas recombinantes directas (vease, p. ej., la Patente de EE. uU. N° 4.816.397), tecnicas de fusion celula-celula (veanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 5.916.771 y 6.207.418), entre otras. En la tecnica de fusion celula-celula, se prepara una lmea celular de mieloma u otra tal como CHO que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otra lmea celular de mieloma u otra tal como CHO que posee la cadena ligera. Posteriormente, tales celulas se pueden fusionar y se puede aislar un lmea celular que expresa un anticuerpo intacto. A modo de ejemplo, un anticuerpo anti-IgG4 de HER-3 humano, que posee la union deseada al antfgeno HER-3, se podna cambiar facilmente de isotipo para generar un isotipo de IgM humana, IgG1 humana o IgG3 humana, mientras que todavfa poseena la misma region variable (que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad). Tal molecula podna ser capaz entonces de fijar el complemento y participar en la CDC.
Por otra parte, tambien puede ser deseable que el anticuerpo anti-HER-3 de la invencion sea capaz de unirse a receptores Fc sobre celulas efectoras, tales como monocitos y celulas asesinas naturales (NK), y participe en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Existe un numero de isotipos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo, sin limitacion, los siguientes: IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgG1 humana e IgG3 humana. Se apreciara que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente tal isotipo sino que, en cambio, el anticuerpo segun se genera puede poseer cualquier isotipo y el anticuerpo puede cambiar de isotipo al adjuntar los genes o ADNc de la region V molecularmente clonados a genes o ADNc de la region constante molecularmente clonados en vectores de expresion apropiados usando tecnicas de biologfa molecular convencionales que son muy conocidas en la especialidad y a continuacion expresar los anticuerpos en celulas hospedadoras usando tecnicas conocidas en la especialidad. El anticuerpo con isotipo cambiando tambien puede poseer una region Fc que se ha manipulado molecularmente para poseer ADCC superior sobre las variantes presentes en la naturaleza (Shields y cols. J Biol Chem., 276, 6591-6604) y se ha expresado recombinantemente en celulas hospedadoras usando tecnicas conocidas en la especialidad. Tales tecnicas incluyen el uso de tecnicas recombinantes directas (vease, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 4.816.397), tecnicas de fusion celula-celula (veanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. N° 5.916.771 y 6.207.418), entre otras. En la tecnica de fusion celula-celula, se prepara una lmea celular de mieloma u otra tal como CHO que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otra lmea celular de mieloma u otra tal como CHO que posee la cadena ligera. Posteriormente, tales celulas se pueden fusionar y se puede aislar un lmea celular que expresa un anticuerpo intacto. A modo de ejemplo, un anticuerpo anti-IgG4 de HER-3 humano, que posee la union deseada al antfgeno HER-3, se podna cambiar facilmente de isotipo para generar un isotipo IgG1 humana o IgG3 humana, mientras que todavfa poseena la misma region variable (que define la especificidad del anticuerpo y algo de su afinidad). Tal molecula podna ser capaz entonces de unirse a FcyR sobre celulas efectoras y participar en la ADCC.
Por otra parte, segun la presente invencion, se aprecia que en anticuerpo anti-HER-3 de la invencion es un anticuerpo completamente humano o humanizado. Los anticuerpos humanos evitan ciertos de los problemas asociados con anticuerpos xenogeneicos, por ejemplo anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de murido o rata. La presencia de protemas derivadas xenogeneicamente tales como protemas de murido o rata puede conducir a la generacion de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por un paciente, conduciendo posteriormente a la depuracion rapida de los anticuerpos, perdida de utilidad terapeutica a traves de la neutralizacion del anticuerpo y/o reacciones alergicas graves, incluso potencialmente letales.
Preferiblemente, el anticuerpo anti-HER-3 de la invencion es el anticuerpo gU1-59.
En una realizacion preferida de la presente invencion, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se acopla a un grupo de etiquetaje. Tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo es particularmente adecuado para aplicaciones de diagnostico. Segun se usa en la presente, el termino "grupo de etiquetaje" se refiere a un marcador
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detectable, p. ej. un aminoacido radioetiquetado o un resto biotinilado que se puede detectar mediante avidina marcada (p. ej. estreptavidina unida a un marcador fluorescente o una actividad enzimatica que se puede detectar mediante metodos opticos o colorimetricos). Diversos metodos para etiquetar polipeptidos y glicoprotemas, tales como anticuerpos, se conocen en la especialidad y se pueden usar al realizar la presente invencion. Ejemplos de grupos de etiquetaje adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisotopos o radionuclidos (p. ej. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p. ej. FITC, rodamina, fosforos lantanidos), grupos enzimaticos (p. ej. peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilados o epftopos polipeptfdicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej. secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de union para anticuerpos secundarios, dominios de union a metales, marcas epitopicas). En ciertos aspectos, puede ser deseable que los grupos de etiquetaje esten enlazados por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento esterico potencial.
Alternativamente, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se puede acoplar a un grupo efector en otra realizacion preferida de la invencion. Tal anticuerpo o fragmento de anticuerpo es especialmente adecuado para aplicaciones terapeuticas. Segun se usa en la presente, el termino "grupo efector" se refiere a un grupo citotoxico tal como un radioisotopo o radionuclido, una toxina, un grupo terapeutico u otro grupo efector conocido en la especialidad. Ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisotopos o radionuclidos (p. ej. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), caliqueamicina, analogos de dolastatina tales como auristatinas, y agentes quimioterapeuticos tales como derivados de geldanamicina y maitansina, incluyendo DM1. En ciertos aspectos, puede ser deseable que los grupos efectores esten enlazados por ramas espaciadoras de diversas longitudes para reducir el impedimento esterico potencial.
Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para preparar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la invencion, que comprende la etapa de aislar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una celula hospedadora que secreta el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Celulas hospedadoras, que se pueden usar segun la presente invencion, son hibridomas; celulas eucarioticas tales como celulas de mairnfero, p. ej. celulas de hamster, conejo, rata, cerdo, raton u otro animal, celulas vegetales, celulas fungicas, p. ej. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; celulas procarioticas tales como E. coli; y otras celulas usadas en la especialidad para la produccion de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Diversos metodos para preparar y aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de celulas hospedadoras se conocen en la especialidad y se pueden usar al realizar la presente invencion. Por otra parte, metodos para preparar fragmentos de anticuerpo, tales como digestion con papama o pepsina, tecnicas de clonacion modernas, tecnicas para preparar moleculas de anticuerpo monocatenarias (Pluckthun en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg y Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) y diacuerpos (Hollinger y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 64446448), tambien son conocidos por los expertos en la especialidad y se pueden usar al realizar la presente invencion.
En una realizacion preferida de la presente invencion, se prepara un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Vease, p. ej., Kohler y cols., Nature 256 (1975), 495.
En una realizacion preferida adicional de la presente invencion, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se prepara recombinantemente al optimizar y/o amplificar la expresion del anticuerpo o fragmento de anticuerpo en una celula hospedadora y aislar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de dicha celula hospedadora. A este fin, las celulas hospedadoras se transforman o transfectan con ADN que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o un vector que contiene ADN que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y se cultivan bajo condiciones apropiadas para producir el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion. Vease, p. ej., la Patente de eE. UU. N° 4.816.567. Celulas hospedadoras preferidas pueden ser celulas CHO, celulas de mieloma NS/0, celulas 293 de rinon embrionario humano, E. coli y Saccharomyces cerevisiae.
Los anticuerpos se pueden preparar a partir de animales geneticamente manipulados para elaborar anticuerpos completamente humanos o a partir de una biblioteca de exposicion de anticuerpos elaborada en un bacteriofago, una levadura, un ribosoma o E. coli. Veanse, p. ej., Clackson y cols., Nature 352 (1991), 624-628, Marks y cols., J. Mol. Biol. 222 (1991), 581-597, Feldhaus y Siegel J Immunol Methods. 290, 69-80, Groves y Osbourn, Expert Opin Biol Ther., 5, 125-135 y Jostock y Dubel, Comb Chem High Throughput Screen. 8, 127-133.
Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/ constantes de murido o rata. La presencia de tales protema derivadas de murido o rata puede conducir a la depuracion rapida de los anticuerpos o puede conducir a la generacion de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por un paciente. A fin de evitar la utilizacion de anticuerpos derivados de murido o rata, se pueden generar anticuerpos completamente humanos a traves de la introduccion de loci de anticuerpos humanos funcionales en un roedor. otro marnffero o animal, de modo que el roedor, otro mamffero o animal produzca anticuerpos completamente humanos.
Un metodo para generar anticuerpos completamente humanos es a traves de uso de cepas XENOMOUSE® de ratones que se han manipulado para contener fragmentos de configuracion de lmea germinal de 245 kb y 190 kb de
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tamano del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa. Otras cepas XenoMouse de ratones contienen fragmentos de configuracion de lmea germinal de 980 kb y 800 kb de tamano del locus de la cadena pesada huma y el locus de la cadena ligera kappa. Otras cepas XenoMouse de ratones adicionales contienen fragmentos de configuracion de lmea germinal de 980 kb y 800 kb de tamano del locus de la cadena pesada humana y el locus de la cadena ligera kappa mas un locus de la cadena ligera lambda humana completo configurado con lmea germinal de 740 kb de tamano. Veanse Mendez y cols. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Las cepas XENOMOUSE® estan disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).
La produccion de los ratones XENOMOUSE® se analiza y esboza adicionalmente en las Solicitudes de Patente de EE. UU. N° de Serie 07/466,008, presentada el 12 de enero de 1990, 07/610.515, presentada el 8 de noviembre de 1990, 07/919.297, presentada el 24 de julio de 1992, 07/922.649, presentada el 30 de julio de 1992, 08/031.801, presentada el 15 de marzo de 1993, 08/112.848, presentada el 27 de agosto de 1993, 08/234.145, presentada el 28 de abril de 1994, 08/376.279, presentada el 20 de enero de 1995, 08/430.938, 27 de abril de 1995, 08/464.584, presentada el 5 de junio de 1995, 08/464.582, presentada el 5 de junio de 1995, 08/463.191, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.837, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.853, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.857, presentada el 5 de junio de 1995, 08/486.859, presentada el 5 de junio de 1995, 08/462.513, presentada el 5 de junio de 1995, 08/724.752, presentada el 2 de octubre de 1996, y 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996, la Publicacion de Patente de EE. UU. 2003/0217373, presentada el 20 de noviembre de 2002, y las Patentes de EE. UU. N° 6.833.268, 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598 y las Patentes Japonesas N° 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Veanse ademas la Patente Europea N° EP 0 463 151 B1, concesion publicada el 12 de junio de 1996, la Solicitud de Patente Internacional N° WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la Solicitud de Patente Internacional N° WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000.
En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, se imita un locus Ig exogeno a traves de la inclusion de trozos (genes individuales) procedentes del locus Ig. Asf, uno o mas genes de Vh, uno o mas genes de Dh, uno o mas genes de Jh, una region constante mu y una segunda region constante (preferiblemente una region constante gamma) se forman en una construccion para la insercion en un animal. Este enfoque se describe en la Patente de EE. UU. N° 5,545.807 de Surani y cols. y las Patentes de EE. UU. N° 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458, cada una de Lonberg y Kay, las Patentes de EE. UU. N° 5.591.669 y 6.023.010 de Krimpenfort y Berns, las Patentes de EE. UU. N° 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 de Berns y cols., y la Patente de EE. UU. N° 5.643.763 de Choi y Dunn, y las Solicitudes de Patente Internacional de GenPharm N° de Serie 07/574.748, presentada el 29 de agosto de 1990, 07/575.962, presentada el 31 de agosto de 1990, 07/810.279, presentada el 17 de diciembre de 1991, 07/853.408, presentada el 18 de marzo de 1992, 07/904.068, presentada el 23 de junio de 1992, 07/990.860, presentada el 16 de diciembre de 1992, 08/053.131, presentada el 26 de abril de 1993, 08/096.762, presentada el 22 de julio de 1993, 08/155.301, presentada el 18 de noviembre de 1993, 08/161.739, presentada el 3 de diciembre de 1993, 08/165.699, presentada el 10 de diciembre de 1993, 08/209.741, presentada el 9 de marzo de 1994. Veanse ademas la Patente Europea N° 0 546 073 B1, las Solicitudes de Patente Internacional N° WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la Patente de EE. UU. N° 5.981.175. Veanse ademas Taylor y cols., 1992, Chen y cols., 1993, Tuaillon y cols., 1993, Choi y cols., 1993, Lonberg y cols., (1994), Taylor y cols., (1994), and Tuaillon y cols., (1995), Fishwild y cols., (1996).
Kirin tambien ha demostrado la generacion de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a traves de fusion microcelular, se han introducido grandes trozos de cromosomas, o cromosomas enteros. Veanse las Solicitudes de Patente Europea N° 773 288 y 843 961. Adicionalmente, se han generado ratones KM™-, que son el resultado del cruce de ratones Tc de Kirin con ratones con minilocus de Medarex (Humab). Estos ratones poseen el transcromosoma HC de los ratones de Kirin y el transgen de la cadena kappa de los ratones Medarex (Ishida y cols., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
Los anticuerpos humanos tambien se pueden derivar mediante metodos in vitro. Ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a, exposicion de fagos (como la comercializada por Cambridge Antibody Technology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed), exposicion de ribosomas (como la comercializada por Cambridge Antibody Technology), exposicion de levaduras, y similares.
Los anticuerpos, que se describen en la presente, se prepararon a traves de la utilizacion de la tecnologfa XENOMOUSE®, segun se describe posteriormente. A continuacion, tales ratones son capaces de producir moleculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la produccion de moleculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Tecnologfas utilizadas para conseguir lo mismo se divulgan en las patentes, solicitudes y referencias divulgadas en la seccion de antecedentes de la presente. En particular, sin embargo, una realizacion preferida de produccion transgenica de ratones y anticuerpos procedentes de los mismos se divulga en la Solicitud de Patente de EE. UU. N° de Serie 08/759.620, presentada el 3 de diciembre de 1996, y las Solicitudes de Patente Internacional N° WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998, y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Vease ademas Mendez y cols. Nature Genetics 15:146-156 (1997).
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A traves del uso de tal tecnologfa, se han producido anticuerpos monoclonales completamente humanos. Esencialmente, las lmeas de ratones XENOMOUSE® se inmunizan con un antigeno de interes (p. ej. HER-3), se recuperan celulas linfaticas (tales como celulas B) de los ratones que expresan anticuerpos, y las lmeas celulares recuperadas se fusionan con una lmea celular de tipo mieloide para preparar lmeas celulares de hibridoma inmortales. Estas lmeas celulares de hibridoma se criban y se seleccionan para identificar lmeas celulares de hibridoma que produjeran anticuerpos espedficos para el antigeno de interes. Se proporcionan en la presente metodos para la produccion de multiples lmeas celulares de hibridoma que producen anticuerpos espedficos para HER-3. Ademas, se proporciona en la presente la caracterizacion de los anticuerpos producidos por tales lmeas celulares, incluyendo analisis de secuencias de nucleotidos y aminoacidos de las cadenas pesada y ligera de tales anticuerpos.
En general, los anticuerpos producidos por los hibridomas fusionados eran cadenas pesadas de IgG1 humana con cadenas ligeras kappa completamente humanas. Los anticuerpos descritos en la presente poseen cadenas pesadas de IgG4 humana asf como cadenas pesadas de IgG1. Los anticuerpos tambien pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo IgG2 o IgG3. Los anticuerpos posefan altas afinidades, poseyendo tfpicamente una Kd de aproximadamente 10"6 a aproximadamente 10"13 M o menos, cuando se mide mediante tecnicas en fase solida y basadas en celulas.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion. Dentro del contexto de la presente invencion, el termino "molecula de acido nucleico aislada", segun se usa en la presente, significa un polinucleotido de ADNc genomico, o un origen sintetico o alguna combinacion del mismo, que, en virtud de su origen, la "molecula de acido nucleico aislada" (1) no esta asociada con la totalidad o una porcion de un polinucleotido en el que el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta conectada operativamente a un polinucleotido al que no esta conectado en la naturaleza, o (3) no esta presente en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. Ademas, el termino "molecula de acido nucleico", segun se menciona en la presente, significa una forma polimerica de nucleotidos de al menos 10 bases de longitud, bien ribonucleotidos o bien desoxinucleotidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido, tales como nucleotidos con grupos azucar modificados o sustituido y similares. El termino tambien incluye formas de ADN de una sola hebra y doble hebra.
En una realizacion de la presente invencion, una molecula de acido nucleico de la invencion esta conectada operativamente a una secuencia de control. El termino "secuencia de control”, segun se usa en la presente, se refiere a secuencias polinucleotfdicas que son necesarias para efectuar la expresion y el procesamiento de secuencias codificantes a las que estan ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. En los procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente promotores, sitios de union ribosomica y secuencias de terminacion de la transcripcion. En los eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminacion de la transcripcion. Segun la presente invencion, el termino "secuencia de control" esta destinado a incluir, como mmimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresion y el procesamiento, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias de socios de fusion. Por otra parte, el termino "conectado operativamente", segun se usa en la presente, se refiere a posiciones de componentes asf descritos que estan en una relacion que los permite funcionar en su modo pretendido. Ademas, segun la presente invencion, una secuencia de control de la expresion conectada operativamente a una secuencia codificante esta ligada de tal manera que la expresion de la secuencia codificante se consiga bajo condiciones compatibles con la secuencia de control de la expresion.
Un aspecto adicional de la presente invencion es un vector que comprende una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion. La molecula de acido nucleico puede estar conectada operativamente a una secuencia de control. Por otra parte, el vector puede contener adicionalmente un origen de replicacion o un gen marcador de seleccion. Ejemplos de vectores que se pueden usar segun la presente invencion son, p. ej., plasmidos, cosmidos, fagos, virus, etc.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un celula hospedadora transformada con una molecula de acido nucleico o un vector de la invencion. La transformacion se podna realizar mediante cualquier metodo conocido para introducir polinucleotidos en una celula hospedadora, incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleotido en un virus (o en un vector viral) y transducir una celula hospedadora con el virus (o el vector) o mediante procedimientos de transfeccion conocidos en la especialidad, como los ejemplificados por las Patentes de EE. UU. N° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 y 4.959.455. Particularmente, los metodos para introducir polinucleotidos heterologos en celulas de mamffero son muy conocidos en la especialidad e incluyen transfeccion mediada por dextrano, precipitacion con fosfato calcico, transfeccion mediada con polibreno, fusion de protoplastos, electroporacion, encapsulacion del polinucleotido o los polinucleotidos en liposomas, y microinyeccion directa del ADN en los nucleos. Ejemplos de celulas hospedadoras que se pueden usar segun la presente invencion son celulas eucarioticas de hibridoma tales como celulas de mamffero, p. ej. celulas de hamster, conejo, rata, cerdo, raton u otras celulas animales; celulas vegetales y celulas fungicas, p. ej. mafz, tabaco, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; celulas procarioticas tales como E. coli; y otras celulas de la especialidad para la produccion de
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anticuerpos. Especialmente, las lmeas celulares de mai^ero disponibles como hospedadores para la expresion son muy conocidas en la especialidad e incluyen muchas lmeas celulares inmortalizadas disponibles de the American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo pero no limitadas a celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de rinon de cna de hamster (BHK), celulas de rinon de mono (COS), celulas de carcinoma hepatocelular humano (p. ej. Hep G2) y un numero de otras lmeas celulares.
Otro aspecto mas de la presente invencion es una composicion farmaceutica que comprende como un agente activo al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion y portadores, diluyentes y/o adyuvantes farmaceuticamente aceptables. El termino "composicion farmaceutica", segun se usa en la presente, se refiere a un compuesto qmmico o una composicion capaz de inducir un efecto terapeutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente (The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985). Segun la presente invencion, la potencia de la composicion farmaceutica de la invencion se basa en la union del al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo a HER-3. Preferiblemente, esta union conduce a un reduccion de la transduccion de senales mediada por HER-3.
Por otra parte, el termino "portadores", cuando se usa en la presente, incluye portadores, excipientes o estabilizantes que son atoxicos para la celula o el mairnfero que se expone a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiologicamente aceptable es una solucion acuosa de pH tamponado o un liposoma (una pequena vesmula compuesta por diversos tipos de lfpidos, fosfolfpidos y/o tensioactivos que es util para el aporte de un farmaco a un mai^ero). Ejemplos de portadores fisiologicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes incluyendo acido ascorbico; polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); protemas tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes sacaricos tales como manitol o sorbitol; iones conjugados formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
En una realizacion de la presente invencion, el al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion contenido en la composicion farmaceutica esta acoplado a un efector, tal como caliqueamicina, auristatina-PE, un radioisotopo o un agente quimioterapeutico toxico tal como geldanamicina y maitansina. En particular, estos conjugados de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo son utiles para elegir como diana celulas, p. ej. celulas cancerosas, que expresan HER-3 para la eliminacion.
Por otra parte, conectar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invencion a radioisotopos, p. ej., proporciona ventajas a los tratamientos de tumores. A diferencia de la quimioterapia y otras formas de tratamiento del cancer, la radioinmunoterapia o la administracion de una combinacion de radioisotopo-anticuerpo o fragmento de anticuerpo directamente elige como diana las celulas cancerosas con dano mmimo al tejido sano normal circundante. Con esta "bala magica", el paciente puede ser tratado con cantidades mucho menores de radioisotopos que otras formas de
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tratamiento disponibles actualmente. Radioisotopos preferidos incluyen itrio ( Y), indio ( In), I, mTc, radioplata-111, radioplata-199 y bismuto213. La conexion de radioisotopos a anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invencion se puede realizar, p. ej., con quelatos bifuncionales convencionales. Puesto que la plata es monovalente, para la conexion de radioplata-111 y radioplata-199, se pueden utilizar conectores basados en azufre (Hazra y cols., Cell Biophys. 24-25, 1-7 (1994)). La conexion de radioisotopos de plata puede implicar reducir la inmunoglobulina con acido ascorbico. Por otra parte, el tiuxetano es un quelador conector de MX-DTPA enlazado a ibritumomab para formar ibritumomab-tiuxetano (Zevalin) (Witzig, T.E, Cancer Chemother. Pharmacol. 48 Supl 1, 915 (2001). El ibritumomab-tiuxetano puede reaccionar con radioisotopos tales como indio111 (111In) o 90Y para formar 111In-ibritumomab-tiuxetano y 90Y-ibritumomab-tiuxetano, respectivamente.
Por otra parte, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion, particularmente cuando se usa para tratar el cancer, se puede conjugar con farmacos quimioterapeuticos toxicos tales como caliqueamicina (Hamann y cols., Bioconjug. Chem. 13(1), 40-6 (2002), geldanamicina (Mandler y cols., J. Natl. Cancer Inst., 92(19), 1549-51 (2000)) y maitansina, por ejemplo, el farmaco maitansinoide DM1 (Liu y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:8618-8623 (1996)). Se pueden emplear con esta tecnologfa diferentes conectores que liberan los farmacos bajo condiciones acidas o reductoras o durante la exposicion a proteasas espedficas. Segun la presente invencion, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion se puede conjugar como se describe en la especialidad.
La auristatina-PE, p. ej., es un agente antimicrotubular que es una modificacion estructural del constituyente peptfdico de moluscos marinos sin concha dolastatina 10. La auristatina-PE tiene tanto actividad antitumoral como actividad vascular antitumoral (Otani y cols., Jpn. J. Cancer Res. 91(8), 837-44 (2000)). Por ejemplo, la auristatina- PE inhibe el crecimiento celular e induce la detencion del ciclo celular y la apoptosis en lmeas celulares de cancer pancreatico (Li y cols., Int. J. Mol. Med. 3(6), 647-53 (1999)). Segun esto, para dirigir espedficamente la actividad antitumoral y las actividades vasculares antitumorales de la auristatina-PE a tumores particulares, la auristatina-PE se puede conjugar al anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion.
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En una realizacion de la presente invencion, la composicion farmaceutica comprende al menos un agente activo adicional. Ejemplos para agentes activos adicionales, que se pueden usar segun la presente invencion, son anticuerpos o inhibidores de bajo peso molecular de otras protema cinasas receptoras, tales como EGFR, HER-2, HER-4, IGFR-1 o c-met, ligandos receptores tales como factor endotelial vascular (VEGF), agentes citotoxicos, tales como doxorrubicina, cisplatino o carboplatino, citocinas o agentes antineoplasticos. Muchos agentes antineoplasticos se conocen actualmente en la especialidad. En una realizacion, el agente antineoplastico se selecciona del grupo de protemas terapeuticas incluyendo, pero no limitadas a, anticuerpos o protemas inmunomoduladoras. En otra realizacion, el agente antineoplastico se selecciona del grupo de inhibidores de molecula pequena o agentes quimioterapeuticos que consisten en inhibidores mitoticos, inhibidores de cinasa, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibioticos intercaladores, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de histona desacetilasa, agentes contra la supervivencia, modificadores de respuestas biologicas, antihormonas, p. ej. antiandrogenos y agentes antiangiogenicos. Cuando el agente antineoplastico es radiacion, el tratamiento se puede conseguir con un fuente interna (braquiterapia BT) o externa (terapia de radicacion con haces externos: EBRT).
La composicion farmaceutica de la presente invencion es especialmente adecuada para el diagnostico, la prevencion o el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa. La enfermedad hiperproliferativa puede estar, p. ej., asociada con un incremento de la transduccion de senales de la familia HER. Particularmente, la enfermedad puede estar asociada con un incremento de la fosforilacion de HER-3 y/o un incremento en la formacion de complejos entre HER-3 y otros miembros de la familia HER y/o un incremento en la actividad de cinasa PI3 y/o un incremento en la actividad de cinasa terminal c-jun y/o la actividad de AKT y/o un incremento en la actividad de ERK2 y/o la actividad de PYK2. Preferiblemente, la enfermedad hiperproliferativa se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de estomago, cancer endometrial, cancer de las glandulas salivares, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de tiroides, cancer de vejiga urinaria, glioma, melanoma u otros canceres que expresan o sobreexpresan HER-3, y la formacion de metastasis tumorales.
Segun la presente invencion, el termino "prevencion o tratamiento", cuando se usa en la presente, se refiere tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en donde el paciente necesita prevenir o frenar (reducir) la afeccion o trastorno patologico elegido. Los que necesitan prevencion o tratamiento incluyen lo que ya tienen el trastorno asf como los tendentes a tener el trastorno o aquellos en los que se ha de prevenir el trastorno. El paciente que necesita la prevencion o el tratamiento es un paciente mairnfero, es decir cualquier animal clasificado como un mai^ero, incluyendo seres humanos, animales domesticos y de granja, y animales de zoologico, deportivos o de compafua, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el paciente que necesita tratamiento es un paciente humano.
Segun la presente invencion, la composicion farmaceutica de la invencion se puede formular al mezclar el agente o los agentes activos con portadores, diluyentes y/o adyuvantes fisiologicamente aceptables, y opcionalmente otros agentes que se incorporan habitualmente en formulaciones para proporcionar una mejora de la transfererencia, el aporte, la tolerancia y similares. La composicion farmaceutica de la invencion se puede formular, p. ej., en la forma de formulaciones liofilizadas, soluciones acuosas, dispersiones o preparaciones solidas, tales como comprimidos, grageas o capsulas. Una multitud de formulaciones apropiadas se puede encontrar en el listado conocido por todos los qmmicos farmaceuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), particularmente el Capftulo 87 de Block, Lawrence del mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, jaleas, ceras, aceites, lfpidos, vesmulas que contienen lfpidos (cationicos o anionicos) (tales como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorcion anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbocera (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisolidos y mezclas semisolidas que contienen carbocera. Cualquiera de las mezclas precedentes puede ser apropiada en tratamientos y terapias segun la presente invencion, con la condicion de que el agente activo en la formulacion no sea inactivado por la formulacion y la formulacion sea fisiologicamente compatible y tolerable con la via de administracion. Veanse ademas Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.", Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2), 210-218 (2000); Wang W., "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.", Int. J. Pharm. 203(1-2), 1-60 (2000); Charman W.N., "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.",J. Pharm. Sci. 89(8), 967-978 (2000); Powell y cols., "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52, 238-311 (1998); y las citas de las mismas, para una informacion adicional relacionada con formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos en la qmmica farmaceutica.
Otro aspecto de la presente invencion trata del uso de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de la invencion y opcionalmente al menos otro agente activo, p. ej. al menos un agente antineoplastico segun se describe anteriormente, mezclados con portadores, diluyentes y/o adyuvantes farmaceuticamente aceptables, para la fabricacion de una composicion farmaceutica para el diagnostico, la prevencion o el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa. Preferiblemente, la composicion farmaceutica es una composicion farmaceutica como la descrita anteriormente y la enfermedad hiperproliferativa es una enfermedad hiperproliferativa como la mencionada anteriormente.
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Otro aspecto mas de la presente invencion esta relacionado con el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado en un metodo para diagnosticar enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3, que comprende poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion bajo condiciones adecuadas para permitir la union de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a HER-3, y detectar la presencia de HER-3 en la muestra. La muestra puede ser una celula que muestra expresion de HER-3, tal como una celula tumoral, una muestra de sangre u otra muestra adecuada. En una realizacion preferida de la presente invencion, las enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3 son las enfermedades hiperproliferativas definidas anteriormente.
Segun la presente invencion, el metodo se puede usar, p. ej., para la deteccion de antigeno para HER-3 en una celula, para la determinacion de la concentracion de antigeno para HER-3 en pacientes que sufren una enfermedad hiperproliferativa como la mencionada anteriormente o para la estadificacion de dicha enfermedad hiperproliferativa en un paciente. A fin de estadificar el avance de una enfermedad hiperproliferativa en un sujeto bajo estudio, o caracterizar la respuesta del sujeto a un ciclo de terapia, una muestra de sangre, p. ej., se puede tomar del sujeto y se determina la concentracion del antigeno para HER-3 presente en la muestra. La concentracion asf obtenida se usa para identificar en que intervalo de concentraciones cae el valor. El intervalo asf identificado se correlaciona con un estadio de avance o un estadio de terapia identificado en las diversas poblaciones de sujetos diagnosticados, proporcionado de ese modo un estadio en el sujeto bajo estudio. Una biopsia del tejido enfermo, p. ej. con cancer, obtenido del paciente tambien se puede usar para determinar la cantidad de antfgeno para HER-3 presente. La cantidad de antfgeno para HER-3 presente en el tejido enfermo se puede determinar mediante inmunohistoqmmica, ELISA o matrices de anticuerpos usando los anticuerpos para HER3 de la invencion. Otros parametros de diagnostico de interes son el estado de dimerizacion asf como los socios de dimerizacion de la protema de HER3 y el estado de activacion de ella y sus socios. Metodos analfticos de protemas para determinar esos parametros son muy conocidos en la especialidad y son entre otros tecnicas de transferencia Western e inmunoprecipitacion, analisis por FACS, reticulacion qmmica, transferencia de energfa con resonancia de bioluminiscencia (BRET), transferencia de energfa con resonancia de fluorescencia (FRET) y similares (p. ej. Price y cols, Methods in Molecular Biology, 218: 255-268 (2002) o la tecnologfa eTag (documentos WO0503707, WO04091384, WO04011900).
Por otra parte, la presente invencion se refiere en otro aspecto a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado para el uso en un metodo para prevenir p tratar enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3 en un paciente, comprendiendo el metodo administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion. Preferiblemente, las enfermedades o afecciones asociadas con la expresion de HER-3 son las enfermedades hiperproliferativas definidas anteriormente. El paciente que necesita prevencion o tratamiento es un paciente mairnfero, es decir cualquier animal clasificado como un mamffero, incluyendo seres humanos, animales domesticos y de granja. y animales de zoologico, deportivos o de comparua, tales como perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el paciente que los necesita es un paciente humano.
En una realizacion preferida de la presente invencion, el metodos para prevenir o tratar una enfermedad hiperproliferativa en un paciente que lo necesite comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion y adicionalmente al menos otro agente activo, p. ej., al menos un agente antineoplastico como el mencionado anteriormente. Preferiblemente, el metodo es para inhibir el crecimiento, la migracion o la invasion celular anormal.
Ademas de los modos clasicos de administracion de agentes terapeuticos de anticuerpo o fragmento de anticuerpo potenciales, p. ej. a traves de las susodichas formulaciones, tambien se pueden usar segun la invencion modalidades de administracion recientemente desarrolladas. Por ejemplo, se ha presentado la administracion local de anticuerpo monoclonal etiquetado con 131I para el tratamiento de tumores cerebrales primarios despues de la extirpacion quirurgica. Adicionalmente, tambien se esta estudiando clmicamente y preclmicamente la inyeccion intracerebral estereotactica directa de anticuerpos monoclonales y sus fragmentos. La perfusion hiperosmolar intracarotidea es una estrategia experimental para dirigirse a una enfermedad maligna cerebral primaria con anticuerpos monoclonales humanos conjugados a farmacos.
Dependiendo del tipo y la gravedad de la afeccion que se va a tratar, se pueden administrar de aproximadamente 1 |jg/kg a 15 mg/kg del al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invencion a un paciente que lo necesite, p. ej. mediante una o mas administraciones separadas o mediante infusion continua. Una dosificacion diaria tfpica podna variar de aproximadamente 1 jg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios dfas o mas, dependiendo de la afeccion que se va a tratar, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresion deseada de los smtomas de la enfermedad.
La dosis del al menos un agente antineoplastico administrado depende de una variedad de factores. Estos son, por ejemplo, la naturaleza del agente, el tipo de tumor y la via de administracion. Se debe enfatizar que la presente no se limita a ninguna dosis.
Finalmente, la presente invencion se refiere en un aspecto mas a un estuche para el diagnostico, la prevencion o el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas asociadas con la transduccion de senales mediada por HER-3, que comprende el al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y/o la molecula de acido nucleico y/o el vector de la invencion. Ademas, el estuche de la invencion puede comprender ademas al menos otro agente activo, p. ej. al 5 menos un agente antineoplastico como el mencionado anteriormente.
Ademas, la presente invencion se explicara mediante los siguientes Ejemplos y las figuras con dibujos adjuntas. Ejemplos
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos efectuados y los resultados alcanzados, se proporcionan 10 solamente con propositos ilustrativos y no se deben considerar limitativos de la presente invencion.
Ejemplo 1: antigeno para HER-3 y preparacion de lmeas celulares
En el presente estudio, se prepararon protemas de HER-3 recombinantes. El dominio extracelular de ADNc de HER- 3 (ECD) se clono mediante una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de pcDNA3-HER-3 (vector de expresion con HER-3 humano de longitud completa, C.Wallasch y cols., EMBO J. 14, 4267-4275) con cebadores 15 basados en la secuencia de HER-3 (Genebank N° Reg. NM_001982).
Los cebadores usados para la amplificacion de HER-3 eran como sigue:
Cebador directo: 5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3' (SEQ ID N°: 233)
Cebador inverso: 5'-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAA CAGTCTTG-3' (SEQ ID N°: 234
20 El producto de PCR se digirio con BamH1 y Xbal y se ligo a pcDNA3 (Invitrogen) digerido con BamH1 y Xbal. Los plasmidos se transfectaron en celulas HEK293 usando un metodo de CaPO4. La protema de fusion HER-3-HIS se purifico de medio acondicionado recogido a traves de cromatograffa de afinidad de Ni-NTA.
Se generaron celulas Rati HER-3 mediante transferencia genica retroviral. Brevemente, se sembraron celulas GP+E 25 86 (3x105) en un disco de cultivo de 60 mm y se transfectaron con 2 pg/ml de vector plXSN o ADNc de plXSN-HER-
3 (C. Wallasch, PhD Thesis, Max-Planck Insitute of Biochemistry, Martinsried, Alemania) usando el metodo del fosfato calcico. Despues de 24 h, el medio se reemplazo por medio reciente y las celulas GP+E 86 se incubaron durante 4-8 h. A continuacion, las celulas Rat1 subconfluentes (2x105 celulas por placa de 6 cm) se incubaron con sobrenadantes de celulas GP+E 86 que liberaban pLXSN o pLXSN-HER-3 con alta concentracion, virus p (>1 X 106 30 G418 c.f.u./ml; m.o.i. de 10) durante 4-12 h en presencia de Polybrene (4 mg/ml; Aldrich). Despues de cambiar el
medio se inicio la seleccion de celulas RatI con G418. Habitualmente, se recogfan clones estables despues de la seleccion durante 21 dfas.
Ejemplo 2: expresion de HER-3 en lmeas celulares cancerosas humanas
La tirosina cinasas receptoras, como por ejemplo HER-3, representan un papel crucial en la iniciacion y el avance de 35 enfermedades hiperproliferativas tales como la transicion del crecimiento celular hiperplastico benigno hasta un carcinoma maligno. Puesto que la expresion de HER-3 vana entre celulas tumorales y tejido normal, un analisis de la expresion de HER-3 es un factor cntico para la identificacion de subgrupos de pacientes que se beneficianan del tratamiento con anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invencion. Asf, la expresion de HER-3 se cuantifico en un grupo de lmeas celulares cancerosas humanas para elucidar el papel de HER-3 en la formacion de cancer 40 humano. Se desarrollaron lmeas celulares cancerosas segun se recomienda por la ATCC. Con detalle, se recogieron 105 celulas con EDTA 10 mM en PBS, se lavaron una vez con tampon de FACS (PBS, FCS al 3%, azida al 0,4%) y se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las celulas se centrifugaron durante 3 min a 1000 rpm para retirar el sobrenadante y a continuacion se resuspendieron con anticuerpo para a-HER-3 2D1D12 (documento WO03013602) (3 pg/ml). Las suspensiones celulares se incubaron sobre hielo durante 1 h, se lavaron 45 dos veces con tampon de FACS y se resuspendieron con anticuerpo secundario (100 pl/pocillos) anti-PE humana de burro (Jackson) diluido 1:50 en tampon de FACS. Las suspensiones celulares se incubaron sobre hielo y en la oscuridad durante 30 min, se lavaron dos veces con tampon de FACS y se analizaron (FACS, Beckman Coulter). La Fig. 1 muestra resultados representativos del analisis y demuestra que HER-3 se expresa en una variedad de canceres humanos.
50 Ejemplo 3: Inmunizacion y valoracion
5
10
15
20
25
30
35
La protema de ECD de HER-3, que se preparaba como se describe en el Ejemplo 1, y celulas C32 (melanoma humano; ATCC N° CRL-1585) se usaron como un antigeno. Se desarrollaron anticuerpos monoclonales contra HER-3 al inmunizar secuencialmente ratones XenoMouse® (cepas XenoMouse®: XMG1 y XMG4, Abgenix, Inc. Fremont, CA). Los animales XenoMouse® se inmunizaron a traves de la via de la almohadilla para todas las inyecciones. El volumen total de cada inyeccion era 50 pl por raton, 25 pl por almohadilla.
Para la Serie N° 1 (10 ratones XMG1), la inmunizacion inicial era con 10 pg de protema de ECD de HER-3 mezclada 1:1 (v/v) con TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) por raton. Las cinco inyecciones de recuerdo posteriores se realizaron con 10 pg de protema de ECD de HER-3 mezclada 1:1 (v/v) con 100 pg de gel de alumbre (Sigma, Oakville, ON) en D-PBS libre de pirogenos. La sexta inyeccion de recuerdo consistfa en 10 pg de protema de ECD de HER-3 mezclada 1:1 (v/v) con TITERMAX GOLD®. La septima inyeccion consistfa en 10 pg de protema de ECD de HER-3 mezclada 1:1 v/v con 100 pg de gel de alumbre. Una inyeccion de recuerdo final se realizo con 10 pg de protema de ECD de HER-3 en DPBS libre de pirogenos, sin adyuvante. Los ratones XenoMouse® se inmunizaron los dfas 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24 y 29 para este protocolo y las fusiones se realizaron el dfa 33. Los dos sangrados se realizaron a traves del procedimiento de sangrado retroorbital el dfa 13 despues de la cuarta inyeccion de recuerdo, el dfa 19 despues de la sexta inyeccion de recuerdo. No habfa serie n° 2.
Para la Serie n° 3 (10 ratones XMG1) y la Serie n° 4 (10 ratones XMG4), la primera inyeccion era con 107 celulas C32 en PBS de Dulbecco (DPBS) libre de pirogenos mezclada 1:1 (v/v) con TITErMaX GOLD® por raton. Las cuatro inyecciones de recuerdo siguientes eran con 107 celulas C32 en DPBS libre de pirogenos, mezclada con 25 pg de Adju-Phos y 10 pg de CpG por raton. La sexta inyeccion de recuerdo era con 107 celulas C32 en DPBS libre de pirogenos, mezcladas 1:1 (v/v) con TITERMAX GOLD® por raton. La septima, octava y novena inyecciones de recuerdo eran con 107 celulas C32 en DPBS libre de pirogenos, mezclada con 25 pg de Adju-Phos y 10 pg CpG por raton. De la decima a la decimocuarta inyecciones de recuerdo eran 5 pg de protema de ECD de HER-3 en DPBS libre de pirogenos, mezclada con 25 pg de Adju-Phos y 10 pg de CpG por raton. Una inyeccion de recuerdo final consistfa en 5 pg de protema de ECD de HER-3 en DPBS libre de pirogenos, sin adyuvante. Tanto en la Serie n° 3 como en la n° 4, los ratones XenoMouse® se inmunizaron los dfas 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21,24, 28, 33, 35, 38, 42 y 45 para este protocolo y las fusiones se realizaron el dfa 49. Los tres sangrados se realizaron a traves del procedimiento de sangrado retroorbital en dfa 12 despues de la cuarta inyeccion de recuerdo, el dfa 19 despues de la sexta inyeccion de recuerdo y el dfa 40 despues de la duodecima inyeccion de recuerdo.
Seleccion de animales para la recogida mediante valoracion
Para la Serie n° 1, los tftulos de anticuerpo anti-HER-3 en el suero de ratones XenoMouse® inmunizados se determinaron mediante ELISA frente a protema de ECD de HER-3. El tttulo espedfico de cada animal XenoMouse® se determino a partir de la densidad optica a 650 nm y se muestra en la Tabla 1 posteriormente. El valor del tttulo es la redproca de la dilucion mayor de suero con una lectura de OD dos veces la del fondo. Por lo tanto, cuanto mayor sea el numero, mayor sera la respuesta inmunitaria humoral a ECD de HER-3.
TABLA 1
Serie N° 1, XGM1
ID Raton
Despues de 4 iny. Despues de 6 iny.
P3421
8.000 11.000
P3422
850 2.600
P3423
2.700 5.200
P3424
3.200 9.100
P3425
5.400 2.500
P3426
700 1.500
P3427
5.800 7.000
P3428
3.900 4.300
P3429
2.200 2.500
P34210
600 850
NC
250 175
PC
377.000 311.000
NC
mAb IL-8, D39.2.1
PC
xHER-3-2D1D12
5 Para la serie N° 3 y N° 4, los tttulos de anticuerpo anti-HER-3 en el suero de ratones XenoMouse® inmunizados se determinaron mediante FACS usando celulas Rat1/HER-3 (lmea celular positiva a antigeno) y celulas Ratl/pLSXN (lmea celular negativa a antigeno). Los datos se presentan como la intensidad de fluorescencia media geometrica (Media Geo) de la tincion de celulas anti-HER-3 mediante diluciones en serie de muestras de suero.
10
TABLA 2
Serie N° 3, XMG1
ID Raton
Dilucion de la muestra Despues de 6 iny. Despues de 12 iny.
Media Geo celulas pos.
Media Geo celulas neg. Media Geo celulas pos. Media Geo celulas neg.
Q832-1
1:50 9 10 11 10
1:250
6 9 6 6
1:1250
6 7 4 4
Q832-2
1:50 8 10 29 42
1:250
7 8 11 11
1:1250
5 6 6 5
Q832-3
1:50 7 12 11 9
1:250
5 7 5 5
1:1250
5 5 4 4
Q832-4
1:50 6 10 9 9
1:250
6 6 5 5
1:1250
5 5 4 4
Q832-5
1:50 11 11 17 13
1:250
10 9 7 6
1:1250
6 8 5 4
Q832-6
1:50 7 11 15 14
Serie N° 3, XMG1
ID Raton
Dilucion de la muestra Despues de 6 iny. Despues de 12 iny.
Media Geo celulas pos.
Media Geo celulas neg. Media Geo celulas pos. Media Geo celulas neg.
1:250 7 7 7 6
1:1250
5 6 6 4
Q832-7
1:50 8 11 7 15
1:250
6 7 5 5
1:1250
5 5 4 4
Q832-8
1:50 7 8 11 20
1:250
6 6 7 8
1:1250
5 5 5 4
Q832-9
1:50 7 12 15 16
1:250
6 8 6 5
1:1250
6 6 4 4
CM CO O CO to
1:50 8 13 34 38
1:250
6 8 9 8
1:1250
6 6 5 4
TABLA 3
Serie N° 4, XMG4
ID Raton
Dilucion de la muestra Despues de 6 iny. Despues de 12 iny.
Media Geo celulas pos.
Media Geo celulas neg. Media Geo celulas pos. Media Geo celulas neg.
Q856-1
1:50 4 6 91 44
1:250
4 5 32 18
1:1250
4 4 19 10
Q856-2
1:50 4 8 148 54
1:250
4 5 89 23
1:1250
4 4 42 9
Q856-3
1:50 4 5 72 14
1:250
4 4 28 6
1:1250
4 4 18 4
Q856-4
1:50 4 5 11 49
1:250
4 5 10 17
1:1250
4 4 8 7
Q856-5
1:50 4 4 74 20
1:250
4 4 30 14
1:1250
4 4 16 6
Q856-6
1:50 4 5 86 21
1:250
4 4 32 10
1:1250
4 4 16 5
Q856-7
1:50 5 6 74 32
1:250
4 5 32 14
5
10
15
20
25
30
35
Serie N° 4, XMG4
ID Raton
Dilucion de la muestra Despues de 6 iny. Despues de 12 iny.
Media Geo celulas pos.
Media Geo celulas neg. Media Geo celulas pos. Media Geo celulas neg.
1:1250 4 4 16 6
Q856-8
1:50 4 5 106 14
1:250
4 4 45 6
1:1250
4 4 22 4
Q856-9
1:50 5 6 53 22
1:250
4 4 17 11
1:1250
4 4 11 5
CD LO O OO O
1:50 4 5 72 53
1:250
4 4 26 17
1:1250
4 4 15 7
Ejemplo 4: Recuperacion de linfocitos, aislamientos de celulas B, fusiones y generacion de hibridomas
Se sacrificaron ratones inmunizados y se recogieron y se reunieron los nodulos linfaticos de cada serie. Las celulas linfoides se disociaron al triturar en DMEM para liberar las celulas de los tejidos, y las celulas se suspendieron en DMEM. Las celulas se contaron y se anadieron a la pella celular 0,9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos para resuspender las celulas suavemente pero completamente. Usando 100 pl de cuentas magneticas CD90+ por 100 millones de celulas, las celulas se etiquetaron al incubar las celulas con las cuentas magneticas a 4°C durante 15 min. La suspension de celulas etiquetadas magneticamente que contema hasta 108 celulas positivas (o hasta 2x109 celulas totales) se cargo en una columna LS+ y la columna se lavo con DMEM. El efluente total se recogio como la fraccion negativa a CD90 (se esperaba que la mayona de estas celulas fueran celulas B).
La fusion se realizo al mezclar celulas B enriquecidas lavadas de lo anterior y celulas P3X63Ag8.653 de mieloma no secretor adquiridas de ATCC (N° Cat. CRL 1580) (Kearney y cols, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) en una relacion de 1:1. La mezcla de celulas se aglomero suavemente mediante centrifugacion a 800 g. Despues de la retirada completa del sobrenadante, las celulas se trataron con de 2 a 4 ml de solucion de pronasa (CalBiochem, N° Cat. 53702; 0,5 mg/ml en PBS) durante no mas de 2 min. A continuacion, se anadieron de 3 a 5 ml de FBS para detener la actividad enzimatica y la suspension se ajusto hasta 40 ml de volumen total usando solucion de electrofusion celular, ECFS (sacarosa 0,3 M, Sigma, N° Cat. S7903, acetato magnesico 0,1 mM, Sigma, N° Cat. M2545, acetato calcico 0,1 mM, Sigma, N° Cat. C4705). El sobrenadante se retiro despues de la centrifugacion y las celulas se resuspendieron en 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavado se repitio y las celulas se resuspendieron de nuevo en ECFS hasta una concentracion de 2x106 celulas/ml.
La electrofusion celular se realizo usando un generador de fusion, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamano de la camara de fusion era 2,0 ml, usando los siguientes ajustes del instrumento: Condicion de alineamiento: voltaje: 50 V, tiempo: 50 s; rotura de la membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 ps; tiempo de reposo despues de la fusion: 3 s.
Despues de la ECF, las suspensiones celulares se retiraron cuidadosamente de la camara de fusion bajo condiciones esteriles y se transfirieron a un tubo esteril que contema el mismo volumen de medio de cultivo de hibridomas (DMEM (JRH Biosciences), FBS al 15% (Hyclone), complementado con L-glutamina, pen/estrep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). Las celulas se incubaron durante de 15 a 30 min a 37°C y a continuacion se centrifugaron a 400 g durante cinco min. Las celulas se resuspendieron suavemente en un pequeno volumen de medio de seleccion de hibridomas (medio de cultivo de hibridomas complementado con 0,5 x HA (Sigma, N° Cat. A9666)) y el volumen se ajusto apropiadamente con mas medio de seleccion de hibridomas, basado en una siembra final de 5x106 celulas B totales por placa de 96 pocillos y 200 pl por pocillo. Las celulas se mezclaron suavemente y se pipetearon en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer. El dfa 7 o 10, la mitad del medio se retiro y las celulas se realimentaron con medio de seleccion de hibridomas.
Ejemplo 5: Seleccion de posibles anticuerpos mediante ELISA
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Despues de 14 dfas de cultivo, un cribado primario de sobrenadantes de hibridoma de la serie N° 1 (los ratones de la serie uno se dividieron arbitrariamente en la fusion N° 1 y N° 2) con respecto a anticuerpos espedficos para HER-3 se realizo mediante ELISA usando ECD de HER-3 etiquetado con his contracribando frente a una protema etiquetada con his irrelevante mediante ELISA usando anti-huIgGFc-HRP de cabra (Caltag Inc., N° Cat. H10507, la concentracion de uso era una dilucion 1:2000) para detectar la union de IgG humana a ECD de HER-3 inmovilizado sobre placas de ELISA. Los sobrenadantes de cultivo antiguos procedentes de los pocillos de crecimiento de celulas de hibridoma positivos basados en el cribado primario se retiraron y las celulas de hibridoma positivas a HER-3 se suspendieron con medio de cultivo de hibridomas reciente y se transfirieron a placas de 24 pocillos. Despues de 2 dfas en cultivo, estos sobrenadantes estaban listos para un cribado de confirmacion secundario. En el cribado de confirmacion secundario para anticuerpos para IgGk completamente humanos espedficos para HER-3, los positivos en el cribado primario se cribaron mediante ELISA con dos grupos de anticuerpos detective: anti-huIgGFc-HRP de cabra (Caltag Inc., N° Cat. H10507, la concentracion de uso era 1:2000 de dilucion) para la deteccion de la cadena gamma humana y anti-hlg kappa-HRP de cabra (Southern Biotechnology, N° Cat. 2060-05) para la deteccion de la cadena ligera kappa humana. Hada 91 anticuerpos monoclonales espedficos de IgG/kappa HER-3 completamente humanos que se generaban a partir de la serie N° 1.
Ejemplo 6: Seleccion de posibles anticuerpos mediante FMAT/FACS
Despues de 14 dfas de cultivo, sobrenadantes de hibridoma procedentes de la serie N° 3 y N° 4 (fusion N° 3 y N° 4) se cribaron con respecto a anticuerpos monoclonales espedficos para HER-3 mediante FMAT. En el cribado primario, sobrenadantes de hibridoma en una dilucion final 1:10 se incubaron con celulas Rat1-Her3 que expresan HER-3 humano y 400 ng/ml de anticuerpo espedfico para Fc anti-IgG humana de F(ab)'2 conjugada a Cy5 (Jackson ImmunoResearch, N° Cat. 109-176-098) a temperatura ambiente durante 6 h. La union de anticuerpos y complejo de anticuerpos de deteccion a las celulas se midio mediante FMAT (Applied Biosystems). La union no espedfica de anticuerpos a las celulas se determino mediante su union a las celulas Rat1 parentales. Un total de 420 hibridomas que producen anticuerpos espedficos para HER se selecciono del cribado primario de la fusion N° 3. Los sobrenadantes procedentes de estos cultivos expandidos se probaron de nuevo usando el mismo protocolo de FMAT y se confirmo que 262 de ellos se uman a celulas que expresan HER-3 espedficamente. Un total de 193 hibridomas que producen anticuerpo espedficos para HER-3 se selecciono del cribado primario de la fusion N° 4. Los sobrenadantes procedentes de estos cultivos expandidos se probaron mediante FACS y se confirmo que 138 de ellos se uman a celulas que expresan HER-3 espedficamente. En el ensayo de confirmacion por FACS, celulas Rat1-Xher3 y celulas Rat1 parentales (como control negativo) se incubaron con sobrenadantes de hibridoma con una dilucion 1:2 durante 1 h a 40°C en PBS que contema 2% de FBS. Despues del lavado con PBS, la union de los anticuerpos a las celulas se detecto mediante 2,5 pg/ml de anticuerpo espedfico para Fc anti-IgG humana de F(ab)'2 conjugada a Cy5 (JIRN° 109-176-098) y 5 pg/ml de anticuerpo espedfico de anti-kappa humana de F(ab')2 de cabra conjugada a Pe (SBN° 2063-09). Despues de retirar los anticuerpos no unidos al lavar con PBS, las celulas se fijaron mediante cytofix (BDN° 51-2090KZ) con una dilucion 1:4 y se analizaron mediante FACSCalibur.
Ejemplo 7: Seleccion de hibridomas para clonacion
Anticuerpos de las series 1 y 2 se seleccionaron para la clonacion de hibridomas basandose en la especificidad para HER-3 sobre HER1 (EGFR), HER-2 y HER-4 en ELISA usando dominios extracelulares recombinantes purificados disponibles de, por ejemplo, R&D Biosystems, y analisis basado en FACS de lmeas celulares tumorales humanas que expresan diferentes miembros de la familia de HER, y un incremento de > 5 veces en la intensidad de fluorescencia media en la tincion con FACS de celulas positivas a HER-3 sobre un fondo. Basandose en estos criterios, se selecciono un total de 23 lmeas de hibridoma con respecto a la clonacion mediante siembra celular con dilucion limitativa.
Anticuerpos de las series 3 y 4 se seleccionaron con respecto a la clonacion de hibridomas basandose en la especificidad para HER-3 sobre HER-1 (EGFR), HER-2 y HER-4 mas otros tres criterios. El primer criterio era un cribado por ELISA con respecto a anticuerpos con epftopos contenidos dentro del dominio L2 de HER-3 (vease el Ejemplo "Analisis estructural de anticuerpos anti-HER-3 en la invencion).
El segundo criterio era la neutralizacion de la union de heregulina-alfa biotinilada a celulas que expresan HER-3 en un ensayo basado en FACS. Las celulas SKBR-3 se recogieron, se lavaron en medio de cultivo, se aglomeraron a traves de centrifugacion y se resuspendieron en medio de cultivo. Las celulas resuspendidas se dividieron en partes almuotas en placas de 96 pocillos. Las placas se centrifugaron para aglomerar las celulas. Se anadieron anticuerpos de prueba en sobrenadantes de hibridoma agotados en 25pl/pocillo y se incubaron durante 1 h sobre hielo para permitir la union del anticuerpo. Se anadieron 50 pl de una solucion de heregulina-alfa 10 nM (R&D Biosystems, Minneapolis, MN) a cada pocillo para una concentracion final de 5 nM y se incubaron sobre hielo durante 1,5 h. Las celulas se lavaron en 150 pl de PBS, se aglomeraron mediante centrifugacion y el sobrenadante se retiro. Las celulas se resuspendieron en 50 pl de anticuerpo policlonal anti-HRG-alfa de cabra en 10 pg/ml y se incubaron durante 45 min sobre hielo. Las celulas se lavaron en 200 pl de PBS, se aglomeraron mediante centrifugacion y el sobrenadante se retiro. Se anadieron 50 pl de una solucion de anticuerpo policlonal contra inmunogobulinas de cabra etiquetado con Cy5 de conejo en 5 pg/ml mas 7AAD en 10 pg/ml y se incubaron sobre hielo durante 15 min.
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Las celulas se lavaron en 200 |jl de PBS, se aglomeraron mediante centrifugacion y el sobrenadante se retiro. Las celulas se resuspendieron en 100 jl de tampon de FACS y se leyeron en el FACS. Los anticuerpos para HER-3 de prueba que redudan la union de heregulina-alfa eran los que teman la menor actividad fluorescente. Como controles positivos, se usaron diluciones en serie 1:5 desde 10.000 ng/ml hasta 16 ng/ml de un mAb para HER-3 de raton (105.5) o el mAb para HER-3 de IgG1 humana, U1-49. Los controles negativos eran heregulina-alfa sola, celulas solas, anticuerpo policlonal anti-heregulina-alfa de cabra solo y anticuerpo policlonal contra inmunoglobulinas de cabra etiquetado con Cy5 de conejo solo.
El tercer criterio era la clasificacion relativa con respecto a la afinidad y/o la intensidad de fluorescencia media relativa superior en FACS usando lmeas celulares que expresan HER-3. La clasificacion relativa con respecto a la afinidad se realizo al normalizar concentraciones de anticuerpo espedfico para HER-3 y presentan frente a los datos de ELISA de antfgenos limitativo como sigue.
Normalizacion de concentraciones de anticuerpo espedfico para antfgeno usando ELISA con alto contenido de antfgeno
Usando un metodo de ELISA, los sobrenadantes para la concentracion de anticuerpo espedfico de antfgeno se normalizaron. Usando dos anticuerpos anti-IgG1 humana de HER-3 de la serie 1 de concentracion conocida valorados en paralelo, se genero una curva estandar y la cantidad de anticuerpo espedfico de antfgeno en los sobrenadantes de hibridoma de prueba procedentes de las series 3 y 4 se compararon con el estandar. DE este modo, se estimo la concentracion de anticuerpo para IgG de HER3 humana en cada cultivo de hibridoma.
Se elaboraron placas de neutravidina al revestir neutravidina en 8 jg/ml en 1XPBS/azida sodica al 0,05% sobre placas de union a medio Costar 3368 en 50 ul/pocillo con incubacion durante la noche a 4°C. Al dfa siguiente, las placas se bloquearon con 1XPBS/leche desnatada al 1%. ECD de HER-3 etiquetado con his fotobiotinilado en 500 ng/ml en 1XPBS/leche desnatada al 1% se unio a las placas de neutravidina al incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. El sobrenadante de hibridoma, diluido en serie 1:2,5 desde una dilucion de partida de 1:31 hasta una dilucion final de 1:7568 en 1XPBS/leche desnatada al 1%/azida al 0,05%, se anadio en 50 jl/pocillo, y a continuacion se incubo durante 20 horas a temperatura ambiente. Se usaron diluciones en serie para asegurar la obtencion de lecturas de OD para cada valor desconocidos en el intervalo lineal del ensayo. Posteriormente, un anticuerpo de deteccion secundario, HRP anti Fc de IgG humana de cabra en 400 ng/ml en 1XPBX/leche desnatada al 1% se anadio en 50 jl/pocillo. Despues de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo 5 veces con agua y se anadieron a cada pocillo 50 jl de sustrato TMB de un componente. La reaccion se detuvo despues de 30 minutos mediante la adicion de 50 jl de acido clorhndrico 1 M a cada pocillo y las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm. Se genero una curva estandar a partir de los dos mAb para HER-3 de IgG1 procedentes de la serie 1, diluidos en serie 1:2 desde 1000 ng/ml hasta 0,06 ng/ml y se ensayaron en un ELISA usando el protocolo anterior. Para cada valor desconocido, se usaron lecturas de OD en el intervalo lineal del ensayo para estimar la concentracion de IgG de HER-3 humana en cada muestra.
El analisis de antfgenos limitado es un metodo que clasifica por afinidad los anticuerpos espedficos para antfgeno en sobrenadantes de cultivo de celulas B con relacion a otros anticuerpos espedficos de antfgeno. En presencia de un revestimiento muy bajo de antfgeno, solo los anticuerpos de afinidad mas alta senan capaces de unirse a cualquier nivel detectable en el equilibrio. (Vease, p. ej., la Publicacion PCT WO/03048730A2 titulada "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" publicada el 12 de junio de 2003). En este caso, dos mAb procedentes de la serie 1, ambos de concentracion conocida y KD conocida, se usaron como puntos de referencia en el ensayo.
Se elaboraron placas de neutravidina al revestir neutravidina en 8 jg/ml en 1XPBS/azida sodica al 0,05% sobre placas de union a medio Costar 3368 en 50 ul/pocillo con incubacion durante la noche a 4°C. Al dfa siguiente, las placas se bloquearon con 1XPBS/leche desnatada al 1%. ECD de HER-3 etiquetado con his biotinilado se unio a placas de neutravidina de 96 pocillos en concentraciones: 125, 62,5, 31,2, 15,6 y 7,8 ng/ml en 1XPBS/leche desnatada al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Cada placa se lavo 5 veces con agua. Sobrenadantes de hibridoma diluidos 1:31 en 1XPBS/leche desnatada al 1%/azida al 0,05% se anadieron en 50 ul/pocillo. Despues de 20 horas de incubacion a temperatura ambiente en un agitador, las placas se lavaron de nuevo 5 veces con dH2O. Posteriormente, un anticuerpo de deteccion secundario, HRP (peroxidasa de rabano picante) anti Fc de IgG humana de cabra en 400 ng/ml en 1XPBS/leche desnatada al 1% se anadio en 50 jl/pocillo. Despues de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo 5 veces con dH2O y se anadieron a cada pocillo 50 jl de sustrato TMB de un componente. La reaccion se detuvo despues de 30 minutos mediante la adicion de 50 jl de acido clorhndrico 1 M a cada pocillo y las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm. Las lecturas de OD de una concentracion de antfgeno que daba valores de OD en el intervalo lineal se usaron para el analisis de datos.
Representar los datos de antfgeno altos, que estiman comparativamente la concentracion de anticuerpo espedfico (vease anteriormente para los detalles), frente a la OD de antfgeno limitada ilustraba los anticuerpos de afinidad relativamente superior, p. ej., los que unidos teman una OD superior en el ensayo con antfgeno limitado mientras que teman cantidades inferiores de anticuerpo para HER-3 de IgG en el sobrenadante.
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Los hibridomas de las series 3 y 4 para los 33 anticuerpos que se comportan mejor en estos grupos de ensayo se adelantaron para la clonacion mediante siembra de hibridomas con dilucion limitativa.
Alternativamente, el analisis por FACS de la expresion de HER-3 de celulas of Ratl/pLXSN y RatI/HER-3 mostraba resultados similares (sin reactividad cruzada con epftopos de rata endogenos) (Fig. 2).
Con detalle, se recogieron 1x105 celulas con EDTA 10 mM en PBS, se lavaron una vez con tampon de FACS (PBS, FCS al 3%, azida al 0,4%) y se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las celulas se centrifugaron durante 3 min a 1000 rpm para retirar el sobrenadante y a continuacion se resuspendieron con los anticuerpos de la familia HER espedficos (3 pg/ml). Las suspensiones celulares se incubaron sobre hielo durante 45 min, se lavaron dos veces con tampon de FACS y se resuspendieron con anticuerpo secundario (100 pl/pocillo) anti- PE humana de burro (Jackson Immunoresearch, PA) diluido 1:50 en tampon de FACS. Las suspensiones celulares se incubaron sobre hielo y en la oscuridad durante 30 min, se lavaron dos veces con tampon de FACS y se analizaron (FACS, Beckman Coulter).
Ejemplo 8: Analisis estructural de anticuerpos anti-HER-3
En el siguiente analisis, se proporciona informacion estructural relativa a anticuerpos preparados segun la invencion. El contenido de la invencion son anticuerpos como los definidos en las reivindicaciones, en particular el anticuerpo U1-59. Anticuerpos adicionales se proporcionan solamente como ejemplos comparativos. A fin de analizar estructuras de anticuerpos producidos segun la presente invencion, genes que codifican los fragmentos de la cadena pesada y ligera se amplificaron fuera del hibridoma particular. La secuenciacion se efectuo como sigue:
Los transcritos de VH y VL se amplificaron de clones de hibridoma individuales en una placa de 96 pocillos usando la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se aislo ARNm de poli(A)+ de aproximadamente 2x105 celulas de hibridoma usando un estuche Fast-Track (Invitrogen). Se pusieron en marcha cuatro reacciones de PCR para cada hibridoma: dos para la cadena ligera (kappa (k), y dos para la cadena pesada gamma (y). Se uso el estuche de PCR a temperatura ambiente QIAGEN OneStep para la amplificacion (Qiagen, N° Catalogo 210212). En las reacciones de PCR a temperatura ambiente acopladas, se sintetizaron ADNc con una combinacion de enzimas a temperatura ambiente (Omniscript y Sensiscript) usando el cebador de secuencia antisentido correspondiente a C-k, o a un consenso de las regiones CH1 de C y genes. La transcripcion inversa se realizo a 50°C durante 1 h seguida por amplificacion por PCR del ADNc mediante ADN polimerasa HotStarTaq para una alta especificidad y sensibilidad. Cada reaccion de PCR usaba una mezcla de cebadores de sentido 5'; las secuencias de los cebadores se basaban en las secuencias lfder de VH y VK disponibles en el cibersitio de Vbase (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
Las reacciones de PCR se llevaron a cabo a 94°C durante 15 min, comienzo en caliente inicial seguido por 40 ciclos de 94°C durante 30 s (desnaturalizacion), 60°C durante 30 s (renaturalizacion) y 72°C durante 1 min (elongacion).
Los productos de PCR se purificaron y se sometieron a secuenciacion directamente usando cebadores de PCR directos e inversos usando el ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reaction Kit (Perkin Elmer). Ambas hebras se sometieron a secuenciacion usando estuches de secuenciacion con terminador de colorante Prism y una maquina de secuenciacion ABI 377.
Analisis de secuencias
Los analisis de las secuencias de ADNc de cadena pesada V y kappa V humanas de los anticuerpos para HER3 se efectuaron al alinear las secuencias de HER-3 con secuencias de cadena pesada V y kappa V de la lmea germinal humana usando el software de diseno propio Abgenix (5AS). El software identificada la utilizacion del gen V, el gen D y el gen J asf como inserciones nucleotfdicas en las uniones de recombinacion y mutaciones somaticas. Tambien se generaron secuencias de aminoacidos informaticamente para identificar mutaciones somaticas. Se podnan obtener resultados similares con un software de analisis de secuencias disponible comercialmente e informacion disponible publicamente sobre la secuencia de los genes V, D y J humanos, p. ej., Vbase (
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/).
Clonacion molecular del mAb U1-59
Se extrajo ARN total del pocillo de cultivo tisular que contema multiples linajes de hibridomas, incluyendo el linaje de hibridoma que secreta el anticuerpo U1-59. Una region variable de la cadena pesada se amplifico usando cebadores espedficos de la familia lfderes 5', con cebador 3'-C-gamma. Una banda principal se amplifico usando un cebador VH4, sin que fueran visibles otras bandas. El fragmento VH4-34 gamma se clono en el vector de expresion pCDNA en el marco con un gen de la region constante de gamma 1 humana.
Una region variable de la cadena pesada de IgM se amplifico usando cebadores espedficos de la familia VH 5' con el cebador de la region constante mu 3'. Una banda principal se amplifico usando el cebador VH2, sin que fueran visibles otras bandas. El fragmento VH2-5 se clono en el vector de expresion pCDNA en el marco con un gen de la region constante mu humano. Las cadenas kappa V se amplificaron y se sometieron a secuenciacion. Se 5 identificaron cuatro productos de RT-PCR de la cadena kappa. Los productos se sometieron a secuenciacion y despues del analisis de secuencias a traves de traduccion informatica, solo tres de ellos teman marcos de lectura abierta. Estas tres cadenas kappa funcionales se clonaron fuera del hibridoma U1-59 oligoclonal bien identificado basandose en la utilizacion del gen V kappa como (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 y (3) B3-JK1. Todas las V- kappa se clonaron en el vector de expresion pCDNA en el marco con el gen de la region constante de la cadena 10 ligera kappa humana.
Transfecciones:
Cada cadena pesada se transfecto con cada una de las cadenas kappa en transfecciones transitorias para un total de 6 pared de cadena pesada/cadena ligera kappa. La transfeccion de la cadena gamma con la cadena kappa A20 daba escasa expresion de anticuerpo, mientras que no se secretaba o detectaba anticuerpo cuando la cadena 15 kappa A20 se cotransfectaba con la cadena mu. Un total de tres IgG sups y dos IgM sups estaba disponible para la union a HER-3.
Cadena
VH D J Constante ORF
Pesada
VH4-34 D1-20 CM X Gamma sf
Pesada
VH2-5 D6-6 JH4b Mu sf
Ligera
A3 JK2 Kappa sf
Ligera
A20 JK3 Kappa sf
Ligera
B3 JK1 Kappa sf
Ligera
A27 JK3 Kappa NO
20 La actividad de union a lmeas celulares HER-3+ se detecto en FACS con el mAb de IgG1 que consistfa en la cadena VH4-34 y la B3 kappa. Ninguna de las otras combinaciones VH/Vk daban senal de fluorescencia por encima del fondo en FACS usando lmeas celulares HER-3+.
Competicion de union de los anticuerpos anti-HER-3
Se realizo una compartimentacion de anticuerpos competitiva multiple segun se publica en Jia y cols. J Immunol 25 Methods. 288, 91-98 (2004) para determinar aglomerados de anticuerpos para HER-3 que competfan con respecto a la union a HER-3. Los anticuerpos para HER-3 probados de la serie 1 se aglomeraban en 5 compartimentos basandose en la competicion con respecto a la union.
Compartimento N° 1
Compartimento N° 2 Compartimento N° 3 Compartimento N° 4 Compartimento N° 5
U 1-42
U1-48 U1-52 U1-38 U1-45
U 1-44
U1-50 U1-39 U1-40
U1-62
U1-51 U1-41
U1-46
U1-43
U1-47
U1-49 U1-61
U1-58
U1-53
U1-55
30 Caracterizacion epitopica de anticuerpos anti-HER-3
Los epttopos de anticuerpos anti-HER-3 humanos se caracterizaron. En primer lugar, un analisis de transferencia de gota de la protema de ECD purificada etiquetada con HER-3-His desnaturalizada reducida mostraba ausencia de union mediante los anticuerpos anti-HER-3 probados (U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44, U1-47, U1-52, U1-40, U1-49)) demostrando que todos teman epttopos sensibles a la reduccion de enlaces disulfuro, 35 sugiriendo que todos teman epftopos discontinuos. Posteriormente, los anticuerpos se cartografiaron a dominios
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definidos en la molecula de HER-3 al manipular diversas moleculas quimericas de HER-3 de ser humano-rata, basandose en la division del dominio extracelular de HER-3 en cuatro dominios:
1) L1 (D1): el dominio secundario de union a ligando,
2) S1 (D2): el primer dominio rico en cistema,
3) L2 (D3): el principal dominio de union a ligando, y
4) S2 (D4): el dominio secundario rico en cistema.
El dominio extracelular (ECD) de ADNc de HER-3 humano se amplifico a partir de celulas RAT1-HER-3. Los ADNc de HER-3 de rata se amplificaron mediante RT-PCR a partir de ARN de tngado de rata y se confirmaron mediante secuenciacion. Los ADNc que expresan el ECD de Her3 humano y de rata se clonaron en vectores de expresion de mamftero como protemas de fusion V5-His. Los dominios procedentes del ECD de HER-3 humano se intercambiaron en el andamiaje proporcionado por el ECD de HER-3 de rata al usar los sitios de restriccion internos Mfe1, BstXI y Dralll. Por este medio, diversas protemas de fusion de ECD de HER-3 HIS de rata/ser humano quimericas (aminoacidos 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) se construyeron y se expresaron a traves de transfeccion transitoria de celulas HEK 293T. La expresion de las construcciones se confirmo usando un anticuerpo policlonal de rata contra HER-3 humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se probaron en ELISA con respecto a la union a los ECD quimericos secretados.
Dos de los anticuerpos humanos, incluyendo el anticuerpo U1-59, reaccionaban cruzadamente con HER-3 de rata. Para asignar dominios de union, estos mAb se probaron contra una forma truncada de HER-3 que consistfa en protema etiquetada con L1-S1-V5his purificada del sobrenadante de celulas HEK 293T transfectadas con un ADN plasmfdico que codifica la expresion de los dominios extracelulares L1-S1 de HER3. El mAb U1-59 se une a la protema de L1-S1 en ELISA, implicando que su epftopo esta en L1-S1. El mAb 2.5.1 no se urna a la protema de L1- S1, implicando que su epftopo esta en L2-S2. Se efectuo una cartograffa adicional del anticuerpo U1-59 usando espectroscopfa de masas de tiempo de vuelo SELDI con digestos proteolfticos sobre chip de complejos de mAb- ECD de HER-3.
Cartograffa de epftopos de U1-59 usando SELDI
La cartograffa adicional del anticuerpo U1-59 se efectuo usando una espectroscopfa de tiempo de vuelo SELDI con digestos proteolfticos sobre chip de complejos de mAb-ECD de HER-3. La protema A se urna covalentemente a una micromatriz de protema PS20 y se uso para capturar el mAb U1-59. A continuacion, el complejo del chip de protema PS20 y el anticuerpo monoclonal se incubo con antfgeno purificado para HER-3-His. Posteriormente, el complejo anticuerpo-antfgeno se digirio con una alta concentracion de Asp-N. El chip se lavo, dando como resultado una retencion solamente del peptido de HER-3 unido al anticuerpo sobre el chip. El epftopo se determino mediante SELDI y se identifico por la masa del fragmento. El fragmento de 6814 D identificado corresponde a dos posibles peptidos esperados generados a partir de un digesto parcial del ECD de HER-3-his. Ambos peptidos solapados se cartograffan al dominio S1. Al acoplar los resultados de SELDI con la union a una construccion con eliminacion de HER-3, el epftopo se cartografio a los residuos 251 a 325.
La localizacion de los dominios de union en la parte extracelular de HER-3 que son reconocidos por los mAb anti- HER-3 humanos de la invencion se resume en la Tabla 4. Los resultados de la cartograffa de los dominios epitopicos eran coherentes con los resultados de compartimentos de competicion de union a anticuerpos, con anticuerpos que competfan cruzadamente entre sf con respecto a la union a HER-3 que tambien se cartografiaban hasta los mismos dominios en HER-3 (Fig. 3).
TABLA 4
Un resumen del dominio de union de mAb basado en los resultados del ensayo ELISA
mAb
XR de rata Dominio de union mAb XR de rata Dominio de union
U 1-59
Sf S1 U1-2 No L2
U1-61
No L2 U1-7 No L2
U1-41
No L2 U1-9 No L2
U1-46
No S1 U1-10 No L2
U1-53
No L2 U1-12 No L2
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Un resumen del dominio de union de mAb basado en los resultados del ensayo ELISA
mAb
XR de rata Dominio de union mAb XR de rata Dominio de union
U1-43
No L2 U1-13 No L2
U 1-44
No S1 U1-14 No L2
U1-47
No S1 U1-15 No L2
U 1-52
Si L2S2 U1-19 No L2
U1-40
No L2 U1-20 No L2
U1-49
No L1 U1-21 No L2
U1-21
No L2 U1-28 No L2
U1-22
No L2 (U1-31) No L2
U1-23
No L2 U1-32 No L2
U 1-24
No L2 (U1-35) No L2
U1-25
No L2 U1-36 No L2
U1-26
No L2 (U1-37) No L2
U1-27
No L2
XR = reactivo cruzadamente
Ejemplo 9: Determinacion de clases canonicas de anticuerpos
Chothia y cols. han descrito la estructura de los anticuerpos en lo relativo a "clases canonicas" para las regiones hipervariable de cada cadena de inmunoglobulina (J. Mol. Biol., 20 de agosto de 1987, 196(4):901-17). Las estructuras atomicas de los fragmentos Fab y VL de una variedad de inmunoglobulinas se analizaron para determinar la relacion entre sus secuencias de aminoacidos y las estructuras tridimensionales de sus sitios de union a antigeno. Chothia y cols. encontraron que habfa relativamente pocos residuos que, a traves de su union por enlaces de hidrogeno con empaquetamiento o la capacidad para asumir conformaciones phi, psi u omega inusuales, fueran fundamentalmente responsables de las conformaciones de la cadena principal de las regiones hipervariables. Se encontro que estos residuos se presentaban en sitios dentro de las regiones hipervariables y en el armazon de lamina p conservado. Al examinar secuencias de inmunoglobulinas que tienen estructura desconocida, Chothia y cols. muestran que muchas inmunoglobulinas tienen regiones hipervariables que son similares en tamano a una de las estructuras conocidas y residuos identicos adicionalmente contenidos en los sitios responsables de la conformacion observada.
Su descubrimiento implicaba que estas regiones hipervariables tienen conformaciones cercanas a las de estructuras conocidas. Para cinco de las regiones hipervariables, el repertorio de conformaciones parecfa estar limitado a un numero relativamente pequeno de clases estructurales discretas. Estas conformaciones de la cadena principal comunmente presentes de las regiones hipervariables se denominaron "estructuras canonicas". Un trabajo adicional de Chothia y cols. (Nature, 21-28 de diciembre de 1989, 342(6252):877-83) y otros (Martin, y cols. J. Mol. Biol., 15 de noviembre de 1996, 263(5):800-15) confirmaban que hay un pequeno repertorio de conformaciones de la cadena principal para al menos cinco de las seis regiones hipervariables de los anticuerpos.
Las CDR de cada anticuerpo descrito anteriormente se analizaron para determinar su clase canonica. Como se sabe, las clases canonicas solo han sido asignadas para CDR1 y CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo, junto con CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo. Las tablas posteriores resumen los resultados del analisis. Los datos de las clases canonicas estan en la forma de HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, en donde "HCDR" se refiere a la CDR de la cadena pesada y "LCDR" se refiere a la CDR de la cadena ligera. Asf, por ejemplo, una clase canonica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene una HCDR1 que esta dentro de la clase canonica 1, una HCDR2 que esta dentro de la clase canonica 3, una LCDR1 que esta dentro de la clase canonica 2, una LCDR2 que esta dentro de la clase canonica 1 y una LCDR3 que esta dentro de la clase canonica 5.
Las asignaciones se hicieron a una clase canonica particular en la que habfa 70% o mas de identidad de los aminoacidos en el anticuerpo con los aminoacidos definidos para cada clase canonica. Los aminoacidos definidos para cada anticuerpo se pueden encontrar, por ejemplo, en los artfculos de Chothia y cols, mencionados anteriormente. La Tabla 5 y la Tabla 6 presentan los datos de las clases canonicas para cada uno de los anticuerpos para HER-3. Cuando hay menos de 70% de identidad, la asignacion a la clase canonica esta marcada con un asterisco ("*") para indicar que se realizaba la mejor estimacion de la clase canonica apropiada, basandose en la longitud de cada CDR y la totalidad de los datos. Cuando no existfa una clase canonica coincidente con la misma
longitud de CDR, la asignacion de la clase canonica se marca con una letra s y un numero, tal como "s18", significando que la CDR es de tamano 18. Cuando no existian datos de secuencia disponibles para una de las cadenas pesada y ligera, la clase canonica se marca con "Z".
5 TABLA 5
Anticuerpo (clasificado)
H1-H2-L1-L2- L3 Longitud de H3 Anticuerpo (clasificado) H1-H2-L1-L2- L3 Longitud de H3
U1-38
3-1-4-1-1 9 U1-7 3-1-2-1-1 12
U1-39
1-1-4-1*-1 6 U1-9 3-1-2-1-1 12
U1-40
3-1-4-1-1 15 U1-10 3-1-2-1-1 12
U1-41
3-1-2-1-1 15 U1-12 3-1-2-1-1 12
U1-42
1-2-2-1-1 9 U1-13 3-1-4-1-1 7
U1-43
3-1-2-1-1 17 U1-14 3-1-2-1-1 12
U 1-44
1-2-2-1-1 9 U1-15 3-1-8-1-1 14
U1-45
1-2*-2-1-1 16 U1-19 3-1-Z-Z-Z 12
U1-46
3-s18-Z-Z-Z 17 U1-20 3-1-2-1-1 19
U1-47
3-s18-2-1-1 16 U1-21 3-1-2-1-1 12
U1-48
1-1-Z-Z-Z 16 U1-22 3-1-2-1-1 12
U1-49
1-3-4-1-1 17 U1-23 3-1-2-1-1 12
U1-50
3-1-2-1-1 17 U1-24 3-1-2-1-1 12
U1-51
1-1-3-1-1 19 U1-25 3-1-2-1-1 12
U1-52
3-1-8-1-1 15 U1-26 3-1-2-1-1 12
U1-53
1-3-2-1-1 10 U1-27 3-1-2-1-1 12
U1-55
3-1-4-1-1 15 U1-28 3-1-2-1-1 12
U1-57
3-1-4-1-1 15 U1-31 1-2-2-1-1 13
U1-58
1-3-2-1-1 12 U1-32 3-1-2-1-1 12
U1-59
1-1-3-1-1 9 U1-35 1-3-2-1-1 14
U1-61.1
3-1*-2-1-1 16 U1-36 3-1-2-1-1 12
U1-62
1-2-8-1-1 12 U1-37 1 -2-Z-Z-Z 13
U1-2
3-1-2-1-1 12
La Tabla 7 es un analisis del numero de anticuerpos por clase. El numero de anticuerpos que tienen la clase canonica particular indicada en la columna de la izquierda se muestra en la columna de la derecha. Los cuatro mAb 10 que carecen de datos de secuencia de una cadena y que tienen asf "Z" en la asignacion canonica no se incluyen en este recuento.
La estructura mas comunmente observada es 3-1-2-1 -1: Veintiuno de cuarenta y un mAb que tienen secuencias de cadenas tanto pesada como ligera teman esta combinacion.
15
TABLA 6
H1-H2-L1-L2-L3
Recuento
1-1-3-1-1
2
1-1-4-1*-1
1
1-2-2-1-1
4
1-2-8-1-1
1
1-3-2-1-1
3
1-3-4-1-1
1
3-1-2-1-1
21
3-1-4-1-1
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H1-H2-L1-L2-L3
Recuento
3-1-8-1-1
2
3-s18-2-1-1
1
Ejemplo 10: Determinacion de la afinidad de los anticuerpos
Se realizaron medidas de afinidad de anticuerpos anti-HER-3 mediante analisis de Scatchard por FACS indirecta. Por lo tanto, 105 celulas de interes o celulas SK-Br 3 se recogieron con EDTA 10 mM en PBS, se lavaron una vez 5 con tampon de FACS (PBS, FCS al 3%, azida al 0,4%) y se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Las celulas se centrifugaron durante 3 min a 1000 rpm para retirar el sobrenadante y a continuacion se resuspendieron con anticuerpo para a-HER-3 (3 pg/ml) o con diluciones de anticuerpo (100 pl/pocillo) partiendo de 20 pg/ml de anticuerpo monoclonal humano en tampon de FACS, diluido en etapas de dilucion 1:2. Las suspensiones celulares se incubaron sobre hielo durante 1 h, se lavaron dos veces con tampon de FACS y se 10 resuspendieron con anticuerpo secundario (100 pl/pocillo) anti-PE humana de burro (Jackson) diluido 1:50 en tampon de FACS. Las suspensiones celulares se incubaron sobre hielo y en la oscuridad durante 30 min, se lavaron dos veces con tampon de FACS y se analizaron (FACS, Beckman Coulter). Segun el analisis de Scatchard por FACS, la media de fluorescencia se calculo para cada medida. La tincion de fondo (= sin el 1° anticuerpo) se sustrajo de cada media de fluorescencia. Se genero una grafica de Scatchard con valor x = media de fluorescencia y 15 el valor y = media de fluorescencia/concentracion de mAb (nM). La KD se tomo como el valor absoluto de 1/m de la ecuacion lineal. La Fig. 4 muestra un analisis cinetico que usa el anticuerpo U1-59 de la invencion. En la tabla 8 siguiente, se proporcionan medidas de afinidad para ciertos anticuerpos seleccionados de este modo.
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TABLA 7
clon
KD (nM)
U1-38
n.d.
U1-39
102
U1-40
6,7
U1-41
0,18
U1-42
n.d.
U1-43
0,57
U1-44
4
U1-52
16,8
U1-61
0,13
U1-62
20,4
U1-46
13,8
U1-47
9,38
U1-49
1
U1-50
39,3
U1-51
131,6
U1-53
0,082
U1-55.1
3,7
U1-58
6,4
U1-59
3,69
U 1-24
0,06
U1-7
0,02
Ejemplo 11: Los anticuerpos anti-HER-3 inducen la endocitosis del receptor HER-3
El HER-3 se ha identificado como un factor que puede influir en el inicio y el avance de enfermedades hiperproliferativas a traves de servir como un importante “portero” de la senalizacion celular mediada por la familia HER. As^ si HER-3 es depurado eficazmente de la superficie celular/membrana por la internalizacion del receptor, la senalizacion celular y por lo tanto la transformacion y/o el mantenimiento de celulas en una enfermedad maligna se puede disminuir o suprimir finalmente.
A fin de investigar si los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion y anticuerpos comparativos son capaces de inducir la endocitosis acelerada de HER-3, se comparara la cantidad relativa de moleculas de HER-3 sobre la superficie celular despues de 0,5 y 4 h de incubacion de las celulas con anticuerpos anti-HER-3 de la invencion. Se sembraron 3x105 celulas en medio de crecimiento normal en un plato de 24 pocillos y se dejo crecer durante la noche. Las celulas se preincubaron con 10 pg/ml de mAb anti-HER-3 en medio de crecimiento normal para los tiempos indicados a 37°C. Las celulas se separaron con EDTA 10 mM y se incubaron con 10 pg/ml de mAb anti-HER-3 en tampon de lavado (PBS, FCS al 3%, azida al 0,04%) durante 45 min a 4°C. Las celulas se lavaron dos veces con tampon, se incubaron con anticuerpo secundario anti-PE humana de burro (Jackson) diluido 1:100 durante 45 min a 4 °C, se lavaron dos veces con tampon de lavado y se analizaron mediante FACS (BeckmanCoulter, EXPO).
Los datos mostrados en la Fig. 5 demuestran que el tratamiento de celulas con anticuerpos anti-HER-3 conduce a la internalizacion del receptor. Los datos se muestran como % de internalizacion y se refieren a la reduccion de la intensidad de fluorescencia media de muestras tratadas con anti-HER3 con relacion a muestras tratadas con control.
Ejemplo 12: Inhibicion de la union de ligandos a celulas cancerosas humanas SKBr3 por anticuerpos anti-HER-3 humanos
Se realizaron experimentos de competicion de radioligandos a fin de cuantificar la capacidad de los anticuerpos anti- HER-3 de la invencion y anticuerpos comparativos para inhibir la union de ligandos a HER-3 en un ensayo basado en celulas. Por lo tanto, el ensayo de union al receptor HER-3 se realizo con 4x105 celulas SK-BR-3 que se
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incubaban con concentraciones variables de anticuerpos durante 30 min sobre hielo. Se anadieron [I125]-a- HRG/[125I]-p-HRG 1,25 nM a cada pocillo y la incubacion se continuo durante 2 h sobre hielo. Las placas se lavaron cinco veces, se secaron al aire y se recontaron en un contador de centelleo. Las Figs. 6a-e muestran los resultados de estos experimented realizados con anticuerpos anti-HER-3 representativos y demuestran que el anticuerpo U1-59 de la invencion es capaz de reducir espedficamente la union de [125I]-a-HRG/[125I]-p-HRG a celulas que expresan HER-3 endogeno.
Ejemplo 13: Inhibicion de la fosforilacion de HER-3 inducida por ligando mediante anticuerpos anti-HER-3 humanos
Se realizaron experimentos de ELISA a fin de investigar si los anticuerpos de la invencion y los anticuerpos comparativos son capaces de bloquear la activacion de HER-3 mediada por el ligando p-HRG -3. La activacion de HER-3 mediada por ligando se detecto mediante una fosforilacion incrementada de tirosina receptora.
Dfa 1: 1 x disco de 96 pocillos se revistio con 20 pg/ml de colageno I en acido acetico 0,1 M durante 4 h a 37°C. Se sembraron 2,5x105 celulas en medio de crecimiento normal
Dfa 2: Las celulas se sometieron a ayuno en 100 pl de medio libre de suero durante 24 h.
Dfa 3: Las celulas se preincubaron con 10 pg/ml de mAb anti-HER-3 durante 1 h a 37°C y a continuacion se trataron con 30 ng/ml de dominio p-HRG-EGF (R&D Systems) durante 10 min. El medio se sacudio y las celulas se fijaron con solucion de formaldehfdo al 4% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. La solucion de formaldetedo se retiro y las celulas se lavaron con tampon de lavado (PBS/Tween 20 al 0,1%). Las celulas se desactivaron con H2O2 al 1%, NaN3 al 0,1% en tampon de lavado y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, a continuacion se bloquearon con NET-gelatina durante 5 h a 4°C. El anticuerpo primario fosfo-HER-3 (Tyr1289) (conejo policlonal; Senalizacion celular N° 4791; 1:300) se anadio durante la noche a 4°C.
Dfa 4: La placa se lavo 3 veces con tampon de lavado, a continuacion se incubo con anti-POD de conejo diluido 1:3000 en PBS - se anadio BSA al 0,5% a cada pocillo y se incubo durante 1,5 h a temperatura ambiente. La placa se lavo 3x con tampon de lavado y una vez con PBS. Se anadio tetrametilbencidina (TMB, Calbiochem) y se comprobo a 650 nm. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 100 pl de HCl 250 nM y la absorbancia se leyo a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm usando un lector de placas Vmax (Thermo Lab Systems).
La Fig. 7a muestra resultados representativos de este experimento, que demuestran que los anticuerpos anti-HER-3 eran capaces de reducir la activacion de HER-3 medida por ligando segun se indicaba por la disminucion de la fosforilacion de la tirosina receptora. Los datos se muestran como porcentaje de reduccion mediante anticuerpos terapeuticos con relacion al anticuerpo de control.
Para probar la potencia del mAb U1-53 para inhibir la activacion de HER-3 inducida por ligando, celulas MCF-7 se sometieron a ayuno durante 24 h, se incubaron con mAb U1-53 durante 1 h a 37°C y se estimularon con HRG-p 10 mM durante 10 min. Los lisados se transfirieron a placas de ELISA 1 B4 (mAb anti-HER-3 de raton) y la fosforilacion de HER-3 se analizo con anticuerpo 4G10. Segun se muestra en la Fig. 7b, la fosforilacion de HER-3 se inhibfa casi completamente de un modo dependiente de la dosis con una IC50 de 0,14 nM.
Ejemplo 14: Inhibicion de la fosforilacion de p42/p44 MAP-cinasa inducida por ligando mediante anticuerpos anti- HER-3 humanos
Posteriormente, se realizaron experimentos de ELISA a fin de investigar si los anticuerpos de la invencion y los anticuerpos comparativos son capaces de bloquear la activacion de p42/p44 MAP-cinasa medida por el ligando p- HRG. La activacion de HER-3 mediada por ligando se detecto mediante un incremento en la fosforilacion de protema (Thr202/Tyr204).
Dfa 1: 1 x plato de 96 pocillos se revistio con 20 pg/ml de colageno I en acido acetico 0,1 M durante 4 h a 37°C. Se sembraron 3x105 celulas en medio de crecimiento normal
Dfa 2: Las celulas se sometieron a ayuno en 100 pl de medio libre de suero durante 24 h.
Dfa 3: Las celulas se preincubaron con 5 pg/ml de mAb anti-HER-3 durante 1 h a 37°C y a continuacion se trataron con 20 ng/ml de dominio p-HRG-EGF (R&D Systems) durante 10 min. El medio se sacudio y las celulas se fijaron con solucion de formaldehfdo al 4% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. La solucion de formaldehudo se retiro y las celulas se lavaron con tampon de lavado (PBS/Tween 20 al 0,1%). Las celulas se desactivaron con H2O2 al 1%, NaN3 al 0,1% en tampon de lavado y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, a continuacion se bloquearon con PBS/BSA al 0,5% durante 5 h a 4°C. Se anadio durante la noche a 4°C el anticuerpo primario fosfo- p44/p42 MAP cinasa (Thr202/Tyr204) (conejo policlonal; Senalizacion celular N° 9101; 1:3000).
Dfa 4: La placa se lavo 3 veces con tampon de lavado, a continuacion se incubo con anti-HRP de conejo diluido 1:5000 en PBS - se anadio BSA al 0,5% a cada pocillo y se incubo durante 1,5 h a temperatura ambiente. La placa se lavo 3x con tampon de lavado y una vez con PBS. Se anadio tetrametilbencidina (TMB, Calbiochem) y se comprobo a 650 nm. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 100 pl de HCl 250 nM y la absorbancia se leyo a 5 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm usando un lector de placas Vmax (Thermo Lab Systems).
La Fig. 8 muestra resultados representativos de este experimento. Los anticuerpos de la invencion eran capaces de reducir la activacion de p42/p44 MAP-cinasa mediada por ligando segun se indica por una disminucion de la 10 fosforilacion. Los datos se muestran como porcentaje de reduccion por anticuerpos terapeuticos con relacion a un anticuerpo de control.
Ejemplo 15: Inhibicion de la fosforilacion de fosfo-AKT inducida por p-HRG mediante anticuerpos anti-HER-3 humanos
En el siguiente experimento de ELISA, se investigo si los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion y los anticuerpos 15 comparativos son capaces de bloquear la activacion de AKT-cinasa mediada por el ligando p-HRG. La activacion de AKT medada por ligando se detecto mediante un incremento en la fosforilacion de protema (Ser473).
Dfa 1: 1 x plato de 96 pocillos se revistio con 20 pg/ml de colageno I en acido acetico 0,1 M durante 4 h a 37°C. Se sembraron 3x105 celulas en medio de crecimiento normal
Dfa 2: Las celulas se sometieron a ayuno en 100 pl de medio libre de suero durante 24 h.
20 Dfa 3: Las celulas se preincubaron con 5 pg/ml de mAb anti-HER-3 durante 1 h a 37°C y a continuacion se trataron con 20 ng/ml de dominio p-HRG-EGF (R&D Systems) durante 10 min. El medio se sacudio y las celulas se fijaron con solucion de formaldehfdo al 4% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. La solucion de formaldehudo se retiro y las celulas se lavaron con tampon de lavado (PBS/Tween 20 al 0,1%). Las celulas se desactivaron con H2O2 al 1%, NaN3 al 0,1% en tampon de lavado y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, a continuacion se 25 bloquearon con PBS/BSA al 0,5% durante 5 h a 4°C. Se anadio durante la noche a 4°C el anticuerpo primario fosfo- Akt (Ser473) (conejo policlonal; Senalizacion celular N° 9217; 1:1000).
Dfa 4: La placa se lavo 3 veces con tampon de lavado, a continuacion se incubo con anti-HRP de conejo diluido 1:5000 en PBS - se anadio BSA al 0,5% a cada pocillo y se incubo durante 1,5 h a temperatura ambiente. La placa 30 se lavo 3x con tampon de lavado y una vez con PBS. Se anadio tetrametilbencidina (TMB, Calbiochem) y se comprobo a 650 nm. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 100 pl de HCl 250 nM y la absorbancia se leyo a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm usando un lector de placas Vmax (Thermo Lab Systems).
La Fig. 9 muestra resultados representativos de este experimento. Los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion eran 35 capaces de reducir AKT mediada por p-HRG segun se indica por una disminucion en la fosforilacion. Los datos se muestran como porcentaje de reduccion por anticuerpos terapeuticos con relacion a un anticuerpo de control.
Ejemplo 16: Inhibicion de la proliferacion de celulas MCF7 mediada por a-HRG/p-HRG mediante anticuerpos anti- HER-3 humanos
Se efectuaron experimentos in vitro a fin de determinar la capacidad de los anticuerpos de la invencion y los 40 anticuerpos comparativos para inhibir la proliferacion celular estimulada por HRG. Se sembraron 2000 celulas MCF7 en medio que contema FCS sobre placas de 96 pocillos durante la noche. Las celulas se preincubaron por cuadruplicado con anticuerpo diluido en medio con fCs al 0,5% durante 1 h a 37°C. Las celulas se estimularon con 30 ng/ml de a- o 20 ng/ml de p-HRG (R&D Systems) al anadir ligando directamente a solucion de anticuerpo y se dejaron crecer durante 72 h. Se anadio AlamarBlue™ (BIOSOURCE) y se incubo a 37°C en la oscuridad. La 45 absorbancia se midio a 590 nm cada 30 min. Los datos se tomaron 90 min despues de la adicion de alamar blue. Los resultados que se indican en la Fig. 10 muestran que los anticuerpos inhiben el crecimiento celular inducido por HRG en celulas cancerosas humanas. Los datos se muestran como porcentaje de reduccion por anticuerpos terapeuticos con relacion a un anticuerpo de control..
Ejemplo 17: Inhibicion de la migracion de celulas MCF7 inducida por p-HRG mediante anticuerpos anti-HER-3 50 humanos
Se realizaron experimentos de transmigracion a fin de investigar si los anticuerpos de la invencion y los anticuerpos comparativos bloquean la migracion celular. Celulas MCF7 privadas de suero se preincubaron al anadir la cantidad indicada de anticuerpo a la suspension celular e incubar ambos durante 45 min a 37°C. A continuacion, 500 pl de suspension celular (50.000 celulas) se pusieron en la camara superior de transpocillos revestidos con colageno I (BD
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Falcon, poros de 8 pm). Se usaron en la camara de fondo 750 pl de medio (MEM, aminoacidos, piruvato Na, pen.- estrept., BSA al 0,1%, sin suero de ternero fetal) solos o que conteman los ligandos dominio p-HRG-EGF (R&D Systems). Las celulas se dejaron migrar durante 8 h a 37°C y se tineron con DAPI.
Los nucleos tenidos se contaron manualmente; el porcentaje de inhibicion se expreso como la inhibicion relativa a un anticuerpo de control.
La Fig. 11 muestra el resultado del experimento que demuestra que los anticuerpos anti-HER-3 reducen la migracion celular inducida por HRG.
Ejemplo 18: Ensayo de formacion de colonias (ensayo en agar blando)
Se efectuaron ensayos en agar blando a fin de investigar la capacidad de los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion para inhibir el crecimiento celular independiente del anclaje. El ensayo de formacion de colonias en agar blando es un ensayo in vitro estandar para probar celulas transformadas, ya que solamente tales celulas transformadas pueden crecer en agar blando.
Se preincubaron de 750 a 2000 celulas (dependiendo de la lmea celular) con los anticuerpos indicados a 10 pg/ml en medio IMDM (Gibco) durante 30 min y se resuspendieron en agar noble de Difco al 0,4%. La suspension celular se sembro sobre una subcapa de agarosa al 0,75% que contema FCS al 20% por cuadruplicado en una placa de 96 pocillos. Se dejo que se formaran colinas durante 14 dfas y a continuacion se tineron con 50 pl de MTT (0,5 mg/ml en PBS) durante la noche. Las Figs. 12a-i muestran los resultados de estos experimentos realizados con tres anticuerpos. Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-HER-3 reducen el crecimiento celular independiente del anclaje de celulas de cancer de mama MDA-MB361 y NCI-ADR (Fig. 12a,b), cancer gastrico MKN-28 (Fig. 12c), celulas de melanoma HT144 (Fig. 12d), celulas de carcinoma ovarico Skov3 (Fig. 12e), celulas de cancer de prostata PPC-1 (Fig. 12f), celulas de cancer de pancreas BX-PC3 (Fig. 12g), celulas de carcinoma epidermoide A431 (Fig. 12h) y celulas de carcinoma pulmonar (Fig. 12i). Las colonias se contaron con un sistema de camara Scanalyzer HTS (Lemnatec, Wuerselen).
Ejemplo 19: Los anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento de carcinoma de mama humano en ratones atfmicos
La eficacia antitumoral de los anticuerpos terapeuticos se evalua a menudo en estudios de tumores xenoinjertados humanos. En estos estudios, tumores humanos crecen como xenoinjertos en ratones inmunocomprometidos y la eficacia terapeutica se mide mediante el grado de inhibicion del crecimiento tumoral. A fin de determinar si los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion y los anticuerpos comparativos interfieren con el crecimiento tumoral de celulas de cancer de mama humano en ratones atfmicos, se implantaron 5x106 celulas T47D en ratones atimicos/atimicos NMRI hembra. Los tumores eran subcutaneos, creciendo sobre el lomo del animal. Los tratamientos comenzaban cuando los tumores alcanzaban un volumen medio de 20 mm3; ocho dfas despues de la implantacion. Antes del primer tratamiento, los ratones se aleatorizaron y se realizaron pruebas estadfsticas para asegurar uniformidad en los volumenes tumorales de partida (media, mediana y desviacion estandar) a traves de los grupos de tratamiento. El tratamiento empezo con una dosis de carga de 50 mg/kg seguida por inyecciones de 25 mg/kg una vez a la semana mediante inyeccion intraperitoneal. Una rama de control recibio doxorrubicina (calidad farmaceutica). Todos los animales se complementaron con 0,5 mg/kg/semana de estrogeno inyectado i.p.
Se dan posteriormente detalles de los grupos de tratamiento.
Gr
N 1° Compuesto Carga (mg/kg) Dosis semanal (mg/kg) Via Plan
1.
10 PBS -- i.p. una vez/semana
2.
10 doxorrubicina 8 mg/kg i.v. una vez/semana *
3.
10 U1-53 50 mg/kg 25 mg/kg i.p. una vez/semana
20 ml/kg 10 ml/kg
* tratamiento con doxorrucibina segun se describe por Boveny cols., Cancer Research, 1992.
Los datos para el volumen tumoral mediano (Fig. 13) demostraban que la administracion de un anticuerpo anti-HER- 3 daba como resultado una reduccion de crecimiento del tumor.
Ejemplo 20: Los anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento de tumor pancreatico humano en ratones SCID
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Para probar el potencial terapeutico de anticuerpos anti-HER3 en otros tipos de tumores solidos, los anticuerpos anti-HER-3, U1-53 y U1-59, se probaron en ratones con tumores establecidos derivados de la lmea celular de tumor pancreatico humano BxPC3. Como controles, se incluyeron grupos de ratones tratados bien con el control de vetuculo, PBS, o bien con el anticuerpo terapeutico establecido, Erbitux. 5x106 celulas BxPC3 se inocularon subcutaneamente sin Matrigel en ratones CB17 SCiD. Los ratones que teman tumores establecidos con un volumen medio de 140 mm2 recibieron 50 mg/kg de U1-53, U1-59, Erbitux o el volumen equivalente de PBS a traves de inyeccion intraperitoneal. Posteriormente, los ratones recibieron inyecciones de 25 mg/kg una vez por semana a lo largo de la duracion del estudio.
Los resultados para este experimento se muestran en la Fig. 14. U1-53 y U1-59 redudan el crecimiento de tumores pancreaticos humanos de un modo citostatico. Notablemente, en este experimento, U1-53 y U1-59 eran mas eficaces que el anticuerpo que de dirige a EGFR Erbitux para retrasar el crecimiento del tumor. Estos datos demostraban la eficacia terapeutica de los anticuerpos anti-HER-3 en comparacion con el agente terapeutico de referencia.
Ejemplo 21: Combinar los anticuerpos anti-HER-3 humanos con anticuerpos anti-EGFR incrementa la actividad antitumoral
La monoterapia de las enfermedades hiperproliferativas con anticuerpos dirigidos esta dificultada a menudo por problemas tales como, por una parte, el desarrollo de resistencia a farmacos, y, por otra parte, un cambio en la antigenicidad. Por ejemplo, la perdida de antigenicidad despues del tratamiento prolongado puede hacer a las celulas tumorales insensibles a anticuerpos terapeuticos, puesto que las celulas tumorales que no expresan o han perdido el antfgeno buscado tienen una ventaja de crecimiento selectivo. Estos problemas se podnan evitar al usar los anticuerpos de la invencion en combinacion con un anticuerpo terapeutico que se dirige a un receptor diferente sobre celulas tumorales, u otro agente antineoplastico. Intervenir en multiples rutas de senalizacion o incluso rutas relacionadas pero en multiples etapas de intervencion tambien podna proporcionar beneficio terapeutico. Es probable que estas modalidades de tratamiento combinado sean mas eficaces debido a que combinan dos agentes anticancerosos, cada uno trabajando a traves de un mecanismo de accion diferente.
A fin de demostrar la viabilidad de los anticuerpos anti-HER-3, U1-53 y U1-59, como agentes de combinacion adecuados, se compararon las administraciones monoterapeuticas de U1-53 o U1-59 con aquellas en las que bien U1-53 o bien U1-59 se combinaban con en anticuerpo espedfico anti-EGR, Erbitux. Se inocularon subcutaneamente 5x106 celulas BxPC3 con Matrigel en ratones CB17 SCID. Despues de que los volumenes tumorales hubieran alcanzado 200 mm3, los ratones se aleatorizaron en grupos de tratamiento individuales. Se realizaron administraciones intraperitoneales semanales de U1-53, U1-59 y Erbitux como agentes simples o combinaciones de bien de anticuerpos anti-HER3 con Erbitux o bien como un coctel de dos anticuerpos anti HER-3. Todos los anticuerpos se dosificaron a una sola dosis de carga de 50 mg/kg/semana, seguido por inyecciones semanales de 25 mg/kg durante seis semanas. Las ramas de control recibieron administraciones bisemanales de gemcitabina (120 mg/kg), inyecciones semanales de IgG humana reunida o inyecciones semanales de vedculo (PBS). Los regfmenes se detallan posteriormente.
Gr.
N Compuesto Dosis de carga (mg/kg) Dosis semanal (mg/kg) Via Plan
4.
12 PBS 20 ml/kg 10 ml/kg cada 7 dfas i.p.
5.
12 IgG humana reunida 50 mg/kg 25 mg/kg cada 7 dfas i.p.
6.
12 U1-53 50 mg/kg 25 mg/kg cada 7 dfas i.p.
7.
12 U1-59 50 mg/kg 25 mg/kg cada 7 dfas i.p.
8.
12 Erbitux 50mg/kg 25 mg/kg cada 7 dfas i.p.
9.
12 U1-53 + Erbitux 25 mg/kg de cada uno 12,5 mg/kg de cada uno cada 7 dfas i.p.
10 .
12 U1-59 + Erbitux 25 mg/kg de cada uno 12,5 mg/kg de cada uno cada 7 dfas i.p.
11 .
12 U1-53 + U1-59 25 mg/kg de cada uno 12,5 mg/kg de cada uno cada 7 dfas i.p.
12 .
12 Gemcitabina ninguna 120 mg/kg 2x por semana i.p.
Los resultados para este experimento se muestran en la Fig. 15. Los anticuerpos U1-53 y U1-59, cuando se administraban como agentes individuales, retrasaban el crecimiento de los tumores pancreaticos humanos en el mismo grado que la gemcitabina, que se usa a menudo como una quimioterapia estandar contra el cancer pancreatico. La coadministracion de Erbitux con U1-53 o U1-59 daba como resultado una reduccion significativamente mayor del crecimiento tumoral que la observada con la administracion de cualquier agente individual de U1-53, U1-59 o Erbitux. Asf, se puede alcanzar una respuesta terapeutica beneficiosa al combinar los anticuerpos anti-HER-3 con anticuerpos adecuados que se dirigen a antfgenos tumorales separados.
En resumen, los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion tienen una potente eficacia terapeutica contra tumores humanos in vivo. Se pueden combinar eficazmente con otras terapias antineoplasticas para el incremento de la actividad antitumoral.
Ejemplo 22: Los anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento tumoral de melanoma humano en ratones 5 nu/nu
Miembros de la familia erbB de receptores, incluyendo Her3, se expresan anormalmente en una gran variedad de canceres epiteliales y se sabe que representan un papel importante en el crecimiento y la supervivencia de muchos de estos tumores solidos. Estos tumores incluyen melanomas, canceres de celulas escamosas de cabeza y cuello, canceres pulmonares no microcfticos y canceres de prostata, glioma, gastrico, de mama, colorrectal, pancreatico, 10 ovarico. A fin de verificar que los anticuerpos anti-Her3 de la invencion no estan restringidos en su actividad anticancerosa a tipos de tumores individuales, p. ej. canceres pancreaticos (vease el Ejemplo 21), pero se pueden usar como agentes terapeuticos contra muchos tumores dependientes de HER-3, se probaron U1-53 (anticuerpo comparativo) y U1-59 en estudios de xenoinjerto adicionales. Un ejemplo se muestra en la Fig. 16. Se inyectaron subcutaneamente 5 x 105 celulas de melanoma humano, HT144, en ratones CB17 SCID, seguido por inyeccion 15 intraperitoneal posterior inmediata de 50 mg/kg de U1-53 y U1-59, el volumen equivalente de PBS o dacarbacina (DITC) en 200 mg/kg. Posteriormente, los ratones recibieron 25 mg/kg de U1-53 o U1-59 una vez por semana, mientras que se daba DITC una vez cada dos semanas en 200 mg/kg.
Los volumenes tumorales medianos de cada grupo de tratamiento se muestran en la Figura 16. La administracion de los anticuerpos daba como resultado una reduccion del crecimiento de los melanomas humanos cuando se 20 comparaba con tumores que se habfan tratado con el control de vehfculo. Estos resultados demuestran que los anticuerpos no estan restringidos en su potencial terapeutico y se dirigen a una amplia variedad de canceres que expresan HER-3.
Ejemplo 23: Los anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma de colon en ratones
25 Se suspendieron celulas de carcinoma de colon humano HT-29 en medio con una relacion 2:1 de Matrigel hasta una concentracion final de 10 x 106 celulas j/ml. Se inyectaron s. c. 0,2 ml de suspension celular en el costado derecho de ratones CD1 nu/nu de 4-5 semanas de edad. Se uso un total de 95 ratones.
Los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos de control y tratamiento. El tratamiento empezo el mismos dfa. La duracion del tratamiento era 29 dfas. Al terminar el estudio, se recogieron tres tumores por grupo 3 horas 30 despues de la administracion del tratamiento. Los tumores se congelaron rapidamente y se mantuvieron -80°C.
Se llevo a cabo el siguiente protocolo de tratamiento:
Grupo de control: IgG humana no espedfica, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento: anticuerpo U1-53, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal 35 Grupo de tratamiento: anticuerpo U1-7, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento: anticuerpo U1-59, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento 5-FU: 5-fluorouracilo, 50 mg/kg, 9d x 5, intraperitoneal
Los volumenes tumorales medianos de cada grupo se muestran en la Fig. 17. La administracion de los anticuerpos daba como resultado una reduccion del crecimiento de los tumores de carcinoma de colon HT-29 cuando se 40 comparaba con tumores que se habfan tratado con IgG1 humana no espedfica.
Ejemplo 24: Los anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento de cancer de pulmon en ratones
Celulas de cancer de pulmon no microdtico humano Calu-3 se suspendieron en medio con una relacion 1:1 de Matrigel hasta una concentracion final de 5 x 101 celulas/ml. Se inyectaron s. c. 0,05 ml de suspension celular en el costado derechos de ratones CB17 scid hembra de 9 semanas de edad. Se uso un total de 60 ratones.
Los ratones se seleccionaron aleatoriamente a grupo de control y tratamiento. El tratamiento empezo el mismo dfa. La duracion del tratamiento era 32 dfas.
Se llevo a cabo el siguiente protocolo de tratamiento:
Grupo de veldculo de PBS
Grupo de control de hG: IgG humana no espedfica: 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal 5 Grupo de tratamiento anticuerpo U1-53, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento anticuerpo U1-7, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento anticuerpo U1-59, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal
Los volumenes tumorales medianos de cada grupo de control y tratamiento se muestran en la Fig. 18. La administracion de los anticuerpos daba como resultado una reduccion del crecimiento de los xenoinjertos de cancer 10 de pulmon no microdtico humano cuando se comparaba con tumores que se hadan tratado con el control de vedculo de PBS o IgG1 humana no espedfica.
Ejemplo 25: Los anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento de tumor pancreatico humano en ratones Balb/C
Se suspendieron celulas de tumor BxPC3 pancreatico en medio con una relacion 2:1 de Matrigel hasta una 15 concentracion final de 5 x 106 celulas por ml. Se inyectaron s. c. 0,2 ml de suspension celular en el costado derecho de ratones BalbC nu/nu hembra de 5-7 semanas de edad. Se uso un total de 100 ratones.
Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de control y tratamiento. El tratamiento empezo el mismo dfa. La duracion del tratamiento era 27 dfas.
20
Se llevo a cabo el siguiente protocolo de tratamiento:
Grupo de control de hIgG: IgG2 humana no espedfica, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento anticuerpo U1-53, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal 25 Grupo de tratamiento anticuerpo U1-7, 25 mg/kg, dos veces por semana, intraperitoneal Grupo de tratamiento anticuerpo U1-59, 25 mg/kg, semanalmente, intraperitoneal Grupo de tratamiento con Gemzar, gemcitabina, 80 mg/kg, semanalmente, intraperitoneal
Los volumenes tumorales medianos de cada grupo de control y tratamiento se muestran en la Fig. 19. La administracion de los anticuerpos daba como resultado una reduccion del crecimiento de los tumores pancreaticos 30 humanos cuando se comparaba con tumores que se hadan tratado con IgG humana no espedfica o con Gemzar.
La inhibicion de HER-3 en los tumores pancreaticos humanos tambien se podrta mostrar en un experimento farmacodinamico. Los xenoinjertos de tumores BxPC3 se hicieron crecer como se describe anteriormente. 3 ratones se trataron con 500 |jg de un anticuerpo de control de IgG1 y 3 ratones se trataron con 500 |jg del anticuerpo anti- 35 HER-3 U1-59. Los ratones se trataron el dfa 1 y el dfa 4 y a continuacion se sacrificaron el dfa 5 para medir la inhibicion dependiente de anticuerpo de la fosforilacion de hER-3 (pHER-3).
Los tumores se homogeneizaron en un tampon de RIPA estandar con inhibidores de proteasa. Se separaron 50 jg de lisado transparente en un gel de Tris-glicina al 4-20%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se 40 bloquearon en albumina de suero bovino (BSA) al 3%. Se realizo inmunotransferencia usando un anticuerpo anti- pHER-3 (anticuerpo 21D3, Cell Signaling technology). Se uso como un control un anticuerpo anti-actina (AB a-2066, Sigma).
La expresion se detecto mediante una quimioluminiscencia aumentada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 45 Las imagenes se capturaron con el Versadoc 5000 Imaging System (BioRad, Hercules, CA).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los resultados se muestran en la Fig. 20. Despues de la administracion del anticuerpo anti-HER-3 humano U1-59, ya no era detectable la fosforilacion de HER-3. As^ los anticuerpos de la invencion son capaces de reducir significativamente la activacion de HER-3 en celulas de tumor pancreatico humano.
Ejemplo 26: Uso de anticuerpos anti-HER-3 como un agente de diagnostico
Se puede usar mAn anti-HER-3 en el diagnostico de enfermedades malignas. HER-3 se expresa sobre celulas tumorales de un modo muy distinto en comparacion con tejido normal y, por lo tanto, un analisis de la expresion de HER-3 ayudana en el diagnostico primario de tumores solidos, la estadificacion y la graduacion de tumores solidos, la determinacion de criterios de pronostico para enfermedades proliferativas y neoplasias y el manejo del riesgo en pacientes con tumores positivos a HER-3.
A. Deteccion de antfgeno HER-3 en una muestra
Se desarrolla un ensayo de inmunoabsorcion con enzimas ligadas (ELISA) para la deteccion de antfgeno HER-3 en una muestra. En el ensayo, los pocillos de una placa de microvaloracion, tal como una placa de microvaloracion de 96 pocillos o una placa de microvaloracion de 384 pocillos, se adsorben durante varias h con un primer anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido contra el antfgeno HER-3. El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquier antfgeno HER-3 que pueda estar presente en una muestra de prueba. Los pocillos se enjuagan y se tratan con un agente de bloqueo tal como protema de la leche o albumina para evitar la adsorcion no espedfica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el antfgeno HER-3, o con una solucion que contiene una cantidad estandar del antfgeno HER-3. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero procedente de un sujeto que se sospecha que tiene niveles de antfgeno hER-3 circulatorios considerados un diagnostico de una patologfa. Despues de enjuagar la muestra de prueba o el estandar, los pocillos se tratan con un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano anti-HER-3 que se etiqueta mediante conjugacion con biotina. El anticuerpo anti-HER-3 etiquetado sirve como un anticuerpo de deteccion. Despues de enjuagar el exceso de anticuerpo secundario, los pocillos se tratan con peroxidasa de rabano picante (HRP) conjugada a avidina y un sustrato cromogenico adecuado. La concentracion del antfgeno HER-3 en las muestras de prueba se determina mediante comparacion con una curva estandar desarrollada a partir de las muestras estandar.
B. Deteccion de antfgeno HER3 en inmunohistoqmmica (IHC)
A fin de determinar el antfgeno HER3 en secciones de tejido mediante IHC, tejidos embebidos en parafina se desparafinan en primer lugar en xileno durante 2 x 5 min y a continuacion se hidratan con etanol al 100% 2 x 3 min, etanol al 95% 1 min y se enjuagan en agua destilada. Epftopos antigenicos enmascarados mediante fijacion con formalina e imbibicion en parafina se exponen mediante desenmascaramiento epitopico, digestion enzimatica o saponina. Para el desenmascaramiento epitopico, secciones de parafina se calientan en un vaporizador, un bano de agua o un horno de microondas durante 20-40 min en una solucion de recuperacion epitopica como por ejemplo solucion de HCl 2 N (pH 1.0). En el caso de la digestion enzimatica, secciones de tejido se incuban a 37°C durante 10-30 minutos en diferentes soluciones enzimaticas tales como proteinasa K, tripsina, pronasa, pepsina, etc.
Despues de enjuagar la solucion de recuperacion epitopica o la enzima en exceso, las secciones tisulares se tratan con un tampon de bloqueo para prevenir interacciones inespedficas. El anticuerpo primario se incuba con diluciones apropiadas en tampon de dilucion durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche. El anticuerpo primario en exceso se enjuaga las secciones se incuban en solucion de bloqueo de peroxidasa durante 10 min a temperatura ambiente. Despues de otra etapa de lavado, las secciones tisulares se incuban con un segundo anticuerpo secundario etiquetado con un grupo que podna servir como un anclaje para una enzima. Ejemplos de los mismos son anticuerpos secundarios etiquetados con biotina que son reconocidos por peroxidasa de rabano picante acoplada a estreptavidina. La deteccion de dicho complejo de anticuerpo/enzima se consigue al incubar con un sustrato cromogenico adecuado.
C. Determinacion de la concentracion de antfgeno HER-3 en suero de pacientes
Se desarrolla un ELISA tipo sandwich para cuantificar los niveles de HER-3 en suero humano. Los dos anticuerpos monoclonales humanos anti-HER-3 usados en el ELISA tipo sandwich reconodan diferentes dominios en la molecula de HER-3 y no compiten por la union, por ejemplo, vease el Ejemplo 8. El ELISA se realiza como sigue: 50 |jl de anticuerpo de captura anti-HER-3 en tampon de revestimiento (NaHCO3 0,1 M, pH 9,6) en una concentracion de 2 jg/ml se revistieron sobre placas de ELISA (Fisher). Despues de la incubacion a 4°C durante la noche, las placas se tratan con 200 jl de tampon de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,1%, timerosal al 0,01% en PBS) durante 1 h a 25°C. Las placas se lavaron (3x) usando Tween 20 al 0,05% en PBS (tampon de lavado, WB). Sueros normales o de paciente (Clinomics, Bioreclaimation) se diluyen en tampon de bloqueo que contiene 50% de suero humano. Las placas se incuban con muestras de suero durante la noche a 4°C, se lavaron con WB y a continuacion
se incubaron con 100 pl/pocillo de anticuerpo de deteccion anti-HER-3 biotinilado durante 1 h a 25°C. Despues del lavado, las placas se incuban con HRP-estreptavidina durante 15 min, se lavaron como anteriormente y a continuacion se trataron con 100 pl/pocillo de o-fenilendiamina en H2O2 (solucion de revelado de Sigma) para la generacion de color. La reaccion se detiene con 50 pl/pocillo de H2SO4 (2 M) y se analizaron usando un lector de 5 placas de ELISA a 492 nm. La concentracion de antigeno HER-3 en muestras de suero se calcula mediante comparacion con diluciones de antigeno HER-3 purificado usando un programa de ajuste de curvas de cuatro parametros.
Estadificacion del cancer en un paciente
Basandose en los resultados indicados y analizados bajo los puntos A., B. y C, a traves del uso de la presente 10 invencion, es posible estadificar un cancer en un sujeto basandose en los niveles de expresion del antfgeno HER-3. Para un tipo de cancer dado, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados de diversos estadios en el avance de la enfermedad, y/o en diversos puntos en el tratamiento terapeutico del cancer. La concentracion del antigeno HER-3 presente en las muestras de sangre se determina usando un metodo que determina espedficamente la cantidad del antigeno que esta presente. Tal metodo incluye un metodo de ELISA, tal como el 15 metodo descrito bajo los puntos A. y B. Usando una poblacion de muestras que proporciona resultados estadfsticamente significativos para cada estadio de avance o terapia, se senala una gama de concentraciones del antigeno HER-3 que se puede considerar caractenstica de cada estadio.
A fin de estadificar el avance del cancer en un sujeto bajo estudio, o de caracterizar la respuestas del sujeto a un 20 ciclo de terapia, se toma una muestra de sangre del sujeto y se determina la concentracion del antfgeno HER-3 presente en la muestra. La concentracion asf obtenida se usa para identificar en que intervalo de concentraciones esta el valor. El intervalo asf identificado se correlaciona con un estadio de avance o un estadio de terapia identificado en las diversas poblaciones de sujetos diagnosticados, proporcionando de ese modo un estadio en el sujeto bajo estudio.
25 Ejemplo 27: Usos de anticuerpos y conjugados de anticuerpo anti-HER-3 para el tratamiento o la prevencion de enfermedades hiperproliferativas
Muchos tumores solidos son conducidos por senalizacion mediada por la familia HER y se ha demostrado que HER- 3 es un socio crucial a traves de la formacion de complejos entre HER-1, HER-2 y HER-4. Por lo tanto, una reduccion o eliminacion de la senalizacion mediada por HER-3 afectana a todos los otros miembros de la familia 30 HER y dificultana la senalizacion celular conduciendo a una amplia gama de intervenciones terapeuticas y potencial
en terapia combinada con otros agentes, materiales biologicos y agentes citotoxicos dirigidos. Asf, los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion se pueden usar para el tratamiento de ciertos trastornos hiperproliferativos o asociados con HER-3, que se basan en un numero de factores como, por ejemplo, la expresion de HER-3. Tipos de tumores como cancer de mama, cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de 35 estomago, cancer endometrial, cancer de las glandulas salivares, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de tiroides, cancer de vejiga urinaria, glioma, melanoma, otros canceres que expresan o sobreexpresan HER-3 parecen presentar indicaciones preferidas, pero las indicaciones no se limitan a las de la lista precedente. Ademas, los siguientes grupos de pacientes se beneficiaran del tratamiento con mAb dirigidos anti-HER-3:
40 Pacientes con resistencia al tratamiento con mAb anti-HER-2
Pacientes no elegibles para el tratamiento con mAb anti-HER-2
Pacientes con resistencia a mAb anti-HER-1 o un inhibidor anti-EGFR de molecula pequena
Pacientes con cancer de pulmon no microdtico resistente a erlotinib o gefitinib.
Los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion se usaron bien como una monoterapia o en combinacion con uno o mas 45 agentes en una llamada "terapia combinada". Dicha terapia combinada puede incluir, pero no se limita a, agentes que se especificaron previamente en la invencion. La terapia combinada con anticuerpos anti-HER3 y otros agentes puede prolongar la supervivencia del paciente, el tiempo hasta el avance del tumor o la calidad de vida del paciente. El protocolo y l diseno de administracion se dirigiran a la eficacia terapeutica asf como a la capacidad para reducir las dosis habituales de las terapias estandar, como por ejemplo quimio- o radioterapia.
50 Tratamiento de seres humanos con anticuerpos anti-HER-3 de la invencion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Para determinar los efectos in vivo del tratamiento con anticuerpos anti-HER-3 en pacientes humanos con tumores, tales pacientes son inyectados a lo largo de una cierta cantidad de tiempo con una cantidad eficaz de anticuerpo anti-HER-3 de la invencion. En momentos periodicos durante el tratamiento, los pacientes humanos son controlados para determinar sus avances de los tumores, en particular si los tumores crecen y se metastatizan.
Un paciente con tumor tratado con los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion tiene un nivel inferior de crecimiento y/o metastasis tumorales en comparacion con el nivel de crecimiento y metastasis tumorales en pacientes con tumores tratados con el patron actual de cuidado terapeutico.
Tratamiento con conjugados de anticuerpo anti-HER-3 de la invencion
Para determinar los efectos in vivo de conjugados de anticuerpo anti-HER-3 de la invencion, pacientes humanos o animales fueron inyectados a lo largo de una cierta cantidad de tiempo con una cantidad eficaz de conjugado de anticuerpo anti-HER-3 de la invencion. Por ejemplo, el conjugado de anticuerpo anti-HER-3 administrado es conjugado de DMI-anticuerpo anti-HER-3, un conjugado de auristatina-anticuerpo anti-HER-3 o conjugado de radioisotopo-anticuerpo anti-HER-3. En momentos periodicos durante el tratamiento, los pacientes humanos o los animales se controlan para determinar si sus tumores avanzan, en particular si los tumores crecen y se metastatizan.
Un paciente humano o una animal que exhibe tumores y esta sometido a tratamiento con, por ejemplo, conjugados de DMI-anticuerpo anti-HER-3 o radioisotopo-anticuerpo anti-HER-3 tiene un nivel inferior de crecimiento y metastasis tumorales cuando se compara con un paciente o animal de control que exhibe tumores y esta sometido a tratamiento con una terapia alternativa. DMI-anticuerpos de control que se pueden usar en animales incluyen conjugados que comprenden DM1 conectado a anticuerpos del mismo isotipo de los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion, pero mas espedficamente, no teniendo la capacidad para unirse al antfgeno tumoral HER-3. Radioisotopo-anticuerpos de control que se pueden usar en pruebas en animales incluyen conjugados que comprenden radioisotopo conectado a anticuerpos del mismo isotipo de los anticuerpos anti-HER-3 de la invencion, pero mas espedficamente, no teniendo la capacidad para unirse a antfgeno tumoral HER-3. Nota: los conjugados de control no se administranan a seres humanos.
Anotaciones generales
Se considera que la memoria descriptiva escrita anteriormente es suficiente para permitir que un experto en la especialidad ponga en practica la invencion. La presente invencion no se debe limitar en alcance por la construccion depositada, ya que la realizacion depositada se entiende como una ilustracion individual de ciertos objetos de la invencion. El deposito de material de la presente no constituye una admision de que la descripcion escrita contenida en la presente sea inadecuada para permitir la practica de cualquier objeto de la invencion, incluyendo el mejo modo de la misma, ni se debe considerar que limite el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones espedficas que representa.
La descripcion y los Ejemplos precedentes detallan ciertas realizaciones preferidas de la invencion y describen el mejor modo contemplado por los inventores. Sin embargo, se apreciara que independientemente de cuan detallada pueda aparecer lo precedente en el texto, la invencion se puede poner en practica de muchas maneras y la invencion se debe considerar segun las reivindicaciones adjuntas de la misma.
Por otra parte, a menos que se defina otra cosa, los terminos cientfficos y tecnicos usados en relacion con la presente invencion tienen los significados que se entienden comunmente por los expertos normales en la especialidad. Ademas, a menos que sea requerida otra cosa por el contexto, los terminos singulares incluiran pluralidades y los terminos plurales incluiran el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y las tecnicas de, el cultivo celular y tisular, la biologfa molecular y la qmmica y la hibridacion de oligo- y polinucleotidos descritas en la presente son las bien conocidas y comunmente usadas en la especialidad. Se usan tecnicas estandar para ADN recombinarte, smtesis de oligonucleotidos y cultivo y transformacion tisulares (p. ej. electroporacion, lipofeccion). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se realizan segun las especificaciones de los fabricantes o como se efectuan comunmente en la especialidad o como se describen en la presente. Las tecnicas y los procedimientos precedentes se realizan generalmente segun metodos convencionales bien conocidos en la especialidad y segun se describen en diversas referencias generales y mas espedficas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Vease, p. ej. Sambrook y cols. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
Las nomenclaturas utilizadas en relacion con, y los procedimientos y las tecnicas de laboratorio de, la qmmica analttica, la qmmica organica sintetica y la qmmica medica y farmaceutica descritas en la presente son las bien conocidas y comunmente usadas en la especialidad. Se usan tecnicas estandar para las smtesis qmmicas, los analisis qmmicos, la preparacion farmaceutica, la formulacion y el aporte y el tratamiento de los pacientes.

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado que se une a HER-3, que comprende
    una CDR1 de la cadena pesada representada por GGSFSGYYWS, una CDR2 de la cadena pesada representada por EINHSGSTNYNPSLKS y una CDR3 de la cadena pesada representada por DKWTWYFDL, y
    una CDR1 de la cadena ligera representada por RSSQSVLYSSSNRNYLA, una CDR2 de la cadena ligera representada por WASTRES y una cDR3 de la cadena ligera representada por QQYYSTPRT.
  2. 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun la reivindicacion 1, que comprende la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de SEQ ID N°: 70 y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de SEQ ID N°:72.
  3. 3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun la reivindicacion 1 o 2, que es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinarte, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo multiespedfico o un fragmento de anticuerpo del mismo, en donde el fragmento de anticuerpo es preferiblemente un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molecula de anticuerpo monocatenaria.
  4. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho anticuerpo aislado es del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
  5. 5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo esta acoplado a un grupo de etiquetaje, que es preferiblemente un radioisotopo o radionuclido, un grupo fluorescente, un grupo enzimatico, un grupo quimioluminiscente, un grupo biotinilado o un epftopo polipeptfdico predeterminado.
  6. 6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se acopla a un grupo efector, que preferiblemente es un radioisotopo o radionuclido, una toxina o un grupo terapeutico o quimioterapeutico, en donde el grupo terapeutico o quimioterapeutico se selecciona, p. ej., del grupo que consiste en caliqueamicina, auristatina-PE, geldanamicina, maitansina y sus derivados.
  7. 7. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la molecula de acido nucleico preferiblemente esta conectada operativamente a una secuencia de control.
  8. 8. Un vector que comprende la molecula de acido nucleico segun la reivindicacion 7.
  9. 9. Una celula hospedadora transformada con el vector segun la reivindicacion 8.
  10. 10. Un procedimiento para preparar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende la etapa de aislar dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una celula hospedadora, en donde la celula hospedadora preferiblemente es una celula de marnffero, una celula vegetal, una celula fungica o una celula procariotica.
  11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende como un agente activo al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun una de las reivindicaciones 1-6 y un portador, diluyente o adyuvante farmaceuticamente aceptable.
  12. 12. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 11, adecuada para uso terapeutico.
  13. 13. La composicion farmaceutica segun la reivindicacion 11, adecuada para uso diagnostico.
  14. 14. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en un metodo para diagnosticar una enfermedad asociada con HER-3, particularmente una enfermedad hiperproliferativa, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cancer de mama, cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, cancer de prostata, cancer ovarico, cancer de estomago, cancer endometrial, cancer de las glandulas salivares, cancer de pulmon, cancer de rinon, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de tiroides, cancer de vejiga urinaria, glioma, melanoma, otros canceres que expresan o sobreexpresan HER-3, cancer de testfculo, sarcoma de tejidos blandos, cancer de cabeza y cuello y formacion de metastasis tumorales, comprendiendo el metodo:
    (a) poner en contacto una muestra con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, bajo condiciones adecuadas para permitir la union de dicho anticuerpo a HER-3; y
    (b) identificar la union de dicho anticuerpo a HER-3.
  15. 15. El uso segun la reivindicacion 14, en el que dicha enfermedad hiperproliferativa esta asociada con un incremento de la fosforilacion de HER-3, un incremento de la heterodimerizacion de HER-2/HER-3 o un incremento de la actividad de PI3-cinasa, cinasa c-jun-terminal, AKT, ERK2 y/o PYK2.
    5
  16. 16. Un estuche que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  17. 17. El estuche segun la reivindicacion 16, que comprende un agente terapeutico adicional, en donde el agente 10 terapeutico adicional es preferiblemente un agente antineoplastico, p. ej. un anticuerpo antitumoral o un agente
    quimioterapeutico.
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Families Citing this family (159)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002051438A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
EP1228766A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PYK2 phosphorylation by HER3 induces tumor invasion
TWI229650B (en) * 2002-11-19 2005-03-21 Sharp Kk Substrate accommodating tray
EP1868647A4 (en) * 2005-03-24 2009-04-01 Millennium Pharm Inc OV064 BINDING ANTIBODIES AND METHOD FOR THEIR USE
US8759490B2 (en) 2005-03-24 2014-06-24 Millennium Pharamaceuticals, Inc. Antibodies that bind OV064 and methods of use therefor
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
AU2015201263B2 (en) * 2005-12-30 2017-01-12 Amgen Inc. Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
AR056857A1 (es) 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
US20100047829A1 (en) * 2006-11-28 2010-02-25 U3 Pharma Gmbh Activated her3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
EP3248617A3 (en) 2007-02-16 2018-02-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
JP5779350B2 (ja) 2007-03-27 2015-09-16 シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー 抗体代替軽鎖配列を含む構築物およびライブラリー
EP1997830A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
KR20110014607A (ko) 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
WO2009151908A1 (en) * 2008-05-25 2009-12-17 Wyeth Biomarkers for egfr/her/erbb drug efficacy
EP2297208A4 (en) 2008-06-03 2012-07-11 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
EP2138511A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. HER3 as a determinant for the prognosis of melanoma
CA2729949A1 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013202410B2 (en) * 2008-07-16 2014-10-09 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neautralizing antibodies and use thereof
EP2318548B1 (en) * 2008-08-15 2013-10-16 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for predicting response of cells to a therapeutic agent
US8734795B2 (en) 2008-10-31 2014-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
WO2010085845A1 (en) * 2009-01-28 2010-08-05 The University Of Queensland Cancer therapy and/or diagnosis
CA2753119A1 (en) * 2009-02-24 2010-09-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of s-erbb-3 as a marker for cancer
TWI461211B (zh) 2009-03-20 2014-11-21 Genentech Inc 抗－ｈｅｒ抗體
EP2417159A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
WO2010127181A1 (en) * 2009-04-29 2010-11-04 Trellis Bioscience, Inc. Improved antibodies immunoreactive with heregulin-coupled her3
CN102482345A (zh) 2009-05-13 2012-05-30 航道生物技术有限责任公司 针对流感病毒的中和分子
WO2011004899A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cancerous disease modifying antibodies
BR112012004710A2 (pt) 2009-09-01 2016-08-16 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e uso das mesmas
CA2775573A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-her 3 antibodies
MX2012004415A (es) 2009-10-15 2012-05-08 Abbott Lab Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
US8785600B2 (en) * 2009-10-23 2014-07-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-GCC antibody molecules and related compositions and methods
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
ES2860453T3 (es) 2009-10-30 2021-10-05 Novartis Ag Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de la fibronectina de tipo III
TWI630916B (zh) * 2009-11-13 2018-08-01 第一三共歐洲公司 供治療或預防人表皮生長因子受體－３（ｈｅｒ－３）相關疾病之藥料和方法
BR112012013734A2 (pt) 2009-12-08 2017-01-10 Abbott Gmbh & Co Kg anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina.
MY161909A (en) 2009-12-22 2017-05-15 Roche Glycart Ag Anti-her3 antibodies and uses thereof
EP2543727B1 (en) 2010-03-02 2016-08-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
SG183532A1 (en) 2010-03-11 2012-09-27 Merrimack Pharmaceuticals Inc Use of erbb3 inhibitors in the treatment of triple negative and basal-like breast cancers
ES2566602T3 (es) * 2010-04-09 2016-04-14 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos anti-ErbB3
WO2011144749A1 (en) 2010-05-20 2011-11-24 Ablynx Nv Biological materials related to her3
AU2011274510A1 (en) 2010-07-09 2013-01-24 Exelixis, Inc. Combinations of kinase inhibitors for the treatment of cancer
CN107903321A (zh) 2010-07-30 2018-04-13 诺华有限公司 纤连蛋白摇篮分子和其库
AU2011285852B2 (en) 2010-08-03 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012019024A2 (en) * 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
WO2012018404A2 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
PT2606070T (pt) * 2010-08-20 2017-03-31 Novartis Ag Anticorpos para o recetor 3 do fator de crescimento epidérmico (her3)
PE20140229A1 (es) 2010-08-26 2014-03-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
TW201302793A (zh) * 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
IT1402149B1 (it) * 2010-10-04 2013-08-28 Ist Fisioterap Ospitalroma Uso di un fosfopeptide in grado di bloccare l interazione her3/p85 per il trattamento dei tumori iperesprimenti her2.
AU2011317743B2 (en) * 2010-10-18 2015-05-21 Mediapharma S.R.L. ErbB3 binding antibody
EP2635604B1 (en) * 2010-11-01 2016-11-30 Symphogen A/S Pan-her antibody composition
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
ITRM20100577A1 (it) * 2010-11-02 2012-05-03 Takis Srl Immunoterapia contro il recettore erbb-3
SG10201602874VA (en) 2010-12-15 2016-05-30 Kek High Energy Accelerator Protein production method
JP6047503B2 (ja) * 2010-12-29 2016-12-21 エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｈｅｒ３タンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ
MX2013010379A (es) 2011-03-11 2014-03-27 Merrimack Pharmaceuticals Inc Uso de inhibidores de receptores de la familia egfr en el tratamiento de canceres de mama refractarios a hormonas.
BR112013022887A2 (pt) 2011-03-15 2016-12-06 Merrimack Pharmaceuticals Inc superação de resistência a inibidores de via de erbb
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
DK2707391T3 (en) * 2011-05-13 2018-02-05 Gamamabs Pharma ANTIBODIES AGAINST HER3
CN103890010B (zh) 2011-05-19 2017-04-19 法国国家健康医学研究院 抗‑人‑her3抗体及其用途
JPWO2012176779A1 (ja) * 2011-06-20 2015-02-23 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
CA2842860A1 (en) 2011-07-28 2013-01-31 Sea Lane Biotechnologies, Llc Sur-binding proteins
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
EP2760893B1 (en) 2011-09-30 2018-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb3 antibodies and uses thereof
AU2012318541B2 (en) 2011-10-06 2018-04-12 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Predicting tumor response to anti-ERBB3 antibodies
JP2015504038A (ja) 2011-10-31 2015-02-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 低減した免疫原性を有するフィブロネクチン結合ドメイン
JP6149042B2 (ja) * 2011-11-09 2017-06-14 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション Ｈｅｒ３抗体およびその使用
RU2620068C2 (ru) 2011-11-23 2017-05-22 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Связывающие молекулы, специфичные по отношению к her3, и их применения
BR112014013495A8 (pt) * 2011-12-05 2017-06-13 Novartis Ag anticorpos para o receptor 3 do fator de crescimento epidérmico (her3) direcionados para o domínio iii e domíniuo iv de her3
KR20140103135A (ko) * 2011-12-05 2014-08-25 노파르티스 아게 Her3의 도메인 ii에 대해 지시된 표피 성장 인자 수용체 3 (her3)에 대한 항체
KR102083957B1 (ko) * 2011-12-05 2020-03-04 노파르티스 아게 표피 성장 인자 수용체 3 (her3)에 대한 항체
ES2710916T3 (es) 2011-12-22 2019-04-29 I2 Pharmaceuticals Inc Proteínas de unión sustitutas
AU2012362326A1 (en) 2011-12-30 2014-07-24 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against IL-13 and/or IL-17
IL297229A (en) 2012-01-27 2022-12-01 Abbvie Inc The composition and method for the diagnosis and treatment of diseases related to the degeneration of nerve cells
BR112014020666A2 (pt) * 2012-02-23 2018-09-25 U3 Pharma Gmbh usos de um inibidor de her3
US20130259867A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
NZ701601A (en) 2012-04-27 2016-09-30 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and use of same to test for susceptibility to gcc-targeted therapy
AU2013255537B2 (en) 2012-05-02 2018-02-15 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
KR20150076172A (ko) 2012-09-25 2015-07-06 그렌마크 파머수티칼스 에스. 아. 이질-이합체 면역글로불린의 정제
CA2928539A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind erbb3
SG11201503412RA (en) 2012-11-01 2015-05-28 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
KR20150063565A (ko) 2012-11-08 2015-06-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 Her3의 베타-헤어핀 및 her4의 베타-헤어핀에 결합하는 항-her3/her4 항원 결합 단백질
WO2014072306A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
AR094403A1 (es) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos anti-her3
KR20150143458A (ko) 2013-03-06 2015-12-23 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-C-MET 탠덤 Fc 이중특이적 항체
CN105246508A (zh) 2013-03-14 2016-01-13 基因泰克公司 Mek抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法
CN105209493B (zh) * 2013-03-14 2019-05-03 德克萨斯州大学系统董事会 用于诊断和治疗用途的her3特异性单克隆抗体
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
EP2821071A1 (en) 2013-07-04 2015-01-07 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Compounds for breast cancer treatment
TW201605896A (zh) * 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
JP6668241B2 (ja) 2013-09-05 2020-03-18 アムジエン・インコーポレーテツド 予測可能で、一貫性のある、且つ再現可能な糖型特性を示すＦｃ含有分子
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
US10519247B2 (en) * 2013-11-01 2019-12-31 Board Of Regents,The University Of Texas System Targeting HER2 and HER3 with bispecific antibodies in cancerous cells
WO2015067986A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Neuregulin allosteric anti-her3 antibody
WO2015100459A2 (en) 2013-12-27 2015-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
BR112016020752B1 (pt) 2014-03-11 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, composição farmacêutica, e, uso de uma composição farmacêutica
ES2859648T3 (es) 2014-04-10 2021-10-04 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticuerpo-fármaco anti-HER3
US10745490B2 (en) 2014-04-11 2020-08-18 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ErbB antibodies and methods of use thereof
FR3020063A1 (fr) 2014-04-16 2015-10-23 Gamamabs Pharma Anticorps humain anti-her4
WO2015173250A1 (en) 2014-05-14 2015-11-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-her3 antibodies binding to the beta-hairpin of her3
JP6671298B2 (ja) 2014-05-16 2020-03-25 アムジェン インコーポレイテッド Ｔｈ１及びｔｈ２細胞集団を検出するためのアッセイ
WO2016059602A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
MY178919A (en) 2015-03-09 2020-10-23 Agensys Inc Antibody drug conjugates (adc) that bind to flt3 proteins
EP3091033A1 (en) 2015-05-06 2016-11-09 Gamamabs Pharma Anti-human-her3 antibodies and uses thereof
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
ES2938186T3 (es) 2015-06-29 2023-04-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco
TW201716439A (zh) 2015-07-20 2017-05-16 美國禮來大藥廠 Ｈｅｒ３抗體
MA43416A (fr) 2015-12-11 2018-10-17 Regeneron Pharma Méthodes pour ralentir ou empêcher la croissance de tumeurs résistantes au blocage de l'egfr et/ou d'erbb3
MX2018011054A (es) 2016-03-15 2019-01-21 Merrimack Pharmaceuticals Inc Metodos para tratar cancer de mama er+, her2-, hrg+ usando terapias de combinacion que comprenden un anticuerpo anti-erbb3.
AU2017235571B2 (en) * 2016-03-18 2024-05-16 Georgetown University Targeting tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to anti-matriptase antibodies by in vivo cleavable linking moieties
WO2018107125A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Seattle Genetics, Inc. Bivalent antibodies masked by coiled coils
CA3046293A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
EP3572428A4 (en) 2017-01-17 2020-12-30 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-GPR20 ANTIBODY AND ANTI-GPR20 ANTIBODY MEDICINAL CONJUGATE
TW201834696A (zh) 2017-02-28 2018-10-01 學校法人近畿大學 藉由投予抗her3抗體－藥物複合體之egfr－tki抗性之非小細胞肺癌的治療方法
CA3056011A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
EP3673918A4 (en) 2017-08-23 2021-05-19 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PREPARATION AND ASSOCIATED LYOPHILIZATION
WO2019044947A1 (ja) 2017-08-31 2019-03-07 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの改良製造方法
CN117838881A (zh) 2017-08-31 2024-04-09 第一三共株式会社 制备抗体-药物缀合物的新方法
EP3758751A4 (en) 2018-02-28 2021-11-17 Wuxi Biologics Ireland Limited. MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN LAG-3, METHOD OF MANUFACTURING AND USING THEREOF
JP7328983B2 (ja) 2018-03-22 2023-08-17 サーフィス オンコロジー インコーポレイテッド 抗ｉｌ－２７抗体及びその使用
US20210079065A1 (en) 2018-03-26 2021-03-18 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
WO2019210144A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-31 Vanderbilt University Broadly neutralizing antibodies against hepatitis c virus
EP4257611A3 (en) 2018-05-18 2024-03-06 Glycotope GmbH Anti-muc1 antibody
AU2019311557A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
EP3831853A4 (en) 2018-07-27 2022-06-01 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PROTEIN-RECOGNIZING DRUG UNIT
BR112021001509A2 (pt) 2018-07-31 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited agente terapêutico para um tumor de cérebro metastásico
CN112512587A (zh) 2018-08-06 2021-03-16 第一三共株式会社 抗体药物缀合物和微管蛋白抑制剂的组合
EP3842546A4 (en) 2018-08-23 2022-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
KR20210062005A (ko) 2018-09-20 2021-05-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her3 항체-약물 콘쥬게이트 투여에 의한 her3 변이암의 치료
CN111289748A (zh) * 2018-12-08 2020-06-16 惠州市中大惠亚医院 ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用
KR20210102341A (ko) 2018-12-11 2021-08-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
MA54469A (fr) * 2018-12-13 2021-10-20 Surface Oncology Inc Anticorps anti-il-27 et leurs utilisations
US20220040324A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
WO2021062372A1 (en) 2019-09-26 2021-04-01 Amgen Inc. Methods of producing antibody compositions
CN114846028A (zh) * 2019-11-01 2022-08-02 美真达治疗公司 抗cd45抗体及其结合物
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
JP2023517889A (ja) * 2020-03-10 2023-04-27 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー ＮＰＭ１ｃ陽性がんの免疫療法のための組成物および方法
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
US20240026028A1 (en) 2020-10-14 2024-01-25 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-her3 antibody and anti-her3 antibody-drug conjugate and medical use thereof
CA3197930A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
WO2022102634A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと抗ＳＩＲＰα抗体の組み合わせ
KR20230164128A (ko) 2021-03-31 2023-12-01 디디바이오. 코포레이션 엘티디.,(상하이) 기능성 항원 결합 단백질 선별을 위한 벡터 및 방법
TW202308701A (zh) 2021-04-29 2023-03-01 大陸商上海匯連生物醫藥有限公司 抗體偶聯藥物的製備方法及應用
CA3222409A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
WO2023024949A1 (zh) 2021-08-24 2023-03-02 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种由可断裂连接子偶联的抗体偶联药物
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023103854A1 (zh) 2021-12-09 2023-06-15 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种亲和力改善的抗体-药物偶联物、其制备方法及应用
WO2023165475A1 (zh) * 2022-03-03 2023-09-07 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 Her3结合蛋白及其用途
TW202400140A (zh) 2022-04-27 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與ezh1及/或ezh2抑制劑之組合
TW202400245A (zh) * 2022-04-29 2024-01-01 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
FR2625508B1 (fr) 1987-12-30 1992-05-22 Charbonnages Ste Chimique Compositions polymeres ignifugees et leur application au revetement de cables electriques
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5183884A (en) 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU633698B2 (en) 1990-01-12 1993-02-04 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0546091B1 (en) 1990-08-29 2007-01-24 Pharming Intellectual Property BV Homologous recombination in mammalian cells
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
EP0730646A1 (en) 1993-11-23 1996-09-11 Genentech, Inc. PROTEIN TYROSINE KINASES NAMED Rse
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5837815A (en) 1994-12-15 1998-11-17 Sugen, Inc. PYK2 related polypeptide products
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CN101333516A (zh) 1995-08-29 2008-12-31 麒麟医药株式会社 嵌合体动物及其制备方法
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
PT896586E (pt) 1996-03-27 2007-01-31 Genentech Inc Anticorpos de erbb3
US6114595A (en) * 1996-04-11 2000-09-05 The Procter & Gamble Company Stretchable, extensible composite topsheet for absorbent articles
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
CA2616914C (en) 1996-12-03 2012-05-29 Abgenix, Inc. Egfr-binding antibody
ES2227729T3 (es) 1996-12-11 2005-04-01 Sugen, Inc. Metodos de cribaje para compuestos unidos al polipeptido pyk2.
US6235883B1 (en) * 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP1141722A1 (en) 1998-12-31 2001-10-10 Sugen, Inc. Pyk2 (raftk) and inflammation
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
AUPQ105799A0 (en) * 1999-06-18 1999-07-08 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Cell growth inhibition
AU784045B2 (en) 1999-06-25 2006-01-19 Genentech Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6627196B1 (en) 1999-08-27 2003-09-30 Genentech, Inc. Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
FR2817258B1 (fr) * 2000-11-27 2003-01-10 Atofina Procede de sulfochloration photochimique d'alcanes gazeux
US7125680B2 (en) * 2001-07-27 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Methods and materials for characterizing and modulating interaction between heregulin and HER3
EP1283053A1 (en) * 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
ATE443259T1 (de) * 2001-09-20 2009-10-15 Univ Texas Bestimmung der zirkulierenden therapeutischen antikörper, antigene sowie antigen-antikörper- komplexe mit elisa-tests
US7435871B2 (en) 2001-11-30 2008-10-14 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human Igλ light chain genes
EP1554576B9 (en) 2001-12-03 2008-08-20 Amgen Fremont Inc. Identification of high affinity molecules by limited dilution screening
CN1219882C (zh) 2002-03-18 2005-09-21 上海泽生科技开发有限公司 以erbb－3为基础的用于肿瘤治疗的方法和组合物
CN100424175C (zh) 2002-03-26 2008-10-08 上海泽生科技开发有限公司 ErbB-3 用于肿瘤治疗的方法和组合物
US7332580B2 (en) * 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
KR20050025669A (ko) 2002-07-25 2005-03-14 아클라라 바이오사이언시스 인코퍼레이티드 수용체 올리고머화의 검출
ES2347239T3 (es) * 2002-12-02 2010-10-27 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.
JP2006521821A (ja) 2003-04-01 2006-09-28 モノグラム バイオサイエンシズ，インコーポレーテッド バイオマーカーとしての表面受容体複合体
JP2005024385A (ja) 2003-07-02 2005-01-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 感圧センサ
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
TWI630916B (zh) * 2009-11-13 2018-08-01 第一三共歐洲公司 供治療或預防人表皮生長因子受體－３（ｈｅｒ－３）相關疾病之藥料和方法
WO2012018404A2 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
EP3684399A1 (en) * 2017-12-29 2020-07-29 Cellectis Method for improving production of car t cells
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Also Published As

Publication number Publication date
US8771695B2 (en) 2014-07-08
MY162624A (en) 2017-06-30
UA97473C2 (ru) 2012-02-27
MX2008008248A (es) 2008-11-26
NZ607711A (en) 2014-09-26
HK1133266A1 (en) 2010-03-19
ZA200805474B (en) 2009-05-27
IL225372A (en) 2016-07-31
EP2993187B1 (en) 2019-05-22
CA2633222C (en) 2017-07-11
IL225372A0 (en) 2013-06-27
EP1984402A2 (en) 2008-10-29
BRPI0620803A2 (pt) 2011-11-22
IL191852A0 (en) 2008-12-29
US20100183631A1 (en) 2010-07-22
CN102633881A (zh) 2012-08-15
US7705130B2 (en) 2010-04-27
CN102633881B (zh) 2014-08-13
EP2993187A2 (en) 2016-03-09
NZ596317A (en) 2013-04-26
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AU2006332065B2 (en) 2012-04-12

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