ES2227729T3 - Metodos de cribaje para compuestos unidos al polipeptido pyk2. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA TERAPIA QUE SE PUEDE UTILIZAR PARA UN ORGANISMO QUE PADECE DE UNA AFECCION O DE UNA PATOLOGIA QUE SE CARACTERIZA POR UNA ANOMALIA DE VIA DE TRANSDUCCION DE LA SEÑAL QUE INCLUYE UNA PROTEINA PYK2. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNAS TECNICAS DE DIAGNOSTICO DE DICHAS AFECCIONES Y TECNICAS DE BUSQUEDA DE AGENTES QUE CONVIENEN PARA EL TRATAMIENTO DE ESTAS AFECCIONES. ESTA INVENCION SE REFIERE FINALMENTE A UN ACIDO NUCLEICO PURIFICADO Y/O AISLADO QUE CODIFICA UNA PROTEINA PYK2.

Description

Métodos de cribaje para compuestos unidos al polipéptido PYK2.

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud está relacionada con la solicitud estadounidense con número de serie U.S. Nº 08/460.626, depositada el 2 de Junio de 1995, la cual en parte es una continuación de la solicitud de patente estadounidense con número de serie 08/357,642, depositada el 15 de Diciembre de 1994.

Introducción

La presente invención se refiere en general a una nueva proteína denominada PYK2 así como a los productos y métodos relacionados con la misma.

Antecedentes de la invención

Ninguno de los puntos de la siguiente discusión de los antecedentes es admitido como previo a la invención.

La transducción de señal celular es un mecanismo fundamental en el que los estímulos externos que regulan diversos procesos celulares son comunicados al interior de la célula. Uno de los mecanismos bioquímicos clave en la transducción de señales implica la fosforilación reversible de los residuos de tirosina de las proteínas. El estado de fosforilación de una proteína se modifica a través de acciones recíprocas de fosfatasas de tirosina (TPs) y tirosina quinasas (TKs), incluyendo a los receptores tirosina quinasa y los no receptores tirosina quinasa.

Los receptores tirosina quinasa (RTKs) pertenecen a una familia de proteínas transmembrana y han sido implicadas en las vías de señalización celular. La actividad biológica predominante de algunas RTKs es la estimulación del crecimiento y la proliferación celulares, mientras que otras RTKs se encuentran implicadas en la detención del crecimiento y promoción de la diferenciación. En algunos casos, una misma tirosina quinasa puede inhibir o estimular la proliferación celular dependiendo del entorno celular en el cual se expresa.

Las RTKs se componen como mínimo de tres dominios: un dominio extracelular de unión a ligando, un dominio transmembrana y un dominio catalítico citoplasmático que puede fosforilar residuos de tirosina. La unión de un ligando un receptor unido a membrana induce la formación de dímeros de receptor que dan lugar a cambios alostéricos que activan los dominios quinasa intracelulares que resulta en una autofosforilación (autofosforilación y/o transfosforilación) del receptor en sus residuos tirosina. Los residuos de fosfotirosina individuales de los dominios citoplasmáticos de los receptores pueden servir como sitios de unión específicos que interaccionan con una gran cantidad de moléculas de señalización citoplásmica, activando así varias vías de transducción de señal.

Las proteínas tirosina quinasas intracelulares, citoplasmáticas, no receptoras no contienen ningún dominio hidrofóbico transmembrana ni ningún dominio extracelular y comparten, además de sus dominios catalíticos quinasa, dominios no catalíticos. Tales dominios no catalíticos incluyen los dominios SH2 y los dominios SH3. Se cree que los dominios no catalíticos son importantes en la regulación de la interacción entre proteínas durante la transducción de la señal.

La quinasa de adhesión focal (FAK) es una proteína tirosina quinasa citoplasmática que se localiza en las adhesiones focales. Schaller, et al., Proc. Natl. Atad. Sci. U.S.A., 89:5192-5196 (1992); Cobb et al., Molecular and Cellular Biology, 14(1):147-155 (1994). En algunas células el dominio C-terminal de FAK se expresa de forma autónoma como una proteína de 41 kDa llamada FRNK y los 140 residuos C-terminales de FAK contienen un dominio diana de adhesión focal (FAT). Los ADNcs que codifican para FRNK se encuentran publicados en Schaller et al., Molecular and Cellular Biology, 13(2):785-791 (1993). En Hilderbrand et al., The Journal of Cell Biology, 123(4): 993-1005 (1993) fue identificado el dominio FAT diciéndose que era requerido para la localización de FAK para las adhesiones celulares focales.

Un rasgo central en la transducción de señales es la fosforilación reversible de determinadas proteínas. La fosforilación del receptor estimula una asociación física del receptor activado con las moléculas diana, las cuales pueden a su vez ser fosforiladas o no. Algunas moléculas diana tales como la fosfolipasa Cy son a su vez fosforiladas y activadas. Tal fosforilación transmite una señal hacia el citoplasma. Otras moléculas diana no se encuentran fosforiladas, pero ayudan en la transducción de la señal actuando a modo de moléculas adaptadoras para proteínas transductoras de una señal secundaria. Por ejemplo, la fosforilación del receptor y los cambios alostéricos subsiguientes en el mismo producen la unión del complejo Grb-2/SOS al dominio catalítico del receptor cuya proximidad a la membrana le permite activar a ras. El transductor de señales secundarias generadas a través de receptores activados da lugar a una cascada de señales que regula las funciones celulares como la división o la diferenciación celulares. Las revisiones que describen la transducción de la señal intracelular incluyen a Aaronson, Science, 254:1146-1153, 1991; Schlessinger, Trends Biochem. Sci., 13:443-447, 1988; y Ullrich y Schlessinger, Cell, 61:203-212,1990.

Muchas proteínas tirosina quinasas son altamente expresadas en el sistema nervioso central siendo evidente que la fosforilación de las proteínas juega un papel regulador crucial en el sistema nervioso. Factores neurotróficos que controlan la diferenciación y mantienen la supervivencia de diferentes tipos de células neuronales median sus efectos biológicos por unión y activación de receptores de la superficie de la célula mediante una actividad intrínseca tirosina quinasa. Además, la fosforilación de la proteína es un mecanismo regulador clave de la excitabilidad de la membrana y de la función de los canales de iones.

La fosforilación de tirosinas regula la función de varios canales iónicos en el sistema nervioso central. La proteína quinasa C (PKC) puede regular la acción de una variedad de canales de iones incluyendo los canales de potasio dependientes de voltaje, los canales de sodio dependientes de voltaje así como el receptor nicotínico de la acetilcolina. La acción del receptor NMDA puede ser modulada mediante tirosina quinasas y fosfatasas. Además, la fosforilación de tirosinas de los receptores nicotínicos de acetilcolina (AchR) incrementa su tasa de desensibilación, y puede intervenir en la regulación de la distribución de AchR en la membrana celular. Otro ejemplo es el canal de K+ del tipo rectificador retardado, denominado Kv1.2 también llamado RAK, RBKZ, RCK5 y NGKI). Este canal se expresa de forma elevada en el cerebro y aurícula cardiaca, y puede ser regulado mediante fosforilación de tirosina. La fosforilación de tirosinas del Kv1.2 se asocia con la supresión del flujo en Kv1.2. La supresión del flujo de Kv1.2 fue inducida por una variedad de estímulos incluyendo el carbacol, la bradicinina, el PMA y el ionóforo de calcio.

La vía de transducción de señal mediante la quinasa Ras/MAP está elevadamente conservada en la evolución y juega un papel importante en el control del crecimiento y la diferenciación celular. La vía de señalización de la MAP quinasa en las células PC12 puede ser activada mediante NGF, mediante hormonas peptídicas que activan receptores acoplados a proteína G, mediante ésteres de forbol así como mediante el influjo de calcio que sigue a la despolarización de la membrana. Sin embargo, el mecanismo que media la activación de la vía de señalización de la quinasa Ras/MAP mediante receptores acoplados a proteína G así como por influjo de calcio no se conoce. Shc está implicado en el acoplamiento de las tirosina quinasas receptor y no receptor a las vías de señalización Ras/MAPK. La sobreexpresión de Shc lleva a la transformación de las células 3T3 y a la diferenciación neuronal de las células pC12. Además, la diferenciación inducida por Shc de las células PC12 es bloqueada por medio de un mutante dominante de Ras indicando que Shc actúa corriente arriba de Ras. La Shc fosforilada en las tirosinas puede activar las vías de señalización Ras mediante al unión al dominio SH2 de la proteína adaptadora Grb2 que se encuentra acomplejada al factor liberador de nucleótidos de guanina Sos a través de sus dominios SH3.

Las vías de transducción de señal que regulan canales iónicos (p.ej. canales de potasio y canales calcio) implican proteínas G las cuales funcionan como intermediarias entre los receptores y los efectores. Gilman, Ann.Rev.Biochem., 56:615-649 (1987); Brown y Birnbaumer, Ann.Rev.Physiol., 52:197-213 (1990). Los receptores acoplados a proteínas G son receptores de neurotransmisores, ligandos que son responsables de la producción de señales en las células nerviosas así como de proliferación y diferenciación de nervios y otros tipos celulares. Existen diferentes subtipos de receptores de neurotransmisores los cuales se expresan de forma diferencial en varios tejidos y neurotransmisores tales como la acetilcolina evoca respuestas a través de los sistemas nerviosos central y periférico. Los receptores muscarínicos de la acetilcolina juegan papeles importantes en una gran variedad de actividades neuronales complejas tales como el aprendizaje, la memoria, y modulación motora, sensorial y excitatoria. Estos receptores también han sido implicados en varios trastornos del sistema nervioso central tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la depresión y la esquizofrenia.

Algunos agentes que están implicados en la vía de transducción de señales regulando un canal iónico, por ejemplo un canal de potasio, puede también estar implicado también en otra o otras vías que regulen otro o otros canales iónicos, por ejemplo un canal de calcio. Dolphin, Ann.Rev.Physiol., 52:243-55 (1990); WilK-Blaszczak et al., Neuron, 12:109-116 (1994). Los canales iónicos pueden ser regulados mediante o sin mediación de un segundo mensajero citosólico. Hille, Neuron, 9:187-195 (1992). Un posible segundo mensajero citosólico es una tirosina quinasa. Huang et al., Cell,75:1145-1156 (1993).

Los receptores implicados en las vías de transducción de señales que regulan canales iónicos se encuentran ligadas finalmente con los canales iónicos por medio de varios intermediarios, acontecimientos y agentes. Por ejemplo, tales acontecimientos incluyen un incremento del calcio intracelular, del inositol trifosfato y de la producción de endotelina. Frucht, et al., Cancer Research, 52:1114-1122 (1992); Schrey, et al., Cancer Research, 52:1786-1790 (1992). Los agentes intermedios incluyen la bombesina, la cual estimula la síntesis de ADN y la fosforilación de un sustrato específico de proteína quinasa C. Rodríguez-Pena, et al., Bio-chemical and Biophysical Research Communication, 140(1):379-385 (1986); Fisher and Schonbrunn, The Journal of Biological Chemistry, 263 (6):2208-2816 (1988).

Resumen de la invención

Los polipéptidos PYK2 se encuentran implicados en varias vías de transducción de señal y por lo tanto la presente invención proporciona varios agentes y métodos útiles para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de varias enfermedades o condiciones asociadas con anormalidades en estas vías.

La presente invención se basa en parte en la identificación y aislamiento de una nueva tirosina quinasa no receptor denominada PYK2. Sin el deseo de estar sujetos a ninguna teoría en particular, parece que PYK2 participa en al menos dos vías de transducción de señales. La primera vía de transducción de señales se activa cuando las señales extracelulares como la bradicinina o la acetilcolina se unen a una proteína quinasa receptor acoplada a proteína G. Las proteína quinasas receptor acopladas a proteína G incluyen, aunque no están limitadas a, Lyn y Syk las cuales se encuentran localizadas en las células B del sistema inmune.

Otra vía de transducción de señal PYK2 se activa cuando los factores de crecimiento se unen a proteínas quinasas receptor. Los receptores dimerizan y posteriormente se fosforilan de forma cruzada el uno al otro. Las partes fosfato ahora unidas a la proteínas quinasas receptor atraen otras moléculas de señalización a estos receptores localizados en la membrana plasmática. Tales moléculas de señalización pueden ser, entre otras, sos, shc, o grb. Complejos tales como el complejo EGFR/grb-2/sos pueden activar moléculas ras también localizadas en la membrana plasmática. Las moléculas Ras pueden entonces activar moléculas de señalización que no se encuentran unidas a la membrana plasmática. Estas moléculas de señalización citoplasmáticas pueden propagar una señal extracelular hacia el núcleo y promover la producción de agentes celulares necesarios para el desarrollo de una respuesta a la señal extracelular. Ejemplos de moléculas de señalización citosólicas son las proteínas implicadas en la cascada de la MAP quinasa.

La descripción que se proporciona aquí indica que PYK2 puede combinarse con las vías acopladas a proteína G con la vía sos/grb para la activación de la transducción de señal de MAP quinasa en respuesta a la estimulación por receptores acoplados a proteína G. La invención también indica que PYK2 lleva estas dos vías conjuntamente con la unión de src, otra proteína quinasa implicada en los mecanismos de transducción de señales. Por lo tanto, la invención proporciona nuevos dianas para la terapéutica efectiva en el tratamiento de enfermedades derivadas de la proliferación celular tales como el cáncer y/o de los trastornos de la diferenciación celular.

PYK2 tiene un peso molecular estimado de 111 kD y contiene cinco dominios: (1) un relativamente largo dominio N-terminal desde el aminoácido 1 al aminoácido 417; (2) un dominio quinasa catalítico desde el aminoácido 418 al aminoácido 679 que contiene un dominio de unión a nucleótido que abarca desde el aminoácido 431 al aminoácido 439 y un lugar de unión a ATP en el aminoácido 457); un dominio rico en prolina desde el aminoácido 713 al aminoácido 733; (4) otro dominio rico en prolina desde el aminoácido 843 al aminoácido 860; y (5) un dominio C-terminal diana de adhesión focal (FAT) desde el aminoácido 861 al aminoácido 1009. PYK2 no contiene dominio SH2 o dominio SH3. Los aminoácidos 696-1009 de PYK2 muestran homología con FRWK, el fragmento C-terminal de FAK. Otros aspectos de la secuencia PYK2 incluyen lo siguiente: (1) el aminoácido 402 es el principal lugar de autofosforilación de PYK2 y es un lugar de unión Src SH2; (2) el aminoácido 599 es un lugar de autofosforilación en un lazo de activación de la quinasa PYK2; (3) el aminoácido 881 es un lugar de autofosforilación y un lugar de unión GRB2; y (4) el aminoácido 906 es un lugar de autofosforilación y lugar de unión SHP-2 (PTP-10).

El dominio FAT de PYK2 presenta alrededor del 62% de similaridad con el dominio FAT de otra tirosina quinasa no receptor, FAK, la cual es también activada a través de proteínas G. La similaridad total entre PIKZ y FAK es de alrededor del 52%. PYK2 se expresa principalmente en los tejidos neuronales, aunque la expresión también ser detectada en las células hematopoyéticas en los primeros estadios del desarrollo y en algunas líneas de células tumorales. La expresión de PYK2 no se corresponde con la expresión de FAK.

Se cree que PYK2 regula los canales de potasio en respuesta a señales generadas por neurotransmisores. La actividad enzimática PYKz se encuentra regulada de forma positiva por medio de fosforilación en tirosinas y resulta en una respuesta a la unión de bradicinina, TPA, ionóforo de calcio, carbacol, TPA + forscolina, y despolarización de membrana. La combinación de toxinas conocidas (tales como la toxina pertusis, toxina del cólera, TPA y bradicinina) con receptores de señalización acoplados a proteína G positivamente regulados incrementa la fosforilación de
PYK2.

La PYK2 activada fosforila a RAK, un canal de potasio del tipo rectificador retardado, y por lo tanto suprime la actividad de RAK. En el mismo sistema, FAK no fosforila a RAK. PYK2 es responsable de la regulación de la señal producida por neurotransmisor y por lo tanto debe de ser usado para el tratamiento de condiciones del sistema nervioso que potencien o inhiban tal señalización.

Un aspecto de la invención caracteriza un método para la detección de la presencia o valorar la cantidad de algún compuesto capaz de unirse al polipéptido PYK2, en el que dicho compuesto sea una indolinona. El método implica incubar dicho compuesto con un polipéptido PYK2 y la detección de la presencia o valoración de la cantidad del compuesto unido al polipéptido PYK2.

En una aplicación mejor, el compuesto inhibe la actividad de fosforilación del polipeptido PYK2.

En otro aspecto la invención caracteriza un método de cribaje para agentes potencialmente útiles en el tratamiento de una enfermedad o condición caracterizada por la anormalidad en una vía de transducción de señal que contenga una interacción entre un polipéptido PYK2 y un compañero de unión natural (NBP). El método implica ensayar aquellos agentes potenciales de entre los que son capaces de promover o interrumpir la interacción como una indicación de agente útil. El compañero de unión natural es Src y la vía implica un receptor acoplado a proteína G pero no implica ningún receptor de factor de crecimiento, y los agentes potenciales son una o más indolinonas.

Preferiblemente la indolinona es una oxindolinona.

Enfermedades específicas o trastornos los cuales pueden ser tratados o prevenidos, en base de las células afectadas son: miastenia gravis; neuroblastoma; trastornos causados por toxinas neuronales tales como la toxina del cólera, la toxina pertusis, o el veneno de serpiente; mielosis megacariocítica aguda; trombocitopénia; aquellas que afectan al sistema nervioso central como apoplejía, embolia, traumatismos craneales, daños en la médula espinal, daños en las células nerviosas inducido por hipóxia en situaciones como el paro cardíaco o el sufrimiento neonatal, epilepsia, enfermedades neuro-degenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson, demencia, tensión muscular, depresión, ansiedad, crisis de pánico, trastornos obsesivo-compulsivos, estrés post-traumático, esquizofrenia, síndrome neuroléptico maligno, y el síndrome de Tourette. Las condiciones que pueden ser tratadas mediante inhibidores de PYK2 incluyen epilepsia, esquizofrenia, hiperactividad extrema en niños, dolor crónico, y dolor agudo. Ejemplos de condiciones que pueden ser tratadas a través de potenciadores de PYK2 (por ejemplo un inhibidor de fosfatasa) incluyen embolia, Alzheimer, Parkinson, otras enfermedades neurodegenerativas y la migraña. Los trastornos preferidos incluyen epilepsia, embolia, esquizofrenia, y Parkinson, ya que existe una relación bien establecida entre estos trastornos y la función de los canales de potasio.

La invención también proporciona un método para el cribaje de moduladores de las vías de señalización PYK2 comprendiendo los siguientes pasos: mezcla de dos o más componentes seleccionados de un grupo constituido por PYK2, Src, bradicinina, LPA, y uno o más de los mencionados moduladores, en donde los moduladores son una o más indolinonas; y monitorizando el efecto de los moduladores en las vías de señalización PYK2.

Preferiblemente la indolinona es una oxindolinona. Preferiblemente el método implica agentes capaces de promover o interrumpir la unión del dominio SH2 de Src a la tirosina de la posición 402 de PYK2.

Preferiblemente el efecto es un estado de fosforilación de PYK2 o Src.

Otras caracterizaciones y ventajas de las invención serán mostradas a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferibles, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras y tablas

La Figura 1 muestra una representación esquemática de los dominios PYK2 (incluyendo el dominio quinasa, un dominio rico en prolina, y el dominio Fat) y los potenciales sitios de unión (incluyendo YAEI, YLNV, e YVVV).

La Figura 2 muestra un posible mecanismo para la despolarización de membrana e influjo de calcio que estimula la vía de las quinasas MEK y MAP de activación de Ras. En las células PC12, la despolarización de la membrana lleva al influjo de calcio a través de canales de calcio del tipo L y activa la MAP quinasa. El influjo de calcio conduce a la activación de Ras y a la activación de MAP en respuesta al influjo de calcio se inhibe por un mutante dominante negativo de Ras. La elevación de la concentración de calcio intracelular por varios estímulos lleva a la activación de PYK2. PYK2 recluta el complejo Shc/Grb2/Sos llevando a la activación de la vía de señalización compuesta de Ras, Raf, MAPKK, MAPK para transmitir las señales al núcleo celular.

La Figura 3 muestra un modelo para el estímulo extracelular que activa PYK2 así como la molécula diana potencial que presenta tirosinas fosforiladas en respuesta a la activación de PYK2. La actividad tirosina quinasa de PYK2 se activa mediante una variedad de señales extracelulares que estimulan el influjo de calcio incluyendo la activación de los receptores nicotínicos de la acetilcolina a través de carbacol, despolarización de membrana mediante KCl (75 mM), y tratamiento con un ionóforo de calcio. La activación de PYK2 por medio de estos estímulos requiere la presencia de calcio extracelular. PYK2 también es estimulada en respuesta a la activación inducida por bradicinina (BK) de sus receptores acoplados a proteína G llevando a la hidrólisis de PI y liberación de Ca+2 de las reservas internas. PYK2 es también activada en respuesta al tratamiento con ésteres de forbol (PMA) que se unen y activan a varias isozimas PKC. Los experimentos de co-expresión en células tranfectadas y en oocitos de rana muestran que la activación de PYK2 lleva a la fosforilación de tirosina (flecha gruesa) del canal de K+ del tipo rectificador retardado Kv1.2 y a la supresión de las corrientes mediadas por el canal Kv1.2.

La Figura 4 muestra una alineación de los aminoácidos de PYK-2 con los de las otras 4 proteínas, Fak, Fer, HER4 y AB1. La Tabla 1 muestra el patrón de expresión y los niveles de PYK2 en varias líneas celulares comprobados por múltiples métodos.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a ensayos que utilizan polipéptidos PYK2. Los iniciados en la materia reconocerán que muchos de los métodos descritos más abajo en relación con PYK-2, un NBP, o un complejo de PYK-2 y un NBP pueden también ser utilizados respecto a los otros miembros de este grupo.

Describimos el aislamiento y la caracterización de una nueva tirosina quinasa no receptor denominada PYK2, que es altamente expresada en el sistema nervioso y en el cerebro de rata adulta. PYK2 es un segundo miembro de la familia Fak de proteínas tirosina quinasas no receptores. Sin embargo, PYK2 muestra una localización citoplasmática difusa a diferencia de una localización preferencial de Fak en áreas de adhesión focal.

Los ejemplos presentados aquí revelan un nuevo mecanismo para el acoplamiento entre los receptores acoplados a proteína G y la vía de señalización de la MAP quinasa. Mostramos también que el influjo de calcio inducido por despolarización de membrana después de la activación del receptor nicotínico de la acetilcolina u otro estímulo que cause influjo de calcio lleva a la activación de PYK2, fosforilación de tirosina de Shc, reclutamiento de Grb2/Sos y activación de la vía de señalización de la MAP quinasa.

PYK2 se activa a través de señales extracelulares que conducen al influjo de calcio o a la liberación de calcio desde las reservas internas. PYK2 se fosforila en los residuos de tirosina en respuesta a una variedad de estímulos externos que causan una despolarización de membrana y un influjo de Ca+^{2} tal y como la activación del receptor nicotínico de la acetilcolina. La fosforilación de tirosinas de PYK2 es también estimulada por el neuropéptido bradicinina que activa un receptor acoplado a proteína G así como por medio de forbol miristato acetato (PMA). Experimentos en células transfectadas y en oocitos de Xenopus micro-inyectados con ARNm de PYK2, indican que la activación de PYK2 puede llevar a la fosforilación de tirosinas del canal de potasio del tipo rectificador retardado y a la supresión de la corriente de potasio por medio de este canal. Estos resultados sugieren que un nuevo mecanismo por medio del cual una tirosina quinasa no receptor, en el sistema nervioso, puede ser activado y puede modular la acción de las proteínas canal de iones. La activación de PYK2 en las células PC12 por medio del mismo estimulo lleva a reclutamiento del complejo Shc/Grb2/Sos y a la activación de la vía de señalización de la MAP quinasa que transmite señales al núcleo celular. El experimento presentado por lo tanto muestra que PYK2 puede también proporcionar un nexo entre los receptores acoplados a proteína G y el influjo de calcio y la vía de señalización de la MAP quinasa; una vía que transmite señales desde la superficie celular para regular los acontecimientos transcripcionales en el núcleo. La sobre-expresión de PYK2 lleva a la activación de la MAP quinasa. Además, los efectos de PYK2 en la fosforilación de tirosina y la acción del canal de potasio Kv1.2 revela un nuevo mecanismo para la regulación heteróloga de la función del canal por medio de la activación de una tirosina quinasa intermediaria. PYK2 puede, por lo tanto, emparejar las hormonas neuropéptido que actúan por medio de receptores acoplados a proteína G que estimulan la hidrólisis de fosfatidil inositol y la acción de las moléculas diana del canal.

Los experimentos de co-expresión transitoria de PYK2 con el canal rectificador retardado K+ Kv1.2 muestran que la proteína canal es sometida a fosforilación de tirosinas en respuesta a la activación de PYK2. Además, los flujos exhibidos por el canal Kv1.2 expresado en oocitos de rana fueron bloqueadas por la co-expresión de la proteína PYK2. Sin embargo, la co-expresión de un mutante negativo de la quinasa PYK2 PMA liberado indujo la supresión de los flujos de Kv1.2. La activación de PYK2 puede proporcionar un rápido y altamente localizado mecanismo de control para la función de los canales iónicos y la activación de la quinasa inducida por estímulos neuronales que eleva el calcio intracelular dando lugar a la integración neuronal y la eficacia sináptica.

Estos resultados revelan un papel para PYK2 en la activación de la vía de señalización de la MAP quinasa por medio de canales iónicos, influjo de calcio y receptores acoplados a proteína G en células PC12 y puede proporcionar un mecanismo para la transducción de señales inducidas por estos estímulos en el sistema nervioso. Además, la fosforilación de tirosinas de Shc en respuesta a la despolarización de membrana y al tratamiento con carbacol fue dependiente de la presencia de calcio extracelular, indicando que el influjo de calcio juega un papel en la regulación de la fosforilación de Shc por medio de estos estímulos. De forma similar, PYK2 podría modular la acción de los canales iónicos que median sus respuestas y son sensibles a la concentración de calcio intracelular. PYK2 puede por lo tanto proporcionar un papel autoregulador para el mismo canal responsable de la activación de PYK2. Una diana potencial de PYK2 es el receptor nicotínico de la acetilcolina. La activación del receptor nicotínico de la acetilcolina en las células PC12 lleva a la fuerte y rápida fosforilación de tirosinas de PYK2. El receptor nicotínico de la acetilcolina es sometido a pegilación y puede modular la actividad de fosforilación de tirosina. La fosforilación de tirosinas de Shc en respuesta al tratamiento con carbacol es inducido por la estimulación del receptor nicotínico de la acetilcolina tal y como ha sido determinado a través de análisis farmacológicos. El agonista nicotínico DMPP indujo fosforilación de Shc, mientras que la muscarina no tuvo ningún efecto, el antagonista nicotínico mecamilamina bloqueó el efecto del carbacol, mientras que el antagonista muscarínico atropina no tuvo ningún efecto. El efecto del carbacol en la fosforilación de tirosinas de Shc fue transitorio con una fosforilación máxima de tirosina detectada un minuto después seguida de un rápido declive. Sin embargo NGF, indujo una estimulación persistente de la fosforilación de Shc durante un periodo de cinco horas después de la adición de NGF. La duración de la fosforilación de Shc puede tener un importante impacto en la vía de señalización Ras y en la expresión de genes inducidos por estos
estímulos.

El modelo presentado aquí puede representar el mecanismo subyacente en la regulación de la expresión de genes mediada por calcio en las células neuronales inducidas por el receptor MMDA o por los canales de calcio sensibles a voltaje. El patrón de expresión de PYK2, el estímulo externo que activa esta quinasa junto con su papel en el control de la vía de señalización de la MAP quinasa sugiere un papel potencial para PYK2 en el control de una amplia colección de procesos en el sistema nervioso central incluyendo la plasticidad neuronal en el sistema nervioso.

Dado que la actividad de PYK2 es regulada por los niveles intracelulares de calcio, los patrones tanto espacial como temporal de activación de PYK2 puede representar una copia o una replica del perfil espacial y temporal de la concentración de calcio intracelular. La concentración de calcio dentro de la célula está altamente localizada debido a una variedad de proteínas de unión a calcio que proporcionan un fuerte efecto tamponador. Además, en las células excitables el nivel de calcio puede ser regulado por canales de calcio dependientes de voltaje que inducen un incremento tanto mantenido como transitorio en la concentración intracelular de calcio dando lugar a oscilaciones en los niveles de calcio así como a ondas de calcio. PYK2 puede proporcionar un mecanismo rápido y altamente localizado de control de la función de los canales iónicos así como de la activación localizada de la vía de señalización de la MAP quinasa. Análisis preliminares de inmunolocalización indican que PYK2 se expresa en las dendritas postsinápticas del hipocampo, sugiriendo este hecho un papel potencial de esta quinasa en la plasticidad sináptica mediada por influjo de calcio. Los canales de potasio son dianas frecuentes para la fosforilación por tirosina quinasas que son activadas por neurotransmisores o neuropéptidos. La fosforilación de otros canales regulados por voltaje o de receptores de neurotransmisor proporciona un importante mecanismo regulador por modulación. Por lo tanto, PYK2 puede representar una importante molécula acopladora entre los neuropéptidos que activan receptores acoplados a proteína G o los neurotransmisores que estimulan el influjo de Ca+2 y los acontecimientos de señalización posteriores que regulan la plasticidad neuronal, la excitabilidad celular, y la eficacia sináptica. Hemos demostrado que PYK2 es rápidamente activada en respuesta a una amplia variedad de estímulos extracelulares. Estos estímulos incluyen la activación de un canal iónico, la estimulación de un receptor acoplado a proteína G, el influjo de calcio que sigue a una despolarización de membrana así como la estimulación por ésteres de forbol. Aunque los mecanismos moleculares por medio de los cuales estas señales inducen la activación de PYK2 no son todavía conocidos, nuestros resultados muestran claramente que la elevación de la concentración de calcio intracelular es crucial para la activación de PYK2. El efecto de PMA en la activación de PYK2 puede indicar que PYK2 puede también ser activado por una vía dependiente de PKC. El hecho de que PYK2 pueda ser activado por un canal iónico, como el receptor nicotínico de la acetilcolina, y por el calcio intracelular incrementó la posibilidad de que PYK2 pudiera regular la función del canal iónico por fosforilación de tirosina.

Además analizamos la actividad de la MAP quinasa inducida por agonista en la línea celular PC12 la cual sobreexpresa de forma estable un mutante interferidor dominante de Grb2 que carece del dominio SH3 N-terminal (Grb2 DN-SH3) o en células PC12 las cuales de forma estable sobreexpresan la cola rica en prolina de Sos (Sos-CT). Xie et al, J. Biol. Chem. 270, 30717-30724 (1995). Gishizky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92, 10889-10893 (1995). La sobreexpresión de Grb2' DN-SH3 en células PC12 bloqueó completamente la activación por LPA- o por bradicinina de la MAP quinasa. La sobreexpresión de Sos-CT redujo fuertemente la activación de la MAP quinasa en respuesta a la estimulación por LPA y bradicinina. Sin embargo, la activación de PYK2 o Src no fue afectada por el mutante interferidor dominante de Grb2 y Sos confirmando que PYK2 y Src actúan corriente arriba de Grb2 y Sos en la cascada de acontecimientos que lleva a la activación de la MAP quinasa. Los experimentos presentados aquí demuestran que PYK2 puede encadenar a los receptores tanto acoplados a proteínas Gi como a proteínas Gq con la vía de señalización de MAP quinasa en las células PC12. La fosforilación en el residuo Tyr402 de PYK2 lleva a la unión del dominio SH2 de Src y la subsiguiente activación de Src en respuesta a los receptores acoplados tanto a proteína Gi como a proteína Gq. La sobreexpresión de Src activado (Y527F) en las células PC12 induce la fosforilación de tirosinas de PYK2, pero no estimula la actividad quinasa de PYK2.

Es posible por lo tanto que, esta fosforilación de tirosinas de PYK2 sea en parte mediada por Src, por lo tanto generando lugares de acoplamiento para proteínas de señalización adicionales que son reclutadas por PYK2. Hemos demostrado que la activación de PYK2 lleva tanto a un reclutamiento directo de Grb2/Sos así como a un reclutamiento indirecto de Shc vía fosforilación de tirosinas. Presentamos experimentos que demuestran que los mutantes interferidores dominantes de Grb2 o de Sos confieren una fuerte inhibición de la activación inducida por LPA o bradicinina de la MAP quinasa. Estos resultados están de acuerdo con estudios recientes que demuestran que un mutante por delección de Sos o un mutante interferidor dominante de Shc bloqueó la activación de la MAP quinasa inducida por LPA o trombina, van Biesen et al., Nature 376:781-784 (1995); Chen et al., EMBO J. 15:1037-1044 (1996), respectivamente.

Considerados de forma conjunta, estos experimentos muestran un papel central del complejo Shc/Grb2/Sos en la mediación de la activación de la MAP quinasa no solamente por medio de receptores tirosina quinasas; sino que también por receptores acoplados a proteínas Gi y Gq. Wan et al., Nature 380:541-544 (1996). En células B de aves tanto Lyn y Syk son esenciales para la activación de la MAP quinasa a través de receptores acoplados a proteínas Gi y Gq. Parece por lo tanto que una combinación de diferentes proteínas tirosina quinasas en diferentes tejidos y tipos celulares pueden encadenar un receptor acoplado a proteína G con la vía de señalización de la MAP quinasa. La familia de proteínas tirosina quinasas Src, las cuales son expresadas en todos los tipos celulares y todos los tejidos, parecen ser comunes e importantes componentes de esta vía, actuando conjuntamente con proteínas tirosina quinasas específicas de cada tipo celular tales como PYK2 en las células PC12 o Syk en las células B de las aves para dar lugar a señales específicas de cada tipo celular mediante el encadenamiento de 30 receptores acoplados a proteína G con la vía de señalización de la MAP quinasa y de ahí con la maquinaria transcripcional.

Ejemplos

Los ejemplos mostrados más abajo no son limitantes y son simplemente representativos de varios aspectos y procedimientos característicos usados para la identificación de las secuencias nucleotídica y aminoácidica completas de PYK-2. También se proporcionan experimentos que muestran la expresión, interacción y señalización de PYK-2.

Material y Métodos Productos químicos

Bradicinina, toxina pertusis, toxina del cólera, forscolina, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), ionoforo de calcio A23187, carbacol, muscarina, atropina, mecamilamina, y 1,1-dimetil-4-fenil yoduro de piperazina (DMPP) fueron obtenidos de Sigma.

Clonación de del ADNc de PYK2

Hemos usado la proteína adaptadora Grb2 como sonda específica para el cribaje en librerías de expresión con la finalidad de aislar las proteínas de unión a Grb2. Una de las proteínas clonadas codificó por una proteína tirosina quinasa que contiene una región rica en prolina que se puede unir in vitro a los dominios SH3 de Grb2. Esta proteína se llamó PYK1 tirosina quinasa rica en prolina 1. La comparación de la secuencia de aminoácidos de PYK1 con otras tirosina quinasas, indicó que PYK1 está relacionada con la proteína tirosina quinasa Ack. El análisis de la secuencia de PYK1 indicó que esta quinasa representa una nueva clase de proteínas tirosina quinasa citoplasmáticas. En el intento de aislar quinasas relacionadas con PYK2, hemos aplicado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de oligonucleótidos degenerados, derivados a partir de la secuencia de PYK1 de acuerdo con el motivo conservado del dominio catalítico de PTKs. ARN procedente de medula espinal de rata fue utilizado para preparar ADNc utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Molony _{(}^{BRL}_{)} de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc fue amplificado por PCR usando cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a los motivos conservados tirosina quinasa procedentes de subdominios TK6 y TK9 de PYK2; (los cebadores sentido y antisentido correspondían a las secuencias de aminoácidos IHRDLAARN [ID. DE SEC. NO: 3] y WMFGVTLW [ID. DE SEC. NO: 4], respectivamente). La PCR se desarrolló bajo las siguientes condiciones; 1 minuto a 94ºC; 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 68ºC durante 35 ciclos. Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis, revisados por tamaño (210 pares de bases), purificados y subclonados en el plásmido pBluescript (Stratagene). Los nuevos clones fueron sometidos a criba mediante una secuenciación de ADN. El inserto de ADNc del clon #38 fue utilizado como sonda para cribar librerías de ADNc procedente de cerebro humano (cerebro humano fetal \lambdagt 10 y cerebro humano \lambdagt 11, con 6x105 clones recombinantes cada uno) esencialmente como se describe en Maniatis.

La secuencia completa de aminoácidos de una nueva proteína tirosina quinasa fue aislada de una librería de ADNc procedente de cerebro humano y fue llamada PYK2. La pauta abierta de lectura de PYK2 codifica para una proteína de 1009 aminoácidos que contienen una larga secuencia N-terminal de 424 aminoácidos seguida de un dominio tirosina quinasa, dos dominios ricos en prolina (29% y 23,3% de prolina respectivamente) y una larga región carboxiterminal. El dominio quinasa de PYK2, contiene varios motivos de secuencia conservados entre las proteínas tirosina quinasa, incluyendo el motivo tripéptido DFG, que se encuentra en muchas quinasas, y un motivo consenso para la unión de ATP GXGXXG seguido de la secuencia AXK 17 residuos aminoacídicos más abajo.

La comparación de la secuencia de aminoácidos del domino quinasa de PYK2 con otras proteínas tirosina quinasas mostró que el núcleo quinasa de PYK2 es más similar a los dominios tirosina quinasa de Fak, Fer, Her4 y Abl. Además de la homología de secuencia en el dominio quinasa, las secuencias flanqueantes de toda la organización estructural de la proteína PYK2 son similares a los de FAK lo que indica que PYK2 pertenece a la misma familia de no receptores similares a las proteínas tirosina quinasa Fak.

Secuenciación y Análisis de ADN

La secuenciación de ADN se realizó en ambas cadenas utilizando series de cebadores de oligonucleótidos y subclones. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida fueron sometidas a búsqueda de homología en las bases de datos Genbank y PIR utilizando los programas servidores FASTA y BLAST.

Análisis de Northern blot

El ARN total fue aislado a partir de tejidos de ratón a través del método ácido guanidin ticinato-fenol-cloroformo (Anal. Biochem. 162; 156, 1987). ARN Poli (A)^{+} fue desnaturalizado mediante formaldehido y fue sometido a electroforesis en un gel 1 agarosa/0,7% formaldehído. Los ARN se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se hibridaron con sondas marcadas con ^{32}P que contenían el inserto de ADNc del clon #38 tal y como se ha descrito anteriormente.

Anticuerpos

Anticuerpos contra PYK2 fueron se obtuvieron en conejos inmunizados (HTI) mediante la proteína de fusión GST que contenía los residuos 362-647 o mediante PYK2 o mediante un péptido sintético correspondiente a los 15 aminoácidos del extremo N-terminal de PYK2. El antisuero fue revisado por inmunoprecipitación y análisis por inmunoblot, y la especificidad se confirmó por reactividad con la proteína relacionada Fak o por competición con péptidos antigénicos control.

Anticuerpos contra PYK-2 fueron desarrollados en conejos inmunizados mediante la proteína de fusión GST que contenía residuos de PYK-2 o mediante un péptido sintético correspondiente a los 15 aminoácidos del extremo N-terminal de PYK-2. Los anticuerpos son específicos contra PYK-2 y no reaccionan de forma cruzada con FAK.

Células y cultivos celulares

Las células PC12 de feocromocitoma de rata fueron cultivadas en medio modificado de Dulbecco Eagle conteniendo 10% suero de caballo, 5% suero fetal bovino, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 unidades de penicilina/ml. Células NIH3T3, 293, GP+E-86 y PA317 se hicieron crecer en en medio modificado de Dulbecco Eagle conteniendo 10% de suero bovino fetal, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 unidades de penicilina/ml.

Transfecciones e infecciones

Con la finalidad de conseguir una expresión estable en células PC12, PYK2 se subclonó en el vector retroviral pLXSN (Miller y Rosman, Biotechniques 7:980,1989). La construcción fue utilizada para transfectar células GP+E-86 utilizando reactivo de lipofectimina (GIBCO BRL). 48 horas después de la transfección, los sobrenadantes que contenían los virus fueron recogidos. Los sobrenadantes que contenían células libres conteniendo retrovirus purificados fueron añadidos a las células PC12 en presencia de polibreno (8 \mug/ml, Aldrich) durante 4 horas (MCB 12 491, 1992). 24 horas después, las células PC12 infectadas se cambiaron a un medio de crecimiento que contenía 350 \mul/mg de G418. Las colonias resistentes a G418 se aislaron de dos a tres semanas después y el nivel de expresión se determinó mediante análisis de western blot.

Líneas celulares estables de NIH3T3 que sobreexpresan PYK2 fueron establecidas por cotransfección de PYK2 subclonado en pLSV conjuntamente con pSV2neo utilizando reactivo de lipofectamina (GIBCO BRL). Después de la transfección las células se desarrollaron en medio modificado Dulbecco Eagle conteniendo 10% de suero bovino fetal y 1 mg/ml de G418. Las transfecciones transitorias en las células 293 se realizaron utilizando una técnica de fosfatasa de calcio.

Construcciones

GST-PYK2- Un fragmento de ADN de \lambda900 pares de bases correspondiente a los residuos 362-647 de PYK2 fue amplificado por PCR utilizando los siguientes cebadores de oligonucleótidos:

5' -CGGGATCCTCATCATCCATCCTAGGAAAGA- 3' (sentido) [ID. DE SEC. NO: 5]

y 5' -CGGGAATTCGTCGTAGTCCCAGCAGCGGGT- 3' (antisentido) [ID. DE SEC. NO: 6).

El producto de PCR fue digerido mediante BamHI y EcoRI y fue subclonado en un pGEX3X (Pharmacia). La expresión de la proteína de fusión GST-PYK2 fue inducida mediante IPTG 1 mM básicamente como se describe en Smith et al., (Gene 67:31, 1988). La proteína de fusión se aisló por electroelución a partir de SDS-PAGE.

PYK2- La secuencia total de ADNc de PYK2 se subclonó en los siguientes vectores de expresión de mamíferos: pLSV; corriente abajo del promotor prematuro de SV40, pLXSN-vector retroviral; corriente debajo de la repetición terminal larga Mo-MuLV; pRK5; corriente abajo del promotor de CMV.

PYK2-HA- el péptido de la hemaglutinina del virus de la gripe (YPYDVPDYAS) [ID. DE SEC. NO: 7] fue fusionado al extremo C-terminal de PYK2 utilizando los siguientes cebadores oligonucleótidos en la PCR: 5'-CA
CAATGTCTTCAAACGCCAC-3' [ID. DE SEC. NO: 8] y 5'-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATC
GTATGGGRACTCT GCAGGTGGGTGGGC CAG-3' [ID. DE SEC. NO: 9]. El fragmento amplificado fue digerido con RsrII y XbaI y se utilizó para sustituir el fragmento correspondiente de PYK2. La secuencia de nucleótidos de la construcción final fue confirmada por secuenciación de ADN.

mutante negativo de quinasa- Con la finalidad de construir un mutante negativo de quinasa, la Lys en la posición 457 fue sustituida por Ala por medio de mutagénesis dirigida (Clontech). La secuencia de oligonucleótidos fue diseñada para crear una nueva diana de restricción para NruI. La secuencia de nucleótidos del mutante fue confirmada por secuenciación de ADN. La secuencia de oligonucleótdos que se utilizó para la mutagénesis fue la que sigue: 5'-CAATGTAGCTGTCGCGACCTGCAAGAAAGAC-3' [ID. DE SEC. NO: 10] (sitio NruI - negrita, Lys-AAC sustituido a Ala-GCG subrayado).

Rak-HA- El ADNc de Rak fué subclonado en pBluescript y obtenido a partir de Bernardu Rudi (NYU medical center). El péptido hemaglutinina del virus de la gripe se fusionó con el extremo C-terminal de Rak esencialmente como se describe para PYK2. Los cebadores de oligonucleótidos que fueron utilizados en la PCR fueron: 5'-GCCAGCAGGC
CATGTCACTGG-3' [ID. DE SEC. NO: 11] y 5'-CGGAATTCTTACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGG
TAGACATCAGTTAACATTTTG-3' [ID. DE SEC. NO: 12]. El producto de PCR fue digerido con BalI y EcoRI y fue utilizado para sustituir el fragmento correspondiente al extremo C-terminal de Rak. El ADNc de Rak-HA fue subclonado en pRK5 corriente abajo del promotor DMV y fue introducido en el vector retroviral pLXSN, corriente abajo de la repetición terminal larga Mo-MuLV.

Mutagénesis In vitro

El oligonucleotido mutagénico (GAGTCAGACATCTEC-GCAGAGATTCCC) ID. DE SEQ. NO: 26 y el oligonucleótido trans GAATTCGATATCACGCGTGGCCGCCATGGC) ID. DE SEQ. NO: 27, fueron usados para convertir la tirosina en la posición 402 a fenilalanina de PYK2 utilizando un kit Clontech. Lev et al. Nature 376:737-745 (1995). La mutación se validó a través de secuenciación de ADN.

Análisis de Inmunoprecipitación e Inmunoblot

Celulas fueron lisadas utilizando un tampón de lisis conteniendo 50 mM de ácido N-2-hidroxietil-pipera-zina-N'-2-etanosulfúrico (HEPES pH 7,5), 150 mM NaCl, glicerol al 10%, Triton X-100 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, ácido etilenglicol-bis (\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, 200 \muM de ortovanadato de sodio y 100 mM fluoruro sódico. Las inmunoprecipitaciones fueron realizadas utilizando proteína A-sefarosa (Pharmacia) acoplada a anticuerpos específicos. Los inmunoprecipitados fueron lavados con solución HNTG' (tampón HEPES 20 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol 10%, Triton X-100 0,1%, fluoruro sódico 100 mM, ortovanadato de sodio 200 \muM) o sucesivamente con solución H' (Tris-HCl 50 mM pH8, NaCl 500 mM, SDS 0,1%, Triton X-100 0,2%, NaF 100 mM, ortovanadato de sódio 200 \muM) y solución L' (Tris-HCl 10 mM pH8, Triton X-100 0,1%, NaF 100 mM, ortovanadato de sodio 200 \muM).

Los inmunoprecipitados lavados se incubaron durante 5 minutos con tampón gel de muestreo a 100ºC y analizados por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida-sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE). En algunos experimentos las proteínas embebidas en el gel fueron transferidas eletroforéticamente a nitrocelulosa. El blot fue entonces bloqueado mediante TBS (Tris 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM) que contenía un 5% de leche desnatada y un 1% de ovoalbúmina. El antisuero o mAbs purificados fueron entonces añadidos en la misma solución y la incubación se desarrolló durante 1 hora a 22ºC. Para la detección los filtros fueron lavados tres veces (5 minutos por cada lavado) con TBS 0,05% Tween-20 y se dejo reaccionar durante 45 minutos a temperatura ambiente con proteína A conjugada con peroxidasa de rábano picante. El enzima fue eliminado por lavado tal y como ha sido descrito más arriba, y los filtros fueron sometidos a reacción durante 1 minuto con un reactivo quimioluminiscente (ECL, Amersham) y expuestos a una película para autoradiografía durante 1-15 minutos.

Ensayo quinasa In vitro

Este ensayo se desarrolló en inmunoprecipitados en 50 \mul HNTG (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM; glicerol 20%, Triton X-100 0,1%) conteniendo MnCl_{2}10 mM, y 5 \muCi o [mN-^{32}P]ATP durante 20 minutos a 22ºC. Las muestras fueron lavadas con soluciones de lavado H', M' y L', hervidas durante 5 minutos en tampón de muestreo y separadas por SDS-PAGE.

Aislamiento de ACK/PYK

ACK/PYK puede ser aislado como se describe en Manser et al,, Nature, 363:364-367, 1993. El análisis por comparación de la secuencia de longitud total de ACK/PYK con otras tirosina quinasas indica que no está íntimamente relacionada con ninguna de éstas, aunque tiene algunas similitudes con la quinasa de adhesión focal. Por lo tanto ACK/PYK representa una clase separada de tirosina quinasas y el aislamiento de los genes relacionados que pertenecen a la misma clase es un logro principal.

Ejemplo 1 Aislamiento de PYK-2 ADNc

Para identificar genes relacionados a la proteína tirosina quinasa ACK/PYK, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se aplicó en combinación con un cebador de oligonucleótidos degenerado basado en motivos conservados del dominio quinasa de PTKs.

Los cebadores de oligonucleótidos diseñados específicamente para un motivo N-terminal altamente conservado de PTKs con subdominio TK6 (IHRDLAARN) ID. DE SEC. NO: 13. y cebadores C-terminales ACK/PIK específicos con un subdominio TK9 (WMF-GVTLW) ID. DE SEC. NO: 14 se utilizaron. Las reacciones de amplificación con los moldes ADNc a partir de 8 fuentes diferentes dio los fragmentos de 0,2-0,9kb. Los productos de PCR se subclonaron en pBlueScript y se cribaron mediante secuenciación de ADN e hibridización en condiciones de astringencia bajas.

Se identificó un fragmento de ADNc de 210 pares de bases a partir de médula espinal de rata que está altamente relacionado con la Quinasa de Adhesión Focal (FAK). El fragmento se secuenció en las direcciones 3' y 5' y a continuación se usó como sonda para cribar genotecas de ADNc (cerebro fetal humano \lambdagt 10 y cerebro humano \lambdagt 11, 6x10^{5} clones recombinantes cada uno).

Varios clones sobrelapados diseminados de 1,5-3kb se aislaron y sus insertos ADNc se analizaron por PCR, el mapeo de restricción y secuenciación. Se escogieron dos clones (#1 y #11) para su posterior análisis y subclonación. El clon #1 contiene un inserto de 2,7kb del extremo 5' del gen, y el clon #11 contiene un inserto de 3kb del extremo 3'del gen.

Utilizando una serie de subclones y cebadores de oligonucleótidos sintetizados se determinó la secuencia de longitud total de PYK-2. El análisis de secuencia resultó en un secuencia compuesta de 3309 pares de bases de longitud que contiene una región sin traducir 5' de 104 pares de bases, una región codificante de 3021 pares de bases y una región 3' sin traducir de 184 pares de bases. El ATG que codifica el codón de inicio está precedido por cuatro codones de inicio de la traducción en todos los marcos de lectura.

El marco de lectura abierto largo codifica una proteína de 1007 aminoácidos (masa molecular prevista de 110.770d) cuya organización estructural es muy similar a FAK. La proteína PYK-2 contiene una secuencia N-terminal larga de 422 aminoácidos seguido de un dominio catalítico de tirosina quinasa. La proteína PYK-2 también contiene los motivos estructurales comunes a todos los PTKs, dos dominios ricos en prolina (19,6% y 17% prolina respectivamente) y un motivo diana de adhesión focal (FA) en el extremo C-terminal. El análisis por comparación de la secuencia de aminoácidos de PYK-2 con el FAK humano reveló una identidad del 52% entre las dos proteínas. El dominio quinasa y la secuencia FAT están íntimamente relacionadas (62% homología).

La proteína PYK-2 contiene varios sitios de unión previstos para los sustratos intracelulares. Por ejemplo, YLMV [ID. DE SEC. NO: 15] es un sitio de unión previsto para el dominio SH2 de GRB2 tirosina 879 de PYK-2. YVVV [ID. DE SEC. NO: 16] es un sitio de unión previsto para SHPTP2 - tirosina 903 de PYK-2. Hay sitios de fosforilación previstos para PKC, PKA y Ca/Calmodulina quinasa. Además, la tirosina 402 es un sitio de autofosforilación previsto PYK-2 y puede estar implicado en la unión de un dominio src SH2. Esto se basa en la homología entre la tirosina 397 de FAK que fue mapeado como un sitio de autofosforilación principal tanto in vivo e in vitro. Esta tirosina proporciona un sitio de unión de mayor afinidad para un dominio src SH2. Ambas tirosina 397 de FAK y tirosina 402 de PYK-2 se localizan en la juntura del extremo N-terminal y el dominio catalítico y están seguidas por la secuencia (Y)AEI que es muy similar al consenso del YEEI péptido de unión del dominio src SH2 de alta afinidad.

El RNA total de la medula espinal de rata se usó para preparar el ADNc utilizando la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina Molony ("Superscript", BRL) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc se amplificó mediante PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a motivos tirosina quinasa conservados de subdominios TK6 y TK9 de PYK1; (los cebadores sentido y antisentido corresponden a las secuencias de aminoácidos IHRDLAARN [ID. DE SEC. NO: 171] y WMFGVTLW [ID. DE SEC. NO: 18] respectivamente). La PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones; 1 minuto a 94ºC; 1 minuto a 50ºC y 1 minuto a 68ºC durante 35 ciclos. El DNA amplificado se subclonó y la secuencia, resultante en la identificación de una nueva tirosina quinasa llamada PYK2. una genoteca de cDNA de cerebro fetal humano \lambdagtlO (clontech) se cribó con un clon de PCR marcado con ^{32}P elaborado correspondiente a PYK2 de rata. Se aislaron cuatro clones sobrelapados, su secuencia de DNA se determinó en ambas cadenas utilizando series de cebadores de oligonucleótidos. La secuencia consenso de 314 pares de bases contiene un marco de lectura abierto simple de 3027 nucleótidos precedido por una región sin traducir 5' de 105 nucleótidos. Las comparaciones de secuencias de aminoácidos se realizaron usando, el algoritmo de Smith-Waterman MPSRCH (IntelliGenetic) en el ordenador MasPar.

La secuencia de aminoácidos deducida de PYK2 humano de los clones de ADNC se muestra en la Figura 4. El dominio tirosina quinasa se ilumina en una caja oscura. Dos dominios ricos en prolina en la región C-terminal se marcaron cuando se ponían a la sombra de la luz. Los residuos de aminoácidos están numerados en la izquierda. La comparación de las secuencias de aminoácidos del dominio catalítico de PYK2 con cuatro proteínas tirosina quinasas humanas demostraron el 61%, 43%, 40% y 41% de identidad de secuencia entre PYK2 y Fak, Fer, HER4 y Abl, respectivamente. La homología entre PYK2 y Fak se extiende más allá del dominio catalítico con un 42% y 36% de identidad de aminoácidos en las regiones N-terminal y C-terminal, respectivamente.

Ejemplo 2 Patrón de la Expresión PYK-2

PYK2 se expresa altamente en el sistema nervioso. Se examinó el patrón de expresión y la distribución en los tejidos de PYK2 por Northern blot y mediante análisis de hibridación in situ.

La distribución en los tejidos de la expresión PYK-2 se determinó mediante análisis por Northern blot. Los ARNs Poli(A) se purificaron de tejidos de ratón (hígado, pulmón, bazo, riñón, corazón, cerebro, piel, útero) y se hibrida con dos sondas diferentes correspondientes a dos regiones diferentes del gen PYK-2. Los resultados son idénticos en ambos casos. Un transcrito de 4,2-4,5 kb PYK-2 es relativamente abundante en el cerebro pero también se encuentra en menos proporción en el bazo y los riñones.

Una sección sagital de una película de autoradiografia de un cerebro adulto muestra niveles muy altos de expresión en el bulbo olfactivo (OB), hipocampo (Hi), y circunvolución dentada (DG). Se observan niveles de expresión moderados en la corteza cerebral (Cx), striatum (S), y tálamo (T). Se vieron bajos niveles de expresión en el cerebelo (Cb) y tronco cerebral (BS).

La expresión de mARN de PYK2 se determinó por análisis de Northern blot de poli(A)+ de varios tejidos humanos. El northern blot se hibridó con 3,9 kb del fragmento ^{32}P-marcado conteniendo el ADNc de PYK2 en 50% formamida a 42ºC. El ARNm del Northern blot aislado de varias secciones cerebrales humanas (amígdalas, núcleo caudado, cuerpo calloso, hipocampo, hipotálamo, sustancia negra, núcleo subtalámico y tálamo) reveló una elevada expresión en el hipocampo y amígdalas, nivel de expresión moderado en el hipotálamo, tálamo y núcleo caudal y bajos niveles de expresión en el cuerpo calloso y núcleo subtalámico.

Estos resultados son consistentes con el análisis de hibridación in situ en las secciones de cerebro de ratas el 7º día post-natal utilizando sondas anti-sentido derivadas de la secuencia PYK2 10. El análisis de hibridación in situ demuestra que el bulbo olfactivo, el hipocampo y el giro dentado exhibieron altos niveles de transcritos PYK2. Se detectaron niveles moderados de expresión de PYK2 en el striatum, corteza cerebral y tálamo y se detectaron bajos niveles de expresión en el cerebelo y tronco cerebral.

Con el fin de caracterizar la proteína PYK2, las células NIH3T3 se transfectaron con un vector de expresión mamífero que codifica la proteína PYK2 con un péptido de hemaglutanina de virus influenza tag. PYK2 se inmunoprecipitó con tanto anticuerpos anti-PYK2 como anti-HA a partir de la célula transfectada 3T3, mientras que la proteína PYK2 endógena inmunoprecipitó con anticuerpos anti-PYK2 a partir de células PC12. Estos anticuerpos precipitaron una proteína que migró en geles SDS con un peso molecular aparente de 112 25 kDa. La adición de Y-[32p]ATP para inmunoprecipitados a partir de células transfectadas con PYK2 seguidas de análisis SDS-PAGE y una autoradiografía mostró que PYK2 experimenta una fosforilación en los residuos tirosina.

La expresión de PYK-2 en diferentes líneas celulares se analizó mediante IP/IB utilizando anticuerpos anti-PYK-2 dirigidos al dominio quinasa tal como se describe previamente (GST-PYK-2). El patrón de expresión se resume en la tabla 1. Algunas de las observaciones interesantes son el cambio de mobilidad de PYK-2 tras la diferenciación de CHRF y L8057 (líneas celulares de premegacariocito 35) por TPA, elevada expresión de Fak y PYK-2 en diferentes líneas celulares; y en células XC (sarcoma de rata) PyK-2 se fosforila en tirosina.

PYK2 inmunoprecipitó a partir de células NIH3T3, células NIH3T3 que sobreexpresan PYK2-HA y células PC12. Los inmunocomplejos se lavaron y resolvieron mediante 7,5% SDS-PAGE. El inmunoblotting se realizó con anticuerpos anti-PYK2. La actividad quinasa in vitro de PYK2. Las células Cos se transfectaron transitoriamente con el vector de expresión PYK2-HA (+) o con un vector vacío (-). La proteína PYK2 inmunoprecipitó con anticuerpos anti-HA, los inmunocomplejos se lavaron y se sometieron al ensayo de la quinasa in vitro.

La hibridización in situ se realizó tal como sigue: Los cerebros de rata congelados en fresco se cortaron en un criostato en secciones de 20 mm de grosor y se montaron descongeladas en portaobjetos cubiertas de gelatina. Las secciones se fijaron en 4% de paraformaldehído en fosfato sódico 0,1 M (pH= 7,4) durante 30 minutos y se dispusieron tres veces durante 5 minutos cada una en PBS y una vez durante 10 minutos en 2 X SSC. La dos sondas se usaron en el análisis de hibridación, un oligonucleótido de 51 bases complementario a la secuencia codificante de los aminoácidos 301-317, y un oligonucleótido de 51 bases complementario a la secuencia codificante por los aminoácidos 559-575 (a partirde un producto de PCR de rata).

Los oligonucleótidos se marcaron con a-^{35}S dATP (Du Pont-New England Nuclear) usando la desoxi-nucleotidil-transferasa terminal (Boehinger Mannheim) y se purificó usando columnas de giro rápido Sephadex G-25 (Boehinger Mannheim). La actividad específica de las sondas marcadas está entre 5 x 10^{8} y 1 x 10^{9} cpm/mg. La pre-hibridación e hibridación se llevaron a cabo en un tampón conteniendo formamida desionizada 50%, 4 X SSC, 1 X solución de Denhardts, 500 ug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado, 250 ug/ml tARN de levadura, y 10% dextrano sulfato. El tejido se incubó durante 12 horas a 45ºC en una solución de hibridación conteniendo la sonda marcada (1 x 10^{6} cpm/sección) y 10 mM ditiotreitol.

Los controles de especificidad se realizaron en secciones adyacentes mediante inhibición competitiva de la hibridación de los oligonucleótidos marcados con una concentración 30 veces de oligonucleótidos sin marcar y por hibridación con sondas sentido. Tras la hibridación, las secciones se lavaron en dos cambios de 2 X SSC a temperatura ambiente durante 1 hora, 1 X SCC a 55ºC durante 30 minutos, 0,5 X SSC a 55ºC durante 30 minutos, y 0,5 X SSC a temperatura ambiente durante 15 minutos y entonces se deshidrató en 60, 80, 95; y 100% etanol. Tras secar en aire, las secciones se expusieron a una película de rayos X durante 5 días. Las secciones entonces se sumergieron en una emulsión fotográfica Ilford K.5 (Polisciences), expuesta durante 4 semanas a 4ºC, y se desarrolló usando un Kodak D-19 y unfijador rápido.

La autoradiografía de emulsión se examinó mediante microscopía de campo oscuro en un axioskop Zeiss. El péptido de hemaglutinina del virus influenza (YPYDVPDYAS) [ID. DE SEC. NO: 19] tag se añadió al extremo C-terminal de PYK2 utilizando los siguientes cebadores de oligonucleótidos en la PCR; '5-CACAATGTCTTCAAACGC
CAC'3' [ID. DE SEC. NO: 20] y '5-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGG-TACTCTG
CAGGTGGGT-GGCCAG-'3' [ID. DE SEC. NO: 21]. El fragmento amplificado se digerió con RsrII y Xbal y usado para sustituir el fragmento correspondiente de PYK2. La secuencia de nucleótidos de esta construcción se confirmó por secuenciación de ADN. El ensayo de quinasa in vitro se llevó a cabo en inmunoprecipitados en 50 \mul de HNTG (20 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 20% glicerol, 0,1% Triton X-100) conteniendo 10 mM MnCl_{2}, y 5 mCi de
[\lambda-^{32}P] ATP durante 20 minutos a 22ºC. Las muestras se lavaron con H' (50 mim Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,2% Triton X-100, 5 mM EGTA,100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico), M' (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 7,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,2% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico) y L (10 mM Tris-HCl pH 8; 0,1% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico) lavado, soluciones, hervido durante 5 minutos en el tampón de muestra y separado mediante SDS-PAGE.

Se obtuvieron anticuerpos contra PYK2 en conejos inmunizados con proteína de fusión GST conteniendo los residuos 62-647 de PYK-2. Los anticuerpos frente el virus influenza (péptido hemaglutinina) se obtuvieron de Boehringer Mannheim. El lisado de células, inmunoprecipitaciones y el inmunoblotting se realizó esencialmente tal como se describe por Lev et al. Mol.Cell.Biol. 13, 2224-2234, 1993,

Ejemplo 3 Propiedades de la proteína PYK-2

Con el fin de analizar las propiedades bioquímicas de PYK-2, el ADNc de longitud total se subclonó en los dos vectores de expresión mamíferos RK5 y pLSV. En paralelo, se construyó un vector de expresión codificando la proteína PYK-2 fusionada al péptido de la hemaglutinina del virus influenza. Esta construcción se usó para identificar la proteína utilizando anticuerpos anti-HA.

pLSV-PYK-2-HA se transfectó en células cos. La proteína se expresó a la masa molecular prevista (-116 kD) tal como se determina mediante IP e IB con anticuerpos anti-HA. La proteína es una quinasa activa tal como se determinó mediante ensayo de la quinasa in vitro utilizando ^{(\lambda32P)}ATP o un ensayo de quinasa in vitro utilizando ATP frío e inmunobloting con anticuerpos anti-fosfotirosina.

El PYK-2 ADNc clonado en pLSV se co-transfectó con pSV2neo en células PC12 y NIH3T3 con el fin de establecer líneas celulares estables. Las colonias resistentes G418 se cribaron mediante inmunoprecipitación e inmunoblotting.

Las líneas celulares NIH3T3 se establecieron para sobreexpresar la proteína PYK-2 y PYK-2-HA. En estas células PYK2 subyace la fosforilación de tirosina en respuesta a PDGF, EGF y aFGF. El nivel de fosforilación no es demasiado alto. El efecto más fuerte se obtiene por tratamiento TPA (6 \muM) tras 15 minutos de incubación a 37ºC tal como se determina mediante el análisis del curso del tiempo.

Ejemplo 4 Fosforilación de tirosina de PYK2 en respuesta a carbacol, despolarización de membrana e influjo Ca+2

La fosforilación de PYK-2 en residuos tirosina en respuesta a diferentes estímulos se analizó mediante inmunoprecipitación de PYK-2 e inmunoblotting con anticuerpos anti-fosfotirosina y viceversa.

Se usaron los siguientes tratamientos: Bradicinina, TPA, forscolina, forscolina + TPA, bradicinina + forscolina, NGF, Neuropéptido Y, Toxina del cólera, Toxina del cólera + TPA, Toxina del cólera + bradicinina, toxina pertusis, toxina pertusis + TPA, bradicinina + toxina pertusis, ionóforo de calcio A23187, bombesina.

Se obtuvieron los siguientes resultados; PYK-2 subyace a la fosforilación de tirosina en respuesta a TPA (1,6 \muM 15 minutos a 37ºC), bradicinina (1 \muM 1 minuto a 37ºC) e ionóforo de calcio A23187 (2 \muM 15 minutos a 37ºC). La forscolina aumenta la respuesta de TPA pero no proporciona ninguna señal por si misma. La toxina del cólera proporcionó señales más altas en combinación con TPA y bradicinina pero no causó la fosforilación de PYK-2 sólo. La toxina pertusis también indujo la respuesta de TPA y bradicinina pero no causó ninguna respuesta sólo. Con el fin de determinar si el efecto de la bradicinina está mediado por la vía de señalización PKC, los intentos para regular a la baja PKC por tratamiento crónico con TPA (dos veces) no proporcionó una respuesta clara. Una interpretación de estos resultados es que PKC y PKA (y puede ser Ca/calmudolina quinasa) induce la auto-fosforilación de PYK-2 en respuesta a la fosforilación ser/the. Esta interpretación se puede comprobar utilizando inhibidores específicos para PKC y PKAy mediante análisis de fosfamino-ácido.

Las células PC12 confluentes en placas de 150 mm se hicieron crecer durante 18 horas en DMEM conteniendo 0,5% de suero de caballo y 0,25% de suero fetal bovino. Las células se estimularon a 37ºC con diferentes agonistas tal como se indica, se lavó con PBS frío y se lisó en 800 ml de tampón de lisis (Lev et al., supra). Los lisados celulares se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PYK2. Siguiendo el SDS-PAGE y transfiriendo a nitrocelulosa las muestras se sometieron a inmunoblotting con anticuerpos antifosfotirosina (RC20, laboratorios de transducción) o anticuerpos anti-PYK2.

El carbacol induce la fosforilación de la tirosina de PYK2 vía la activación del receptor nicotínico de la acetilcolina. Los inmunoprecipitados de PYK2 a partir de células PC12 se sometieron a los siguientes tratamientos: muscarina (ImM) o carbacol (ImM) durante 20 seg a 37ºC. El carbacol (1 mM), DMPP (100 \muM), o carbacol tras pre-tratamiento con el antagonista muscarínico atropina (100nM) o el antagonista nicotínico mecamilamina (10 \muM) durante 5 minutos a 37ºC. La incubación con carbacol en la presencia o ausencia de EGTA (3 mM) tal como se indicó. Los inmunocomplejos se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirió a nitrocelulosa, y sondado tanto con anticuerpos anti-fosfotirosina o con anticuerpos anti-PYK2 tal como se indica. La despolarización de membrana y el iónoforo de calcio inducen la fosforilación de tirosina de PYK2. Los inmunoprecipitados de PYK2 a partir de células inactivas PC12 se sometieron a los siguientes tratamientos: Incubación con 75 mM KCl en presencia o ausencia de EGTA (3 mM), la incubación con 6 \muM del ionóforo de calcio A23187 durante 15 minutos a 37ºC. Los inmunoprecipitados se lavaron, se resolvieron mediante 7,5% SDS-PAGE y se sometió a inmunoblot con tanto anticuerpos antifosfotirosina o con anticuerpos anti-PYK2.

La activación de PYK2 por carbacol, despolarización de membrana y el influjo de Ca+2 se estudió. Desde que PYK2 se expresa altamente en el sistema nervioso central y en las células PC12, examinamos el efecto de una variedad de agonistas neuronales en el estado de fosforilación de PYK2. En estos experimentos, las células PC12 se trataron con un agonista, se lisaron y se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PYK2 seguido de análisis SDS-PAGE e inmunoblotting con anticuerpos específicos de fosfotirosina.

La estimulación de células PC12 con carbacol indujo la fosforilación fuerte de la tirosina de PYK2. Exploramos la posibilidad si la activación de ambos subtipos de receptores colinérgicos llevan a los receptores nicotínicos y muscarínicos a la fosforilación de tirosina de PYK2. El análisis farmacológico con tanto agonistas del subtipo específico, muscarina y DMPP o antagonistas de subtipo específicos, atropina y mecamilamina indicaron la activación de PYK2 mediante carbacol está mediada vía el receptor nicotínico de la acetilcolina. La fosforilación de PYK2 en respuesta a carbacol es muy rápida; 5 segundos tras la aplicación de carbacol a las células, PYK2 apareció fosforilado en los residuos tirosina. La eliminación de un extracto celular de calcio mediante EGTA bloquea completamente la fosforilación inducida por agonistas de la tirosina de PYK2, indicando el influjo de de calcio que se requiere para la activación de PYK2 inducida por carbacol.

La estimulación del receptor nicotínico de la acetilcolina induce la despolarización de membrana mediante influjo del catión vía el poro del canal iónico. Hemos por lo tanto comprobado si la despolarización de membrana inducida por una concentración alta de cloruro de potasio causará el mismo efecto en la fosforilación de tirosina de PYK2. La despolarización de las células PC12 con 75 mM KCl induce la fosforilación rápida de la tirosina de PYK2. La omisión de calcio del medio extracelular evita completamente la fosforilación de la tirosina PYK2, indicando la activación de PYK2 es debido al influjo de calcio más que a la despolarización de la membrana per se. Para además explorar tal posibilidad, examinamos el efecto del ionóforo de calcio en la activación PYK2, PYK2 se fosforila en residuos tirosina seguido de incubación con el ionóforo de calcio A23187. Estos resultados muestran la elevación del calcio intracelular en respuesta a una variedad de estímulos causa la fosforilación de la tirosina de PYK2.

La fosforilación de tirosina de PYK2 en respuesta a la activación de un receptor acoplado a una proteína G se estudió. Analizamos el efecto de bradicinina en el estado de fosforilación de PYK2. La bradicinina induce la fosforilación rápida de la tirosina de PYK2 en células PC12. Por contraposición a la estimulación de la fosforilación PYK2 en respuesta al tratamiento de carbacol o a la despolarización de membrana, el efecto de la bradicinina no estuvo influenciado por la omisión de calcio extracelular; la bradicinina indujo la fosforilación de PYK2 en ausencia de calcio extracelular o en la presencia de EGTA.

La incubación de células PC12 con forbol miristato acetato (PMA) indujo la fosforilación de la tirosina de PYK2, sugiriendo que la fosforilación de tirosina de PYK2 pudo también estar mediada por la activación de una proteína quinasa C (PKC). Para determinar si la fosforilación inducida por bradicinina de PYK2 está mediada vía PKC, las células se trataron con bradicinina o PMA seguido de una regulación a la baja de isozimas PKC sensibles a PMA mediante tratamiento prolongado con PMA. El tratamiento prolongado con PMA evitó completamente el efecto de PMA, pero tuvo sólo un efecto menor en la fosforilación estimulada por bradicinina de tirosina de PYK2. Estos resultados sugirieron que la fosforilación de la tirosina de PYK2 pudo ser inducida por mecanismos PKC-independientes y por PKC-dependientes.

Ejemplo 5 Fosforilación de RAK

Las células 293 en placas de 65 mm se transfectaron transitoriamente si el canal de potasio RAK-HA sólo, o junto con Fak, PYK2 o el mutante PYK2-quinasa negativo (PKN), tras 12 hr de transfección continua las células se hicieron crecer en DMEM conteniendo suero fetal bovino 0,3% durante 24 horas. Las células fueron también estimuladas con PMA (1,6 \muM) o con ionóforo de calcio A23187 (6 \muM) durante 15 minutos a 37ºC o se dejaron sin estimular. Las células se solubilizaron y el nivel de expresión de cada proteína se determinó mediante análisis por western blot. La proteína Rak inmunoprecipitó por anticuerpos anti-HA y su fosforilación en los residuos tirosina se analizó mediante western blot utilizando anticuerpos anti-fosfotirosina seguido de la inmunoprecipitación de las proteínas tanto con anticuerpos anti-PYK2 (para PYK2 y PKN) o con anticuerpos anti Fax para(Fak).

El nivel de expresión de cada proteína (Rak PYK2, PKN y Fak) y la fosforilación de la tirosina de Rak, PYK2, PKN y Fak se midieron. Sólo la proteína quinasa activa PYK2 fosforiló el canal de potasio. No se observó fosforilación con quinasa negativa PYK2 o con FAK.

Ejemplo 6 Fosforilación de la tirosina de PYK2 y Shc en respuesta a la activación de células PC12 por estímulos diferentes

Las células PC12 se hicieron crecer en DMEM conteniendo suero fetal bovino 0,25% y suero de caballo al 0,5% durante 18 horas antes de la estimulación. Tras la estimulación, las células se lavaron con PBS frío y se lisaron en 0,8 ml de tampón de lisis (Lev et al.,Mol.Cell.Biol, 13, 225-2234, 1993). PYK2 se inmunoprecipitó mediante anticuerpos anti-PYK2, los inmunoprecipitados se resolvieron en 7,5% SDS-PAGE y se sometieron a inmunoblot tanto con anticuerpos anti-fosfotirosina (RC20, laboratorios de transducción) o con anticuerpos anti-PYK2. Los anticuerpos contra PYK2 se obtuvieron de conejos.

La fosforilación de la tirosina de PYK2 en respuesta a diferentes estímulos se estudió. Las células inactivas PC12 fueron estimuladas a 37ºC con carbacol (1 mM, 20 seg), bradicinina (1 \muM, 1 min KCl (75 mM, 3 mm), PMA 1,6 \muM, 15 min), A23187 (6 \muM, 15min) o se dejó sin estimular (-). PYK2 se hizo inmunoprecipitar a partir de los lisados celulares con anticuerpos anti-PYK2, seguido de SDS-PAGE e inmunoblotting, con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-PYK2. La fosforilación de tirosina de Shc en respuesta a bradicinina, carbacol, PMA y otros estímulos también se midió. Las células PC12 inactivas se estimularon durante 5 min a 37ºC con bradicinina (1 \muM), carbacol (1 mM), KCl (75 mM), PMA (1,6 \muM), NGF (100 ng/ml), o se dejó sin estimular (-). Las células también se estimularon con carbacol (1 mM) o cloruro de potasio (75 mM) en la presencia de 3 mM EGTA. Las estimulaciones con DMPP (100 \muM) o muscarina (1 mM) se realizaron bajo las mismas condiciones. El curso del tiempo de la fosforilación de tirosina inducida por carbacol se realizó mediante incubación de las células con 1 mM de carbacol. Las proteínas Shc inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Shc, los inmunoprecipitados se resolvieron por SDS-PAGE (8%), se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina.

Ejemplo 7 Asociación de PYK2 con Grb2 y Sos1 en células intactas

Con el fin de explorar la posibilidad que la activación de PYK2 inducida por calcio es responsable de la fosforilación de la tirosina de Shc y activación de la vía de señalización Ras/MAPK, hemos examinado la capacidad de PYK2 para reclutar elementos reguladores corriente arriba de esta vía de señalización, tal como Shc y Grb2. Las células humanas embriónicas 293 se transfectaron transitoriamente con diferentes combinaciones de vectores de expresión para dirigir la síntesis de PYK2,a un mutante negativo de quinasa PYK2 (PKN) y la proteína adaptadora Grb2. Los resultados muestran que Grb2 está asociado directamente con PYK2 de tipo salvaje pero no con el mutante quinasa negativo. Los experimentos con proteína de fusión GST de Grb2 indica que la asociación entre Grb2 y PYK2 está mediada vía su dominio SH2. La inspección de la estructura primaria PYK2 muestra que la tyr881 está seguida por una secuencia LNV que mostró ser un sitio de unión canónico para el dominio SH2 de Grb219.

A continuación examinamos la interacción de PYK2 con el factor de liberación del nucleótido gauanina SOS I. Las células 293 de riñón embriónicas humanas se transfectaron con los vectores de expresión codificando SOS 1, PYK2 y PKIN y se sometieron a un análisis de inmunoprecipitación/inmunoblotting con anticuerpos anti Sos1 o anti-PYK2, respectivamente. El PYK2 de tipo salvaje pero no el mutante quinasa negativo (PKN) se co-inmunoprecipitaron con la proteína Sos1. Así, Grb2 se unió a Sos1 vía sus dominios SH3 y a PYK2 vía su dominio SH2 llevando al reclutamiento de Sos por la PYK2 tirosina fosforilada.

El factor de crecimiento indujo la activación del receptor de tirosina quinasa llevando a un cambio en la mobilidad electroforética de la proteína SOS. El cambio de mobilidad se mostró que fue debido a la fosforilación mediante serina y treonina quinasas que eran dependientes de la activación Ras incluyendo la MAP quinasa 11, 12, 20. La proteína SOS 1 de las células transfectadas PYKI- exhibió una mobilidad electroforética reducida en comparación con la proteína SOS 1. Este experimento muestra la sobreexpresión PYK2 que lleva a la activación de las ser/thr quinasas responsables de la fosforilación de SOS 1.

293 células se transfectaron transitoriamente con ADNcs de longitud completa de PYK2, PKN Grb2 y hSosl-HA clonada en los vectores de expresión mamífera pRK5 corriente abajo del promotor CMV, usando el método de precipitación de fosfato cálcico (Wigler et al., Cell 16, 777-785, 1979). Doce horas tras la transfección, las células se incubaron en medio conteniendo 0,2% de suero fetal bovino durante 24 horas. Las células se lisaron, se sometieron a inmunoprecipitación, se resolvieron mediante SDS-PAGE (15% para Grb2 IPS, 7,5% para PYK2 IPS) y se sometieron a inmunoblot esencialmente tal como se describe (Lev et al., Mol.Cell.Biol. 13, 2224-2234, 1993). Para el inmunoblotting se usaron anticuerpos monoclonales de ratón contra Grb2 (Laboratorios de Transducción #G16720). El mutante quinasa negativo de PYK2 se construyó tal como se describe. Un vector de expresión mamífero que codifica hSos1-HA se construyó tal como se describe (Aronheim et al., Cell. 78, 949-961,1994).

Las células 293 de riñón embriónico humano se transfectaron transitoriamente con diferentes combinaciones de vectores de expresión mamíferos que dirigieron la síntesis de Grb2, PYK2 y a un mutante de punto PYK2 quinasa negativo (PKN). Las células se solubilizaron e inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Grb2 o anti-PYK2. Los inmunocomplejos se lavaron, se resolvieron con SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunoblot con tanto anticuerpos anti-PYK2 o anti-Grb2. El nivel de expresión de Grb2 en cada célula se determinó por el inmunoblotting de los lisados totales de células con anticuerpos anti-Grb2.

Las células 293 de riñón embriónico humano se transfectaron temporalmente con vectores de expresión mamíferos codificando hsos1-HA, hSos1-HA junto con PYK2 o hSos1-HA junto con PKN. Hsos1 se inmunoprecipitó con anticuerpos anti HA a partir de cada línea celular, y la presencia de PYK2 en los inmunocomplejos se determinó por inmunobloting con anticuerpos anti-PYK2. Los niveles de expresión de hsosl, PYK2 y PKN se determinaron mediante análisis por inmunoblot de lisados de células totales, con anticuerpos anti-HA o anti PYK2.

Ejemplo 8 PYK2 induce la fosforilación de tirosina de Shc y su asociación con Grb2

El receptor EGF activado es capaz de reclutar directamente e indirectamente Grb2. Hemos investigado por lo tanto, si PYK2 puede inducir la fosforilación de Shc de la tirosina de Shc y su asociación con Grb2. Las proteínas Shc inmunoprecipitaron con anticuerpos anti Shc a partir de Shc, a partir de Shc y PYK2, o a partir de células expresando Shc y PKIN. Las muestras se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometió a inmunoblot con anti-fosfo-tirosina o anticuerpos anti-Grb2. La fosforilación dramática de tirosina de Shc en células para sobreexpresar PYK2. Además, varias proteínas conteniendo fosfotirosina se encontraron en los inmunoprecipitados Shc a partir de células que sobreexpresan PYK2. Se observaron resultados similares expresando proteínas Shc endógenas que se transfectaron con ADNc de PYK2 y se sometieron a análisis por inmunoprecipitación con anticuerpos anti Shc. El análisis por inmunoblot con anticuerpos Grb2 de los inmunoprecipitados Shc indicaron que Grb2 estaba asociado con tirosina fosforilada Shc en células que sobreexpresaban PYK2. Por lo tanto concluimos que la tirosina fosforilada PYK2 puede directamente e indirectamente reclutar Grb2 vía la fosforilación de la tirosina de Shc revelando al menos dos vías alternativas para la activación inducida por PYK2 de la vía de señalización Ras.

La fosforilación de la tirosina de Shc en células que co-expresan YK2 fue estándar. Las células que expresan Shc sólo o co-expresan Shc junto con tanto PYK2 o PKN se lisaron y sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Shc o suero pro-inmune (P.I.). Los inmunocomplejos se lavaron, se hicieron correr en un gel SDS y se sometieron a inmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina. Las proteínas Shc (46,52 y 66 kDa) se identificaron.

PYK2 induce la asociación de Shc con Grb2. Las proteínas Shc inmunoprecipitaron a partir de cada línea celular usando anticuerpos anti-Shc. Como control, los lisados de células que co-expresan PYK2 y Shc se sometieron a inmunoprecipitación con suero pro-inmune (P.I.). La presencia de Grb2 en los inmunocomplejos se determinó mediante inmunoblotting con anticuerpos anti-Grb2.

El nivel de expresión de PYK2, PKN y Shc en cada línea celular se determinó mediante análisis por inmunoblot de los lisados de células totales con anticuerpos específicos tal como se indica.

Ejemplo 9 Activación de la MAP quinasa en células PC12 por bradicinina, carbacol y otros estímulos

Los experimentos presentados a partir de aquí muestran el mismo estímulo que induce la activación de PYK2 que induce la fosforilación de la tirosina de Shc. A continuación examinamos la capacidad de estos agentes para inducir la activación de las quinasas en células PC12. Las células inactivas PC12 se incubaron con una variedad de estímulos. Los lisados de células estimuladas se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-MAP quinasa seguido de inmunoblotting, con anticuerpos fosfotirosina. La proteína básica mielina (MBP) se utilizó como sustrato para determinar la activación MAP quinasa. La adición de varios ligandos a las células PC12 indujo un perfil similar de fosforilación de tirosina y activación de MAP quinasa en estas células.

Desde que se observó la activación de la MAP quinasa en respuesta a estímulos para inducir la fosforilación PYK2, examinamos la posibilidad si la sobreexpresión PYK2 puede inducir la actividad MAP quinasa. Las células 293 de riñón embriónico humano se transfectaron transitoriamente con concentraciones crecientes de vectores de expresión mamíferos que dirigen la síntesis de PYK2. Las células se hicieron crecer durante 24 horas en presencia de 0,2% suero, las proteínas MAPK 1,2 inmunoprecipitaron, se lavaron y se sometieron al ensayo de fosforilación MPB. Los resultados presentados en la figura 4b muestra que la sobreexpresión PYK2 indujo la fosforilación de MPB de una manera dependiente de la concentración

La cuantificación de estos resultados muestra que la actividad MAP quinasa fue aproximadamente tres veces mayor en las células que expresaban los niveles más altos de PYK2 en comparación con células transfectadas falsamente.

Las células 293 se transfectaron transitoriamente con vectores de expresión mamíferos para Shc sólo, Shc junto con PYK2, o Shc junto con PKN. Las células PC12 se cultivaron durante 18 horas tal como se describe. Las células se estimularon durante 5 minutos a 37ºC con los estímulos indicados, se lisaron y se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos antiMAPK 1,2 (Santa Cruz Biotechnology, #c-14 y #c-16). Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces con tampón de lisis (Lev et al., Mol.Cell.Biol, 13, 2224-2234, 1993) y una vez con tampón Tris conteniendo 10 mM Tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl, 1 mM Na-vanadato y 5 mM benzamidina. Los inmunocomplejos se resuspendieron en 40 \mul de tampón MAP quinasa conteniendo 30 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM MgCl_{2}, 2 mM MnCl_{2}, 15 \mug MBP, 10 \muM ATP y 5 \muCi\tau-[^{32}P]ATP (Amersham). Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 30ºC y las reacciones se pararon mediante la adición de SDS-tampón de muestra. Las muestras se resolvieron en 15% SDS-PAGE y se analizaron por autoradiografía. Las células 293 de riñón embriónicas humanas se transfectaron temporalmente con concentraciones crecientes de pRK5-PYK2 ADN (0,5 \mug). Doce horas tras la transfección, las células se hicieron crecer en medio que contenía 0,2% de suero durante 24 horas. Las células se lisaron, inmunoprecipitaron con anticuerpos MAPK 1,2 y se sometieron al ensayo de fosforilación MBP tal como se describe anterior-
mente.

Las células PC12 inactivas se estimularon durante 5 minutos a 37ºC con bradicinina (1 \muM), carbacol (1 mM), KCl (75 mM), PMA (1,6 \muM), NGF (100 mg/ml), o se dejaron sin estimular (-). Las células se lisaron y MAPK 1,2 se hicieron inmunoprecipitar con anticuerpos específicos. Los inmunocomplejos se lavaron y también se resolvieron por SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se sometió a un inmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina, o se sometieron al ensayo de fosforilación de la proteína básica de mielina (MBP).

La activación de MAP quinasa por sobre-expresión de PYK2. Las células 293 de riñón embriónico humano se transfectaron transitoriamente con concentraciones crecientes de un vector de expresión mamífero que dirige la síntesis de PYK2. Las proteínas MAPK 1,2 proteínas inmunoprecipitaron a partir de cada línea celular y los inmunocomplejos se lavaron y se sometieron al ensayo de fosforilación del MBP. La cuantificación de la actividad MAP quinasa de cada línea celular se determinó mediante un fosforimager y software ImagQuant (Molecular Dinamics, Incorporaed). La actividad MAPK en las células transfectadas se compara con la actividad detectada en las células transfectadas falsamente control.

Ejemplo 10 Estimulación con bradicinina de las células PC12 induce la fosforilación de tirosina de PYK2

La estimulación de ligando, inmunoprecipitaciones e inmunoblotting se realizaron. El tratamiento crónico con PMA se realizó mediante incubación de las células con 100 nM de PMA durante 12 horas a 37ºC.

El curso del tiempo de la bradicinina induce la fosforilación de la tirosina de PYK2. Las células inactivas PC12 se incubaron a 37ºC con 1 \muM bradicinina durante el periodo de tiempo indicado. PYK2 inmunoprecipitó a partir de células sin tratar (-) o tratadas, los inmunocomplejos se lavaron, se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, y se sondaron tanto con anticuerpos anti-fosfotirosina como anti-PYK2.

Las células inactivas PC12 se incuban con 1 \muM bradicinina (1 minuto a 37ºC) o con PMA (1,6 \muM, 15 minutos a 37ºC) en presencia o ausencia de CaCl o EGTA (3 \muM) tal como se indique. En algunos casos las células se pre-trataron con 100 nM PMA durante 12 h. PYK2 se hizo inmunoprecipitar a partir de células estimuladas o sin estimular (-) y analizadas mediante análisis inmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina o anti-PYK2.

Ejemplo 11 Estimulación de la fosforilación de tirosina del canal de potasio Kv1.2 en respuesta a la activación PYK2

Examinamos la posibilidad de si PYK2 puede fosforilar la tirosina del Canal Kv1.2 y regular su función. Con el fin de ensayar esta posibilidad expresamos en células 293 la proteína Kv1.2, Kv1.2 junto con PYK2, y como control Kv1.2 con un mutante quinasa negativo PYK2 (PKN) o con la proteína tirosina quinasa Fak. Las células se hicieron crecer durante 24 horas en un medio que contiene 0,2% de suero y entonces se estimuló con PMA (1,6 \muM), ionóforo de calcio (6 \muM), o se dejó sin estimular.

El análisis por Inmunoblotting con anticuerpos fosfotirosina seguido de inmunoprecipitación de PYK2, PKN y Fak mediante anticuerpos específicos. PYK2 y Fak se fosforilaron en tirosina aún en células sin estimular y tratamiento con PMA indujo la fosforilación de tirosina mientras el tratamiento con ionóforo de calcio indujo una respuesta débil. El nivel de expresión del mutante quinasa negativo de PYK2 (PKN) fue similar a la expresión de tipo salvaje de PYK2 o FAK. No obstante, tal como se espera, PKN no se encontró que fosforilara a los residuos tirosina. A continuación analizamos la fosforilación de la tirosina del Canal Kv1.2 en cada línea celular.

Nosotros hemos añadido a la construcción de expresión ADNc de Kv1.2 una etiqueta HA y se determinó el nivel de expresión de Kv1.2 mediante un análisis por inmunoblot con anticuerpos anti-HA. Una cantidad similar de proteína Kv1.2 se expresó en las líneas celulares transfectadas. La proteína Kv1.2 inmunoprecipitó a partir de las células sin estimular así como a partir de células estimuladas PMA o ionóforo de calcio. Los inmunoprecipitados se resolvieron mediante SDS-PAGE y se sometieron a inmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina. La fosforilación de Kv1.2 en los residuos tirosina se observó sólo en las células que co-expresan PYK2. Además, la fosforilación de la tirosina de Kvl.2 se potenció mediante tratamientos con PMA o ionóforo de calcio indicando que la activación de PYK2 se requiere para PYK2 en la fosforilación de la tirosina del canal de potasio.

Las células 293 de riñón embriónico humano se transfectaron transitoriamente con diferentes combinaciones de vectores de expresión mamíferos que dirigen la síntesis de Kv1.2-HA, PYKZ, una quinasa negativa PYK2 (PKN) o la proteína tirosina quinasa Fak. Las células se hicieron crecer durante 24 h en la presencia de suero 0,2% y entonces se estimularon con PMA (1,6 \muM, 10 minutos a 37ºC), el ionóforo de calcio A23187 (6 \muM, 10 minutos a 37ºC) o se dejó sin estimular (-). La fosforilación de la tirosina de cada proteína se analizó siguiendo la inmunoprecipitación e inmunoblotting con anticuerpos anti-fosfotirosina. La expresión de cada proteína se determinó mediante análisis por inmunoblot del lisado de células totales de cada transfección con anticuerpos anti-PIKZ, anti-HA o anti-Fak.

La fosforilación de la tirosina de Kv1.2 se analizó mediante inmunoprecipitación de la proteína Kv1.2-HA de cada línea celular con anticuerpos anti-HA, seguido de análisis por inmunoblot con anticuerpos anti-fosfotirosina. Las células 293 se transfectaron mediante la técnica del fosfato de calcio tal como se describe (Wigier et al., Cell. 16, 777-785, 2979). El péptido de hemaglutinina del virus influenza (YPYDVPDYAS) [ID. DE SEC. NO: 22] tag se añadió al extremo C-terminal y del cDNA de Kv1.2 utilizando los siguientes cebadores de oligonucleótidos en la PCR;

'5GCCAGCAGGCCATGTCACTGG-3' [ID. de SEC. Nº23] y

'5CGGAATTCTTACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGGTAGACATCAGTTAAC-ATTTTG-'3 [ID. DE SEC. NO: 24]. El producto de PCR se digerió con BAIT y EcoR1 y se usó para sustituir el correspondiente fragmento al extremo C-terminal del Kv1.2 ADNc. El Kv1.2-HA ADNc se subclonó en pRK5 corriente abajo del promotor CMV.

Un mutante de quinasa negativo de PYK2 (PKN) se construyó mediante reemplazo de Lys475 con un residuo Ala utilizando un kit de mutagénesis dirigida a un sitio (Clontech). La secuencia de oligonucleótidos se diseñó para crear un nuevo sitio de restricción NruI. La secuencia de nucleótidos del mutante se confirmó mediante secuenciación del ADN. La secuencia de oligonucleótidos que se usó para la mutagénesis es:

'5-CAATGTAGCTGTCGCGACCTGCAAGAAAGAC-3' [ID. DE SEC. NO: 25] (sitio Nrul- negrita, Lys-AAC sustituido a Ala-GCG subrayado). Los ADNcs de longitud total de PYK2, PKN y Fak se subclonaron en los vectores de expresión mamífera pRK5 corriente abajo del promotor CMV.

Ejemplo 12 Supresión de la acción del canal de potasio en los oocitos de rana mediante expresión PYK2 y tratamiento PMA

Los transcritos de ARN capados in vitro de Kv1.2, PYK2 y PKN se sintetizaron a partir de moldes de DNA de plásmidos linearizados utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE (Ambion), siguiendo el protocolo del fabricante. Los productos de la reacción de transcripción (cARNs) se diluyeron en agua libre de ARNasa y se conservó a -70ºC. La expresión de ARNs se hizo mediante inyección de 50 nl de ARN en oocitos desfoliculados en estado V y VI de Xenopus laevis (Iverson et al.; J.Neurosc, 10, 2903-2916, 1990). Los oocitos inyectados se incubaron durante 2-3 días a 20ºC en una solución L15 (dilución en medio 1:2 de Gibco's Leibovitz L15 en H_{2}O, con 50 U/ml de nistatina, 0,1 mg/ml de gentamicina, tampón 30 mM HEPES, pH 7,3-7,4, se filtró a través de una membrana 0,45 mm). El análisis y grabado electrofisiológico. Las corrientes iónicas se grabaron con una prensa de voltaje de dos microelectródos tal como se describe (Iverson et al., supra). La corriente se filtró por un paso bajo de KHz usando un filtro de 8-polos Bessel y se almacenó en una microcomputadora 80286 usando el sistema de adquisición pClamp (Axon Instruments). Los datos se analizaron con programas de ajustes de la prensa del sistema pClamp (Axon Instruments). Todas las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente (20-230ºC). La cámara de grabación se inundó continuamente con la solución de grabación. Para evitar la contaminación del oocito por corrientes de Cl activadas por Ca+^{2} se usó una solución de grabación de baja corriente Cl^{-} (96 mM Na+, glutamato, 2 mM K+ glutamato, 0,5 mM CaCl_{2}, 5 mM MgCl_{2}, 5 mM tampón HEPES). Las corrientes Kt se elucidaronen pasos despolarizantes desde -100 a +40 mv en incrementos de 10 mV cada 15 segundos. Las corrientes Kv1.2 a partir de los oocitos microinyectados con tanto Kv1.2 mARN, Kv1.2 y PYK2 mARNs, o Kv1.2 y un mutante quinasa negativo de PYK2 mARNs (PKN). Las corrientes se elucidaron en respuesta a pasos despolarizantes desde incrementos -100 a + 30 mV desde un potencial alcanzado de -110 mV. Las trazas representativas de canales Kv1.2 antes y después de la aplicación de 100 nM de PMA en el tiempo anunciado (8 y 20 minutos) en la misma célula.

La supresión de las corriente Kv1.2 en respuesta a PMA se bloquea mediante el mutante quinasa negativo PYK2 (PKN). La inhibición de las corrientes Kv1.2 en un oocito microinyectado con mARN Kv1.2, antes y 25 minutos después del tratamiento con PMA a una concentración de 50 nM o 100 nM. Las grabaciones de expresión de un oocito Kv1.2 y PYK2 o Kv1.2 y un mutante quinasa negativo de PYK2 bajo las mismas condiciones tal como se describen anteriormente. El mismo protocolo se utilizó en ambos experimentos.

Preguntamos si la estimulación de PYK2 puede suprimir las corrientes Kv1.2. Exploramos el efecto de la expresión PYK2, en las corrientes exhibidas por la expresión Kv1.2 en los oocitos de Xenopus. Los oocitos del estadio V se microinyectaron tanto con transcritos Kv1.2 o con Kv1.2 junto con PYK2 o PKN mARNs. Tras dos o tres días de incubación a 20ºC, las corrientes macroscópicas exhibidas por los oocitos se grabaron con una prensa de voltaje de dos microelectródos tal como se describe (Iverson et al., J. Neurosc, 10, 2903-2916, 1990). Las corrientes rectificadoras exteriores se grabaron tras la despolarización de la membrana anterior -40mV, indicando que un canal funcional Kv1.2 se expresa en los oocitos. La expresión de Kv1.2, PYK2 y PKN en los oocitos de rana se confirmó mediante análisis del inmunoblot con anticuerpos anti-HA o anti-PYK2.

Examinamos el efecto de la expresión PYK2 en corrientes Kv1.2 en los oocitos en ausencia o presencia de PMA. También examinamos el efecto del mutante quinasa negativo PKN en la supresión inducida por PMA de corriente Kv 1.2 mediada por la proteína endógena tirosina quinasa. El tratamiento de los oocitos con PMA causó la inhibición de las corrientes Kv1.2. Tal como se muestra previamente, la inhibición de las corrientes se desarrolló gradualmente tras la aplicación de PMA alcanzando el 80-90% de inhibición tras 20 minutos de incubación (Huang et al., Cell. 75, 1145-1156, 1993). Además, la tasa de bloqueo del canal se encontró que era dependiente de la concentración de PMA aplicado. La coexpresión de PYK2 resultó en la aceleración de la inhibición de las corrientes Kv1.2. La aceleración significativa de la inhibición de corriente se observó a cada concentración de PMA ensayada. Por ejemplo, 8 minutos tras la adición de 100 nM PMA, se observó un 25% de inhibición de la corriente externa en los oocitos expresando Kv1.2 sólo como compartido con el 95% de inhibición observada en los oocitoscoexpresando las proteínas Kv1.2 y PYK2.

La inhibición de la corriente mediante tratamiento con PMA en la ausencia o presencia de la expresión PYK2 no resultó en cambios en la dependencia de voltaje o cinética de las corrientes restantes. La coexpresión de Kv1.2 junto con el mutante quinasa negativo de PYK2 (PKN) lleva a la casi completa inhibición de PMA inducida por el bloqueo de los canales de potasio. Es posible que la proteína endógena tirosina quinasa activada por PMA que es responsable de la supresión de las corrientes Kv1.2 en los oocitos representan un homólogo de xenopus de PYK2 o una proteína íntimamente relacionada tirosina quinasa que puede estar afectada por un mutante interferente dominante de PYK2.

Ejemplo 13 PYK2 se fosforila tras la estimulación de células con LPA y bradicinina

Hemos demostrado ahora que el ácido lisofosfatídico (LPA) y bradicinina inducen de hecho la fosforilación de la tirosina de PYK2 así como la formación de complejos entre PYK2 y Src activado. Esta observación proporciona nuevas estrategias para cribar los moduladores de las vías de señalización de PYK2. Además, la fosforilación de tirosina de PYK2 conduce a la unión del dominio SH2 de Src a la tirosina en la posición 402 de PYK2 y la activación de Src, proporcionando así otra información útil en el diseño racional de tales moduladores de la vía de señalización PYK2. La sobreexpresión transitoria de un mutante interferente dominante de PYK2 o la proteína tirosina quinasa Csk reduce la activación inducida mediante LPA o bradicinina de la MAP quinasa. La activación de la MAP quinasa inducida por LPA o bradicinina también fue inhibida mediante la sobre-expresión de mutantes interferentes dominantes de Grb2 y Sos. Así, sin desear estar unido a ninguna teoría de la invención en particular, proponemos que PYK2 actúe en concierto con Src a la unión a receptores acoplados a Gi- y Gq- con Grb2 y Sos para activar la vía de señalización MAP quinasa en las células PC12.

Las células PC12 se estimularon con ácido lisofosfatídico (LPA) y los lisados de células estimuladas o no estimuladas se sometieron a la inmunoprecipitación con anticuerpos contra PYK2 seguido de inmunoblotting con anticuerpos contra la fosfotirosina. El experimento muestra la fosforilación rápida de tirosina de PYK2 en respuesta a la estimulación con LPA o bradicinina. El pre-tratamiento con células PC12 con la fosforilación significativamente inhibida por la toxina pertussis de la tirosina de PYK2 en respuesta a la estimulación con LPA. Sin embargo, la bradicinina o el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) que indujo la activación de PYK2 no se vieron afectadas por el pre-tratamiento con toxina pertussis. La eliminación de calcio extracelular mediante la adición de EGTA al medio no afectó la fosforilación PYK2 inducida por LPA. Estos resultados indicaron que la activación de PYK2 inducida por LPA es dependiente, al menos en parte, en una vía dependiente de Gi sensible a la toxina pertussis en las células PC12.

Las células PC12 se estimularon con LPA (2,5 mM) o bradicinina (1 mM) durante 3 minutos a 37ºC y se lisaron. PYK2 inmunoprecipitó con anticuerpos contra PYK2 y se sometieron a inmunoblot con anticuerpos contra la fosfotirosina (anti-pTyr) o contra PYK2.

Las células PC12 se dejaron sin tratar (-) o se incubaron con la toxina pertussis (PTx) 100 ng/ml durante 20 horas y entonces se estimuló con LPA (2,5 mM), bradicinina (1 mM) durante 3 minutos a 37ºC o con PMA (1 mM) durante 10 minutos a 37ºC. Además, las células se estimularon con LPA en medio conteniendo 3 mM de EGTA. Hemos analizado la fosforilación del inmunoprecipitado PYK2 por inmunoblotting con anticuerpos anti-pTyr o anti-PYK2. LPA, PMA, PMA, y bradicinina proporcionó aumentos de 4, 12, y 9 veces en el estado de fosforilación de PYK2 en relación a las células sin estimular.

Las células PC12 se transfectaron transitoriamente con pRK5, mutante quinasa negativo PYK2 (PKM) y Csk. La expresión de Csk se determinó mediante blotting del total de lisados celulares con anticuerpos anti-Csk, las células PC12 se transfectaron de forma falsa (pRK5), o se transfectaron con el receptor truncado EGF, PKM, Csk, o con ambos PKM y Csk, se estimularon con LPA o bradicinina durante 3 min, se lisaron y se determinó la actividad MAP quinasa. La eficiencia de la transfección se determinó usando un transgen de la \beta-Galactosidasa. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes realizados por duplicado. La actividad MAP quinasa en células PC12 sobreexpresando los mutantes interferentes dominantes de Grb2 y Sos también se comprobó. Las células se estimularon con LPA o bradicinina y se determinó la actividad MAP quinasa. El experimento se repitió tres veces.

Ejemplo 14 PYK2 y Src Asociados tras la estimulación de las células con LPA y Bradicinina

Hemos demostrado que la activación de PYK2 mediante la elevación de la concentración de calcio intracelular puede llevar a la activación de la vía de señalización de la MAP quinasa en las células PC12. La familia Src de proteínas tirosina quinasas está activada en respuesta a la estimulación de una variedad de receptores acoplados a proteína G y han demostrado ser necesarias para la unión a receptores acoplados a Gi y Gq con la activación de la MAP quinasa. Sadoshima & Izumo, EMBO J 15:775-787 (1996); Wan et al., Nature 380: 541-544 (1996). El receptor EGF y erbB2 también se implicaron en la activación de la MAP quinasa inducida mediante LPA y otros agonistas del receptor acoplado a proteína G. Daub et al., Naure 379:557-564 (1996). Hemos comprobado si LPA y bradicinina pueden activar Src y el receptor EGF en las células PC12. La estimulación de las células PC12 mediante LPA o bradicinina conduce a un aumento aproximadamente de tres o cuatro veces en la actividad Src quinasa, mientras no eramos capaces de inducir la activación inducida por LPA del receptor EGF en células PC12.

Examinamos la posibilidad de asociación entre las dos proteínas tirosina quinasas PYK2 y Src en respuesta a la estimulación con LPA o bradicinina. Los lisados de las células estimuladas o sin estimular se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra Src seguido de inmunoblotting con anticuerpos contra PYK2, contra anticuerpos Src o anti-pY416^{src} que reconocen específicamente activado Src. Liu et al., Oncogene 8:1119-1126 (1993). Este experimento demuestra que PYK2 forma un complejo con Src activado en respuesta a la estimulación con LPA o bradicinina. Además, el dominio SH2 de Src unido a PYK2 activado sugiere que la unión de Src a PYK2 está mediada por métodos de su dominio SH2 en vez de conducir a su activación.

Para analizar además la interacción entre Src y PYK2, realizamos un experimento de unión in vitro usando una proteína de fusión GST conteniendo el dominio SH2 de Src con PYK2 de tipo salvaje, una forma mutante de PYK2 en que la tirosina en la posición 402 se reemplazó mediante un residuo fenilalanina (PYK2-Y402F) o un mutante quinasa negativo de PYK2. Lev et al., 1995, Nautre 376:737-745. Una proteína de fusión GST conteniendo el dominio SH2 de Src unido a la tirosina fosforilada PYK2 pero no al mutante PYK2-Y402F o PKM. La tirosina en posición 402 representa el sitio principal de autofosforilación de PYK2 y se encuentra en la secuencia YAEI, un sitio de unión consenso para el dominio SH2 de Src quinasas Songyang et al., Cell 72:76-778 (1993).

Las células PC12 se dejaron sin tratar (-) o se estimularon con LPA (2,5 mM) o bradicinina (1 mM) durante 3 minutos a 37ºC. Src inmunoprecipitó y se sometió a inmunoblot con anticuerpos contra Src, anticuerpos anti-pY416^{src} o anticuerpos contra PK2.

Los mismos lisados se mezclaron con una proteína de fusión GST conteniendo el dominio SH2 de Src y las proteínas unidas se analizaron mediante inmunoblot con anticuerpos contra PYK2.

Las células 293T se transfectaron transitoriamente con pRK5, PYK2; PYK2-Y402F y PKM. Los lisados celulares totales se analizaron mediante inmunoblot con anticuerpos anti-pTyr o anti-PYK2. Los mismos lisados se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos contra src e inmunoblotting con anticuerpos anti-pY416^{src} o anticuerpos contra Src. La actividad src quinasa se cuantificó como un incremento en la fosforilación pY416src y se presentó como la media +/-S.D. a partir de cuatro experimentos individuales.

Los efectos de coexpresión de PYK2 y Csk en la fosforilación de PYK2 de tirosina y la activación MAP quinasa también se evaluaron. pRKS, PYK2, PYK2-Y402F o PYK2 más concentraciones crecientes de Csk se transfectaron transitoriamente en células 293T. Los lisados celulares totales se analizaron mediante inmunoblot con anticuerpos contra la fosfotirosina, PYK2 y Csk. Una fosforilación débil de la tirosina de PYK2 Y402F se observó tras una larga exposición. Los mismos lisados se usaron para determinar la activación MAP quinasa. Este experimento se repitió tres veces. Se determinó así PKY2 y Src estaban implicados en la activación de la MAP quinasa.

Ejemplo 15 PYK2 y Src activan MAPK

Además examinamos el estado de fosforilación de Src y la activación de la MAP quinasa tras la transfección de PYK2 o PYK2-Y402F en células 293T de riñón embriónico humano. La sobreexpresión de PYK2 conduce a aproximadamente una estimulación de cuatro veces la actividad endógena Src en estas células. Sin embargo, la sobreexpresión de PYK2-Y402F o un mutante negativo de la quinasa de PYK2 (PKM) no afectó la actividad Src en el mismo ensayo. Estos experimentos demostraron la autofosforilación de PYK2 en Tyr402 conducía a la unión del dominio SH2 de Src y la consiguiente activación Src.

A continuación sobreexpresamos PYK2, PYK2-Y402F o PKM con cantidades crecientes de Csk, una proteína tirosina quinasa que regula negativamente Src (Nada et al., Nature 351: 69-72 (1991), y se ensayó si la activación de Src inducida por PYK2 contribuye a la fosforilación PYK2 de tirosina y la activación de la MAP quinasa inducida por PYK2 en células 293T. La fosforilación de tirosina de PYK2 y la activación de la MAP quinasa inducida por PYK2, normalmente observada a partir de las células que sobreexpresan PYK2, fueron significativamente reducidas en la presencia de concentraciones crecientes de Csk. Lev et al., Nature 376: 737-745 (1995). Además, la activación MAP quinasa se redujo principalmente en células que sobreexpresaban PYK2-Y402F en comparación con la activación de MAP quinasa inducida mediante la expresión de tipo salvaje de PYK2. PYK2-Y402F es fosforilado pobremente en la tirosina tras la sobreexpresión. Además la sobreexpresión de PYK2-Y402F no activó Src en estos experimentos. Estos experimentos demuestran que la fosforilación PYK2 de tirosina y la activación de MAP quinasa inducida por PYK2 son dependientes, al menos en parte, de la actividad Src quinasa estimulada por la unión a tyr402 autofosforilado en PYK2.

A continuación examinamos el papel de PYK2 en la activación de MAP quinasa inducida por LPA o bradicininautilizando el mutante negativo quinasa interferente dominante de PYK2. Lev et al, Nature 376:737-745 (1995); Tokiwa et al., Science 273: 792-794 (1996). No fuimos capaces de generar líneas celulares PC12 capaces de sobreexpresar PKM y por lo tanto usar una estrategia de sobreexpresión transitoria. La sobreexpresión de PKM en células PC12 inhibió fuertamente la activación MAP quinasa mediante LPA o bradicinina. El papel de Src en la activación de la MAP quinasa inducida por LPA o bradicinina fue además ensayado mediante sobreexpresión transitoria de Csk. Cuando Csk se sobreexpresó en células PC12 se observó una fuerte reducción en la MAP quinasa inducida por LPA o bradicinina. En células que se co-transfectaron con ambos PKM y Csk, la activación de MAP quinasa inducida por LPA o bradicinina se inhibió profundamente. Sin embargo, la sobreexpresión de PKM o Csk no afectó a la activación de la MAP quinasa inducida por el factor de crecimiento nervioso o EGF en PC12.

Cogidos conjuntamente, estos experimentos revelan un papel específico para PYK2 y Src en la unión al receptor acoplado a proteína G, pero no los receptores de los factores de crecimiento, con la activación MAP quinasa.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCTOS Y MÉTODOS RELACIONADOS CON PYK2

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Lyon & Lyon

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 633 West Fift Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Los Ángeles

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 90071

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5'', 1,44 Mb almacenamiento

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: IBM P.C. DOS (Version 5,0)

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WordPerfect (Version 5,1)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE DEPÓSITO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE DEPÓSITO:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE LEGAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE:Warburg, Richard J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32,327

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 211/121

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (213) 489-1600

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (213) 955-0440

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 67-3510

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1009

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 1

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3416

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLÉCULA: nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:3

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCATCCT ATCATCCATC CTAGGAAAGA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGAATTCG TCGTAGTCCC AGCAGCGGGT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAATGTCT TCAAACGCCA C

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAATGTAGCT GTCGCGACCT GCAAGAAAGA C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGCAGGC CATGTCACTG G

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAATTCTT ACGATGCGTA GTCAGGGACA TCGTATGGGT AGACATCAGT TAACATTTTG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 16

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 17

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAATGTCT TCAAACGCCA C

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 21

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 22

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGCAGGC CATGTCACTG G

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAATTCTT ACGATGCGTA GTCAGGGACA TCGTATGGGT AGACATCAGT TAACATTTTG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAATGTAGCT GTCGCGACCT GCAAGAAAGA C

\hfill

31

Claims (8)

1. Un método de cribaje para un compuesto capaz de unirse al polipéptido PYK2, en donde dicho compuesto es una indolinona, comprendiendo los pasos de:

(a)

incubar dicho compuesto con dicho polipéptido PYK2, y

(b)

detectar la presencia de dicho compuesto unido a dicho polipéptido PYK2.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho compuesto inhibe una actividad de fosforilación de dicho polipéptido PYK2.

3. Un método de cribaje de agentes potenciales útiles para el tratamiento de una enfermedad o condición caracterizada por una anormalidad en una vía de transducción de la señal, en donde dicha vía de transducción de la señal incluye una interacción entre un polipéptido PYK2 y un patrón de unión natural, comprendiendo el paso de ensayar dichos agentes potenciales para aquellos capaces de promover o romper dicha interacción como una indicación de un agente útil, en donde dicho patrón de unión natural es Src, y en donde dicha vía implica un receptor acoplado a proteína G pero no implica un receptor de factor de crecimiento, y en donde dichos agentes potenciales son una o más indolinonas.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha indolinona es oxindolinona.

5. Un método de cribaje de moduladores de las vías de señalización de PYK2 comprendiendo los pasos de:

(a)

mezclar dos o más componentes seleccionados del grupo consistente de PYK2, Src, bradicinina, LPA y uno o más de dichos moduladores en donde dichos moduladores son una o mas indolinonas; y

(b)

monitorizar el efecto de dichos moduladores en dichas vías de señalización PYK2.

6. El método de la reivindicación 5 en donde dicha indolinona es una oxindolinona.

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 en donde dicho método implica el cribaje de agentes capaces de promover o romper la unión del dominio SH2 de Src a la tirosina de la posición 402 de PYK2.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 en donde dicho efecto es un estado de fosforilación de PYK2 o Src.