ES2227729T3 - Metodos de cribaje para compuestos unidos al polipeptido pyk2. - Google Patents
Metodos de cribaje para compuestos unidos al polipeptido pyk2.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA TERAPIA QUE SE PUEDE UTILIZAR PARA UN ORGANISMO QUE PADECE DE UNA AFECCION O DE UNA PATOLOGIA QUE SE CARACTERIZA POR UNA ANOMALIA DE VIA DE TRANSDUCCION DE LA SEÑAL QUE INCLUYE UNA PROTEINA PYK2. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNAS TECNICAS DE DIAGNOSTICO DE DICHAS AFECCIONES Y TECNICAS DE BUSQUEDA DE AGENTES QUE CONVIENEN PARA EL TRATAMIENTO DE ESTAS AFECCIONES. ESTA INVENCION SE REFIERE FINALMENTE A UN ACIDO NUCLEICO PURIFICADO Y/O AISLADO QUE CODIFICA UNA PROTEINA PYK2.
Description
Métodos de cribaje para compuestos unidos al
polipéptido PYK2.
La presente solicitud está relacionada con la
solicitud estadounidense con número de serie U.S. Nº 08/460.626,
depositada el 2 de Junio de 1995, la cual en parte es una
continuación de la solicitud de patente estadounidense con número de
serie 08/357,642, depositada el 15 de Diciembre de 1994.
La presente invención se refiere en general a una
nueva proteína denominada PYK2 así como a los productos y métodos
relacionados con la misma.
Ninguno de los puntos de la siguiente discusión
de los antecedentes es admitido como previo a la invención.
La transducción de señal celular es un mecanismo
fundamental en el que los estímulos externos que regulan diversos
procesos celulares son comunicados al interior de la célula. Uno de
los mecanismos bioquímicos clave en la transducción de señales
implica la fosforilación reversible de los residuos de tirosina de
las proteínas. El estado de fosforilación de una proteína se
modifica a través de acciones recíprocas de fosfatasas de tirosina
(TPs) y tirosina quinasas (TKs), incluyendo a los receptores
tirosina quinasa y los no receptores tirosina quinasa.
Los receptores tirosina quinasa (RTKs) pertenecen
a una familia de proteínas transmembrana y han sido implicadas en
las vías de señalización celular. La actividad biológica
predominante de algunas RTKs es la estimulación del crecimiento y la
proliferación celulares, mientras que otras RTKs se encuentran
implicadas en la detención del crecimiento y promoción de la
diferenciación. En algunos casos, una misma tirosina quinasa puede
inhibir o estimular la proliferación celular dependiendo del entorno
celular en el cual se expresa.
Las RTKs se componen como mínimo de tres
dominios: un dominio extracelular de unión a ligando, un dominio
transmembrana y un dominio catalítico citoplasmático que puede
fosforilar residuos de tirosina. La unión de un ligando un receptor
unido a membrana induce la formación de dímeros de receptor que dan
lugar a cambios alostéricos que activan los dominios quinasa
intracelulares que resulta en una autofosforilación
(autofosforilación y/o transfosforilación) del receptor en sus
residuos tirosina. Los residuos de fosfotirosina individuales de los
dominios citoplasmáticos de los receptores pueden servir como sitios
de unión específicos que interaccionan con una gran cantidad de
moléculas de señalización citoplásmica, activando así varias vías de
transducción de señal.
Las proteínas tirosina quinasas intracelulares,
citoplasmáticas, no receptoras no contienen ningún dominio
hidrofóbico transmembrana ni ningún dominio extracelular y
comparten, además de sus dominios catalíticos quinasa, dominios no
catalíticos. Tales dominios no catalíticos incluyen los dominios SH2
y los dominios SH3. Se cree que los dominios no catalíticos son
importantes en la regulación de la interacción entre proteínas
durante la transducción de la señal.
La quinasa de adhesión focal (FAK) es una
proteína tirosina quinasa citoplasmática que se localiza en las
adhesiones focales. Schaller, et al., Proc. Natl. Atad. Sci.
U.S.A., 89:5192-5196 (1992); Cobb et al.,
Molecular and Cellular Biology,
14(1):147-155 (1994). En algunas células el
dominio C-terminal de FAK se expresa de forma
autónoma como una proteína de 41 kDa llamada FRNK y los 140
residuos C-terminales de FAK contienen un dominio
diana de adhesión focal (FAT). Los ADNcs que codifican para FRNK se
encuentran publicados en Schaller et al., Molecular and Cellular
Biology, 13(2):785-791 (1993). En
Hilderbrand et al., The Journal of Cell Biology,
123(4): 993-1005 (1993) fue identificado el
dominio FAT diciéndose que era requerido para la localización de FAK
para las adhesiones celulares focales.
Un rasgo central en la transducción de señales es
la fosforilación reversible de determinadas proteínas. La
fosforilación del receptor estimula una asociación física del
receptor activado con las moléculas diana, las cuales pueden a su
vez ser fosforiladas o no. Algunas moléculas diana tales como la
fosfolipasa Cy son a su vez fosforiladas y activadas. Tal
fosforilación transmite una señal hacia el citoplasma. Otras
moléculas diana no se encuentran fosforiladas, pero ayudan en la
transducción de la señal actuando a modo de moléculas adaptadoras
para proteínas transductoras de una señal secundaria. Por ejemplo,
la fosforilación del receptor y los cambios alostéricos
subsiguientes en el mismo producen la unión del complejo
Grb-2/SOS al dominio catalítico del receptor cuya
proximidad a la membrana le permite activar a ras. El transductor de
señales secundarias generadas a través de receptores activados da
lugar a una cascada de señales que regula las funciones celulares
como la división o la diferenciación celulares. Las revisiones que
describen la transducción de la señal intracelular incluyen a
Aaronson, Science, 254:1146-1153, 1991;
Schlessinger, Trends Biochem. Sci.,
13:443-447, 1988; y Ullrich y Schlessinger,
Cell, 61:203-212,1990.
Muchas proteínas tirosina quinasas son altamente
expresadas en el sistema nervioso central siendo evidente que la
fosforilación de las proteínas juega un papel regulador crucial en
el sistema nervioso. Factores neurotróficos que controlan la
diferenciación y mantienen la supervivencia de diferentes tipos de
células neuronales median sus efectos biológicos por unión y
activación de receptores de la superficie de la célula mediante una
actividad intrínseca tirosina quinasa. Además, la fosforilación de
la proteína es un mecanismo regulador clave de la excitabilidad de
la membrana y de la función de los canales de iones.
La fosforilación de tirosinas regula la función
de varios canales iónicos en el sistema nervioso central. La
proteína quinasa C (PKC) puede regular la acción de una variedad de
canales de iones incluyendo los canales de potasio dependientes de
voltaje, los canales de sodio dependientes de voltaje así como el
receptor nicotínico de la acetilcolina. La acción del receptor NMDA
puede ser modulada mediante tirosina quinasas y fosfatasas. Además,
la fosforilación de tirosinas de los receptores nicotínicos de
acetilcolina (AchR) incrementa su tasa de desensibilación, y puede
intervenir en la regulación de la distribución de AchR en la
membrana celular. Otro ejemplo es el canal de K+ del tipo
rectificador retardado, denominado Kv1.2 también llamado RAK, RBKZ,
RCK5 y NGKI). Este canal se expresa de forma elevada en el cerebro y
aurícula cardiaca, y puede ser regulado mediante fosforilación de
tirosina. La fosforilación de tirosinas del Kv1.2 se asocia con la
supresión del flujo en Kv1.2. La supresión del flujo de Kv1.2 fue
inducida por una variedad de estímulos incluyendo el carbacol, la
bradicinina, el PMA y el ionóforo de calcio.
La vía de transducción de señal mediante la
quinasa Ras/MAP está elevadamente conservada en la evolución y juega
un papel importante en el control del crecimiento y la
diferenciación celular. La vía de señalización de la MAP quinasa en
las células PC12 puede ser activada mediante NGF, mediante hormonas
peptídicas que activan receptores acoplados a proteína G, mediante
ésteres de forbol así como mediante el influjo de calcio que sigue a
la despolarización de la membrana. Sin embargo, el mecanismo que
media la activación de la vía de señalización de la quinasa Ras/MAP
mediante receptores acoplados a proteína G así como por influjo de
calcio no se conoce. Shc está implicado en el acoplamiento de las
tirosina quinasas receptor y no receptor a las vías de señalización
Ras/MAPK. La sobreexpresión de Shc lleva a la transformación de las
células 3T3 y a la diferenciación neuronal de las células pC12.
Además, la diferenciación inducida por Shc de las células PC12 es
bloqueada por medio de un mutante dominante de Ras indicando que Shc
actúa corriente arriba de Ras. La Shc fosforilada en las tirosinas
puede activar las vías de señalización Ras mediante al unión al
dominio SH2 de la proteína adaptadora Grb2 que se encuentra
acomplejada al factor liberador de nucleótidos de guanina Sos a
través de sus dominios SH3.
Las vías de transducción de señal que regulan
canales iónicos (p.ej. canales de potasio y canales calcio) implican
proteínas G las cuales funcionan como intermediarias entre los
receptores y los efectores. Gilman, Ann.Rev.Biochem.,
56:615-649 (1987); Brown y Birnbaumer,
Ann.Rev.Physiol., 52:197-213 (1990). Los
receptores acoplados a proteínas G son receptores de
neurotransmisores, ligandos que son responsables de la producción de
señales en las células nerviosas así como de proliferación y
diferenciación de nervios y otros tipos celulares. Existen
diferentes subtipos de receptores de neurotransmisores los cuales se
expresan de forma diferencial en varios tejidos y neurotransmisores
tales como la acetilcolina evoca respuestas a través de los sistemas
nerviosos central y periférico. Los receptores muscarínicos de la
acetilcolina juegan papeles importantes en una gran variedad de
actividades neuronales complejas tales como el aprendizaje, la
memoria, y modulación motora, sensorial y excitatoria. Estos
receptores también han sido implicados en varios trastornos del
sistema nervioso central tales como la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson, la depresión y la esquizofrenia.
Algunos agentes que están implicados en la vía de
transducción de señales regulando un canal iónico, por ejemplo un
canal de potasio, puede también estar implicado también en otra o
otras vías que regulen otro o otros canales iónicos, por ejemplo un
canal de calcio. Dolphin, Ann.Rev.Physiol.,
52:243-55 (1990); WilK-Blaszczak
et al., Neuron, 12:109-116 (1994). Los
canales iónicos pueden ser regulados mediante o sin mediación de un
segundo mensajero citosólico. Hille, Neuron,
9:187-195 (1992). Un posible segundo mensajero
citosólico es una tirosina quinasa. Huang et al.,
Cell,75:1145-1156 (1993).
Los receptores implicados en las vías de
transducción de señales que regulan canales iónicos se encuentran
ligadas finalmente con los canales iónicos por medio de varios
intermediarios, acontecimientos y agentes. Por ejemplo, tales
acontecimientos incluyen un incremento del calcio intracelular, del
inositol trifosfato y de la producción de endotelina. Frucht, et
al., Cancer Research, 52:1114-1122 (1992);
Schrey, et al., Cancer Research, 52:1786-1790
(1992). Los agentes intermedios incluyen la bombesina, la cual
estimula la síntesis de ADN y la fosforilación de un sustrato
específico de proteína quinasa C. Rodríguez-Pena,
et al., Bio-chemical and Biophysical Research
Communication, 140(1):379-385 (1986);
Fisher and Schonbrunn, The Journal of Biological Chemistry,
263 (6):2208-2816 (1988).
Los polipéptidos PYK2 se encuentran implicados en
varias vías de transducción de señal y por lo tanto la presente
invención proporciona varios agentes y métodos útiles para el
diagnóstico, el tratamiento y la prevención de varias enfermedades o
condiciones asociadas con anormalidades en estas vías.
La presente invención se basa en parte en la
identificación y aislamiento de una nueva tirosina quinasa no
receptor denominada PYK2. Sin el deseo de estar sujetos a ninguna
teoría en particular, parece que PYK2 participa en al menos dos vías
de transducción de señales. La primera vía de transducción de
señales se activa cuando las señales extracelulares como la
bradicinina o la acetilcolina se unen a una proteína quinasa
receptor acoplada a proteína G. Las proteína quinasas receptor
acopladas a proteína G incluyen, aunque no están limitadas a, Lyn y
Syk las cuales se encuentran localizadas en las células B del
sistema inmune.
Otra vía de transducción de señal PYK2 se activa
cuando los factores de crecimiento se unen a proteínas quinasas
receptor. Los receptores dimerizan y posteriormente se fosforilan de
forma cruzada el uno al otro. Las partes fosfato ahora unidas a la
proteínas quinasas receptor atraen otras moléculas de señalización a
estos receptores localizados en la membrana plasmática. Tales
moléculas de señalización pueden ser, entre otras, sos, shc,
o grb. Complejos tales como el complejo EGFR/grb-2/sos
pueden activar moléculas ras también localizadas en la
membrana plasmática. Las moléculas Ras pueden entonces
activar moléculas de señalización que no se encuentran unidas a la
membrana plasmática. Estas moléculas de señalización citoplasmáticas
pueden propagar una señal extracelular hacia el núcleo y promover la
producción de agentes celulares necesarios para el desarrollo de una
respuesta a la señal extracelular. Ejemplos de moléculas de
señalización citosólicas son las proteínas implicadas en la cascada
de la MAP quinasa.
La descripción que se proporciona aquí indica que
PYK2 puede combinarse con las vías acopladas a proteína G con la vía
sos/grb para la activación de la transducción de señal de MAP
quinasa en respuesta a la estimulación por receptores acoplados a
proteína G. La invención también indica que PYK2 lleva estas dos
vías conjuntamente con la unión de src, otra proteína quinasa
implicada en los mecanismos de transducción de señales. Por lo
tanto, la invención proporciona nuevos dianas para la terapéutica
efectiva en el tratamiento de enfermedades derivadas de la
proliferación celular tales como el cáncer y/o de los trastornos de
la diferenciación celular.
PYK2 tiene un peso molecular estimado de 111 kD y
contiene cinco dominios: (1) un relativamente largo dominio
N-terminal desde el aminoácido 1 al aminoácido 417;
(2) un dominio quinasa catalítico desde el aminoácido 418 al
aminoácido 679 que contiene un dominio de unión a nucleótido que
abarca desde el aminoácido 431 al aminoácido 439 y un lugar de unión
a ATP en el aminoácido 457); un dominio rico en prolina desde el
aminoácido 713 al aminoácido 733; (4) otro dominio rico en prolina
desde el aminoácido 843 al aminoácido 860; y (5) un dominio
C-terminal diana de adhesión focal (FAT) desde el
aminoácido 861 al aminoácido 1009. PYK2 no contiene dominio SH2 o
dominio SH3. Los aminoácidos 696-1009 de PYK2
muestran homología con FRWK, el fragmento C-terminal
de FAK. Otros aspectos de la secuencia PYK2 incluyen lo siguiente:
(1) el aminoácido 402 es el principal lugar de autofosforilación de
PYK2 y es un lugar de unión Src SH2; (2) el aminoácido 599 es un
lugar de autofosforilación en un lazo de activación de la quinasa
PYK2; (3) el aminoácido 881 es un lugar de autofosforilación y un
lugar de unión GRB2; y (4) el aminoácido 906 es un lugar de
autofosforilación y lugar de unión SHP-2
(PTP-10).
El dominio FAT de PYK2 presenta alrededor del 62%
de similaridad con el dominio FAT de otra tirosina quinasa no
receptor, FAK, la cual es también activada a través de proteínas G.
La similaridad total entre PIKZ y FAK es de alrededor del 52%. PYK2
se expresa principalmente en los tejidos neuronales, aunque la
expresión también ser detectada en las células hematopoyéticas en
los primeros estadios del desarrollo y en algunas líneas de células
tumorales. La expresión de PYK2 no se corresponde con la expresión
de FAK.
Se cree que PYK2 regula los canales de potasio en
respuesta a señales generadas por neurotransmisores. La actividad
enzimática PYKz se encuentra regulada de forma positiva por medio de
fosforilación en tirosinas y resulta en una respuesta a la unión de
bradicinina, TPA, ionóforo de calcio, carbacol, TPA + forscolina, y
despolarización de membrana. La combinación de toxinas conocidas
(tales como la toxina pertusis, toxina del cólera, TPA y
bradicinina) con receptores de señalización acoplados a proteína G
positivamente regulados incrementa la fosforilación de
PYK2.
PYK2.
La PYK2 activada fosforila a RAK, un canal de
potasio del tipo rectificador retardado, y por lo tanto suprime la
actividad de RAK. En el mismo sistema, FAK no fosforila a RAK. PYK2
es responsable de la regulación de la señal producida por
neurotransmisor y por lo tanto debe de ser usado para el tratamiento
de condiciones del sistema nervioso que potencien o inhiban tal
señalización.
Un aspecto de la invención caracteriza un método
para la detección de la presencia o valorar la cantidad de algún
compuesto capaz de unirse al polipéptido PYK2, en el que dicho
compuesto sea una indolinona. El método implica incubar dicho
compuesto con un polipéptido PYK2 y la detección de la presencia o
valoración de la cantidad del compuesto unido al polipéptido
PYK2.
En una aplicación mejor, el compuesto inhibe la
actividad de fosforilación del polipeptido PYK2.
En otro aspecto la invención caracteriza un
método de cribaje para agentes potencialmente útiles en el
tratamiento de una enfermedad o condición caracterizada por la
anormalidad en una vía de transducción de señal que contenga una
interacción entre un polipéptido PYK2 y un compañero de unión
natural (NBP). El método implica ensayar aquellos agentes
potenciales de entre los que son capaces de promover o interrumpir
la interacción como una indicación de agente útil. El compañero de
unión natural es Src y la vía implica un receptor acoplado a
proteína G pero no implica ningún receptor de factor de crecimiento,
y los agentes potenciales son una o más indolinonas.
Preferiblemente la indolinona es una
oxindolinona.
Enfermedades específicas o trastornos los cuales
pueden ser tratados o prevenidos, en base de las células afectadas
son: miastenia gravis; neuroblastoma; trastornos causados por
toxinas neuronales tales como la toxina del cólera, la toxina
pertusis, o el veneno de serpiente; mielosis megacariocítica
aguda; trombocitopénia; aquellas que afectan al sistema nervioso
central como apoplejía, embolia, traumatismos craneales, daños en la
médula espinal, daños en las células nerviosas inducido por hipóxia
en situaciones como el paro cardíaco o el sufrimiento neonatal,
epilepsia, enfermedades neuro-degenerativas tales
como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la
enfermedad de Parkinson, demencia, tensión muscular, depresión,
ansiedad, crisis de pánico, trastornos
obsesivo-compulsivos, estrés
post-traumático, esquizofrenia, síndrome
neuroléptico maligno, y el síndrome de Tourette. Las condiciones que
pueden ser tratadas mediante inhibidores de PYK2 incluyen epilepsia,
esquizofrenia, hiperactividad extrema en niños, dolor crónico, y
dolor agudo. Ejemplos de condiciones que pueden ser tratadas a
través de potenciadores de PYK2 (por ejemplo un inhibidor de
fosfatasa) incluyen embolia, Alzheimer, Parkinson, otras
enfermedades neurodegenerativas y la migraña. Los trastornos
preferidos incluyen epilepsia, embolia, esquizofrenia, y Parkinson,
ya que existe una relación bien establecida entre estos trastornos y
la función de los canales de potasio.
La invención también proporciona un método para
el cribaje de moduladores de las vías de señalización PYK2
comprendiendo los siguientes pasos: mezcla de dos o más componentes
seleccionados de un grupo constituido por PYK2, Src, bradicinina,
LPA, y uno o más de los mencionados moduladores, en donde los
moduladores son una o más indolinonas; y monitorizando el efecto de
los moduladores en las vías de señalización PYK2.
Preferiblemente la indolinona es una
oxindolinona. Preferiblemente el método implica agentes capaces de
promover o interrumpir la unión del dominio SH2 de Src a la tirosina
de la posición 402 de PYK2.
Preferiblemente el efecto es un estado de
fosforilación de PYK2 o Src.
Otras caracterizaciones y ventajas de las
invención serán mostradas a partir de la siguiente descripción de
las realizaciones preferibles, y a partir de las
reivindicaciones.
La Figura 1 muestra una representación
esquemática de los dominios PYK2 (incluyendo el dominio quinasa, un
dominio rico en prolina, y el dominio Fat) y los potenciales sitios
de unión (incluyendo YAEI, YLNV, e YVVV).
La Figura 2 muestra un posible mecanismo para la
despolarización de membrana e influjo de calcio que estimula la vía
de las quinasas MEK y MAP de activación de Ras. En las células PC12,
la despolarización de la membrana lleva al influjo de calcio a
través de canales de calcio del tipo L y activa la MAP quinasa. El
influjo de calcio conduce a la activación de Ras y a la activación
de MAP en respuesta al influjo de calcio se inhibe por un mutante
dominante negativo de Ras. La elevación de la concentración de
calcio intracelular por varios estímulos lleva a la activación de
PYK2. PYK2 recluta el complejo Shc/Grb2/Sos llevando a la
activación de la vía de señalización compuesta de Ras, Raf, MAPKK,
MAPK para transmitir las señales al núcleo celular.
La Figura 3 muestra un modelo para el estímulo
extracelular que activa PYK2 así como la molécula diana potencial
que presenta tirosinas fosforiladas en respuesta a la activación de
PYK2. La actividad tirosina quinasa de PYK2 se activa mediante una
variedad de señales extracelulares que estimulan el influjo de
calcio incluyendo la activación de los receptores nicotínicos de la
acetilcolina a través de carbacol, despolarización de membrana
mediante KCl (75 mM), y tratamiento con un ionóforo de calcio. La
activación de PYK2 por medio de estos estímulos requiere la
presencia de calcio extracelular. PYK2 también es estimulada en
respuesta a la activación inducida por bradicinina (BK) de sus
receptores acoplados a proteína G llevando a la hidrólisis de PI y
liberación de Ca+2 de las reservas internas. PYK2 es también
activada en respuesta al tratamiento con ésteres de forbol (PMA) que
se unen y activan a varias isozimas PKC. Los experimentos de
co-expresión en células tranfectadas y en oocitos de
rana muestran que la activación de PYK2 lleva a la fosforilación de
tirosina (flecha gruesa) del canal de K+ del tipo rectificador
retardado Kv1.2 y a la supresión de las corrientes mediadas por el
canal Kv1.2.
La Figura 4 muestra una alineación de los
aminoácidos de PYK-2 con los de las otras 4
proteínas, Fak, Fer, HER4 y AB1. La Tabla 1 muestra el patrón de
expresión y los niveles de PYK2 en varias líneas celulares
comprobados por múltiples métodos.
La presente invención se refiere a ensayos que
utilizan polipéptidos PYK2. Los iniciados en la materia reconocerán
que muchos de los métodos descritos más abajo en relación con
PYK-2, un NBP, o un complejo de
PYK-2 y un NBP pueden también ser utilizados
respecto a los otros miembros de este grupo.
Describimos el aislamiento y la caracterización
de una nueva tirosina quinasa no receptor denominada PYK2, que es
altamente expresada en el sistema nervioso y en el cerebro de rata
adulta. PYK2 es un segundo miembro de la familia Fak de proteínas
tirosina quinasas no receptores. Sin embargo, PYK2 muestra una
localización citoplasmática difusa a diferencia de una localización
preferencial de Fak en áreas de adhesión focal.
Los ejemplos presentados aquí revelan un nuevo
mecanismo para el acoplamiento entre los receptores acoplados a
proteína G y la vía de señalización de la MAP quinasa. Mostramos
también que el influjo de calcio inducido por despolarización de
membrana después de la activación del receptor nicotínico de la
acetilcolina u otro estímulo que cause influjo de calcio lleva a la
activación de PYK2, fosforilación de tirosina de Shc, reclutamiento
de Grb2/Sos y activación de la vía de señalización de la MAP
quinasa.
PYK2 se activa a través de señales extracelulares
que conducen al influjo de calcio o a la liberación de calcio desde
las reservas internas. PYK2 se fosforila en los residuos de tirosina
en respuesta a una variedad de estímulos externos que causan una
despolarización de membrana y un influjo de Ca+^{2} tal y como la
activación del receptor nicotínico de la acetilcolina. La
fosforilación de tirosinas de PYK2 es también estimulada por el
neuropéptido bradicinina que activa un receptor acoplado a proteína
G así como por medio de forbol miristato acetato (PMA). Experimentos
en células transfectadas y en oocitos de Xenopus
micro-inyectados con ARNm de PYK2, indican que la
activación de PYK2 puede llevar a la fosforilación de tirosinas del
canal de potasio del tipo rectificador retardado y a la supresión de
la corriente de potasio por medio de este canal. Estos resultados
sugieren que un nuevo mecanismo por medio del cual una tirosina
quinasa no receptor, en el sistema nervioso, puede ser activado y
puede modular la acción de las proteínas canal de iones. La
activación de PYK2 en las células PC12 por medio del mismo estimulo
lleva a reclutamiento del complejo Shc/Grb2/Sos y a la activación de
la vía de señalización de la MAP quinasa que transmite señales al
núcleo celular. El experimento presentado por lo tanto muestra que
PYK2 puede también proporcionar un nexo entre los receptores
acoplados a proteína G y el influjo de calcio y la vía de
señalización de la MAP quinasa; una vía que transmite señales desde
la superficie celular para regular los acontecimientos
transcripcionales en el núcleo. La sobre-expresión
de PYK2 lleva a la activación de la MAP quinasa. Además, los efectos
de PYK2 en la fosforilación de tirosina y la acción del canal de
potasio Kv1.2 revela un nuevo mecanismo para la regulación
heteróloga de la función del canal por medio de la activación de una
tirosina quinasa intermediaria. PYK2 puede, por lo tanto, emparejar
las hormonas neuropéptido que actúan por medio de receptores
acoplados a proteína G que estimulan la hidrólisis de fosfatidil
inositol y la acción de las moléculas diana del canal.
Los experimentos de co-expresión
transitoria de PYK2 con el canal rectificador retardado K+ Kv1.2
muestran que la proteína canal es sometida a fosforilación de
tirosinas en respuesta a la activación de PYK2. Además, los flujos
exhibidos por el canal Kv1.2 expresado en oocitos de rana fueron
bloqueadas por la co-expresión de la proteína PYK2.
Sin embargo, la co-expresión de un mutante negativo
de la quinasa PYK2 PMA liberado indujo la supresión de los flujos de
Kv1.2. La activación de PYK2 puede proporcionar un rápido y
altamente localizado mecanismo de control para la función de los
canales iónicos y la activación de la quinasa inducida por estímulos
neuronales que eleva el calcio intracelular dando lugar a la
integración neuronal y la eficacia sináptica.
Estos resultados revelan un papel para PYK2 en la
activación de la vía de señalización de la MAP quinasa por medio de
canales iónicos, influjo de calcio y receptores acoplados a proteína
G en células PC12 y puede proporcionar un mecanismo para la
transducción de señales inducidas por estos estímulos en el sistema
nervioso. Además, la fosforilación de tirosinas de Shc en respuesta
a la despolarización de membrana y al tratamiento con carbacol fue
dependiente de la presencia de calcio extracelular, indicando que el
influjo de calcio juega un papel en la regulación de la
fosforilación de Shc por medio de estos estímulos. De forma similar,
PYK2 podría modular la acción de los canales iónicos que median sus
respuestas y son sensibles a la concentración de calcio
intracelular. PYK2 puede por lo tanto proporcionar un papel
autoregulador para el mismo canal responsable de la activación de
PYK2. Una diana potencial de PYK2 es el receptor nicotínico de la
acetilcolina. La activación del receptor nicotínico de la
acetilcolina en las células PC12 lleva a la fuerte y rápida
fosforilación de tirosinas de PYK2. El receptor nicotínico de la
acetilcolina es sometido a pegilación y puede modular la actividad
de fosforilación de tirosina. La fosforilación de tirosinas de Shc
en respuesta al tratamiento con carbacol es inducido por la
estimulación del receptor nicotínico de la acetilcolina tal y como
ha sido determinado a través de análisis farmacológicos. El agonista
nicotínico DMPP indujo fosforilación de Shc, mientras que la
muscarina no tuvo ningún efecto, el antagonista nicotínico
mecamilamina bloqueó el efecto del carbacol, mientras que el
antagonista muscarínico atropina no tuvo ningún efecto. El efecto
del carbacol en la fosforilación de tirosinas de Shc fue transitorio
con una fosforilación máxima de tirosina detectada un minuto después
seguida de un rápido declive. Sin embargo NGF, indujo una
estimulación persistente de la fosforilación de Shc durante un
periodo de cinco horas después de la adición de NGF. La duración de
la fosforilación de Shc puede tener un importante impacto en la vía
de señalización Ras y en la expresión de genes inducidos por
estos
estímulos.
estímulos.
El modelo presentado aquí puede representar el
mecanismo subyacente en la regulación de la expresión de genes
mediada por calcio en las células neuronales inducidas por el
receptor MMDA o por los canales de calcio sensibles a voltaje. El
patrón de expresión de PYK2, el estímulo externo que activa esta
quinasa junto con su papel en el control de la vía de señalización
de la MAP quinasa sugiere un papel potencial para PYK2 en el control
de una amplia colección de procesos en el sistema nervioso central
incluyendo la plasticidad neuronal en el sistema nervioso.
Dado que la actividad de PYK2 es regulada por los
niveles intracelulares de calcio, los patrones tanto espacial como
temporal de activación de PYK2 puede representar una copia o una
replica del perfil espacial y temporal de la concentración de calcio
intracelular. La concentración de calcio dentro de la célula está
altamente localizada debido a una variedad de proteínas de unión a
calcio que proporcionan un fuerte efecto tamponador. Además, en las
células excitables el nivel de calcio puede ser regulado por canales
de calcio dependientes de voltaje que inducen un incremento tanto
mantenido como transitorio en la concentración intracelular de
calcio dando lugar a oscilaciones en los niveles de calcio así como
a ondas de calcio. PYK2 puede proporcionar un mecanismo rápido y
altamente localizado de control de la función de los canales iónicos
así como de la activación localizada de la vía de señalización de la
MAP quinasa. Análisis preliminares de inmunolocalización indican que
PYK2 se expresa en las dendritas postsinápticas del hipocampo,
sugiriendo este hecho un papel potencial de esta quinasa en la
plasticidad sináptica mediada por influjo de calcio. Los canales de
potasio son dianas frecuentes para la fosforilación por tirosina
quinasas que son activadas por neurotransmisores o neuropéptidos. La
fosforilación de otros canales regulados por voltaje o de
receptores de neurotransmisor proporciona un importante mecanismo
regulador por modulación. Por lo tanto, PYK2 puede representar una
importante molécula acopladora entre los neuropéptidos que activan
receptores acoplados a proteína G o los neurotransmisores que
estimulan el influjo de Ca+2 y los acontecimientos de señalización
posteriores que regulan la plasticidad neuronal, la excitabilidad
celular, y la eficacia sináptica. Hemos demostrado que PYK2 es
rápidamente activada en respuesta a una amplia variedad de estímulos
extracelulares. Estos estímulos incluyen la activación de un canal
iónico, la estimulación de un receptor acoplado a proteína G, el
influjo de calcio que sigue a una despolarización de membrana así
como la estimulación por ésteres de forbol. Aunque los mecanismos
moleculares por medio de los cuales estas señales inducen la
activación de PYK2 no son todavía conocidos, nuestros resultados
muestran claramente que la elevación de la concentración de calcio
intracelular es crucial para la activación de PYK2. El efecto de PMA
en la activación de PYK2 puede indicar que PYK2 puede también ser
activado por una vía dependiente de PKC. El hecho de que PYK2 pueda
ser activado por un canal iónico, como el receptor nicotínico de la
acetilcolina, y por el calcio intracelular incrementó la posibilidad
de que PYK2 pudiera regular la función del canal iónico por
fosforilación de tirosina.
Además analizamos la actividad de la MAP quinasa
inducida por agonista en la línea celular PC12 la cual sobreexpresa
de forma estable un mutante interferidor dominante de Grb2 que
carece del dominio SH3 N-terminal (Grb2
DN-SH3) o en células PC12 las cuales de forma
estable sobreexpresan la cola rica en prolina de Sos
(Sos-CT). Xie et al, J. Biol. Chem. 270,
30717-30724 (1995). Gishizky et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 92, 10889-10893 (1995). La
sobreexpresión de Grb2' DN-SH3 en células PC12
bloqueó completamente la activación por LPA- o por bradicinina de la
MAP quinasa. La sobreexpresión de Sos-CT redujo
fuertemente la activación de la MAP quinasa en respuesta a la
estimulación por LPA y bradicinina. Sin embargo, la activación de
PYK2 o Src no fue afectada por el mutante interferidor dominante de
Grb2 y Sos confirmando que PYK2 y Src actúan corriente arriba de
Grb2 y Sos en la cascada de acontecimientos que lleva a la
activación de la MAP quinasa. Los experimentos presentados aquí
demuestran que PYK2 puede encadenar a los receptores tanto acoplados
a proteínas Gi como a proteínas Gq con la vía de señalización de MAP
quinasa en las células PC12. La fosforilación en el residuo Tyr402
de PYK2 lleva a la unión del dominio SH2 de Src y la subsiguiente
activación de Src en respuesta a los receptores acoplados tanto a
proteína Gi como a proteína Gq. La sobreexpresión de Src activado
(Y527F) en las células PC12 induce la fosforilación de tirosinas de
PYK2, pero no estimula la actividad quinasa de PYK2.
Es posible por lo tanto que, esta fosforilación
de tirosinas de PYK2 sea en parte mediada por Src, por lo tanto
generando lugares de acoplamiento para proteínas de señalización
adicionales que son reclutadas por PYK2. Hemos demostrado que la
activación de PYK2 lleva tanto a un reclutamiento directo de
Grb2/Sos así como a un reclutamiento indirecto de Shc vía
fosforilación de tirosinas. Presentamos experimentos que demuestran
que los mutantes interferidores dominantes de Grb2 o de Sos
confieren una fuerte inhibición de la activación inducida por LPA o
bradicinina de la MAP quinasa. Estos resultados están de acuerdo con
estudios recientes que demuestran que un mutante por delección de
Sos o un mutante interferidor dominante de Shc bloqueó la activación
de la MAP quinasa inducida por LPA o trombina, van Biesen et al.,
Nature 376:781-784 (1995); Chen et al., EMBO
J. 15:1037-1044 (1996), respectivamente.
Considerados de forma conjunta, estos
experimentos muestran un papel central del complejo Shc/Grb2/Sos en
la mediación de la activación de la MAP quinasa no solamente por
medio de receptores tirosina quinasas; sino que también por
receptores acoplados a proteínas Gi y Gq. Wan et al., Nature
380:541-544 (1996). En células B de aves tanto Lyn y
Syk son esenciales para la activación de la MAP quinasa a través de
receptores acoplados a proteínas Gi y Gq. Parece por lo tanto que
una combinación de diferentes proteínas tirosina quinasas en
diferentes tejidos y tipos celulares pueden encadenar un receptor
acoplado a proteína G con la vía de señalización de la MAP quinasa.
La familia de proteínas tirosina quinasas Src, las cuales son
expresadas en todos los tipos celulares y todos los tejidos, parecen
ser comunes e importantes componentes de esta vía, actuando
conjuntamente con proteínas tirosina quinasas específicas de cada
tipo celular tales como PYK2 en las células PC12 o Syk en las
células B de las aves para dar lugar a señales específicas de cada
tipo celular mediante el encadenamiento de 30 receptores acoplados a
proteína G con la vía de señalización de la MAP quinasa y de ahí con
la maquinaria transcripcional.
Los ejemplos mostrados más abajo no son
limitantes y son simplemente representativos de varios aspectos y
procedimientos característicos usados para la identificación de las
secuencias nucleotídica y aminoácidica completas de
PYK-2. También se proporcionan experimentos que
muestran la expresión, interacción y señalización de
PYK-2.
Bradicinina, toxina pertusis, toxina del
cólera, forscolina, forbol 12-miristato
13-acetato (PMA), ionoforo de calcio A23187,
carbacol, muscarina, atropina, mecamilamina, y
1,1-dimetil-4-fenil
yoduro de piperazina (DMPP) fueron obtenidos de Sigma.
Hemos usado la proteína adaptadora Grb2 como
sonda específica para el cribaje en librerías de expresión con la
finalidad de aislar las proteínas de unión a Grb2. Una de las
proteínas clonadas codificó por una proteína tirosina quinasa que
contiene una región rica en prolina que se puede unir in
vitro a los dominios SH3 de Grb2. Esta proteína se llamó PYK1
tirosina quinasa rica en prolina 1. La comparación de la secuencia
de aminoácidos de PYK1 con otras tirosina quinasas, indicó que PYK1
está relacionada con la proteína tirosina quinasa Ack. El análisis
de la secuencia de PYK1 indicó que esta quinasa representa una nueva
clase de proteínas tirosina quinasa citoplasmáticas. En el intento
de aislar quinasas relacionadas con PYK2, hemos aplicado la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores de
oligonucleótidos degenerados, derivados a partir de la secuencia de
PYK1 de acuerdo con el motivo conservado del dominio catalítico de
PTKs. ARN procedente de medula espinal de rata fue utilizado para
preparar ADNc utilizando la transcriptasa inversa del virus de la
leucemia murina de Molony _{(}^{BRL}_{)} de acuerdo con el
protocolo del fabricante. El ADNc fue amplificado por PCR usando
cebadores de oligonucleótidos degenerados correspondientes a los
motivos conservados tirosina quinasa procedentes de subdominios TK6
y TK9 de PYK2; (los cebadores sentido y antisentido correspondían a
las secuencias de aminoácidos IHRDLAARN [ID. DE SEC. NO: 3] y
WMFGVTLW [ID. DE SEC. NO: 4], respectivamente). La PCR se desarrolló
bajo las siguientes condiciones; 1 minuto a 94ºC; 1 minuto a 50ºC y
1 minuto a 68ºC durante 35 ciclos. Los productos de PCR fueron
sometidos a electroforesis, revisados por tamaño (210 pares de
bases), purificados y subclonados en el plásmido pBluescript
(Stratagene). Los nuevos clones fueron sometidos a criba mediante
una secuenciación de ADN. El inserto de ADNc del clon #38 fue
utilizado como sonda para cribar librerías de ADNc procedente de
cerebro humano (cerebro humano fetal \lambdagt 10 y cerebro humano
\lambdagt 11, con 6x105 clones recombinantes cada uno)
esencialmente como se describe en Maniatis.
La secuencia completa de aminoácidos de una nueva
proteína tirosina quinasa fue aislada de una librería de ADNc
procedente de cerebro humano y fue llamada PYK2. La pauta abierta de
lectura de PYK2 codifica para una proteína de 1009 aminoácidos que
contienen una larga secuencia N-terminal de 424
aminoácidos seguida de un dominio tirosina quinasa, dos dominios
ricos en prolina (29% y 23,3% de prolina respectivamente) y una
larga región carboxiterminal. El dominio quinasa de PYK2, contiene
varios motivos de secuencia conservados entre las proteínas tirosina
quinasa, incluyendo el motivo tripéptido DFG, que se encuentra en
muchas quinasas, y un motivo consenso para la unión de ATP GXGXXG
seguido de la secuencia AXK 17 residuos aminoacídicos más abajo.
La comparación de la secuencia de aminoácidos del
domino quinasa de PYK2 con otras proteínas tirosina quinasas mostró
que el núcleo quinasa de PYK2 es más similar a los dominios tirosina
quinasa de Fak, Fer, Her4 y Abl. Además de la homología de secuencia
en el dominio quinasa, las secuencias flanqueantes de toda la
organización estructural de la proteína PYK2 son similares a los de
FAK lo que indica que PYK2 pertenece a la misma familia de no
receptores similares a las proteínas tirosina quinasa Fak.
La secuenciación de ADN se realizó en ambas
cadenas utilizando series de cebadores de oligonucleótidos y
subclones. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos
deducida fueron sometidas a búsqueda de homología en las bases de
datos Genbank y PIR utilizando los programas servidores FASTA y
BLAST.
El ARN total fue aislado a partir de tejidos de
ratón a través del método ácido guanidin
ticinato-fenol-cloroformo (Anal.
Biochem. 162; 156, 1987). ARN Poli (A)^{+} fue
desnaturalizado mediante formaldehido y fue sometido a
electroforesis en un gel 1 agarosa/0,7% formaldehído. Los ARN se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se hibridaron con
sondas marcadas con ^{32}P que contenían el inserto de ADNc del
clon #38 tal y como se ha descrito anteriormente.
Anticuerpos contra PYK2 fueron se obtuvieron en
conejos inmunizados (HTI) mediante la proteína de fusión GST que
contenía los residuos 362-647 o mediante PYK2 o
mediante un péptido sintético correspondiente a los 15 aminoácidos
del extremo N-terminal de PYK2. El antisuero fue
revisado por inmunoprecipitación y análisis por inmunoblot, y la
especificidad se confirmó por reactividad con la proteína
relacionada Fak o por competición con péptidos antigénicos
control.
Anticuerpos contra PYK-2 fueron
desarrollados en conejos inmunizados mediante la proteína de fusión
GST que contenía residuos de PYK-2 o mediante un
péptido sintético correspondiente a los 15 aminoácidos del extremo
N-terminal de PYK-2. Los anticuerpos
son específicos contra PYK-2 y no reaccionan de
forma cruzada con FAK.
Las células PC12 de feocromocitoma de rata fueron
cultivadas en medio modificado de Dulbecco Eagle conteniendo 10%
suero de caballo, 5% suero fetal bovino, 100 \mug/ml de
estreptomicina y 100 unidades de penicilina/ml. Células NIH3T3, 293,
GP+E-86 y PA317 se hicieron crecer en en medio
modificado de Dulbecco Eagle conteniendo 10% de suero bovino fetal,
100 \mug/ml de estreptomicina y 100 unidades de penicilina/ml.
Con la finalidad de conseguir una expresión
estable en células PC12, PYK2 se subclonó en el vector retroviral
pLXSN (Miller y Rosman, Biotechniques 7:980,1989). La
construcción fue utilizada para transfectar células
GP+E-86 utilizando reactivo de lipofectimina (GIBCO
BRL). 48 horas después de la transfección, los sobrenadantes que
contenían los virus fueron recogidos. Los sobrenadantes que
contenían células libres conteniendo retrovirus purificados fueron
añadidos a las células PC12 en presencia de polibreno (8 \mug/ml,
Aldrich) durante 4 horas (MCB 12 491, 1992). 24 horas después, las
células PC12 infectadas se cambiaron a un medio de crecimiento que
contenía 350 \mul/mg de G418. Las colonias resistentes a G418 se
aislaron de dos a tres semanas después y el nivel de expresión se
determinó mediante análisis de western blot.
Líneas celulares estables de NIH3T3 que
sobreexpresan PYK2 fueron establecidas por cotransfección de PYK2
subclonado en pLSV conjuntamente con pSV2neo utilizando reactivo de
lipofectamina (GIBCO BRL). Después de la transfección las células se
desarrollaron en medio modificado Dulbecco Eagle conteniendo 10% de
suero bovino fetal y 1 mg/ml de G418. Las transfecciones
transitorias en las células 293 se realizaron utilizando una técnica
de fosfatasa de calcio.
GST-PYK2- Un fragmento de
ADN de \lambda900 pares de bases correspondiente a los residuos
362-647 de PYK2 fue amplificado por PCR utilizando
los siguientes cebadores de oligonucleótidos:
5' -CGGGATCCTCATCATCCATCCTAGGAAAGA- 3' (sentido)
[ID. DE SEC. NO: 5]
y 5' -CGGGAATTCGTCGTAGTCCCAGCAGCGGGT- 3'
(antisentido) [ID. DE SEC. NO: 6).
El producto de PCR fue digerido mediante BamHI y
EcoRI y fue subclonado en un pGEX3X (Pharmacia). La expresión de la
proteína de fusión GST-PYK2 fue inducida mediante
IPTG 1 mM básicamente como se describe en Smith et al.,
(Gene 67:31, 1988). La proteína de fusión se aisló por
electroelución a partir de SDS-PAGE.
PYK2- La secuencia total de ADNc de PYK2
se subclonó en los siguientes vectores de expresión de mamíferos:
pLSV; corriente abajo del promotor prematuro de SV40,
pLXSN-vector retroviral; corriente debajo de la
repetición terminal larga Mo-MuLV; pRK5; corriente
abajo del promotor de CMV.
PYK2-HA- el péptido de la
hemaglutinina del virus de la gripe (YPYDVPDYAS) [ID. DE SEC. NO: 7]
fue fusionado al extremo C-terminal de PYK2
utilizando los siguientes cebadores oligonucleótidos en la PCR:
5'-CA
CAATGTCTTCAAACGCCAC-3' [ID. DE SEC. NO: 8] y 5'-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATC
GTATGGGRACTCT GCAGGTGGGTGGGC CAG-3' [ID. DE SEC. NO: 9]. El fragmento amplificado fue digerido con RsrII y XbaI y se utilizó para sustituir el fragmento correspondiente de PYK2. La secuencia de nucleótidos de la construcción final fue confirmada por secuenciación de ADN.
CAATGTCTTCAAACGCCAC-3' [ID. DE SEC. NO: 8] y 5'-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATC
GTATGGGRACTCT GCAGGTGGGTGGGC CAG-3' [ID. DE SEC. NO: 9]. El fragmento amplificado fue digerido con RsrII y XbaI y se utilizó para sustituir el fragmento correspondiente de PYK2. La secuencia de nucleótidos de la construcción final fue confirmada por secuenciación de ADN.
mutante negativo de quinasa- Con la
finalidad de construir un mutante negativo de quinasa, la Lys en la
posición 457 fue sustituida por Ala por medio de mutagénesis
dirigida (Clontech). La secuencia de oligonucleótidos fue diseñada
para crear una nueva diana de restricción para NruI. La secuencia de
nucleótidos del mutante fue confirmada por secuenciación de ADN. La
secuencia de oligonucleótdos que se utilizó para la mutagénesis fue
la que sigue:
5'-CAATGTAGCTGTCGCGACCTGCAAGAAAGAC-3'
[ID. DE SEC. NO: 10] (sitio NruI - negrita, Lys-AAC
sustituido a Ala-GCG subrayado).
Rak-HA- El ADNc de Rak fué
subclonado en pBluescript y obtenido a partir de Bernardu Rudi (NYU
medical center). El péptido hemaglutinina del virus de la gripe se
fusionó con el extremo C-terminal de Rak
esencialmente como se describe para PYK2. Los cebadores de
oligonucleótidos que fueron utilizados en la PCR fueron:
5'-GCCAGCAGGC
CATGTCACTGG-3' [ID. DE SEC. NO: 11] y 5'-CGGAATTCTTACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGG
TAGACATCAGTTAACATTTTG-3' [ID. DE SEC. NO: 12]. El producto de PCR fue digerido con BalI y EcoRI y fue utilizado para sustituir el fragmento correspondiente al extremo C-terminal de Rak. El ADNc de Rak-HA fue subclonado en pRK5 corriente abajo del promotor DMV y fue introducido en el vector retroviral pLXSN, corriente abajo de la repetición terminal larga Mo-MuLV.
CATGTCACTGG-3' [ID. DE SEC. NO: 11] y 5'-CGGAATTCTTACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGG
TAGACATCAGTTAACATTTTG-3' [ID. DE SEC. NO: 12]. El producto de PCR fue digerido con BalI y EcoRI y fue utilizado para sustituir el fragmento correspondiente al extremo C-terminal de Rak. El ADNc de Rak-HA fue subclonado en pRK5 corriente abajo del promotor DMV y fue introducido en el vector retroviral pLXSN, corriente abajo de la repetición terminal larga Mo-MuLV.
El oligonucleotido mutagénico
(GAGTCAGACATCTEC-GCAGAGATTCCC) ID. DE SEQ. NO: 26 y
el oligonucleótido trans GAATTCGATATCACGCGTGGCCGCCATGGC) ID. DE SEQ.
NO: 27, fueron usados para convertir la tirosina en la posición 402
a fenilalanina de PYK2 utilizando un kit Clontech. Lev et al.
Nature 376:737-745 (1995). La mutación se validó
a través de secuenciación de ADN.
Celulas fueron lisadas utilizando un tampón de
lisis conteniendo 50 mM de ácido
N-2-hidroxietil-pipera-zina-N'-2-etanosulfúrico
(HEPES pH 7,5), 150 mM NaCl, glicerol al 10%, Triton
X-100 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, ácido
etilenglicol-bis
(\beta-aminoetileter)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA) 1 mM, 10 \mug/ml de leupeptina, 10 \mug/ml de aprotinina,
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, 200 \muM de
ortovanadato de sodio y 100 mM fluoruro sódico. Las
inmunoprecipitaciones fueron realizadas utilizando proteína
A-sefarosa (Pharmacia) acoplada a anticuerpos
específicos. Los inmunoprecipitados fueron lavados con solución
HNTG' (tampón HEPES 20 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol 10%,
Triton X-100 0,1%, fluoruro sódico 100 mM,
ortovanadato de sodio 200 \muM) o sucesivamente con solución H'
(Tris-HCl 50 mM pH8, NaCl 500 mM, SDS 0,1%, Triton
X-100 0,2%, NaF 100 mM, ortovanadato de sódio 200
\muM) y solución L' (Tris-HCl 10 mM pH8, Triton
X-100 0,1%, NaF 100 mM, ortovanadato de sodio 200
\muM).
Los inmunoprecipitados lavados se incubaron
durante 5 minutos con tampón gel de muestreo a 100ºC y analizados
por medio de electroforesis en gel de
poliacrilamida-sodio dodecil sulfato
(SDS-PAGE). En algunos experimentos las proteínas
embebidas en el gel fueron transferidas eletroforéticamente a
nitrocelulosa. El blot fue entonces bloqueado mediante TBS
(Tris 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM) que contenía un 5% de leche
desnatada y un 1% de ovoalbúmina. El antisuero o mAbs purificados
fueron entonces añadidos en la misma solución y la incubación se
desarrolló durante 1 hora a 22ºC. Para la detección los filtros
fueron lavados tres veces (5 minutos por cada lavado) con TBS 0,05%
Tween-20 y se dejo reaccionar durante 45 minutos a
temperatura ambiente con proteína A conjugada con peroxidasa de
rábano picante. El enzima fue eliminado por lavado tal y como ha
sido descrito más arriba, y los filtros fueron sometidos a reacción
durante 1 minuto con un reactivo quimioluminiscente (ECL, Amersham)
y expuestos a una película para autoradiografía durante
1-15 minutos.
Este ensayo se desarrolló en inmunoprecipitados
en 50 \mul HNTG (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM; glicerol 20%,
Triton X-100 0,1%) conteniendo MnCl_{2}10 mM, y 5
\muCi o [mN-^{32}P]ATP durante 20 minutos
a 22ºC. Las muestras fueron lavadas con soluciones de lavado H', M'
y L', hervidas durante 5 minutos en tampón de muestreo y separadas
por SDS-PAGE.
ACK/PYK puede ser aislado como se describe en
Manser et al,, Nature, 363:364-367, 1993. El
análisis por comparación de la secuencia de longitud total de
ACK/PYK con otras tirosina quinasas indica que no está íntimamente
relacionada con ninguna de éstas, aunque tiene algunas similitudes
con la quinasa de adhesión focal. Por lo tanto ACK/PYK representa
una clase separada de tirosina quinasas y el aislamiento de los
genes relacionados que pertenecen a la misma clase es un logro
principal.
Para identificar genes relacionados a la proteína
tirosina quinasa ACK/PYK, la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se aplicó en combinación con un cebador de oligonucleótidos
degenerado basado en motivos conservados del dominio quinasa de
PTKs.
Los cebadores de oligonucleótidos diseñados
específicamente para un motivo N-terminal altamente
conservado de PTKs con subdominio TK6 (IHRDLAARN) ID. DE SEC. NO:
13. y cebadores C-terminales ACK/PIK específicos con
un subdominio TK9 (WMF-GVTLW) ID. DE SEC. NO: 14 se
utilizaron. Las reacciones de amplificación con los moldes ADNc a
partir de 8 fuentes diferentes dio los fragmentos de
0,2-0,9kb. Los productos de PCR se subclonaron en
pBlueScript y se cribaron mediante secuenciación de ADN e
hibridización en condiciones de astringencia bajas.
Se identificó un fragmento de ADNc de 210 pares
de bases a partir de médula espinal de rata que está altamente
relacionado con la Quinasa de Adhesión Focal (FAK). El fragmento se
secuenció en las direcciones 3' y 5' y a continuación se usó como
sonda para cribar genotecas de ADNc (cerebro fetal humano
\lambdagt 10 y cerebro humano \lambdagt 11, 6x10^{5} clones
recombinantes cada uno).
Varios clones sobrelapados diseminados de
1,5-3kb se aislaron y sus insertos ADNc se
analizaron por PCR, el mapeo de restricción y secuenciación. Se
escogieron dos clones (#1 y #11) para su posterior análisis y
subclonación. El clon #1 contiene un inserto de 2,7kb del extremo 5'
del gen, y el clon #11 contiene un inserto de 3kb del extremo 3'del
gen.
Utilizando una serie de subclones y cebadores de
oligonucleótidos sintetizados se determinó la secuencia de longitud
total de PYK-2. El análisis de secuencia resultó en
un secuencia compuesta de 3309 pares de bases de longitud que
contiene una región sin traducir 5' de 104 pares de bases, una
región codificante de 3021 pares de bases y una región 3' sin
traducir de 184 pares de bases. El ATG que codifica el codón de
inicio está precedido por cuatro codones de inicio de la traducción
en todos los marcos de lectura.
El marco de lectura abierto largo codifica una
proteína de 1007 aminoácidos (masa molecular prevista de 110.770d)
cuya organización estructural es muy similar a FAK. La proteína
PYK-2 contiene una secuencia
N-terminal larga de 422 aminoácidos seguido de un
dominio catalítico de tirosina quinasa. La proteína
PYK-2 también contiene los motivos estructurales
comunes a todos los PTKs, dos dominios ricos en prolina (19,6% y 17%
prolina respectivamente) y un motivo diana de adhesión focal (FA) en
el extremo C-terminal. El análisis por comparación
de la secuencia de aminoácidos de PYK-2 con el FAK
humano reveló una identidad del 52% entre las dos proteínas. El
dominio quinasa y la secuencia FAT están íntimamente relacionadas
(62% homología).
La proteína PYK-2 contiene varios
sitios de unión previstos para los sustratos intracelulares. Por
ejemplo, YLMV [ID. DE SEC. NO: 15] es un sitio de unión previsto
para el dominio SH2 de GRB2 tirosina 879 de PYK-2.
YVVV [ID. DE SEC. NO: 16] es un sitio de unión previsto para SHPTP2
- tirosina 903 de PYK-2. Hay sitios de fosforilación
previstos para PKC, PKA y Ca/Calmodulina quinasa. Además, la
tirosina 402 es un sitio de autofosforilación previsto
PYK-2 y puede estar implicado en la unión de un
dominio src SH2. Esto se basa en la homología entre la tirosina 397
de FAK que fue mapeado como un sitio de autofosforilación principal
tanto in vivo e in vitro. Esta tirosina proporciona un
sitio de unión de mayor afinidad para un dominio src SH2. Ambas
tirosina 397 de FAK y tirosina 402 de PYK-2 se
localizan en la juntura del extremo N-terminal y el
dominio catalítico y están seguidas por la secuencia (Y)AEI
que es muy similar al consenso del YEEI péptido de unión del dominio
src SH2 de alta afinidad.
El RNA total de la medula espinal de rata se usó
para preparar el ADNc utilizando la transcriptasa reversa del virus
de la leucemia murina Molony ("Superscript", BRL) de acuerdo
con el protocolo del fabricante. El ADNc se amplificó mediante PCR
utilizando cebadores de oligonucleótidos degenerados
correspondientes a motivos tirosina quinasa conservados de
subdominios TK6 y TK9 de PYK1; (los cebadores sentido y antisentido
corresponden a las secuencias de aminoácidos IHRDLAARN [ID. DE SEC.
NO: 171] y WMFGVTLW [ID. DE SEC. NO: 18] respectivamente). La PCR se
llevó a cabo bajo las siguientes condiciones; 1 minuto a 94ºC; 1
minuto a 50ºC y 1 minuto a 68ºC durante 35 ciclos. El DNA
amplificado se subclonó y la secuencia, resultante en la
identificación de una nueva tirosina quinasa llamada PYK2. una
genoteca de cDNA de cerebro fetal humano \lambdagtlO (clontech) se
cribó con un clon de PCR marcado con ^{32}P elaborado
correspondiente a PYK2 de rata. Se aislaron cuatro clones
sobrelapados, su secuencia de DNA se determinó en ambas cadenas
utilizando series de cebadores de oligonucleótidos. La secuencia
consenso de 314 pares de bases contiene un marco de lectura abierto
simple de 3027 nucleótidos precedido por una región sin traducir 5'
de 105 nucleótidos. Las comparaciones de secuencias de aminoácidos
se realizaron usando, el algoritmo de Smith-Waterman
MPSRCH (IntelliGenetic) en el ordenador MasPar.
La secuencia de aminoácidos deducida de PYK2
humano de los clones de ADNC se muestra en la Figura 4. El dominio
tirosina quinasa se ilumina en una caja oscura. Dos dominios ricos
en prolina en la región C-terminal se marcaron
cuando se ponían a la sombra de la luz. Los residuos de aminoácidos
están numerados en la izquierda. La comparación de las secuencias de
aminoácidos del dominio catalítico de PYK2 con cuatro proteínas
tirosina quinasas humanas demostraron el 61%, 43%, 40% y 41% de
identidad de secuencia entre PYK2 y Fak, Fer, HER4 y Abl,
respectivamente. La homología entre PYK2 y Fak se extiende más allá
del dominio catalítico con un 42% y 36% de identidad de aminoácidos
en las regiones N-terminal y
C-terminal, respectivamente.
PYK2 se expresa altamente en el sistema nervioso.
Se examinó el patrón de expresión y la distribución en los tejidos
de PYK2 por Northern blot y mediante análisis de hibridación in
situ.
La distribución en los tejidos de la expresión
PYK-2 se determinó mediante análisis por Northern
blot. Los ARNs Poli(A) se purificaron de tejidos de ratón
(hígado, pulmón, bazo, riñón, corazón, cerebro, piel, útero) y se
hibrida con dos sondas diferentes correspondientes a dos regiones
diferentes del gen PYK-2. Los resultados son
idénticos en ambos casos. Un transcrito de 4,2-4,5
kb PYK-2 es relativamente abundante en el cerebro
pero también se encuentra en menos proporción en el bazo y los
riñones.
Una sección sagital de una película de
autoradiografia de un cerebro adulto muestra niveles muy altos de
expresión en el bulbo olfactivo (OB), hipocampo (Hi), y
circunvolución dentada (DG). Se observan niveles de expresión
moderados en la corteza cerebral (Cx), striatum (S), y tálamo
(T). Se vieron bajos niveles de expresión en el cerebelo (Cb) y
tronco cerebral (BS).
La expresión de mARN de PYK2 se determinó por
análisis de Northern blot de poli(A)+ de varios tejidos
humanos. El northern blot se hibridó con 3,9 kb del fragmento
^{32}P-marcado conteniendo el ADNc de PYK2 en 50%
formamida a 42ºC. El ARNm del Northern blot aislado de varias
secciones cerebrales humanas (amígdalas, núcleo caudado, cuerpo
calloso, hipocampo, hipotálamo, sustancia negra, núcleo subtalámico
y tálamo) reveló una elevada expresión en el hipocampo y amígdalas,
nivel de expresión moderado en el hipotálamo, tálamo y núcleo caudal
y bajos niveles de expresión en el cuerpo calloso y núcleo
subtalámico.
Estos resultados son consistentes con el análisis
de hibridación in situ en las secciones de cerebro de ratas
el 7º día post-natal utilizando sondas
anti-sentido derivadas de la secuencia PYK2 10. El
análisis de hibridación in situ demuestra que el bulbo
olfactivo, el hipocampo y el giro dentado exhibieron altos niveles
de transcritos PYK2. Se detectaron niveles moderados de expresión de
PYK2 en el striatum, corteza cerebral y tálamo y se detectaron bajos
niveles de expresión en el cerebelo y tronco cerebral.
Con el fin de caracterizar la proteína PYK2, las
células NIH3T3 se transfectaron con un vector de expresión mamífero
que codifica la proteína PYK2 con un péptido de hemaglutanina de
virus influenza tag. PYK2 se inmunoprecipitó con tanto anticuerpos
anti-PYK2 como anti-HA a partir de
la célula transfectada 3T3, mientras que la proteína PYK2 endógena
inmunoprecipitó con anticuerpos anti-PYK2 a partir
de células PC12. Estos anticuerpos precipitaron una proteína que
migró en geles SDS con un peso molecular aparente de 112 25 kDa. La
adición de Y-[32p]ATP para inmunoprecipitados a partir de
células transfectadas con PYK2 seguidas de análisis
SDS-PAGE y una autoradiografía mostró que PYK2
experimenta una fosforilación en los residuos tirosina.
La expresión de PYK-2 en
diferentes líneas celulares se analizó mediante IP/IB utilizando
anticuerpos anti-PYK-2 dirigidos al
dominio quinasa tal como se describe previamente
(GST-PYK-2). El patrón de expresión
se resume en la tabla 1. Algunas de las observaciones interesantes
son el cambio de mobilidad de PYK-2 tras la
diferenciación de CHRF y L8057 (líneas celulares de premegacariocito
35) por TPA, elevada expresión de Fak y PYK-2 en
diferentes líneas celulares; y en células XC (sarcoma de rata)
PyK-2 se fosforila en tirosina.
PYK2 inmunoprecipitó a partir de células NIH3T3,
células NIH3T3 que sobreexpresan PYK2-HA y células
PC12. Los inmunocomplejos se lavaron y resolvieron mediante 7,5%
SDS-PAGE. El inmunoblotting se realizó con
anticuerpos anti-PYK2. La actividad quinasa in
vitro de PYK2. Las células Cos se transfectaron transitoriamente
con el vector de expresión PYK2-HA (+) o con un
vector vacío (-). La proteína PYK2 inmunoprecipitó con anticuerpos
anti-HA, los inmunocomplejos se lavaron y se
sometieron al ensayo de la quinasa in vitro.
La hibridización in situ se realizó tal
como sigue: Los cerebros de rata congelados en fresco se cortaron en
un criostato en secciones de 20 mm de grosor y se montaron
descongeladas en portaobjetos cubiertas de gelatina. Las secciones
se fijaron en 4% de paraformaldehído en fosfato sódico 0,1 M (pH=
7,4) durante 30 minutos y se dispusieron tres veces durante 5
minutos cada una en PBS y una vez durante 10 minutos en 2 X SSC. La
dos sondas se usaron en el análisis de hibridación, un
oligonucleótido de 51 bases complementario a la secuencia
codificante de los aminoácidos 301-317, y un
oligonucleótido de 51 bases complementario a la secuencia
codificante por los aminoácidos 559-575 (a partirde
un producto de PCR de rata).
Los oligonucleótidos se marcaron con
a-^{35}S dATP (Du Pont-New England
Nuclear) usando la
desoxi-nucleotidil-transferasa
terminal (Boehinger Mannheim) y se purificó usando columnas de giro
rápido Sephadex G-25 (Boehinger Mannheim). La
actividad específica de las sondas marcadas está entre 5 x 10^{8}
y 1 x 10^{9} cpm/mg. La pre-hibridación e
hibridación se llevaron a cabo en un tampón conteniendo formamida
desionizada 50%, 4 X SSC, 1 X solución de Denhardts, 500 ug/ml de
DNA de esperma de salmón desnaturalizado, 250 ug/ml tARN de
levadura, y 10% dextrano sulfato. El tejido se incubó durante 12
horas a 45ºC en una solución de hibridación conteniendo la sonda
marcada (1 x 10^{6} cpm/sección) y 10 mM ditiotreitol.
Los controles de especificidad se realizaron en
secciones adyacentes mediante inhibición competitiva de la
hibridación de los oligonucleótidos marcados con una concentración
30 veces de oligonucleótidos sin marcar y por hibridación con sondas
sentido. Tras la hibridación, las secciones se lavaron en dos
cambios de 2 X SSC a temperatura ambiente durante 1 hora, 1 X SCC a
55ºC durante 30 minutos, 0,5 X SSC a 55ºC durante 30 minutos, y 0,5
X SSC a temperatura ambiente durante 15 minutos y entonces se
deshidrató en 60, 80, 95; y 100% etanol. Tras secar en aire, las
secciones se expusieron a una película de rayos X durante 5 días.
Las secciones entonces se sumergieron en una emulsión fotográfica
Ilford K.5 (Polisciences), expuesta durante 4 semanas a 4ºC, y se
desarrolló usando un Kodak D-19 y unfijador
rápido.
La autoradiografía de emulsión se examinó
mediante microscopía de campo oscuro en un axioskop Zeiss. El
péptido de hemaglutinina del virus influenza (YPYDVPDYAS) [ID. DE
SEC. NO: 19] tag se añadió al extremo C-terminal de
PYK2 utilizando los siguientes cebadores de oligonucleótidos en la
PCR; '5-CACAATGTCTTCAAACGC
CAC'3' [ID. DE SEC. NO: 20] y '5-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGG-TACTCTG
CAGGTGGGT-GGCCAG-'3' [ID. DE SEC. NO: 21]. El fragmento amplificado se digerió con RsrII y Xbal y usado para sustituir el fragmento correspondiente de PYK2. La secuencia de nucleótidos de esta construcción se confirmó por secuenciación de ADN. El ensayo de quinasa in vitro se llevó a cabo en inmunoprecipitados en 50 \mul de HNTG (20 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 20% glicerol, 0,1% Triton X-100) conteniendo 10 mM MnCl_{2}, y 5 mCi de
[\lambda-^{32}P] ATP durante 20 minutos a 22ºC. Las muestras se lavaron con H' (50 mim Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,2% Triton X-100, 5 mM EGTA,100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico), M' (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 7,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,2% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico) y L (10 mM Tris-HCl pH 8; 0,1% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico) lavado, soluciones, hervido durante 5 minutos en el tampón de muestra y separado mediante SDS-PAGE.
CAC'3' [ID. DE SEC. NO: 20] y '5-GGCTCTAGATCACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGG-TACTCTG
CAGGTGGGT-GGCCAG-'3' [ID. DE SEC. NO: 21]. El fragmento amplificado se digerió con RsrII y Xbal y usado para sustituir el fragmento correspondiente de PYK2. La secuencia de nucleótidos de esta construcción se confirmó por secuenciación de ADN. El ensayo de quinasa in vitro se llevó a cabo en inmunoprecipitados en 50 \mul de HNTG (20 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 20% glicerol, 0,1% Triton X-100) conteniendo 10 mM MnCl_{2}, y 5 mCi de
[\lambda-^{32}P] ATP durante 20 minutos a 22ºC. Las muestras se lavaron con H' (50 mim Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,2% Triton X-100, 5 mM EGTA,100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico), M' (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 7,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,2% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico) y L (10 mM Tris-HCl pH 8; 0,1% Triton X-100, 100 mM NaF, 200 \muM ortovanadato sódico) lavado, soluciones, hervido durante 5 minutos en el tampón de muestra y separado mediante SDS-PAGE.
Se obtuvieron anticuerpos contra PYK2 en conejos
inmunizados con proteína de fusión GST conteniendo los residuos
62-647 de PYK-2. Los anticuerpos
frente el virus influenza (péptido hemaglutinina) se obtuvieron de
Boehringer Mannheim. El lisado de células, inmunoprecipitaciones y
el inmunoblotting se realizó esencialmente tal como se describe por
Lev et al. Mol.Cell.Biol. 13, 2224-2234,
1993,
Con el fin de analizar las propiedades
bioquímicas de PYK-2, el ADNc de longitud total se
subclonó en los dos vectores de expresión mamíferos RK5 y pLSV. En
paralelo, se construyó un vector de expresión codificando la
proteína PYK-2 fusionada al péptido de la
hemaglutinina del virus influenza. Esta construcción se usó para
identificar la proteína utilizando anticuerpos
anti-HA.
pLSV-PYK-2-HA
se transfectó en células cos. La proteína se expresó a la masa
molecular prevista (-116 kD) tal como se determina mediante IP e IB
con anticuerpos anti-HA. La proteína es una quinasa
activa tal como se determinó mediante ensayo de la quinasa in
vitro utilizando ^{(\lambda32P)}ATP o un ensayo de quinasa
in vitro utilizando ATP frío e inmunobloting con anticuerpos
anti-fosfotirosina.
El PYK-2 ADNc clonado en pLSV se
co-transfectó con pSV2neo en células PC12 y NIH3T3
con el fin de establecer líneas celulares estables. Las colonias
resistentes G418 se cribaron mediante inmunoprecipitación e
inmunoblotting.
Las líneas celulares NIH3T3 se establecieron para
sobreexpresar la proteína PYK-2 y
PYK-2-HA. En estas células PYK2
subyace la fosforilación de tirosina en respuesta a PDGF, EGF y
aFGF. El nivel de fosforilación no es demasiado alto. El efecto más
fuerte se obtiene por tratamiento TPA (6 \muM) tras 15 minutos de
incubación a 37ºC tal como se determina mediante el análisis del
curso del tiempo.
La fosforilación de PYK-2 en
residuos tirosina en respuesta a diferentes estímulos se analizó
mediante inmunoprecipitación de PYK-2 e
inmunoblotting con anticuerpos anti-fosfotirosina y
viceversa.
Se usaron los siguientes tratamientos:
Bradicinina, TPA, forscolina, forscolina + TPA, bradicinina +
forscolina, NGF, Neuropéptido Y, Toxina del cólera, Toxina del
cólera + TPA, Toxina del cólera + bradicinina, toxina
pertusis, toxina pertusis + TPA, bradicinina + toxina
pertusis, ionóforo de calcio A23187, bombesina.
Se obtuvieron los siguientes resultados;
PYK-2 subyace a la fosforilación de tirosina en
respuesta a TPA (1,6 \muM 15 minutos a 37ºC), bradicinina (1
\muM 1 minuto a 37ºC) e ionóforo de calcio A23187 (2 \muM 15
minutos a 37ºC). La forscolina aumenta la respuesta de TPA pero no
proporciona ninguna señal por si misma. La toxina del cólera
proporcionó señales más altas en combinación con TPA y bradicinina
pero no causó la fosforilación de PYK-2 sólo. La
toxina pertusis también indujo la respuesta de TPA y
bradicinina pero no causó ninguna respuesta sólo. Con el fin de
determinar si el efecto de la bradicinina está mediado por la vía de
señalización PKC, los intentos para regular a la baja PKC por
tratamiento crónico con TPA (dos veces) no proporcionó una respuesta
clara. Una interpretación de estos resultados es que PKC y PKA (y
puede ser Ca/calmudolina quinasa) induce la
auto-fosforilación de PYK-2 en
respuesta a la fosforilación ser/the. Esta interpretación se puede
comprobar utilizando inhibidores específicos para PKC y PKAy
mediante análisis de fosfamino-ácido.
Las células PC12 confluentes en placas de 150 mm
se hicieron crecer durante 18 horas en DMEM conteniendo 0,5% de
suero de caballo y 0,25% de suero fetal bovino. Las células se
estimularon a 37ºC con diferentes agonistas tal como se indica, se
lavó con PBS frío y se lisó en 800 ml de tampón de lisis (Lev et
al., supra). Los lisados celulares se sometieron a
inmunoprecipitación con anticuerpos anti-PYK2.
Siguiendo el SDS-PAGE y transfiriendo a
nitrocelulosa las muestras se sometieron a inmunoblotting con
anticuerpos antifosfotirosina (RC20, laboratorios de transducción) o
anticuerpos anti-PYK2.
El carbacol induce la fosforilación de la
tirosina de PYK2 vía la activación del receptor nicotínico de la
acetilcolina. Los inmunoprecipitados de PYK2 a partir de células
PC12 se sometieron a los siguientes tratamientos: muscarina (ImM) o
carbacol (ImM) durante 20 seg a 37ºC. El carbacol (1 mM), DMPP (100
\muM), o carbacol tras pre-tratamiento con el
antagonista muscarínico atropina (100nM) o el antagonista
nicotínico mecamilamina (10 \muM) durante 5 minutos a 37ºC. La
incubación con carbacol en la presencia o ausencia de EGTA (3 mM)
tal como se indicó. Los inmunocomplejos se resolvieron por
SDS-PAGE, se transfirió a nitrocelulosa, y sondado
tanto con anticuerpos anti-fosfotirosina o con
anticuerpos anti-PYK2 tal como se indica. La
despolarización de membrana y el iónoforo de calcio inducen la
fosforilación de tirosina de PYK2. Los inmunoprecipitados de PYK2 a
partir de células inactivas PC12 se sometieron a los siguientes
tratamientos: Incubación con 75 mM KCl en presencia o ausencia de
EGTA (3 mM), la incubación con 6 \muM del ionóforo de calcio
A23187 durante 15 minutos a 37ºC. Los inmunoprecipitados se lavaron,
se resolvieron mediante 7,5% SDS-PAGE y se sometió a
inmunoblot con tanto anticuerpos antifosfotirosina o con anticuerpos
anti-PYK2.
La activación de PYK2 por carbacol,
despolarización de membrana y el influjo de Ca+2 se estudió. Desde
que PYK2 se expresa altamente en el sistema nervioso central y en
las células PC12, examinamos el efecto de una variedad de agonistas
neuronales en el estado de fosforilación de PYK2. En estos
experimentos, las células PC12 se trataron con un agonista, se
lisaron y se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos
anti-PYK2 seguido de análisis
SDS-PAGE e inmunoblotting con anticuerpos
específicos de fosfotirosina.
La estimulación de células PC12 con carbacol
indujo la fosforilación fuerte de la tirosina de PYK2. Exploramos la
posibilidad si la activación de ambos subtipos de receptores
colinérgicos llevan a los receptores nicotínicos y muscarínicos a la
fosforilación de tirosina de PYK2. El análisis farmacológico con
tanto agonistas del subtipo específico, muscarina y DMPP o
antagonistas de subtipo específicos, atropina y mecamilamina
indicaron la activación de PYK2 mediante carbacol está mediada vía
el receptor nicotínico de la acetilcolina. La fosforilación de PYK2
en respuesta a carbacol es muy rápida; 5 segundos tras la aplicación
de carbacol a las células, PYK2 apareció fosforilado en los residuos
tirosina. La eliminación de un extracto celular de calcio mediante
EGTA bloquea completamente la fosforilación inducida por agonistas
de la tirosina de PYK2, indicando el influjo de de calcio que se
requiere para la activación de PYK2 inducida por carbacol.
La estimulación del receptor nicotínico de la
acetilcolina induce la despolarización de membrana mediante influjo
del catión vía el poro del canal iónico. Hemos por lo tanto
comprobado si la despolarización de membrana inducida por una
concentración alta de cloruro de potasio causará el mismo efecto en
la fosforilación de tirosina de PYK2. La despolarización de las
células PC12 con 75 mM KCl induce la fosforilación rápida de la
tirosina de PYK2. La omisión de calcio del medio extracelular evita
completamente la fosforilación de la tirosina PYK2, indicando la
activación de PYK2 es debido al influjo de calcio más que a la
despolarización de la membrana per se. Para además explorar tal
posibilidad, examinamos el efecto del ionóforo de calcio en la
activación PYK2, PYK2 se fosforila en residuos tirosina seguido de
incubación con el ionóforo de calcio A23187. Estos resultados
muestran la elevación del calcio intracelular en respuesta a una
variedad de estímulos causa la fosforilación de la tirosina de
PYK2.
La fosforilación de tirosina de PYK2 en respuesta
a la activación de un receptor acoplado a una proteína G se estudió.
Analizamos el efecto de bradicinina en el estado de fosforilación de
PYK2. La bradicinina induce la fosforilación rápida de la tirosina
de PYK2 en células PC12. Por contraposición a la estimulación de la
fosforilación PYK2 en respuesta al tratamiento de carbacol o a la
despolarización de membrana, el efecto de la bradicinina no estuvo
influenciado por la omisión de calcio extracelular; la bradicinina
indujo la fosforilación de PYK2 en ausencia de calcio extracelular o
en la presencia de EGTA.
La incubación de células PC12 con forbol
miristato acetato (PMA) indujo la fosforilación de la tirosina de
PYK2, sugiriendo que la fosforilación de tirosina de PYK2 pudo
también estar mediada por la activación de una proteína quinasa C
(PKC). Para determinar si la fosforilación inducida por bradicinina
de PYK2 está mediada vía PKC, las células se trataron con
bradicinina o PMA seguido de una regulación a la baja de isozimas
PKC sensibles a PMA mediante tratamiento prolongado con PMA. El
tratamiento prolongado con PMA evitó completamente el efecto de PMA,
pero tuvo sólo un efecto menor en la fosforilación estimulada por
bradicinina de tirosina de PYK2. Estos resultados sugirieron que la
fosforilación de la tirosina de PYK2 pudo ser inducida por
mecanismos PKC-independientes y por
PKC-dependientes.
Las células 293 en placas de 65 mm se
transfectaron transitoriamente si el canal de potasio
RAK-HA sólo, o junto con Fak, PYK2 o el mutante
PYK2-quinasa negativo (PKN), tras 12 hr de
transfección continua las células se hicieron crecer en DMEM
conteniendo suero fetal bovino 0,3% durante 24 horas. Las células
fueron también estimuladas con PMA (1,6 \muM) o con ionóforo de
calcio A23187 (6 \muM) durante 15 minutos a 37ºC o se dejaron sin
estimular. Las células se solubilizaron y el nivel de expresión de
cada proteína se determinó mediante análisis por western blot. La
proteína Rak inmunoprecipitó por anticuerpos anti-HA
y su fosforilación en los residuos tirosina se analizó mediante
western blot utilizando anticuerpos
anti-fosfotirosina seguido de la inmunoprecipitación
de las proteínas tanto con anticuerpos anti-PYK2
(para PYK2 y PKN) o con anticuerpos anti Fax para(Fak).
El nivel de expresión de cada proteína (Rak PYK2,
PKN y Fak) y la fosforilación de la tirosina de Rak, PYK2, PKN y Fak
se midieron. Sólo la proteína quinasa activa PYK2 fosforiló el canal
de potasio. No se observó fosforilación con quinasa negativa PYK2 o
con FAK.
Las células PC12 se hicieron crecer en DMEM
conteniendo suero fetal bovino 0,25% y suero de caballo al 0,5%
durante 18 horas antes de la estimulación. Tras la estimulación, las
células se lavaron con PBS frío y se lisaron en 0,8 ml de tampón de
lisis (Lev et al.,Mol.Cell.Biol, 13,
225-2234, 1993). PYK2 se inmunoprecipitó mediante
anticuerpos anti-PYK2, los inmunoprecipitados se
resolvieron en 7,5% SDS-PAGE y se sometieron a
inmunoblot tanto con anticuerpos anti-fosfotirosina
(RC20, laboratorios de transducción) o con anticuerpos
anti-PYK2. Los anticuerpos contra PYK2 se obtuvieron
de conejos.
La fosforilación de la tirosina de PYK2 en
respuesta a diferentes estímulos se estudió. Las células inactivas
PC12 fueron estimuladas a 37ºC con carbacol (1 mM, 20 seg),
bradicinina (1 \muM, 1 min KCl (75 mM, 3 mm), PMA 1,6 \muM,
15 min), A23187 (6 \muM, 15min) o se dejó sin estimular (-). PYK2
se hizo inmunoprecipitar a partir de los lisados celulares con
anticuerpos anti-PYK2, seguido de
SDS-PAGE e inmunoblotting, con anticuerpos
anti-fosfotirosina o anti-PYK2. La
fosforilación de tirosina de Shc en respuesta a bradicinina,
carbacol, PMA y otros estímulos también se midió. Las células PC12
inactivas se estimularon durante 5 min a 37ºC con bradicinina (1
\muM), carbacol (1 mM), KCl (75 mM), PMA (1,6 \muM), NGF (100
ng/ml), o se dejó sin estimular (-). Las células también se
estimularon con carbacol (1 mM) o cloruro de potasio (75 mM) en la
presencia de 3 mM EGTA. Las estimulaciones con DMPP (100 \muM) o
muscarina (1 mM) se realizaron bajo las mismas condiciones. El curso
del tiempo de la fosforilación de tirosina inducida por carbacol se
realizó mediante incubación de las células con 1 mM de carbacol. Las
proteínas Shc inmunoprecipitaron con anticuerpos
anti-Shc, los inmunoprecipitados se resolvieron por
SDS-PAGE (8%), se transfirieron a nitrocelulosa y se
sometieron a inmunoblot con anticuerpos
anti-fosfotirosina.
Con el fin de explorar la posibilidad que la
activación de PYK2 inducida por calcio es responsable de la
fosforilación de la tirosina de Shc y activación de la vía de
señalización Ras/MAPK, hemos examinado la capacidad de PYK2 para
reclutar elementos reguladores corriente arriba de esta vía de
señalización, tal como Shc y Grb2. Las células humanas embriónicas
293 se transfectaron transitoriamente con diferentes combinaciones
de vectores de expresión para dirigir la síntesis de PYK2,a un
mutante negativo de quinasa PYK2 (PKN) y la proteína adaptadora
Grb2. Los resultados muestran que Grb2 está asociado directamente
con PYK2 de tipo salvaje pero no con el mutante quinasa negativo.
Los experimentos con proteína de fusión GST de Grb2 indica que la
asociación entre Grb2 y PYK2 está mediada vía su dominio SH2. La
inspección de la estructura primaria PYK2 muestra que la tyr881 está
seguida por una secuencia LNV que mostró ser un sitio de unión
canónico para el dominio SH2 de Grb219.
A continuación examinamos la interacción de PYK2
con el factor de liberación del nucleótido gauanina SOS I. Las
células 293 de riñón embriónicas humanas se transfectaron con los
vectores de expresión codificando SOS 1, PYK2 y PKIN y se sometieron
a un análisis de inmunoprecipitación/inmunoblotting con anticuerpos
anti Sos1 o anti-PYK2, respectivamente. El PYK2 de
tipo salvaje pero no el mutante quinasa negativo (PKN) se
co-inmunoprecipitaron con la proteína Sos1. Así,
Grb2 se unió a Sos1 vía sus dominios SH3 y a PYK2 vía su dominio SH2
llevando al reclutamiento de Sos por la PYK2 tirosina
fosforilada.
El factor de crecimiento indujo la activación del
receptor de tirosina quinasa llevando a un cambio en la mobilidad
electroforética de la proteína SOS. El cambio de mobilidad se mostró
que fue debido a la fosforilación mediante serina y treonina
quinasas que eran dependientes de la activación Ras incluyendo la
MAP quinasa 11, 12, 20. La proteína SOS 1 de las células
transfectadas PYKI- exhibió una mobilidad electroforética reducida
en comparación con la proteína SOS 1. Este experimento muestra la
sobreexpresión PYK2 que lleva a la activación de las ser/thr
quinasas responsables de la fosforilación de SOS 1.
293 células se transfectaron transitoriamente con
ADNcs de longitud completa de PYK2, PKN Grb2 y
hSosl-HA clonada en los vectores de expresión
mamífera pRK5 corriente abajo del promotor CMV, usando el método de
precipitación de fosfato cálcico (Wigler et al., Cell 16,
777-785, 1979). Doce horas tras la transfección, las
células se incubaron en medio conteniendo 0,2% de suero fetal bovino
durante 24 horas. Las células se lisaron, se sometieron a
inmunoprecipitación, se resolvieron mediante
SDS-PAGE (15% para Grb2 IPS, 7,5% para PYK2 IPS) y
se sometieron a inmunoblot esencialmente tal como se describe (Lev
et al., Mol.Cell.Biol. 13, 2224-2234, 1993).
Para el inmunoblotting se usaron anticuerpos monoclonales de ratón
contra Grb2 (Laboratorios de Transducción #G16720). El mutante
quinasa negativo de PYK2 se construyó tal como se describe. Un
vector de expresión mamífero que codifica hSos1-HA
se construyó tal como se describe (Aronheim et al., Cell. 78,
949-961,1994).
Las células 293 de riñón embriónico humano se
transfectaron transitoriamente con diferentes combinaciones de
vectores de expresión mamíferos que dirigieron la síntesis de Grb2,
PYK2 y a un mutante de punto PYK2 quinasa negativo (PKN). Las
células se solubilizaron e inmunoprecipitaron con anticuerpos
anti-Grb2 o anti-PYK2. Los
inmunocomplejos se lavaron, se resolvieron con
SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se
sometieron a inmunoblot con tanto anticuerpos
anti-PYK2 o anti-Grb2. El nivel de
expresión de Grb2 en cada célula se determinó por el inmunoblotting
de los lisados totales de células con anticuerpos
anti-Grb2.
Las células 293 de riñón embriónico humano se
transfectaron temporalmente con vectores de expresión mamíferos
codificando hsos1-HA, hSos1-HA junto
con PYK2 o hSos1-HA junto con PKN. Hsos1 se
inmunoprecipitó con anticuerpos anti HA a partir de cada línea
celular, y la presencia de PYK2 en los inmunocomplejos se determinó
por inmunobloting con anticuerpos anti-PYK2. Los
niveles de expresión de hsosl, PYK2 y PKN se determinaron mediante
análisis por inmunoblot de lisados de células totales, con
anticuerpos anti-HA o anti PYK2.
El receptor EGF activado es capaz de reclutar
directamente e indirectamente Grb2. Hemos investigado por lo tanto,
si PYK2 puede inducir la fosforilación de Shc de la tirosina de Shc
y su asociación con Grb2. Las proteínas Shc inmunoprecipitaron con
anticuerpos anti Shc a partir de Shc, a partir de Shc y PYK2, o a
partir de células expresando Shc y PKIN. Las muestras se resolvieron
mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa
y se sometió a inmunoblot con
anti-fosfo-tirosina o anticuerpos
anti-Grb2. La fosforilación dramática de tirosina de
Shc en células para sobreexpresar PYK2. Además, varias proteínas
conteniendo fosfotirosina se encontraron en los inmunoprecipitados
Shc a partir de células que sobreexpresan PYK2. Se observaron
resultados similares expresando proteínas Shc endógenas que se
transfectaron con ADNc de PYK2 y se sometieron a análisis por
inmunoprecipitación con anticuerpos anti Shc. El análisis por
inmunoblot con anticuerpos Grb2 de los inmunoprecipitados Shc
indicaron que Grb2 estaba asociado con tirosina fosforilada Shc en
células que sobreexpresaban PYK2. Por lo tanto concluimos que la
tirosina fosforilada PYK2 puede directamente e indirectamente
reclutar Grb2 vía la fosforilación de la tirosina de Shc revelando
al menos dos vías alternativas para la activación inducida por PYK2
de la vía de señalización Ras.
La fosforilación de la tirosina de Shc en células
que co-expresan YK2 fue estándar. Las células que
expresan Shc sólo o co-expresan Shc junto con tanto
PYK2 o PKN se lisaron y sometieron a inmunoprecipitación con
anticuerpos anti-Shc o suero
pro-inmune (P.I.). Los inmunocomplejos se lavaron,
se hicieron correr en un gel SDS y se sometieron a inmunoblot con
anticuerpos anti-fosfotirosina. Las proteínas Shc
(46,52 y 66 kDa) se identificaron.
PYK2 induce la asociación de Shc con Grb2. Las
proteínas Shc inmunoprecipitaron a partir de cada línea celular
usando anticuerpos anti-Shc. Como control, los
lisados de células que co-expresan PYK2 y Shc se
sometieron a inmunoprecipitación con suero
pro-inmune (P.I.). La presencia de Grb2 en los
inmunocomplejos se determinó mediante inmunoblotting con anticuerpos
anti-Grb2.
El nivel de expresión de PYK2, PKN y Shc en cada
línea celular se determinó mediante análisis por inmunoblot de los
lisados de células totales con anticuerpos específicos tal como se
indica.
Los experimentos presentados a partir de aquí
muestran el mismo estímulo que induce la activación de PYK2 que
induce la fosforilación de la tirosina de Shc. A continuación
examinamos la capacidad de estos agentes para inducir la activación
de las quinasas en células PC12. Las células inactivas PC12 se
incubaron con una variedad de estímulos. Los lisados de células
estimuladas se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos
anti-MAP quinasa seguido de inmunoblotting, con
anticuerpos fosfotirosina. La proteína básica mielina (MBP) se
utilizó como sustrato para determinar la activación MAP quinasa. La
adición de varios ligandos a las células PC12 indujo un perfil
similar de fosforilación de tirosina y activación de MAP quinasa en
estas células.
Desde que se observó la activación de la MAP
quinasa en respuesta a estímulos para inducir la fosforilación PYK2,
examinamos la posibilidad si la sobreexpresión PYK2 puede inducir la
actividad MAP quinasa. Las células 293 de riñón embriónico humano se
transfectaron transitoriamente con concentraciones crecientes de
vectores de expresión mamíferos que dirigen la síntesis de PYK2. Las
células se hicieron crecer durante 24 horas en presencia de 0,2%
suero, las proteínas MAPK 1,2 inmunoprecipitaron, se lavaron y se
sometieron al ensayo de fosforilación MPB. Los resultados
presentados en la figura 4b muestra que la sobreexpresión PYK2
indujo la fosforilación de MPB de una manera dependiente de la
concentración
La cuantificación de estos resultados muestra que
la actividad MAP quinasa fue aproximadamente tres veces mayor en las
células que expresaban los niveles más altos de PYK2 en comparación
con células transfectadas falsamente.
Las células 293 se transfectaron transitoriamente
con vectores de expresión mamíferos para Shc sólo, Shc junto con
PYK2, o Shc junto con PKN. Las células PC12 se cultivaron durante 18
horas tal como se describe. Las células se estimularon durante 5
minutos a 37ºC con los estímulos indicados, se lisaron y se
sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos antiMAPK 1,2 (Santa
Cruz Biotechnology, #c-14 y #c-16).
Los inmunoprecipitados se lavaron dos veces con tampón de lisis (Lev
et al., Mol.Cell.Biol, 13, 2224-2234, 1993) y
una vez con tampón Tris conteniendo 10 mM Tris-HCl
pH 7,2, 100 mM NaCl, 1 mM Na-vanadato y 5 mM
benzamidina. Los inmunocomplejos se resuspendieron en 40 \mul de
tampón MAP quinasa conteniendo 30 mM Tris-HCl pH 8,
20 mM MgCl_{2}, 2 mM MnCl_{2}, 15 \mug MBP, 10 \muM ATP y 5
\muCi\tau-[^{32}P]ATP (Amersham). Las muestras se
incubaron durante 30 minutos a 30ºC y las reacciones se pararon
mediante la adición de SDS-tampón de muestra. Las
muestras se resolvieron en 15% SDS-PAGE y se
analizaron por autoradiografía. Las células 293 de riñón embriónicas
humanas se transfectaron temporalmente con concentraciones
crecientes de pRK5-PYK2 ADN (0,5 \mug). Doce horas
tras la transfección, las células se hicieron crecer en medio que
contenía 0,2% de suero durante 24 horas. Las células se lisaron,
inmunoprecipitaron con anticuerpos MAPK 1,2 y se sometieron al
ensayo de fosforilación MBP tal como se describe
anterior-
mente.
mente.
Las células PC12 inactivas se estimularon durante
5 minutos a 37ºC con bradicinina (1 \muM), carbacol (1 mM), KCl
(75 mM), PMA (1,6 \muM), NGF (100 mg/ml), o se dejaron sin
estimular (-). Las células se lisaron y MAPK 1,2 se hicieron
inmunoprecipitar con anticuerpos específicos. Los inmunocomplejos se
lavaron y también se resolvieron por SDS-PAGE, se
transfirieron a nitrocelulosa y se sometió a un inmunoblot con
anticuerpos anti-fosfotirosina, o se sometieron al
ensayo de fosforilación de la proteína básica de mielina (MBP).
La activación de MAP quinasa por
sobre-expresión de PYK2. Las células 293 de riñón
embriónico humano se transfectaron transitoriamente con
concentraciones crecientes de un vector de expresión mamífero que
dirige la síntesis de PYK2. Las proteínas MAPK 1,2 proteínas
inmunoprecipitaron a partir de cada línea celular y los
inmunocomplejos se lavaron y se sometieron al ensayo de
fosforilación del MBP. La cuantificación de la actividad MAP quinasa
de cada línea celular se determinó mediante un fosforimager y
software ImagQuant (Molecular Dinamics, Incorporaed). La actividad
MAPK en las células transfectadas se compara con la actividad
detectada en las células transfectadas falsamente control.
La estimulación de ligando, inmunoprecipitaciones
e inmunoblotting se realizaron. El tratamiento crónico con PMA se
realizó mediante incubación de las células con 100 nM de PMA durante
12 horas a 37ºC.
El curso del tiempo de la bradicinina induce la
fosforilación de la tirosina de PYK2. Las células inactivas PC12 se
incubaron a 37ºC con 1 \muM bradicinina durante el periodo de
tiempo indicado. PYK2 inmunoprecipitó a partir de células sin tratar
(-) o tratadas, los inmunocomplejos se lavaron, se resolvieron
mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa,
y se sondaron tanto con anticuerpos
anti-fosfotirosina como
anti-PYK2.
Las células inactivas PC12 se incuban con 1
\muM bradicinina (1 minuto a 37ºC) o con PMA (1,6 \muM, 15
minutos a 37ºC) en presencia o ausencia de CaCl o EGTA (3 \muM)
tal como se indique. En algunos casos las células se
pre-trataron con 100 nM PMA durante 12 h. PYK2 se
hizo inmunoprecipitar a partir de células estimuladas o sin
estimular (-) y analizadas mediante análisis inmunoblot con
anticuerpos anti-fosfotirosina o
anti-PYK2.
Examinamos la posibilidad de si PYK2 puede
fosforilar la tirosina del Canal Kv1.2 y regular su función. Con el
fin de ensayar esta posibilidad expresamos en células 293 la
proteína Kv1.2, Kv1.2 junto con PYK2, y como control Kv1.2 con un
mutante quinasa negativo PYK2 (PKN) o con la proteína tirosina
quinasa Fak. Las células se hicieron crecer durante 24 horas en un
medio que contiene 0,2% de suero y entonces se estimuló con PMA (1,6
\muM), ionóforo de calcio (6 \muM), o se dejó sin
estimular.
El análisis por Inmunoblotting con anticuerpos
fosfotirosina seguido de inmunoprecipitación de PYK2, PKN y Fak
mediante anticuerpos específicos. PYK2 y Fak se fosforilaron en
tirosina aún en células sin estimular y tratamiento con PMA indujo
la fosforilación de tirosina mientras el tratamiento con ionóforo de
calcio indujo una respuesta débil. El nivel de expresión del mutante
quinasa negativo de PYK2 (PKN) fue similar a la expresión de tipo
salvaje de PYK2 o FAK. No obstante, tal como se espera, PKN no se
encontró que fosforilara a los residuos tirosina. A continuación
analizamos la fosforilación de la tirosina del Canal Kv1.2 en cada
línea celular.
Nosotros hemos añadido a la construcción de
expresión ADNc de Kv1.2 una etiqueta HA y se determinó el nivel de
expresión de Kv1.2 mediante un análisis por inmunoblot con
anticuerpos anti-HA. Una cantidad similar de
proteína Kv1.2 se expresó en las líneas celulares transfectadas. La
proteína Kv1.2 inmunoprecipitó a partir de las células sin estimular
así como a partir de células estimuladas PMA o ionóforo de calcio.
Los inmunoprecipitados se resolvieron mediante
SDS-PAGE y se sometieron a inmunoblot con
anticuerpos anti-fosfotirosina. La fosforilación de
Kv1.2 en los residuos tirosina se observó sólo en las células que
co-expresan PYK2. Además, la fosforilación de la
tirosina de Kvl.2 se potenció mediante tratamientos con PMA o
ionóforo de calcio indicando que la activación de PYK2 se requiere
para PYK2 en la fosforilación de la tirosina del canal de
potasio.
Las células 293 de riñón embriónico humano se
transfectaron transitoriamente con diferentes combinaciones de
vectores de expresión mamíferos que dirigen la síntesis de
Kv1.2-HA, PYKZ, una quinasa negativa PYK2 (PKN) o la
proteína tirosina quinasa Fak. Las células se hicieron crecer
durante 24 h en la presencia de suero 0,2% y entonces se estimularon
con PMA (1,6 \muM, 10 minutos a 37ºC), el ionóforo de calcio
A23187 (6 \muM, 10 minutos a 37ºC) o se dejó sin estimular (-).
La fosforilación de la tirosina de cada proteína se analizó
siguiendo la inmunoprecipitación e inmunoblotting con anticuerpos
anti-fosfotirosina. La expresión de cada proteína se
determinó mediante análisis por inmunoblot del lisado de células
totales de cada transfección con anticuerpos
anti-PIKZ, anti-HA o
anti-Fak.
La fosforilación de la tirosina de Kv1.2 se
analizó mediante inmunoprecipitación de la proteína
Kv1.2-HA de cada línea celular con anticuerpos
anti-HA, seguido de análisis por inmunoblot con
anticuerpos anti-fosfotirosina. Las células 293 se
transfectaron mediante la técnica del fosfato de calcio tal como se
describe (Wigier et al., Cell. 16, 777-785,
2979). El péptido de hemaglutinina del virus influenza (YPYDVPDYAS)
[ID. DE SEC. NO: 22] tag se añadió al extremo
C-terminal y del cDNA de Kv1.2 utilizando los
siguientes cebadores de oligonucleótidos en la PCR;
'5GCCAGCAGGCCATGTCACTGG-3' [ID.
de SEC. Nº23] y
'5CGGAATTCTTACGATGCGTAGTCAGGGACATCGTATGGGTAGACATCAGTTAAC-ATTTTG-'3
[ID. DE SEC. NO: 24]. El producto de PCR se digerió con BAIT
y EcoR1 y se usó para sustituir el correspondiente fragmento al
extremo C-terminal del Kv1.2 ADNc. El
Kv1.2-HA ADNc se subclonó en pRK5 corriente abajo
del promotor CMV.
Un mutante de quinasa negativo de PYK2 (PKN) se
construyó mediante reemplazo de Lys475 con un residuo Ala utilizando
un kit de mutagénesis dirigida a un sitio (Clontech). La secuencia
de oligonucleótidos se diseñó para crear un nuevo sitio de
restricción NruI. La secuencia de nucleótidos del mutante se
confirmó mediante secuenciación del ADN. La secuencia de
oligonucleótidos que se usó para la mutagénesis es:
'5-CAATGTAGCTGTCGCGACCTGCAAGAAAGAC-3'
[ID. DE SEC. NO: 25] (sitio Nrul- negrita,
Lys-AAC sustituido a Ala-GCG
subrayado). Los ADNcs de longitud total de PYK2, PKN y Fak se
subclonaron en los vectores de expresión mamífera pRK5 corriente
abajo del promotor CMV.
Los transcritos de ARN capados in vitro de
Kv1.2, PYK2 y PKN se sintetizaron a partir de moldes de DNA de
plásmidos linearizados utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE (Ambion),
siguiendo el protocolo del fabricante. Los productos de la reacción
de transcripción (cARNs) se diluyeron en agua libre de ARNasa y se
conservó a -70ºC. La expresión de ARNs se hizo mediante inyección de
50 nl de ARN en oocitos desfoliculados en estado V y VI de
Xenopus laevis (Iverson et al.; J.Neurosc, 10,
2903-2916, 1990). Los oocitos inyectados se
incubaron durante 2-3 días a 20ºC en una solución
L15 (dilución en medio 1:2 de Gibco's Leibovitz L15 en H_{2}O, con
50 U/ml de nistatina, 0,1 mg/ml de gentamicina, tampón 30 mM HEPES,
pH 7,3-7,4, se filtró a través de una membrana 0,45
mm). El análisis y grabado electrofisiológico. Las corrientes
iónicas se grabaron con una prensa de voltaje de dos microelectródos
tal como se describe (Iverson et al., supra). La corriente se
filtró por un paso bajo de KHz usando un filtro de
8-polos Bessel y se almacenó en una microcomputadora
80286 usando el sistema de adquisición pClamp (Axon Instruments).
Los datos se analizaron con programas de ajustes de la prensa del
sistema pClamp (Axon Instruments). Todas las grabaciones se
realizaron a temperatura ambiente (20-230ºC). La
cámara de grabación se inundó continuamente con la solución de
grabación. Para evitar la contaminación del oocito por corrientes de
Cl activadas por Ca+^{2} se usó una solución de grabación de baja
corriente Cl^{-} (96 mM Na+, glutamato, 2 mM K+ glutamato, 0,5 mM
CaCl_{2}, 5 mM MgCl_{2}, 5 mM tampón HEPES). Las corrientes
Kt se elucidaronen pasos despolarizantes desde -100 a +40 mv en
incrementos de 10 mV cada 15 segundos. Las corrientes Kv1.2 a partir
de los oocitos microinyectados con tanto Kv1.2 mARN, Kv1.2 y PYK2
mARNs, o Kv1.2 y un mutante quinasa negativo de PYK2 mARNs (PKN).
Las corrientes se elucidaron en respuesta a pasos despolarizantes
desde incrementos -100 a + 30 mV desde un potencial alcanzado de
-110 mV. Las trazas representativas de canales Kv1.2 antes y después
de la aplicación de 100 nM de PMA en el tiempo anunciado (8 y 20
minutos) en la misma célula.
La supresión de las corriente Kv1.2 en respuesta
a PMA se bloquea mediante el mutante quinasa negativo PYK2 (PKN). La
inhibición de las corrientes Kv1.2 en un oocito microinyectado con
mARN Kv1.2, antes y 25 minutos después del tratamiento con PMA a una
concentración de 50 nM o 100 nM. Las grabaciones de expresión de un
oocito Kv1.2 y PYK2 o Kv1.2 y un mutante quinasa negativo de PYK2
bajo las mismas condiciones tal como se describen anteriormente. El
mismo protocolo se utilizó en ambos experimentos.
Preguntamos si la estimulación de PYK2 puede
suprimir las corrientes Kv1.2. Exploramos el efecto de la expresión
PYK2, en las corrientes exhibidas por la expresión Kv1.2 en los
oocitos de Xenopus. Los oocitos del estadio V se
microinyectaron tanto con transcritos Kv1.2 o con Kv1.2 junto con
PYK2 o PKN mARNs. Tras dos o tres días de incubación a 20ºC, las
corrientes macroscópicas exhibidas por los oocitos se grabaron con
una prensa de voltaje de dos microelectródos tal como se describe
(Iverson et al., J. Neurosc, 10,
2903-2916, 1990). Las corrientes rectificadoras
exteriores se grabaron tras la despolarización de la membrana
anterior -40mV, indicando que un canal funcional Kv1.2 se expresa en
los oocitos. La expresión de Kv1.2, PYK2 y PKN en los oocitos de
rana se confirmó mediante análisis del inmunoblot con anticuerpos
anti-HA o anti-PYK2.
Examinamos el efecto de la expresión PYK2 en
corrientes Kv1.2 en los oocitos en ausencia o presencia de PMA.
También examinamos el efecto del mutante quinasa negativo PKN en la
supresión inducida por PMA de corriente Kv 1.2 mediada por la
proteína endógena tirosina quinasa. El tratamiento de los oocitos
con PMA causó la inhibición de las corrientes Kv1.2. Tal como se
muestra previamente, la inhibición de las corrientes se desarrolló
gradualmente tras la aplicación de PMA alcanzando el
80-90% de inhibición tras 20 minutos de incubación
(Huang et al., Cell. 75, 1145-1156, 1993).
Además, la tasa de bloqueo del canal se encontró que era dependiente
de la concentración de PMA aplicado. La coexpresión de PYK2 resultó
en la aceleración de la inhibición de las corrientes Kv1.2. La
aceleración significativa de la inhibición de corriente se observó a
cada concentración de PMA ensayada. Por ejemplo, 8 minutos tras la
adición de 100 nM PMA, se observó un 25% de inhibición de la
corriente externa en los oocitos expresando Kv1.2 sólo como
compartido con el 95% de inhibición observada en los
oocitoscoexpresando las proteínas Kv1.2 y PYK2.
La inhibición de la corriente mediante
tratamiento con PMA en la ausencia o presencia de la expresión PYK2
no resultó en cambios en la dependencia de voltaje o cinética de las
corrientes restantes. La coexpresión de Kv1.2 junto con el mutante
quinasa negativo de PYK2 (PKN) lleva a la casi completa inhibición
de PMA inducida por el bloqueo de los canales de potasio. Es posible
que la proteína endógena tirosina quinasa activada por PMA que es
responsable de la supresión de las corrientes Kv1.2 en los oocitos
representan un homólogo de xenopus de PYK2 o una proteína
íntimamente relacionada tirosina quinasa que puede estar afectada
por un mutante interferente dominante de PYK2.
Hemos demostrado ahora que el ácido
lisofosfatídico (LPA) y bradicinina inducen de hecho la
fosforilación de la tirosina de PYK2 así como la formación de
complejos entre PYK2 y Src activado. Esta observación proporciona
nuevas estrategias para cribar los moduladores de las vías de
señalización de PYK2. Además, la fosforilación de tirosina de PYK2
conduce a la unión del dominio SH2 de Src a la tirosina en la
posición 402 de PYK2 y la activación de Src, proporcionando así otra
información útil en el diseño racional de tales moduladores de la
vía de señalización PYK2. La sobreexpresión transitoria de un
mutante interferente dominante de PYK2 o la proteína tirosina
quinasa Csk reduce la activación inducida mediante LPA o bradicinina
de la MAP quinasa. La activación de la MAP quinasa inducida por LPA
o bradicinina también fue inhibida mediante la
sobre-expresión de mutantes interferentes dominantes
de Grb2 y Sos. Así, sin desear estar unido a ninguna teoría de la
invención en particular, proponemos que PYK2 actúe en concierto con
Src a la unión a receptores acoplados a Gi- y Gq- con Grb2 y Sos
para activar la vía de señalización MAP quinasa en las células
PC12.
Las células PC12 se estimularon con ácido
lisofosfatídico (LPA) y los lisados de células estimuladas o no
estimuladas se sometieron a la inmunoprecipitación con anticuerpos
contra PYK2 seguido de inmunoblotting con anticuerpos contra la
fosfotirosina. El experimento muestra la fosforilación rápida de
tirosina de PYK2 en respuesta a la estimulación con LPA o
bradicinina. El pre-tratamiento con células PC12 con
la fosforilación significativamente inhibida por la toxina pertussis
de la tirosina de PYK2 en respuesta a la estimulación con LPA. Sin
embargo, la bradicinina o el forbol 12-miristato
13-acetato (PMA) que indujo la activación de PYK2 no
se vieron afectadas por el pre-tratamiento con
toxina pertussis. La eliminación de calcio extracelular mediante la
adición de EGTA al medio no afectó la fosforilación PYK2 inducida
por LPA. Estos resultados indicaron que la activación de PYK2
inducida por LPA es dependiente, al menos en parte, en una vía
dependiente de Gi sensible a la toxina pertussis en las células
PC12.
Las células PC12 se estimularon con LPA (2,5 mM)
o bradicinina (1 mM) durante 3 minutos a 37ºC y se lisaron. PYK2
inmunoprecipitó con anticuerpos contra PYK2 y se sometieron a
inmunoblot con anticuerpos contra la fosfotirosina
(anti-pTyr) o contra PYK2.
Las células PC12 se dejaron sin tratar (-) o se
incubaron con la toxina pertussis (PTx) 100 ng/ml durante 20 horas y
entonces se estimuló con LPA (2,5 mM), bradicinina (1 mM) durante 3
minutos a 37ºC o con PMA (1 mM) durante 10 minutos a 37ºC. Además,
las células se estimularon con LPA en medio conteniendo 3 mM de
EGTA. Hemos analizado la fosforilación del inmunoprecipitado PYK2
por inmunoblotting con anticuerpos anti-pTyr o
anti-PYK2. LPA, PMA, PMA, y bradicinina proporcionó
aumentos de 4, 12, y 9 veces en el estado de fosforilación de PYK2
en relación a las células sin estimular.
Las células PC12 se transfectaron
transitoriamente con pRK5, mutante quinasa negativo PYK2 (PKM) y
Csk. La expresión de Csk se determinó mediante blotting del total de
lisados celulares con anticuerpos anti-Csk, las
células PC12 se transfectaron de forma falsa (pRK5), o se
transfectaron con el receptor truncado EGF, PKM, Csk, o con ambos
PKM y Csk, se estimularon con LPA o bradicinina durante 3 min, se
lisaron y se determinó la actividad MAP quinasa. La eficiencia de la
transfección se determinó usando un transgen de la
\beta-Galactosidasa. Se obtuvieron resultados
similares en tres experimentos independientes realizados por
duplicado. La actividad MAP quinasa en células PC12 sobreexpresando
los mutantes interferentes dominantes de Grb2 y Sos también se
comprobó. Las células se estimularon con LPA o bradicinina y se
determinó la actividad MAP quinasa. El experimento se repitió tres
veces.
Hemos demostrado que la activación de PYK2
mediante la elevación de la concentración de calcio intracelular
puede llevar a la activación de la vía de señalización de la MAP
quinasa en las células PC12. La familia Src de proteínas tirosina
quinasas está activada en respuesta a la estimulación de una
variedad de receptores acoplados a proteína G y han demostrado ser
necesarias para la unión a receptores acoplados a Gi y Gq con la
activación de la MAP quinasa. Sadoshima & Izumo, EMBO J
15:775-787 (1996); Wan et al., Nature
380: 541-544 (1996). El receptor EGF y erbB2 también
se implicaron en la activación de la MAP quinasa inducida mediante
LPA y otros agonistas del receptor acoplado a proteína G. Daub et
al., Naure 379:557-564 (1996). Hemos comprobado
si LPA y bradicinina pueden activar Src y el receptor EGF en las
células PC12. La estimulación de las células PC12 mediante LPA o
bradicinina conduce a un aumento aproximadamente de tres o cuatro
veces en la actividad Src quinasa, mientras no eramos capaces de
inducir la activación inducida por LPA del receptor EGF en células
PC12.
Examinamos la posibilidad de asociación entre las
dos proteínas tirosina quinasas PYK2 y Src en respuesta a la
estimulación con LPA o bradicinina. Los lisados de las células
estimuladas o sin estimular se sometieron a inmunoprecipitación con
anticuerpos contra Src seguido de inmunoblotting con anticuerpos
contra PYK2, contra anticuerpos Src o
anti-pY416^{src} que reconocen específicamente
activado Src. Liu et al., Oncogene
8:1119-1126 (1993). Este experimento demuestra que
PYK2 forma un complejo con Src activado en respuesta a la
estimulación con LPA o bradicinina. Además, el dominio SH2 de Src
unido a PYK2 activado sugiere que la unión de Src a PYK2 está
mediada por métodos de su dominio SH2 en vez de conducir a su
activación.
Para analizar además la interacción entre Src y
PYK2, realizamos un experimento de unión in vitro usando una
proteína de fusión GST conteniendo el dominio SH2 de Src con PYK2 de
tipo salvaje, una forma mutante de PYK2 en que la tirosina en la
posición 402 se reemplazó mediante un residuo fenilalanina
(PYK2-Y402F) o un mutante quinasa negativo de PYK2.
Lev et al., 1995, Nautre 376:737-745. Una
proteína de fusión GST conteniendo el dominio SH2 de Src unido a la
tirosina fosforilada PYK2 pero no al mutante
PYK2-Y402F o PKM. La tirosina en posición 402
representa el sitio principal de autofosforilación de PYK2 y se
encuentra en la secuencia YAEI, un sitio de unión consenso para el
dominio SH2 de Src quinasas Songyang et al., Cell
72:76-778 (1993).
Las células PC12 se dejaron sin tratar (-) o se
estimularon con LPA (2,5 mM) o bradicinina (1 mM) durante 3 minutos
a 37ºC. Src inmunoprecipitó y se sometió a inmunoblot con
anticuerpos contra Src, anticuerpos
anti-pY416^{src} o anticuerpos contra PK2.
Los mismos lisados se mezclaron con una proteína
de fusión GST conteniendo el dominio SH2 de Src y las proteínas
unidas se analizaron mediante inmunoblot con anticuerpos contra
PYK2.
Las células 293T se transfectaron
transitoriamente con pRK5, PYK2; PYK2-Y402F y PKM.
Los lisados celulares totales se analizaron mediante inmunoblot con
anticuerpos anti-pTyr o anti-PYK2.
Los mismos lisados se sometieron a inmunoprecipitación con
anticuerpos contra src e inmunoblotting con anticuerpos
anti-pY416^{src} o anticuerpos contra Src. La
actividad src quinasa se cuantificó como un incremento en la
fosforilación pY416src y se presentó como la media +/-S.D. a partir
de cuatro experimentos individuales.
Los efectos de coexpresión de PYK2 y Csk en la
fosforilación de PYK2 de tirosina y la activación MAP quinasa
también se evaluaron. pRKS, PYK2, PYK2-Y402F o PYK2
más concentraciones crecientes de Csk se transfectaron
transitoriamente en células 293T. Los lisados celulares totales se
analizaron mediante inmunoblot con anticuerpos contra la
fosfotirosina, PYK2 y Csk. Una fosforilación débil de la tirosina de
PYK2 Y402F se observó tras una larga exposición. Los mismos lisados
se usaron para determinar la activación MAP quinasa. Este
experimento se repitió tres veces. Se determinó así PKY2 y Src
estaban implicados en la activación de la MAP quinasa.
Además examinamos el estado de fosforilación de
Src y la activación de la MAP quinasa tras la transfección de PYK2 o
PYK2-Y402F en células 293T de riñón embriónico
humano. La sobreexpresión de PYK2 conduce a aproximadamente una
estimulación de cuatro veces la actividad endógena Src en estas
células. Sin embargo, la sobreexpresión de
PYK2-Y402F o un mutante negativo de la quinasa de
PYK2 (PKM) no afectó la actividad Src en el mismo ensayo. Estos
experimentos demostraron la autofosforilación de PYK2 en Tyr402
conducía a la unión del dominio SH2 de Src y la consiguiente
activación Src.
A continuación sobreexpresamos PYK2,
PYK2-Y402F o PKM con cantidades crecientes de Csk,
una proteína tirosina quinasa que regula negativamente Src (Nada
et al., Nature 351: 69-72 (1991), y se ensayó
si la activación de Src inducida por PYK2 contribuye a la
fosforilación PYK2 de tirosina y la activación de la MAP quinasa
inducida por PYK2 en células 293T. La fosforilación de tirosina de
PYK2 y la activación de la MAP quinasa inducida por PYK2,
normalmente observada a partir de las células que sobreexpresan
PYK2, fueron significativamente reducidas en la presencia de
concentraciones crecientes de Csk. Lev et al., Nature 376:
737-745 (1995). Además, la activación MAP quinasa se
redujo principalmente en células que sobreexpresaban
PYK2-Y402F en comparación con la activación de MAP
quinasa inducida mediante la expresión de tipo salvaje de PYK2.
PYK2-Y402F es fosforilado pobremente en la tirosina
tras la sobreexpresión. Además la sobreexpresión de
PYK2-Y402F no activó Src en estos experimentos.
Estos experimentos demuestran que la fosforilación PYK2 de tirosina
y la activación de MAP quinasa inducida por PYK2 son dependientes,
al menos en parte, de la actividad Src quinasa estimulada por la
unión a tyr402 autofosforilado en PYK2.
A continuación examinamos el papel de PYK2 en la
activación de MAP quinasa inducida por LPA o bradicininautilizando
el mutante negativo quinasa interferente dominante de PYK2. Lev
et al, Nature 376:737-745 (1995); Tokiwa
et al., Science 273: 792-794 (1996).
No fuimos capaces de generar líneas celulares PC12 capaces de
sobreexpresar PKM y por lo tanto usar una estrategia de
sobreexpresión transitoria. La sobreexpresión de PKM en células PC12
inhibió fuertamente la activación MAP quinasa mediante LPA o
bradicinina. El papel de Src en la activación de la MAP quinasa
inducida por LPA o bradicinina fue además ensayado mediante
sobreexpresión transitoria de Csk. Cuando Csk se sobreexpresó en
células PC12 se observó una fuerte reducción en la MAP quinasa
inducida por LPA o bradicinina. En células que se
co-transfectaron con ambos PKM y Csk, la activación
de MAP quinasa inducida por LPA o bradicinina se inhibió
profundamente. Sin embargo, la sobreexpresión de PKM o Csk no afectó
a la activación de la MAP quinasa inducida por el factor de
crecimiento nervioso o EGF en PC12.
Cogidos conjuntamente, estos experimentos revelan
un papel específico para PYK2 y Src en la unión al receptor acoplado
a proteína G, pero no los receptores de los factores de crecimiento,
con la activación MAP quinasa.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PRODUCTOS Y MÉTODOS RELACIONADOS CON PYK2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Lyon & Lyon
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 633 West Fift Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Ángeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 90071
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5'', 1,44 Mb almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: IBM P.C. DOS (Version 5,0)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WordPerfect (Version 5,1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE DEPÓSITO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE LEGAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE:Warburg, Richard J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,327
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 211/121
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (213) 489-1600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (213) 955-0440
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 67-3510
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1009
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3416
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGCATCCT ATCATCCATC CTAGGAAAGA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGAATTCG TCGTAGTCCC AGCAGCGGGT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAATGTCT TCAAACGCCA C
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATGTAGCT GTCGCGACCT GCAAGAAAGA C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAGCAGGC CATGTCACTG G
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCTT ACGATGCGTA GTCAGGGACA TCGTATGGGT AGACATCAGT TAACATTTTG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACAATGTCT TCAAACGCCA C
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAGCAGGC CATGTCACTG G
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAATTCTT ACGATGCGTA GTCAGGGACA TCGTATGGGT AGACATCAGT TAACATTTTG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATGTAGCT GTCGCGACCT GCAAGAAAGA C
\hfill31
Claims (8)
1. Un método de cribaje para un compuesto capaz
de unirse al polipéptido PYK2, en donde dicho compuesto es una
indolinona, comprendiendo los pasos de:
- (a)
- incubar dicho compuesto con dicho polipéptido PYK2, y
- (b)
- detectar la presencia de dicho compuesto unido a dicho polipéptido PYK2.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicho compuesto inhibe una actividad de fosforilación de
dicho polipéptido PYK2.
3. Un método de cribaje de agentes potenciales
útiles para el tratamiento de una enfermedad o condición
caracterizada por una anormalidad en una vía de transducción
de la señal, en donde dicha vía de transducción de la señal incluye
una interacción entre un polipéptido PYK2 y un patrón de unión
natural, comprendiendo el paso de ensayar dichos agentes potenciales
para aquellos capaces de promover o romper dicha interacción como
una indicación de un agente útil, en donde dicho patrón de unión
natural es Src, y en donde dicha vía implica un receptor acoplado a
proteína G pero no implica un receptor de factor de crecimiento, y
en donde dichos agentes potenciales son una o más indolinonas.
4. El método de la reivindicación 3, en donde
dicha indolinona es oxindolinona.
5. Un método de cribaje de moduladores de las
vías de señalización de PYK2 comprendiendo los pasos de:
- (a)
- mezclar dos o más componentes seleccionados del grupo consistente de PYK2, Src, bradicinina, LPA y uno o más de dichos moduladores en donde dichos moduladores son una o mas indolinonas; y
- (b)
- monitorizar el efecto de dichos moduladores en dichas vías de señalización PYK2.
6. El método de la reivindicación 5 en donde
dicha indolinona es una oxindolinona.
7. El método de la reivindicación 5 o la
reivindicación 6 en donde dicho método implica el cribaje de agentes
capaces de promover o romper la unión del dominio SH2 de Src a la
tirosina de la posición 402 de PYK2.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7 en donde dicho efecto es un estado de
fosforilación de PYK2 o Src.
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