CN1724569A - 抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，本发明具体步骤如下：1)采用将猪狂犬病疫苗或猪狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清洁级供试蛋鸡，用酶联免疫吸附试验进行效价测定后，收集免疫卵；2)强化免疫卵黄，用水稀释、用乳酸液调酸进行酸处理去除杂蛋白、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和冻融处理，以去除脂质，抽滤液经硫酸铵盐析、透析除盐、柱层析获得高纯度的抗猪狂犬病卵黄抗体。本发明制备的卵黄抗体其敏感性高，特异性强，为建立基因工程缺失疫苗和鉴别诊断方法的技术与产品提供物质条件；为使用常规血清学方法难以区分野毒感染猪和疫苗免疫猪成为可能；为我国根除猪伪狂犬病提供基础技术保障。

Description

抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物制剂的制备方法，具体地说，是一种抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法。用于生物工程领域。
背景技术
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种可以引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要症状的疾病。近年来，随着我国养猪业规模化、集约化发展，猪的伪狂犬病在许多地区爆发流行，而且有逐步扩大蔓延的趋势。该病严重危害着养猪业，可引起妊娠母猪流产，初生仔猪多为急性致死性经过，给养猪业造成巨大的经济损失，而且在国际贸易时导致贸易壁垒。目前该病的检测方法主要为病毒分离、中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，最近又研制了gE-ELISA和胶体金鉴别诊断技术，为我国根除此病提供有效的检测手段。这些快速灵敏的检测试剂盒均需要有特异性高的免疫抗体。
经对现有技术的文献检索发现，孔令达等在《中国预防兽医学报》2004年第5期发表的“猪伪狂犬病高免血清的制作与初步应用”一文中，用猪作为实验动物，通过强化免疫，制备高效价的免疫抗体用于免疫检测取得了良好的效果。用猪作为实验动物饲养不方便，一次采血量少，且手续麻烦，成本高。在进一步的文献检索中，尚未发现与本发明主题“抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法”相同或者类似的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，使其制备卵黄抗体的方法简便、产量高、易于纯化。制备抗体的敏感性高，特异性强，可用于免疫检测，为建立基因工程缺失疫苗和鉴别诊断方法的技术与产品提供物质条件。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明具体步骤如下：
1)采用将猪狂犬病疫苗或猪狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清洁级供试鸡。免疫剂量每头份0.5ml，间隔10天进行第二次免疫，免疫剂量为0.5ml。免疫10天后，进行第三次免疫，免疫剂量为1ml。第三次免疫10天后，用酶联免疫吸附试验进行效价测定，当卵黄抗体效价达1∶1280以上时收集免疫卵；
2)强化免疫卵黄，用对倍无菌水稀释、用水配成2摩尔/升的乳酸液，调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白、0.5％邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和-40℃冻融处理，以去除脂质，抽滤液经硫酸铵盐析、透析除盐、柱层析获得高纯度(99.9％)的抗猪狂犬病卵黄抗体。
本发明的基本原理是利用家禽作为生物反应器生产各类生物活性物质。当供试鸡免疫后即产生特异性抗体，血液中的抗体逐渐进入卵黄并蓄积。该抗体稳定，经提纯后可用于免疫检测。
本发明的有益效果是：提供制备抗猪伪狂犬病卵黄抗体的方法简便，成本低，制备的卵黄抗体其敏感性高，特异性强，为建立基因工程缺失疫苗和鉴别诊断方法的技术与产品提供物质条件；为使用常规血清学方法难以区分野毒感染猪和疫苗免疫猪成为可能；为我国根除猪伪狂犬病提供基础技术保障。
具体实施方式
以下实施例中采用中牧股份有限公司所属的生物制品厂生产的猪用疫苗，由全国畜牧兽医部门发售，为冻干疫苗，剂量为50头份/瓶。
实施例1
饲养清洁级经产蛋鸡，第一次免疫猪狂犬病疫苗，免疫剂量每头份0.5ml(冻干疫苗用生理盐水稀释成20ml)。间隔10天进行第二次免疫，免疫剂量为0.5ml。免疫10天后，进行第三次免疫，免疫剂量为1ml。用酶联免疫吸附试验进行效价测定，当效价达1∶1280以上时收集免疫卵，无菌获取卵黄，用对倍无菌水稀释、用2mol.L-1乳酸液调pH4.4进行酸处理去除杂蛋白、0.5％邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和-40℃冻融处理，以去除脂质，抽滤液经硫酸铵盐析、透析除盐、柱层析获得高纯度的抗猪狂犬病卵黄抗体。其免疫球蛋白的得率达90％以上。
制备抗猪伪狂犬病卵黄抗体的方法简便，成本低，获得的卵黄抗体纯度高，特异性强，可用于免疫检测。
实施例2
饲养清洁级经产蛋鸡，第一次免疫猪狂犬病gE基因工程缺失疫苗，免疫剂量每头份0.5ml。间隔10天进行第二次免疫，免疫剂量为0.5ml。免疫10天后，进行第三次免疫，免疫剂量为1ml。用gE酶联免疫吸附试验进行效价测定，当效价达1∶1280时收集免疫卵。其后抗猪狂犬病卵黄抗体的制备方法同方案1。
制备的卵黄抗体其敏感性高，特异性强，为建立基因工程缺失疫苗和鉴别诊断方法的技术与产品提供物质条件；为使用常规血清学方法难以区分野毒感染猪和疫苗免疫猪成为可能；为我国根除猪伪狂犬病提供基础技术保障。

Claims (5)

1、一种抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)采用将猪狂犬病疫苗或猪狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清洁级供试蛋鸡，用酶联免疫吸附试验进行效价测定后，收集免疫卵；
2)强化免疫卵黄，用水稀释、用乳酸液调酸进行酸处理去除杂蛋白、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素处理和冻融处理，以去除脂质，抽滤液经硫酸铵盐析、透析除盐、柱层析获得的抗猪狂犬病卵黄抗体。
2、根据权利要求1所述的抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，其特征是，所述的步骤1)中，采用将猪狂犬病疫苗或猪狂犬病基因工程缺失疫苗免疫清洁级供试蛋鸡，连续免疫三次，每次间隔10天，第三次免疫10天后，用酶联免疫吸附试验进行效价测定，当卵黄抗体效价达1∶1280以上时收集免疫卵。
3、根据权利要求1所述的抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，其特征是，所述的水是对倍无菌水，所述的乳酸液浓度是用水配成2摩尔/升，乳酸液进行酸处理的pH值是4.4。
4、根据权利要求1所述的抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，其特征是，所述的邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素的浓度是0.5％，
5、根据权利要求1所述的抗猪伪狂犬病卵黄抗体的制备方法，其特征是，所述的冻融处理的温度是-40℃。
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