DE834600C

DE834600C - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Einzelkomponenten von Stoffgemischen

Info

Publication number: DE834600C
Application number: DEG3028A
Authority: DE
Inventors: Dr W Grassmann; Kurt Hannig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1950-07-11
Filing date: 1950-07-11
Publication date: 1952-03-20

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Einzelkomponenten von Stoffgemisdien Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Einzelkomponenten von Stoffgemischen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen aus porösem Material, insbesondere Filtrierpapier, getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind.
Es ist bekannt, Stoffgemische, beispielsweise aus Farbstoffen, Aminosäuren, Zuckern, Gerbstoffen, Hormonen, Fermenten und anderen Wirkstoffen sowie Eiweißkörpern, dadurch zu zerlegen und zu analysieren, daß man i'hre untterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit bei der sog. Verteilungschromatographie auf Filtrierpapier oder ihre unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld innerhalb eines mit einer Elektrolyt- bzw. Pufferlösung getränkten Filtrierpapierstreifens ausnutzt (vgl. z. B. Th. Wieland und E. Fischer, Naturw. 35, S. 29, I948). Es ist weiterhin bekannt, daß man nicht gefärbte Substanzen nach Abschluß der Trennung auf dem Filtrierpapier dadurch Farbreaktionen bzw. durch ein spezifisches Anfärben mittels geeigneter Farbstoffe sichtbar machen kann, um auf diese Weise das Chromatogramm oder Elektrophoresediagramm zu entwickeln. Für die quantitative Auswertung der so erhaltenen Diagramme existiert jedoch bisher noch kein völlig befriedigendes Verfahren.
Dieser Mangel ist u. a. besonders störend für die quantitative und ins einzelne gehende Analyse von Eiweißgemischen, wie z. B. von Blutserum, der eine erhebliche klinische Bedeutung zukommt. Die Analyse von Rlutserum, d. h. die quantitative Bestimmung des Albumin und der verschiedenen Glohulinfraktionen (a1 . α2-, ß-, γ- Glohuline) mußte daher auf elektrophoretischem Wege hisher fast ausschließlich in der außerordentlich kostspieligen Elektrophoreseapparatur nach T is e 1 i ti 5 vorgenommen werden, bei der Menge tind Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Proteinfraktionen mittels sehr komplizierter und empfindlicher optischer Apparaturen verfolgt werden.
Bekannt ist ferner, die durch Elektrophorese auf Papier erhaltenen Eiweißdiagramme in Querstreifen zu zerschneiden, den Farbstoff aus jedem einzelnen Streifen getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln zu eluieren und seine Konzentration kolorimetrisch zu bestimmen. Wenn dabei Kurvenbilder erhalten werden sollen, die ähnliche Einzelheiten zeigen, wie die in der Apparatur nach Tiselius gewonnenen, was für die klinische l)iagnostik sehr wichtig ist, so müssen die Diagramme in eine sehr große Zahl einzelner Querstreifen zerlegt und diese einzeln eluiert und kolorimetriert werden, ein Verfahren das sehr umständlich und zeitraubend und mit vieleii Fehlerquellen behaftet ist.
Ertindungsgemäß erfolgt die quantitative Bestimmung der Einzelkomponenten von Stoffgemischen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen aus porösem Material, insbesondere Filtrierpapier, getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind, in der Weise, daß man die betreffenden Streifen durch Einbetten in eine Flüssigkeit, welche den gleichen oder etwa den gleichen Brechungsindex aufweist wie das Material, aus dem die Streifen bestehen, lichtdurchlässig macht und anschließend nach üblichen quantitativen Methoden die Extinktion im durchfallenden Licht mißt.
Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es mit einem minimalen Zeitaufwand möglich, die Einzelkomponenten von Stoffgemischen quantitativ zu bestimmen. Die benutzte l inl>ettungsflüssigkeit darf selbstverständlich die aul deii Streifen vorhandenen oder entwickelten I;irbungen weder lösen oder verändern noch das Streifenmaterial angreifen.
Fiir den erfindungsgemäßen Zweck eignen sich organische Lösungsmittel oder sonstige Flüssigkeiten, deren Brechungsindex demjenigen des porösem Materials, aus dem die Streifen bestehen, nahekommt. Bei Anwendung von Filtrierpapierstreifen beispielsweise haben sich Anisol, Nitrobenzol, Chlorbenzol und Nitrotoluol bewährt.
Eine sich über die Gesamtlänge des Streifens erstreckende Extinktionskurve kalm man dadurch erhalten, daß man den Streifen an der Blende eines photometrischen Aufnahmegeräts vorbeibewegt.
Zweckmäßigerweise verfährt man dabei so, daß man den beispielsweise zwischen zwei dünne Glasplatten eingelegten und mit den obengenannten F lüssigkeiten durchtränkten Streifen vor einem etwa 1 mm breiten und I bis 2 cm langen, zur Längsrichtung des Filterpapierstreifens senkrecht stehenden Spalt eines photometrischen Aufnahmegeräts vorbeiführt. Der Spalt wird von vorn durch eiii paralleles Lichtbündel durchstrahlt, uiid auf seiner Rückseite befin(iet stich eine Photozelle.
Durch eine in der Photometrie an sich bekannte Kompensationsschaltung gegen eine zweite Photozelle, die durch einen gleichartigen, leeren Filtrierpapierstreifen hindurch hestrahlt wird, kann dabei erreicht werden, daß die Ausschläge des Meßinstruments unmittelbar die Extinktion des angefärbten Streifens anzeigen. Die Auswertung eines Streifens erfordert bei diesem Verfahren nicht mehr als 5 Minuten. Es ist selbstverständlich möglich, die Kurven auch in der Weise automatisch aufzunehmen, daß man den Vorschub des Streifens mit einer ühlicheit selbsttätigen Registrieranordnung kuppelt.
Im folgenden soll die Durchführung des erfindungsgemäßen \~erfahrens an lSand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.

Claims

B e i 5 p i e 1 0,OI ccm unverdünntes Serum werden auf einem mit 0,2 molarem Veronalnttr iumacetatp.uffer nach Michaelis (Bio. Z. 234, 13(), 193I) getränktem Filtrierpapierstreifenvün den Abmessungen 4 x 30 cm in einem feinen Querstrich aufgetragen. Hierauf wird der Streifen in eine feuchte Glaskammer (Innenmaße 16 X 7 X I cm) freiliegend eingespannt und die beiden Enden iii Gefäße mit der gleichen Pufferlösung eingetaucht, die über einen mit Pufferlösung getränkten Tonpfropfen mit den beiden Elektroden verbunden sind. Die elektrophoretische Wanderung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 100 (Eiskiihlung) und einer Gleichstromspannung von 110 Volt, wobei ein Strom von etwa o,8 mA fließt. Nach etwa 12 bis I8 Stunden wird der Streifen getrocknet tiiid mit einer gesättigten methanolischen Lösung eines Farbstoffes mit hoher Eiweißaffinität, z.H. Amidoschwarz 10 13, die 10% Eisessig enthält, 10 Minuten angefärbt. Zur Entfernung des überschüssigen Farbstoffes wird wiederholt mit einer Mischung aus Methanol und IO°/o Eisessig ausgewaschen, bis die von Eiweiß unbeladenen Teile des Filtrierpapiers nur noch schwach blau gefärbt sind, was etwa 4 bis 5 Stunden in Anspruch nimmt. Nach dem Trocknen wird der Streifen mit Anisol getränkt, zwischen zwei Glasplatten gespannt und an einem mittels eines starken parallelisierten Strahlenbündels durchstrahlten Spalt von etwa I X 20 mm, der mit seiner Hauptahmessung quer zur Längsrichtung des Streifens steht, vorbeigeführt, wobei das durch den Streifen gelangende Licht mit einer Photozelle gemessen wird. l)ie Extinktion des Streifens kann kontinuierlich oder diskontinuierlich von Millimeter zu Millimeter gemessen werden.

In der Zeichnung zeigt Abb. I das auf diese RTcise erhaltene Kurvenbild eines normalen, Abb. 2 dasjenige eines pathologischen Serums (Lebercirrhose).

PATEN TA N PH C ti I. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Einzelkompotietttti voll Sinffgemischen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen von porösem Material, insbesondere Filtrierpapier, getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die betreffenden Streifen durch Einbetten in eine Flüssigkeit, welche den gleichen oder etwa den gleichen Brechungsindex aufweist wie das Material, aus dem die Streifen hestehen, lichtdurchlässig macht und anschließend nach üblichen quantitativen Methoden die Extinktion im durchfallenden Licht mißt.
2. Verfahreri, nach Anspruch I, dadurch gekennzeiclniet, daß man eine sich über die Gesamtlänge des Streifens erstreckende Extinktionskurve aufnimmt, indem man den Streifen an der Blende eines photometrischen Aufnahmegeräts vorbeiführt.