CH297067A - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Stoffgemischen. - Google Patents

Description

  



  Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Stoffgemischen.



   Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Stoffgemischen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen aus porösem Material, insbeson  dere    Filtrierpapier getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind.



   Es ist bekannt, Stoffgemische, beispielsweise aus Farbstoffen, Aminosäuren, Zuckern, Gerbstoffen, Hormonen, Fermenten und andern Wirkstoffen, sowie Eiweisskorpern dadurch zu zerlegen und zu analysieren, dass man ihre unterschiedliche Wanderungsgesehwindigkeit bei der sogenannten Vertei  lungschromatogra. phie auf Filtrierpapier    oder ihre   untersehiedliche      Wanderungsgesehwin-      digkeit    im elektrischen Feld innerhalb eines mit einer   Elek : trolyt-bz v. Pufferlösung    getränkten   Filtrierpapierstreifens      ausnützt.   



  (Vergleiche zum Beispiel Th.   Wieland und    E. Fiseher, Naturw. 35, Seite 29 (1948). Es ist weiterhin   bekannt, dass man nicht, gefärbte    Substanzen nach Abschluss der Trennung auf dem Filtrierpapier durch Farbreaktionen bzw. durch ein spezifisches Anfärben mittels geeigneter Farbstoffe   siehtbar    machen kann, um auf diese Weise das Chromatogramm oder   Elektrophoresediagramm    zu entwickeln. Für (lie quantitative Auswertung der so erhaltenen Diagramme existiert jedoch bisher noch kein völlig befriedigendes Verfahren.



   Dieser Mangel ist unter anderem besonders störend für die quantitative und ins einzelne gehende Analyse von   Eiweissgemischen,    wie zum Beispiel von Blutserum, der eine   erheb-    liche klinische Bedeutung zukommt Die Analyse von Blutserum, das heisst die   quanti-    tative Bestimmung des Albumins und der    versehiedenen Globulinfraktionen (ai-, a2-,    ss, y-Globuline) musste daher auf   elektropho-      retisehem    Wege bisher fast   aussehliesslich    in der ausserordentlich kostspieligen Elektrophoreseapparatur nach Tiselius vorgenommen werden, bei der Menge und   Wanderungs-    geschwindigkeit der einzelnen Proteinfraktionen mittels sehr komplizierter und empfindlicher optischer Apparaturen verfolgt.

   werden.



   Bekannt ist ferner, die durch   Elektro-    phorese auf Papier erhaltenen   Eiweissdia-    gramme in   Querstreifen zu zerschneiden, den    Farbstoff aus jedem einzelnen Streifen getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln   Zll    eluieren und seine Konzentration kolori  metriseh    zu bestimmen.

   Wenn dabei Kurvenbilder erhalten werden sollen, die ähnliche Einzelheiten zeigen wie die in der Apparatur nach   Tiselius      gewonnenen-was für die    klinische Diagnostik sehr wichtig ist-so müssen die Diagramme in eine sehr grosse Zahl einzelner   Querstreifen    zerlegt und diese einzeln eluiert und kolorimetriert werden, ein Verfahren, das sehr umständlich und zeit   raubend und mit vielen Fehlerquellen be-    haftet ist.



   Erfindungsgemäss erfolgt die quantitative   Bestimmung der Kompon. enten    von Stoff  gemisehen,    die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen aus porösem Material, insbesondere Filtrierpapier getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind, in der Weise, dass man die Streifen durch Einbetten in eine Flüssigkeit, welche den gleichen oder nahezu den gleichen Breehungsindex aufweist wie das Material, aus dem die : Streifen bestehen,   liehtdurehlässig    macht und anschliessend nach einer quantitativen Methode die Extinktion im durchfallenden Licht, misst.



   Bei Anwendung des   erfindungsgemä#en    Verfahrens ist es mit einem minimalen Zeit  aufwand moglieh,    die Einzelkomponenten von Stoffgemischen quantitativ zu bestimmen. Die benutzte   Einbettungsflüssigkeit    darf selbstverständlich die auf den Streifen   vorhande-    nen oder entwickelten Färbungen weder   loden    oder verändern noch das Streifenmaterial angreifen.



   Für den erfindungsgemässen Zweck eignen sieh zum Beispiel organische Losungsmittel oder sonstige Flüssigkeiten, deren Breehungsindex demjenigen des porösen Materials, aus dem die Streifen bestehen, nahekommt. Bei   Anwendimg    von   Filtrierpapierstreifen    beispielsweise haben sich Anisol, Nitrobenzol, Chlorbenzol und Nitrotoluol und insbesondere    WIischungen aus Paraffinöl (DeutsehesArznei-    buch   VI)und α-Bromnaphthalin bewährt.   



   Eine sicli über die Gesamtlänge des Streifens erstreckende   Extinktionskurve kann    man   dadureh    erhalten, dass man den Streifen an n der Blende eines photometrischen Aufnahmegerätes vorbeibewegt.   Zweckmässigerweise ver-    fährt man dabei so, dass man den   beispiels-    weise zwischen zwei dünne Glasplatten einge  legten    und mit den obengenannten Flüssigkeiten   durchtränkten    Streifen vor einem etwa   1    mm breiten und   19 em    langen, zur Längsrichtung des Filterpapierstreifens senkrecht stehenden Spalt eines   photometrischenAuf-    nahmegerätes vorbeiführt.

   Der Spalt wird von vorn durch ein paralleles Lichtbündel durchstrahlt und auf seiner Rückseite befindet sich eine Photozelle. Durch eine in der Photometrie an sieh hekannte   Kompensationsschal-      tung    gegen eine zweite Photozelle, die durch einen gleichartigen, leeren Filtrierpapierstreifen   hindureh    bestrahlt wird, kann dabei   erreiclit    werden, dass die Aussehläge des Messinstrumentes unmittelbar die Extinktion des angefärbten Streifens anzeigen. Die Auswertung eines Streifens erfordert bei diesem Verfahren nieht mehr als fünf Minuten. Es ist selbstverständlich möglich, die Kurven auch in der Weise automatisch aufzunehmen, dass man den Vorschub des Streifens mit einer üblichen selbsttätigen Registrieranordnung kuppelt.



   Im folgenden soll die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens an Hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.



   Beispiel :
0, 01 em3 unverdünntes Serum werden auf einem mit 0, 2   molaremVeronal-Natriumacetat-    puffer nach Ilichaelis (Bio. Z. 234, 139,    [1931])'getränkten Filtrierpapierstreifen    von den Abmessungen 4   X    30 cm in einem feinen Querstrich aufgetragen. Hierauf wird der Streifen in eine feuchte Glaskammer (Innen  maRe    16 X 7 X   1    em) freiliegend eingespannt und die beiden Enden in Gefässe mit der gleichen Pufferlosung eingetaucht, die über einem mit   Pufferlosung    getränkten Tonpfropfen mit den beiden Elektroden verbunden sind.

   Die elektrophoretische Wanderung erfolgt bei einer Temperatur von etwa   10      (Eiskühlung) und einer   Gleichstromspannung    von 110 Volt, wobei ein Strom von etwa 0,   8    mA   flie#t.    Nach etwa 12-18 Stunden wird der Streifen getrocknet und mit einer gesät  tigten    methanolischen   Losung eines    Farbstoffes mit hoher Eiweissaffinität, z. B. Amidosehwarz 10 B, die   100/o    Eisessig enthält, 10 Minuten angefärbt. Zur Entfernung des über  schüssigen    Farbstoffes wird wiederholt mit einer Mischung aus Methanol und 10% Eisessig ausgewaschen, bis die von Eiweiss   unbe-    ladenen Teile des   Filtrierpapiers    nur noch

Claims (1)

1. schwach blau gefärbt sind, was etwa 4-5 Stunden in Anspruch nimmt. Nach dem Trocknen wird der Streifen mit Anisol getränkt, zwischen zwei Glasplatten gespannt und an einem mittels eines starken parallelisierten Strahlenbündels durchstrahlten Spalt ; von etwa 1 X 20 mm, der mit seiner Hauptabmessung quer zur Längsrichtung des Streifens steht, vorbeigeführt, wobei das durch den Streifen gelangende Licht mit einer Photozelle gemessen wird. Die Extinktion des Streifens kann kontinuierlich oder diskonti nuierlieh von Millimeter zu Millimeter gemessen werden.

   In der beigefiigten Zeichnung zeigt Abb. 1 das auf diese Weise erhaltene Kurvenbild eines normalen, Abb. 2 dasjenige eines patho logisehen Serums (Lebercirrhose).

   PATENTANSPRUCH : Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Stoffgemischen, die durch Elektrophorese oder dureh Chromatographie auf Streifen aus. porösem Material getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind, dadurch gekennzeichnet, dass man die Streifen durch Einbetten in eine Fliissigkeit, welche den gleichen oder nahezu den gleichen Brechungsindex aufweist wie das Material, aus dem die Streifen bestehen, lichtdurchlässig maeht und anschliessend nach einer quantitativenMethode die Extinktion im durchfalienden Licht misst.

   UNTERANSPRUCH : Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man eime sich über die Gesamtlänge des Streifens erstreckende Ex tinktionskurve aufnimmt, indem man den Streifen an der Blende eines photometrischen Aufnahmegerätes vorbeiführt.