Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Stoffgemischen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Komponenten von Stoffgemischen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen aus porösem Material, insbeson dere Filtrierpapier getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind.
Es ist bekannt, Stoffgemische, beispielsweise aus Farbstoffen, Aminosäuren, Zuckern, Gerbstoffen, Hormonen, Fermenten und andern Wirkstoffen, sowie Eiweisskorpern dadurch zu zerlegen und zu analysieren, dass man ihre unterschiedliche Wanderungsgesehwindigkeit bei der sogenannten Vertei lungschromatogra. phie auf Filtrierpapier oder ihre untersehiedliche Wanderungsgesehwin- digkeit im elektrischen Feld innerhalb eines mit einer Elek : trolyt-bz v. Pufferlösung getränkten Filtrierpapierstreifens ausnützt.
(Vergleiche zum Beispiel Th. Wieland und E. Fiseher, Naturw. 35, Seite 29 (1948). Es ist weiterhin bekannt, dass man nicht, gefärbte Substanzen nach Abschluss der Trennung auf dem Filtrierpapier durch Farbreaktionen bzw. durch ein spezifisches Anfärben mittels geeigneter Farbstoffe siehtbar machen kann, um auf diese Weise das Chromatogramm oder Elektrophoresediagramm zu entwickeln. Für (lie quantitative Auswertung der so erhaltenen Diagramme existiert jedoch bisher noch kein völlig befriedigendes Verfahren.
Dieser Mangel ist unter anderem besonders störend für die quantitative und ins einzelne gehende Analyse von Eiweissgemischen, wie zum Beispiel von Blutserum, der eine erheb- liche klinische Bedeutung zukommt Die Analyse von Blutserum, das heisst die quanti- tative Bestimmung des Albumins und der versehiedenen Globulinfraktionen (ai-, a2-, ss, y-Globuline) musste daher auf elektropho- retisehem Wege bisher fast aussehliesslich in der ausserordentlich kostspieligen Elektrophoreseapparatur nach Tiselius vorgenommen werden, bei der Menge und Wanderungs- geschwindigkeit der einzelnen Proteinfraktionen mittels sehr komplizierter und empfindlicher optischer Apparaturen verfolgt.
werden.
Bekannt ist ferner, die durch Elektro- phorese auf Papier erhaltenen Eiweissdia- gramme in Querstreifen zu zerschneiden, den Farbstoff aus jedem einzelnen Streifen getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln Zll eluieren und seine Konzentration kolori metriseh zu bestimmen.
Wenn dabei Kurvenbilder erhalten werden sollen, die ähnliche Einzelheiten zeigen wie die in der Apparatur nach Tiselius gewonnenen-was für die klinische Diagnostik sehr wichtig ist-so müssen die Diagramme in eine sehr grosse Zahl einzelner Querstreifen zerlegt und diese einzeln eluiert und kolorimetriert werden, ein Verfahren, das sehr umständlich und zeit raubend und mit vielen Fehlerquellen be- haftet ist.
Erfindungsgemäss erfolgt die quantitative Bestimmung der Kompon. enten von Stoff gemisehen, die durch Elektrophorese oder durch Chromatographie auf Streifen aus porösem Material, insbesondere Filtrierpapier getrennt und, falls sie keine Eigenfarbe besitzen, angefärbt worden sind, in der Weise, dass man die Streifen durch Einbetten in eine Flüssigkeit, welche den gleichen oder nahezu den gleichen Breehungsindex aufweist wie das Material, aus dem die : Streifen bestehen, liehtdurehlässig macht und anschliessend nach einer quantitativen Methode die Extinktion im durchfallenden Licht, misst.
Bei Anwendung des erfindungsgemä#en Verfahrens ist es mit einem minimalen Zeit aufwand moglieh, die Einzelkomponenten von Stoffgemischen quantitativ zu bestimmen. Die benutzte Einbettungsflüssigkeit darf selbstverständlich die auf den Streifen vorhande- nen oder entwickelten Färbungen weder loden oder verändern noch das Streifenmaterial angreifen.
Für den erfindungsgemässen Zweck eignen sieh zum Beispiel organische Losungsmittel oder sonstige Flüssigkeiten, deren Breehungsindex demjenigen des porösen Materials, aus dem die Streifen bestehen, nahekommt. Bei Anwendimg von Filtrierpapierstreifen beispielsweise haben sich Anisol, Nitrobenzol, Chlorbenzol und Nitrotoluol und insbesondere WIischungen aus Paraffinöl (DeutsehesArznei- buch VI)und α-Bromnaphthalin bewährt.
Eine sicli über die Gesamtlänge des Streifens erstreckende Extinktionskurve kann man dadureh erhalten, dass man den Streifen an n der Blende eines photometrischen Aufnahmegerätes vorbeibewegt. Zweckmässigerweise ver- fährt man dabei so, dass man den beispiels- weise zwischen zwei dünne Glasplatten einge legten und mit den obengenannten Flüssigkeiten durchtränkten Streifen vor einem etwa 1 mm breiten und 19 em langen, zur Längsrichtung des Filterpapierstreifens senkrecht stehenden Spalt eines photometrischenAuf- nahmegerätes vorbeiführt.
Der Spalt wird von vorn durch ein paralleles Lichtbündel durchstrahlt und auf seiner Rückseite befindet sich eine Photozelle. Durch eine in der Photometrie an sieh hekannte Kompensationsschal- tung gegen eine zweite Photozelle, die durch einen gleichartigen, leeren Filtrierpapierstreifen hindureh bestrahlt wird, kann dabei erreiclit werden, dass die Aussehläge des Messinstrumentes unmittelbar die Extinktion des angefärbten Streifens anzeigen. Die Auswertung eines Streifens erfordert bei diesem Verfahren nieht mehr als fünf Minuten. Es ist selbstverständlich möglich, die Kurven auch in der Weise automatisch aufzunehmen, dass man den Vorschub des Streifens mit einer üblichen selbsttätigen Registrieranordnung kuppelt.
Im folgenden soll die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens an Hand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.
Beispiel :
0, 01 em3 unverdünntes Serum werden auf einem mit 0, 2 molaremVeronal-Natriumacetat- puffer nach Ilichaelis (Bio. Z. 234, 139, [1931])'getränkten Filtrierpapierstreifen von den Abmessungen 4 X 30 cm in einem feinen Querstrich aufgetragen. Hierauf wird der Streifen in eine feuchte Glaskammer (Innen maRe 16 X 7 X 1 em) freiliegend eingespannt und die beiden Enden in Gefässe mit der gleichen Pufferlosung eingetaucht, die über einem mit Pufferlosung getränkten Tonpfropfen mit den beiden Elektroden verbunden sind.
Die elektrophoretische Wanderung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 10 (Eiskühlung) und einer Gleichstromspannung von 110 Volt, wobei ein Strom von etwa 0, 8 mA flie#t. Nach etwa 12-18 Stunden wird der Streifen getrocknet und mit einer gesät tigten methanolischen Losung eines Farbstoffes mit hoher Eiweissaffinität, z. B. Amidosehwarz 10 B, die 100/o Eisessig enthält, 10 Minuten angefärbt. Zur Entfernung des über schüssigen Farbstoffes wird wiederholt mit einer Mischung aus Methanol und 10% Eisessig ausgewaschen, bis die von Eiweiss unbe- ladenen Teile des Filtrierpapiers nur noch
Method for the quantitative determination of the components of mixtures of substances.
The present invention relates to a method for the quantitative determination of the components of mixtures of substances which have been separated by electrophoresis or by chromatography on strips of porous material, in particular filter paper and, if they have no intrinsic color, have been stained.
It is known that mixtures of substances, for example of dyes, amino acids, sugars, tannins, hormones, ferments and other active ingredients, as well as protein bodies, can be broken down and analyzed by their different migration speeds in the so-called distribution chromatography. phie on filter paper or their different migration speed in the electric field within an electrolyte-bz v. Buffer solution soaked filter paper strip exploits.
(Compare, for example, Th. Wieland and E. Fiseher, Naturw. 35, page 29 (1948). It is also known that, after separation, non-colored substances can be deposited on the filter paper by color reactions or by specific staining using suitable Dyes can be made visible in order to develop the chromatogram or electrophoresis diagram. For quantitative evaluation of the diagrams obtained in this way, however, there is as yet no completely satisfactory method.
Among other things, this deficiency is particularly disruptive for the quantitative and detailed analysis of protein mixtures, such as blood serum, which is of considerable clinical importance. The analysis of blood serum, i.e. the quantitative determination of albumin and the various globulin fractions (ai-, a2-, ss, y-globulins) therefore had to be carried out by electrophoresis almost exclusively in the extremely expensive electrophoresis apparatus according to Tiselius, with the amount and migration speed of the individual protein fractions using very complicated and sensitive optical apparatus tracked.
will.
It is also known to cut the protein diagrams obtained by electrophoresis on paper into transverse strips, to elute the dye separately from each individual strip with suitable solvents ZII and to determine its concentration colorimetrically.
If curve images are to be obtained that show details similar to those obtained in the Tiselius apparatus - which is very important for clinical diagnostics - the diagrams must be broken down into a very large number of individual horizontal stripes and these must be eluted and colorized individually A procedure that is very cumbersome and time-consuming and has many sources of error.
According to the invention, the quantitative determination of the components takes place. Ducks of material that have been separated by electrophoresis or by chromatography on strips of porous material, in particular filter paper, and, if they have no intrinsic color, stained in such a way that the strips can be embedded in a liquid that has the same or has almost the same index of refraction as the material from which the: strips are made, makes it lent-permeable and then uses a quantitative method to measure the extinction in the transmitted light.
When using the method according to the invention, it is possible to quantitatively determine the individual components of mixtures of substances with a minimum expenditure of time. The embedding liquid used must of course neither lode nor change the colorations present or developed on the strips, nor attack the strip material.
For the purpose according to the invention, for example, organic solvents or other liquids whose refraction index comes close to that of the porous material of which the strips are made are suitable. When filter paper strips are used, for example, anisole, nitrobenzene, chlorobenzene and nitrotoluene and, in particular, wipes made from paraffin oil (DeutsehesArzneibuch VI) and α-bromonaphthalene have proven useful.
An extinction curve extending over the entire length of the strip can be obtained by moving the strip past the aperture of a photometric recording device. It is expedient to proceed in such a way that, for example, the strip placed between two thin glass plates and soaked with the liquids mentioned above is passed in front of a gap of a photometric recording device about 1 mm wide and 19 cm long, perpendicular to the longitudinal direction of the filter paper strip .
A parallel bundle of light shines through the gap from the front and a photocell is located on its back. By means of a compensation circuit against a second photocell, which is known in photometry and which is irradiated through an empty filter paper strip of the same type, it can be achieved that the readings of the measuring instrument directly indicate the extinction of the colored strip. The evaluation of a strip does not require more than five minutes with this method. It is of course possible to automatically record the curves in such a way that the feed of the strip is coupled to a conventional automatic registration arrangement.
In the following, the implementation of the method according to the invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment.
Example:
0.01 em3 undiluted serum is applied in a fine horizontal line to a filter paper strip with dimensions of 4 × 30 cm soaked with 0.2 molar veronal sodium acetate buffer according to Ilichaelis (Bio. Z. 234, 139, [1931]). The strip is then clamped exposed in a moist glass chamber (inside size 16 X 7 X 1 em) and the two ends are immersed in vessels with the same buffer solution, which are connected to the two electrodes via a clay plug soaked with buffer solution.
The electrophoretic migration takes place at a temperature of about 10 (ice cooling) and a direct current voltage of 110 volts, with a current of about 0.8 mA flowing. After about 12-18 hours, the strip is dried and treated with a saturated methanolic solution of a dye with high protein affinity, e.g. B. Amidose black 10 B, which contains 100 / o glacial acetic acid, stained for 10 minutes. To remove the excess dye, it is washed out repeatedly with a mixture of methanol and 10% glacial acetic acid until only the parts of the filter paper that are not loaded with protein remain