ES2873233T3 - Kit y procedimiento de detección de biopelículas - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección de biopelículas, que comprende las etapas de: - vaporización de una disolución de coloración de biopelículas que consiste en un colorante que es azul de Coomassie en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, sobre una superficie susceptible de estar contaminada por una biopelícula, siendo dicha superficie una superficie abierta de una instalación, - coloración de dicha biopelícula mediante dicha disolución de coloración durante un periodo de tiempo predeterminado de menos de 15 minutos, - vaporización de una disolución de limpieza que comprende dicha fase de dilución, - dilución de dicha disolución de coloración excedente mediante dicha disolución de limpieza durante un periodo de tiempo predeterminado de menos de 15 minutos, y - detección y localización de manera precisa de dicha biopelícula mediante la observación de zonas residuales coloreadas con azul de Coomassie correspondientes a biopelículas coloreadas por dicho colorante, - siendo dicho procedimiento de detección de biopelículas un procedimiento de detección y de localización precisa de biopelículas en menos de una hora y compatible con la industria agroalimentaria.
Description
DESCRIPCIÓN
Kit y procedimiento de detección de biopelículas
La presente invención se refiere a un procedimiento y a un kit de detección de biopelículas, compatibles con la industria alimentaria.
La higiene cobra cada vez más importancia en la industria alimentaria, en los hospitales, en las instalaciones de potabilización y de desalinización de agua, en el tratamiento de aguas de proceso y, en particular, en las aguas usadas en las torres de refrigeración y en las necesidades de la vida diaria, por ejemplo, las lentes de contacto. Con frecuencia se observa que, durante la circulación de agua o de sustancias ricas en material nutritivo sobre un soporte, microorganismos que circulan libremente en el agua o en el material nutritivo pueden adherirse a la superficie. Estos microorganismos pueden desarrollar entonces una matriz extracelular adhesiva compuesta por sustancias poliméricas.
Una comunidad de microorganismos adheridos a una superficie e incluida en una matriz de este tipo se denomina biopelícula. Generalmente, estas biopelículas están compuestas por bacterias y por polímeros orgánicos producidos por las mismas. Las biopelículas se desarrollan en la actualidad sobre todo tipo de soporte tales como las cintas transportadoras de alimentos en la industria agroalimentaria, sobre los soportes destinados a mantener una sustancia nutritiva o, en cualquier caso, orgánica para cualquier etapa tal como, por ejemplo, los ganchos de sujeción de carne y similares. Las biopelículas también se desarrollan sobre los planos de trabajo del sector de la hostelería, sobre las instalaciones de limpieza tales como los escurreplatos, los grifos, estantes, lavavajillas, etc.
También se observa la presencia de biopelículas en las instalaciones médicas tales como las salas de operaciones y otros dispositivos médicos en los que están presentes fases líquidas (líquidos corporales, fase acuosa de limpieza después del uso, etc.).
Finalmente, otras industrias están sometidas a la presencia de biopelículas, tales como la industria papelera, la industria del tratamiento de lodos y cualquier otra industria en la que se pongan a digerir materias sólidas vegetales u orgánicas en presencia de agua o de una disolución acuosa similar.
Desgraciadamente, se observa que esta matriz es muy resistente y puede constituir una barrera para agentes que actuarían contra los microorganismos. Los tratamientos clásicos a base de sosa y/o que comprenden diferentes biocidas no actúan de manera suficientemente eficaz ya que no penetran en la biopelícula a lo largo de todo su grosor o se ven inhibidos por determinadas moléculas que componen esta matriz. Por tanto, el tratamiento sólo es parcialmente eficaz sobre la superficie superior de la biopelícula. Además, esta última también puede atrapar otros microorganismos, en especial patógenos, distintos del establecido inicialmente. Por tanto, generalmente una simple limpieza de las instalaciones no es suficiente y requiere un tratamiento más específico de las zonas contaminadas por las biopelículas.
Desgraciadamente, los tratamientos específicos de biopelículas son más restrictivos que una simple etapa de limpieza convencional y, por tanto, requieren que las zonas contaminadas se identifiquen fácilmente. Aunque en determinados casos dicha matriz extracelular se identifica fácilmente cuando está muy desarrollada, en otros casos la biopelícula se desarrolla de manera oculta en las instalaciones y su presencia sólo se detecta durante el análisis de la calidad del producto terminado.
En efecto, hay que saber que, en el campo de la industria alimentaria, las biopelículas se forman de manera inevitable (a la vista de la riqueza del medio del entorno). Las biopelículas presentan una actividad de crecimiento cíclico que comprende una fase de crecimiento durante la cual se produce la acumulación de los microorganismos y una fase de desprendimiento durante la cual fragmentos enteros de biopelículas se desprenden por erosión y bajo el efecto de su propio peso. Cuando un industrial se enfrenta a este fenómeno, en realidad debe detener su cadena de producción y realizar el ciclo de limpieza para eliminar la biopelícula. Ahora bien, esto representa numerosas horas de trabajo y de pérdida de rendimiento de la instalación. Además, este tipo de detección permite saber que hay una biopelícula presente en alguna parte, pero no permite localizarla de manera precisa.
Por consiguiente, en la práctica, no se detiene la producción y, cuando la biopelícula está en fase de ruptura, los lotes producidos se contaminan y se separan hasta que el nivel de contaminación por los microorganismos de los alimentos producidos vuelve a ser aceptable a la vista de las normas en vigor.
Por tanto, existe una necesidad de poder localizar de manera precisa la presencia de biopelículas en este tipo de instalación particularmente restrictiva, dado que los productos fabricados están destinados a ingerirse por seres vivos, pero también en cualquier tipo de industria sometida a la posibilidad de desarrollo de biopelículas y para las que este desarrollo representa un problema (por ejemplo, tratamiento de aguas, circuito de refrigeración, sanidad, alimentación animal,...), y ello con el fin de poder remediarla de manera puntual en cualquier momento o, por ejemplo, entre cada lote de producción o en cada parada de la producción. En efecto, si las superficies de dispositivos de producción se han higienizado correctamente y están libres de biopelículas al comienzo de una producción, queda claro que se ralentizará el desarrollo de las biopelículas. Por el contrario, si queda un residuo no visible de biopelícula en las instalaciones limpiadas antes de la
producción, éste constituye un cebador para el desarrollo de una biopelícula durante la fase de producción del alimento que conducirá inevitablemente al desperdicio de una parte de la producción, contaminada por dicha biopelícula.
Por tanto, en los últimos años se han desarrollado técnicas de detección de biopelículas.
Por ejemplo, el documento JP 2005210997 da a conocer una composición colorante para detectar biopelículas en la industria alimentaria que contiene rojo de arroz (monascina) que se vaporiza sobre superficies susceptibles de contener biopelículas.
Esta composición comprende el 92 % de agua, el 4 % de colorante y el 4 % de etanol. Aunque es compatible con la industria alimentaria, esta composición requiere un gran contenido en colorante, es poco compatible con un medio alcalino (usado para higienizar las instalaciones de manera convencional) y presenta un color difícil de observar (lo que justifica probablemente el alto contenido en colorante).
Además, tal como puede constatarse tras la lectura de los ejemplos comparativos de la presente solicitud de patente, determinadas sustancias alimentarias se detectan mediante la monascina mientras que no hay ninguna película presente.
La detección de falsos positivos presenta un verdadero problema. En efecto, no resulta rentable ni ecológico iniciar tratamientos de superficies contaminadas supuestamente por biopelículas con la ayuda de sustancias específicas mientras que en realidad no hay ninguna biopelícula y se trata simplemente de residuos alimentarios. En efecto, hace falta entender que, para los industriales, una etapa de eliminación de biopelículas requiere generalmente la parada de las instalaciones de producción, lo cual representa un coste no despreciable, que no debe realizarse si no es necesario.
Por su parte, el documento EP 1491505 da a conocer un procedimiento de medición de la formación de biopelículas en sistemas acuosos. Este procedimiento comprende una primera etapa de colocación de cupones de muestras en el sistema acuoso. Entonces hace falta esperar a que se desarrolle una biopelícula antes de recuperar los cupones. A continuación, se colorean los cupones con la ayuda de un colorante, se aclaran y se analizan mediante fotometría o mediante comparación con una tarjeta de calibración.
A partir de esto, ya resulta que el procedimiento de detección según este documento presenta varios inconvenientes, en particular el hecho de que revela ciertas incertidumbres y que es realmente largo. En efecto, la colocación de cupones debe realizarse en zonas en las que se sospecha la presencia de biopelículas (dejando suponer que ya se han detectado previamente) y esperar al desarrollo de la misma. Aunque las bacterias se desarrollen rápidamente, no se excluye en ningún caso que no se desarrolle una biopelícula sobre el cupón mientras que la instalación está cubierta por biopelículas o que el tiempo durante el cual están colocados los cupones en la instalación no sea adecuado para que se desarrolle una biopelícula sobre el cupón. Las bacterias siempre presentan una afinidad más alta por la matriz extracelular ya formada sobre la instalación que va a tratarse que por la superficie lisa del cupón de muestreo.
Además, según las enseñanzas de este documento, antes de la coloración, los cupones se aclaran con azida para eliminar el crecimiento bacteriano. La disolución de coloración puede ser una disolución acuosa de safranina, azul de Coomassie, violeta cristal, rojo de rutenio o eritionina. La disolución de aclarado es una disolución que contiene azida y los cupones se lavan finalmente con DMSO después del secado.
Tal como puede constatarse fácilmente, este procedimiento descrito no permite aplicarse en procedimientos alimentarios, la azida NaN3 es tóxica y explosiva, su manipulación es peligrosa. Esto tiene como resultado que, en la práctica, este procedimiento es difícilmente aplicable por otro lado a cualquier tipo de industria. Además, el DMSO tampoco es aplicable en la industria alimentaria. Finalmente, se requiere el uso de cupones, lo cual limita este procedimiento a aplicaciones en circuito cerrado (los cupones deben colocarse durante un periodo de tiempo que llega a ser hasta de 5 meses).
Además, este documento no da a conocer ningún kit de detección, usa dispositivos voluminosos y todos los ejemplos usan safranina y azida. Ninguna aplicación de las enseñanzas de este documento es posible en la industria agroalimentaria y el color rojo no es adecuado. Además, los cupones no pueden aplicarse a las superficies abiertas (cintas transportadoras) debido al alto tiempo de permanencia (que llega a ser hasta de 5 meses), siendo los cupones necesarios a la vista de la toxicidad de las sustancias usadas.
Por tanto, existe una necesidad de proporcionar un procedimiento y un kit de detección fiable, rápido y poco voluminoso, que no necesite aparatos de medición difíciles de usar o de transportar tales como espectrómetros y cuya detección pueda aplicarse en cualquier tipo de industria tal como, por ejemplo, en la industria alimentaria.
La invención tiene como objetivo aliviar los inconvenientes del estado de la técnica proporcionando un procedimiento y un kit de detección de biopelículas que permitan detectar, sobre cualquier tipo de superficie, la presencia de biopelículas, particularmente polivalentes, es decir, que puedan usarse para cualquier tipo de aplicación, incluido en la industria agroalimentaria en la que, desde un punto de vista sanitario, las biopelículas deben detectarse rápidamente y de manera
precisa y eficaz, es decir, en los que la detección de falsos negativos y de falsos positivos sea limitada o incluso inexistente.
Para resolver este problema, según la invención se prevé un procedimiento de detección de biopelículas, que comprende las etapas de:
- vaporización de una disolución de coloración de biopelículas que consiste en un colorante que es azul de Coomassie en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, sobre una superficie susceptible de estar contaminada por una biopelícula, siendo dicha superficie una superficie abierta de una instalación,
- coloración de dicha biopelícula mediante dicha disolución de coloración durante un periodo de tiempo predeterminado de menos de 15 minutos,
- vaporización de una disolución de limpieza que comprende dicha fase de dilución,
- dilucion de dicha disolución de coloración excedente mediante dicha disolución de limpieza durante un periodo de tiempo predeterminado de menos de 15 minutos, y
- detección y localización de manera precisa de dicha biopelícula mediante la observación de zonas residuales coloreadas con azul de Coomassie correspondientes a biopelículas coloreadas por dicho colorante, - siendo dicho procedimiento de detección de biopelículas un procedimiento de detección y de localización precisa de las biopelículas en menos de una hora y compatible con la industria agroalimentaria.
Más particularmente, un kit de detección y de localización de biopelículas para la puesta en práctica del procedimiento según la invención comprende:
- una disolución de coloración de biopelículas lista para vaporizarse que contiene un colorante en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, en el que dicho colorante es azul de Coomassie,
- una disolución de limpieza lista para vaporizarse que comprende dicha fase de dilución,
- siendo dicho kit de detección y de localización de biopelículas compatible con la industria agroalimentaria.
Tal como puede constatarse, la fase de dilución del colorante es compatible con cualquier tipo de aplicación, pero también con la industria agroalimentaria, lo cual permite aplicarla en cualquier tipo de instalación industrial y el colorante usado está fácilmente disponible en el mercado y es particularmente visible. Además, la combinación de la disolución de coloración según la invención y de la disolución de limpieza permite reducir la detección de falsos positivos y mejora la selectividad de la detección con respecto a las detecciones existentes.
En efecto, según la presente invención, lo que se desea no es la detección de bacterias ya que este tipo de detección proporcionaría inevitablemente resultados de falsos negativos. En efecto, cuando las bacterias provocan la formación de una biopelícula, desarrollan una matriz extracelular adhesiva compuesta por sustancias poliméricas. Las bacterias se adhieren entonces a la superficie y están confinadas en la matriz polimérica compuesta principalmente por glicoproteínas. Por tanto, son estas glicoproteínas las que hace falta detectar y no los polisacáridos generalmente usados en la técnica anterior para detectar las biopelículas. Por su parte, la detección de polisacáridos puede proporcionar una cantidad de resultados inespecíficos por la presencia de falsos positivos (los polisacáridos están muy presentes en los residuos de la industria agroalimentaria) o de falsos negativos. Si la superficie se limpia bien y, por tanto, están presentes pocos polisacáridos procedentes de residuos de alimentos, los polisacáridos de bacterias no pueden detectarse dado que las bacterias están confinadas en esta matriz polimérica y, por tanto, no están accesibles para la coloración, sobre todo si el tiempo de exposición de colorante no es muy alto.
Además, generalmente, se usan colorantes con base de color rojo, pero son muy poco visibles, si llegan a alcanzar los polisacáridos de las bacterias confinadas en las biopelículas, a través de esta matriz que constituye la biopelícula.
Por este motivo, el kit según la invención presenta una rapidez de detección y una especificidad muy ventajosa ya que selecciona como diana las glicoproteínas de la matriz extracelular de la biopelícula y, por tanto, reduce la presencia de falsos negativos o de falsos positivos y selecciona como diana las glicoproteínas muy accesibles para el colorante y poco presentes en los alimentos u otros residuos. Por tanto, la biopelícula se detecta rápidamente y de manera selectiva.
El kit de detección según la invención comprende simplemente una primera disolución de coloración que va a vaporizarse y una disolución de limpieza que va a vaporizarse a continuación cuyos tiempos de exposición son cortos (menos de 15 minutos). Esto significa que, generalmente, en menos de una hora, preferiblemente en menos de media hora, se detectan y se localizan de manera precisa las biopelículas.
El aspecto práctico del kit según la invención es particularmente ventajoso ya que no requiere una instalación costosa para detectar la biopelícula, a simple vista es suficiente, lo cual se debe a la elección particular del colorante, fácilmente identificable a simple vista, diferente de los colores que se encuentran generalmente en
todos los tipos de industrias que tratan materia vegetal u orgánica (pocos alimentos azules, a diferencia de rojos). Una simple vaporización de la primera disolución seguida por la segunda es suficiente.
Ventajosamente, el kit de detección según la invención comprende además una composición de decoloración, compatible con la industria agroalimentaria, lo cual permite a continuación hacer que desaparezca el color azul de la instalación si es necesario. En efecto, en determinadas aplicaciones, los materiales usados son porosos, tales como los cauchos de las cintas transportadoras. Con el fin de no mantener el color azul sobre estas materias específicas, se usará una disolución de decoloración. En efecto, no resulta ventajoso que el color azul persista tras el uso dado que esto podría perjudicar a las etapas de detección posteriores. Evidentemente, el color azul de la biopelícula se elimina con la biopelícula.
En una realización particular, dicha composición de decoloración es una fase sólida de un agente oxidante que, por tanto, puede distribuirse simplemente sobre la zona tratada, de manera preferible previamente humedecida para favorecer la activación del agente oxidante en el agua. La presencia de la composición de decoloración en forma de una fase sólida es ventajosa para la conservación del carácter oxidante de la composición de decoloración a lo largo del tiempo.
En una variante según la invención, dicha composición de decoloración es una disolución acuosa de un agente oxidante, lo cual permite aplicarla fácilmente sobre la zona que va a tratarse mediante simple vaporización, sobre todo cuando es vertical.
En una forma particular del kit de detección de biopelículas según la invención, dicho agente oxidante se elige del grupo constituido por percarbonato de sodio, hipoclorito de sodio, agua oxigenada, perboratos, persulfatos o incluso peróxidos o sus mezclas y sus derivados tales como, por ejemplo, el percarbamato de urea.
En particular, dicha fase de dilución comprende del 40 al 50 %, de manera más preferible aproximadamente el 45 % en volumen de etanol, en particular de etanol absoluto, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, del 8 al 12 %, de manera más particular aproximadamente el 10 % en volumen de ácido acético, en particular de ácido acético glacial, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, y del 40 al 50 %, de manera más preferible aproximadamente el 45 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución.
Tal como puede constatarse fácilmente, esta fase de dilución sólo comprende sustancias que pueden ingerirse y compatibles con la industria agroalimentaria, que pueden conseguirse fácilmente y poco costosas.
Otras realizaciones del kit de detección según la invención se indican en las reivindicaciones adjuntas.
Tal como se mencionó anteriormente, el procedimiento según la presente invención es rápido, poco costoso en cuanto al tiempo y a los equipos que van a usarse, eficaz debido a su selectividad y su rapidez de detección y compatible con la industria agroalimentaria, por tanto, polivalente para cualquier tipo de industria.
Ventajosamente, una o varias de las etapas elegidas del grupo de la etapa de vaporización de dicha disolución de coloración, de vaporización de dicha disolución de limpieza y de detección de dicha biopelícula están precedidas por una etapa de aclarado con agua, lo cual permite eliminar el exceso de colorante, sobre la zona que va a tratarse o diluido en la disolución de limpieza, lo cual permite mejorar la selectividad del procedimiento de detección de biopelículas según la invención.
En una realización preferible según la presente invención, el procedimiento comprende además una etapa de decoloración de dichas zonas residuales coloreadas con azul de Coomassie mediante la aplicación de una composición de decoloración.
Ventajosamente, dicha etapa de decoloración se realiza mediante la aplicación de una composición de decoloración sólida, en particular pulverulenta, de un agente oxidante, sobre la superficie que va a tratarse previamente humedecida para favorecer la activación del agente oxidante.
En una variante según la invención, dicha etapa de decoloración se realiza mediante la aplicación de una composición de decoloración líquida de un agente oxidante.
Preferiblemente, según la invención, dicho periodo de tiempo predeterminado está comprendido entre 3 y 15 minutos, preferiblemente entre 4 y 10 minutos, y generalmente es de aproximadamente 5 minutos. Evidentemente, esto permite detectar rápidamente la biopelícula, pero también refleja la eficacia del procedimiento según la invención que puede ponerse en práctica rápidamente y su selectividad (se selecciona realmente como diana la sustancia que va a detectarse y se detecta rápidamente).
De manera más preferible, dicha superficie susceptible de estar contaminada por una biopelícula es una superficie abierta de una instalación, en particular de una instalación de la industria agroalimentaria. En efecto, es preferible que la superficie sobre la cual debe detectarse una biopelícula mediante el procedimiento según la invención sea una superficie visible a simple vista, es lo que generalmente se denomina una superficie abierta. No
obstante, el procedimiento según la invención también puede aplicarse sobre superficies menos accesibles o no visibles, pero sin duda deberán desmontarse con vistas a la etapa de detección, por ejemplo, pueden tratarse tuberías, por ejemplo, mediante circulación, pero probablemente deberán abrirse para detectar el resultado.
Evidentemente, aunque no sea necesario según la presente invención, el procedimiento también puede recurrir al uso de cupones colocados en instalaciones cerradas. Una vez recuperados, los cupones se tratan entonces como cualquier superficie abierta en el sentido de la presente invención.
Otras realizaciones del procedimiento según la invención se indican en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención también se refiere a un uso de una disolución de coloración de biopelículas que consiste en un colorante que es azul de Coomassie en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, y de una disolución de limpieza lista para vaporizarse que comprende dicha fase de dilución, sobre una superficie susceptible de estar contaminada por una biopelícula, siendo dicha superficie una superficie abierta, en particular en una instalación de la industria agroalimentaria, con el fin de detectar y localizar dicha biopelícula.
Otras características, detalles y ventajas de la invención se desprenderán de la descripción facilitada a continuación, a título no limitativo y haciendo referencia a los ejemplos mencionados.
La figura 1 es una vista en perspectiva de un kit de detección de biopelículas según la invención.
La figura 2 es una fotografía de un elemento de la industria agroalimentaria tratado mediante el kit de detección de biopelículas según la presente invención que muestra la detección de biopelículas.
En las figuras, los elementos idénticos o similares portan las mismas referencias.
La figura 1 ilustra el kit 1 de detección de biopelículas que comprende una disolución 2 de coloración de biopelículas que contiene azul de Coomassie en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria. Evidentemente, en función de las aplicaciones requeridas, el colorante puede comprender eventualmente otro colorante en mezcla, pero de todos modos comprenderá azul de Coomassie con el objetivo de detectar biopelículas.
La fase de dilución de la disolución 2 de coloración comprende, en esta realización ventajosa ilustrada, el 45 % en volumen de etanol absoluto, el 10 % en volumen de ácido acético glacial y el 45 % en volumen de agua con respecto al volumen final de dicha fase de dilución.
El kit 1 de detección comprende además una disolución 3 de limpieza ventajosamente constituida por dicha fase de dilución. Evidentemente, esto permite diluir el colorante no unido a las proteínas de la biopelícula.
El kit 1 de detección de biopelículas comprende además ventajosamente una composición 4 de decoloración, compatible con la industria agroalimentaria. En la realización ilustrada, la composición 4 de decoloración es una fase sólida de un agente oxidante compuesto por percarbonato de sodio. En una variante no ilustrada según la invención, la composición 4 de decoloración es una disolución acuosa de un agente oxidante tal como, por ejemplo, una disolución de hipoclorito de sodio o de agua oxigenada.
En un uso ventajoso del kit 1 de detección de biopelículas, en primer lugar, se aclara la superficie que va a tratarse para detectar si está presente o no una biopelícula, por ejemplo, una superficie abierta de la industria agroalimentaria, y, a continuación, se vaporiza con la ayuda de la disolución 2 de coloración. Se deja actuar la coloración durante aproximadamente 5 minutos y, a continuación, se aclara la superficie que va a tratarse para eliminar de la misma la disolución de coloración excedente. Generalmente, la cantidad de disolución de coloración usada será de aproximadamente 6,5 pl/cm2 de superficie que va a tratarse, es decir 65,2 ml/m2.
A continuación, según las recomendaciones, se vaporiza la superficie que va a tratarse con la ayuda de la disolución 3 de limpieza que se deja actuar durante aproximadamente 5 minutos. La disolución de limpieza está ventajosamente constituida por la fase de dilución del colorante de la disolución 2 de coloración del kit de detección de biopelículas según la presente invención. Por tanto, la disolución de limpieza permite eliminar los eventuales restos de azul de Coomassie excedente que no se adhiere a la biopelícula por efecto de dilución en la fase de dilución. Generalmente, la cantidad de disolución de coloración usada será de aproximadamente 21,7 pl/cm2 de superficie que va a tratarse, es decir 217 ml/m2.
A continuación, se aclara la superficie con agua para eliminar los restos de azul de Coomassie residuales diluido en la disolución 3 de limpieza y, a continuación, se deja en reposo la superficie que va a tratarse durante 5 minutos. Cuando persiste una coloración azul sobre la superficie que va a tratarse, esto indica la presencia de una biopelícula y, por tanto, permite su detección rápida en aproximadamente menos de 20 minutos. Finalmente,
se distribuye la composición de decoloración en forma de reactivo en polvo en el kit según la invención sobre la superficie que va a tratarse húmeda para eliminar la coloración azul de la superficie que va a tratarse.
Ejemplo 1.-(ejemplo útil para comprender la invención, pero que no constituye una realización)
Se recubrieron 5 juegos de cupones diferentes con diferentes materias orgánicas usadas con frecuencia en la industria agroalimentaria según los protocolos mencionados a continuación.
a) mantequilla: se untaron manualmente los cupones con mantequilla
b) almidón: se colocan cupones en un cuenco y se recubren con un ml de agua de cocción de arroz, rica en almidón. A continuación, se dejan secar los cupones al aire libre.
c) carboximetilcelulosa: se colocan cupones en un cuenco y se recubren con un ml de una disolución de carboximetilcelulosa (CMC). A continuación, se dejan secar los cupones al aire libre. La concentración de carboximetilcelulosa de la disolución usada es de 500 mg de CMC/50 ml de agua desmineralizada.
d) gelatina: se colocan cupones en un cuenco y se recubren con un ml de una disolución de gelatina. A continuación, se dejan secar los cupones al aire libre. La concentración de la disolución de gelatina es del 3,6 % de gelatina, obtenida mediante la disolución de 3,6 g de gelatina comercial en 100 ml de agua caliente.
e) leche: se colocan cupones en un cuenco y se vierte 1 ml de una disolución de leche diluida 100 veces con agua sobre cada cupón. A continuación, se dejan secar los cupones al aire libre.
Después, se disponen durante 30 minutos los cupones en la disolución coloreada que contiene aproximadamente 0,25 g de azul de Coomassie R250 en una fase de dilución que comprende 45 ml de etanol puro, 45 ml de agua destilada y 10 ml de ácido acético glacial. A continuación, se sumergen los cupones en 100 ml de disolución de limpieza constituida aproximadamente por la misma fase de dilución. A continuación, se dejan secar los cupones al aire libre.
El análisis visual de los cupones permite constatar que la mantequilla, la carboximetilcelulosa, la gelatina y el almidón no se colorean por el azul de Coomassie. Persisten ligeros restos con la leche diluida 100 veces.
Tal como puede constatarse, el kit de detección de biopelícula según la presente invención permite detectar las biopelículas con una gran especificidad.
Ejemplo 2.- ejemplo industrial en una industria agroalimentaria.
Se sometieron a prueba instalaciones de un matadero, tras una limpieza convencional, para detectar la presencia de biopelículas con la ayuda del kit según la invención. Tras la limpieza convencional, las instalaciones presentaban un aspecto visual de limpieza muy bueno. Las zonas sometidas a prueba para la detección de biopelículas son principalmente las salas de desplumadura, evisceración y embridado.
Sobre las superficies ligeramente húmedas, se vaporizó la disolución de coloración del kit según la invención sobre todos los dispositivos de estas salas tales como ganchos, cortadores de cabezas, cuchillas, recipientes de acero inoxidable, bebederos, etc., y se dejó actuar durante 5 minutos. La disolución de coloración comprendía 0,1 g de azul de Coomassie en 100 ml de fase de dilución que comprendía 45 ml de agua, 45 ml de etanol absoluto y 10 ml de ácido acético glacial.
Las superficies de los elementos sometidos a prueba se aclararon con agua para eliminar el colorante en exceso y, a continuación, se vaporizaron con la disolución de limpieza que comprendía dicha fase de dilución. Se dejó actuar la disolución de limpieza durante 5 minutos y se aclararon los elementos sometidos a prueba para la detección de biopelículas y se frotaron mecánicamente para aportar una ligera acción mecánica y eliminar las coloraciones residuales y/o los falsos positivos eventuales. A continuación, se observaron los resultados. Puede apreciarse muy fácilmente que los problemas de contaminación persistente sobre determinadas superficies están provocados por la presencia de biopelículas, tal como, por ejemplo, sobre los elementos sometidos a prueba tales como los ganchos de desplumadura, las cuchillas, los bebederos, recipientes y los cortadores de cabezas. En la figura 2 sólo se ilustran los cortadores de cabezas, aunque los demás elementos también están contaminados. A pesar de la calidad de la limpieza realizada por la sociedad, determinados aparatos están contaminados de manera algunas veces intensa por una biopelícula. Esta biopelícula es la causa de resultados microbiológicos no conformes.
Ejemplo comparativo 1
Se recubrieron los 5 juegos de cupones diferentes del ejemplo 1 según la invención con las mismas materias orgánicas diferentes usadas con frecuencia en la industria agroalimentaria con la excepción del hecho de que, para la leche, se realizaron dos pruebas, la dilución de la leche aplicada era de 00 veces como en el ejemplo 1, pero también de 20 veces.
Después se dispusieron los cupones en la disolución coloreada que contenía aproximadamente 3 g de rojo de arroz (monascina) en 100 ml de una fase de dilución que comprendía agua y etanol en una relación de 1/1 durante 15 minutos y después, para el aclarado, 10 minutos en agua destilada.
El análisis visual de los cupones permite constatar que la mantequilla, la carboximetilcelulosa, no se colorean por el rojo de arroz (monascina), por el contrario la leche (a las dos diluciones), el almidón y la gelatina se colorean por este colorante, lo cual hace que sea inespecífico y hace que su uso sea complejo. Hay que indicar en este caso que se adaptó el protocolo de prueba según el documento anterior JP2005210997 para poder comparar los resultados con los obtenidos para el kit según la presente invención.
Ejemplo comparativo 2
Se recubrieron los 5 juegos de cupones diferentes del ejemplo 1 con las mismas materias orgánicas diferentes usadas con frecuencia en la industria agroalimentaria con la excepción del hecho de que, para la leche, se realizaron dos pruebas, la dilución de la leche aplicada era de 00 veces como en el ejemplo 1, pero también de 20 veces.
Después se dispusieron los cupones en la disolución coloreada que contenía aproximadamente 36 g/l de safranina en una fase de dilución que comprendía agua desmineralizada, metil etil cetona y etanol durante 15 minutos y después, para el aclarado, 10 minutos en agua desmineralizada.
El análisis visual de los cupones permite constatar que la mantequilla, la carboximetilcelulosa y la gelatina no se colorean por la safranina, por el contrario la leche (a las dos diluciones) y el almidón se colorean por este colorante, lo cual hace que sea inespecífico y hace que su uso sea complejo. Hay que indicar en este caso que se adaptó el protocolo de prueba según el documento anterior EP1491505, por un lado, para que sea aplicable en la industria agroalimentaria, y para poder comparar los resultados con los obtenidos para el kit según la presente invención.
Evidentemente, la presente invención no se limita de ninguna manera a las realizaciones descritas anteriormente y pueden aportarse muchas modificaciones a las mismas sin salirse del contexto de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (14)
- REIVINDICACIONESi. Procedimiento de detección de biopelículas, que comprende las etapas de:- vaporización de una disolución de coloración de biopelículas que consiste en un colorante que es azul de Coomassie en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, sobre una superficie susceptible de estar contaminada por una biopelícula, siendo dicha superficie una superficie abierta de una instalación,- coloración de dicha biopelícula mediante dicha disolución de coloración durante un periodo de tiempo predeterminado de menos de 15 minutos,- vaporización de una disolución de limpieza que comprende dicha fase de dilución, - dilución de dicha disolución de coloración excedente mediante dicha disolución de limpieza durante un periodo de tiempo predeterminado de menos de 15 minutos, y- detección y localización de manera precisa de dicha biopelícula mediante la observación de zonas residuales coloreadas con azul de Coomassie correspondientes a biopelículas coloreadas por dicho colorante,- siendo dicho procedimiento de detección de biopelículas un procedimiento de detección y de localización precisa de biopelículas en menos de una hora y compatible con la industria agroalimentaria.
- 2. Procedimiento de detección de biopelículas según la reivindicación 1, en donde una o varias de las etapas elegidas del grupo de la etapa de vaporización de dicha disolución de coloración, de vaporización de dicha disolución de limpieza y de detección de dicha biopelícula están precedidas por una etapa de aclarado con agua.
- 3. Procedimiento de detección de biopelículas según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además una etapa de decoloración de dichas zonas residuales coloreadas con azul de Coomassie mediante la aplicación de una composición de decoloración.
- 4. Procedimiento de detección de biopelículas según la reivindicación 3, en donde dicha etapa de decoloración se realiza mediante la aplicación de una composición de decoloración sólida, en particular pulverulenta, de un agente oxidante.
- 5. Procedimiento de detección de biopelículas según la reivindicación 3, en donde dicha etapa de decoloración se realiza mediante la aplicación de una composición de decoloración líquida de un agente oxidante.
- 6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho periodo de tiempo predeterminado está comprendido entre 3 y 15 minutos, preferiblemente entre 4 y 10 minutos, y generalmente es de 5 minutos.
- 7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha superficie abierta susceptible de estar contaminada por una biopelícula es una superficie de una instalación de la industria agroalimentaria, tratamiento de aguas, circuito de refrigeración, sanidad y alimentación animal.
- 8. Kit (1) de detección y de localización de biopelículas para la puesta en práctica del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:- una disolución (2) de coloración de biopelículas lista para vaporizarse que contiene un colorante en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, en el que dicho colorante es azul de Coomassie,- una disolución (3) de limpieza lista para vaporizarse que comprende dicha fase de dilución - siendo dicho kit de detección y de localización de biopelículas compatible con la industria agroalimentaria.
- 9. Kit (1) de detección de biopelículas según la reivindicación 8, que comprende además una composición (4) de decoloración, compatible con la industria agroalimentaria.
- 10. Kit (1) de detección de biopelículas según la reivindicación 9, en donde dicha composición (4) de decoloración es una disolución acuosa de un agente oxidante.
- 11. Kit (1) de detección de biopelículas según la reivindicación 9, en donde dicha composición (4) de decoloración es una fase sólida de un agente oxidante.
- 12. Kit (1) de detección de biopelículas según la reivindicación 10 u 11, eligiéndose dicho agente oxidante del grupo de percarbonato de sodio, hipoclorito de sodio, agua oxigenada, perboratos, persulfatos o incluso peróxidos o sus mezclas y derivados tales como, por ejemplo, el percarbamato de urea.
- 13. Kit (1) de detección de biopelículas según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicha fase de dilución comprende del 40 al 50 %, más preferiblemente el 45 % en volumen de etanol, en particular de etanol absoluto, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, del 8 al 12 %, más particularmente el 10 % en volumen de ácido acético, en particular de ácido acético glacial, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, y del 40 al 50 %, más preferiblemente el 45 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución.
- 14. Uso de una disolución de coloración de biopelículas lista para vaporizarse que consiste en un colorante que es azul de Coomassie en disolución en una fase de dilución compatible con la industria agroalimentaria, que comprende del 35 al 55 % en volumen de etanol, del 7 al 13 % en volumen de ácido acético y del 35 al 55 % en volumen de agua, con respecto al volumen final de dicha fase de dilución, y de una disolución de limpieza lista para vaporizarse que comprende dicha fase de dilución, sobre una superficie susceptible de estar contaminada por una biopelícula, siendo dicha superficie una superficie abierta, en particular en una instalación de la industria agroalimentaria, con el fin de detectar y localizar dicha biopelícula.
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