CN101132814B - 用于染色眼膜的染色组合物 - Google Patents

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Abstract

一种当进行眼膜摘除时用于染色眼膜的染色组合物，其中该染色组合物包含亮蓝G(BBG)衍生物作为主要成分。

Description

用于染色眼膜的染色组合物
优先权要求
本申请要求2004年12月6日提交的美国临时申请No.60/633,592和2005年1月27日提交的美国临时申请No.60/647,504的优先权，所述申请的内容全文引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及用于染色眼膜(ophthalmic membrane)的染色组合物。更具体而言，本发明涉及作为佐剂用于染色眼膜，特别是用于摘除眼膜的染色组合物。
背景技术
内界膜(ILM)染色是用于诸如黄斑裂孔和视网膜前膜(ERMS)等玻璃体视网膜疾病的外科手术的重要进展之一(Indocyanine green-assisted peeling of the retinal internal limiting membrane.Burk SE等.Ophthalmology.2000；107：2010-2014)。现在普遍认为，在不使用手术佐剂的情况下，由于ILM和ERMS的可视性较差，摘除眼膜是极其困难的。特别是，在各种玻璃体视网膜疾病中，吲哚菁绿(ICG)和台盼蓝(TB)染色非常有利于ILM和ERMS剥离，结果，该技术现在已经被许多外科医生广泛接受。然而，最近出现了大量关于在实验和临床应用中玻璃体内注射ICG和TB引起视网膜损害的报道(Morphological and functional damage of the retina caused byintravitreous indocyanine green in rat eyes.Enaida H，等.Graefes ArchClin Exp Ophthalmol.2002；240：209-213；Uemura A，等.Visual fielddefects after uneventful vitrectomy for epiretinal membrane withindocyanine green-assisted internal limiting membrane peeling.Am JOphthalmol.2003；136：252-257；Veckeneer M，等.Ocular toxicity studyof trypan blue injected into the vitreous cavity of rabbit eyes.GraefesArch Clin Exp Ophthalmol.2001；239：698-704)。
此外，在白色的成熟白内障眼中进行连续曲线形撕囊术(CCC)可能是挑战性的，因为难以区分前囊与下面的白色皮质。较差的前囊可视性倾向于导致不完全的或不充分的CCC，这可能导致随后的囊撕裂、玻璃体损失和眼内晶状体(IOL)脱位。为了在具有较差红反射或没有红反射的白内障眼内进行CCC而眼内施用染料进行前囊染色已经越来越普遍。数据证明，囊染色有利于CCC，甚至在未成熟白内障中也是如此，并且可以是实习外科医生的有用辅助手段。已经使用0.1％和0.06％的台盼蓝进行了囊染色，并且发现其在体内没有明显的毒性。但是，曾经报道在苛刻条件下台盼蓝在体外对角膜内皮有毒。吲哚菁绿(ICG)也是常用于囊染色的染料。McEnerney和Peyman记载了应用ICG对兔角膜内皮进行细胞计数，并且提出该染料不损害活的内皮。但是，本发明人在2002年报道了ICG对视网膜细胞的潜在毒性，最近，在视网膜色素上皮细胞、神经节细胞和光感受器中报道了ICG的毒性。(Indocyanine green induces apoptosis in human retinalpigment epithelial cells.Rezai KA，等.Am J Ophthalmol.2004；137：931-933；Trypan blue induces apoptosis in human retinal pigment epithelialcells.Rezai KA等.Am J Ophthalmol.2004；138：492-495.)
如上所述，常规用于染色眼膜，特别是内界膜和前囊的染料(如IC或TB)已经产生了关于安全性的问题。由于对视网膜细胞的毒性、致畸性等的可能性的报道，产生了这些疑虑。此外，还存在诸如无法获得较低浓度的令人满意的染料和复杂的染色方法等技术问题。因此，这些问题使得眼科手术更加困难。
因此，为了促进眼科手术的改进，非常需要发展一种特异性地染色眼膜，并且具有在低浓度下高水平染色以及高水平安全性的目标的染料。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种染色组合物，它是常规用于染色眼膜的染料的替代物。一个更详细的目的是提供特别用于染色内界膜或前囊的染色组合物，可用作摘除该膜的外科手术的佐剂。
为了提供用于实现这些目的的染色组合物，使用了所有染料，包括当前尚未用于生物体的染料，然后在其中筛选候选染料。另外，作为筛选条件，特别注意安全性和染色亲和力。然后使用大鼠对范围缩小的候选染料进行安全性评价。根据较高的染色亲和力和安全性，亮蓝G(BBG)成为最终的候选物。
进而，为了检查含有BBG的染色组合物用于染色眼膜的最佳条件，进行了各种实验。这样，获得了本发明的染色组合物。应当注意，BBG尚未在临床上使用，特别是对于人类而言。但是，通过本发明的最佳条件，可以提供一种临床应用安全的并且也具有高染色亲和力的染色组合物。
因此，根据本发明的第一主要方面，提供了一种含有BBG作为主要成分的染色组合物，用于在摘除眼膜时染色眼膜。
也就是说，本发明的一个方面涉及一种当进行眼膜摘除时用于染色眼膜的染色组合物，其中该染色组合物包含亮蓝G(BBG)衍生物、其药学上可接受的盐或其水合物作为主要成分。
优选的BBG衍生物由通式[I]代表，
Figure G05841677920070607D000031
其中，
R1代表C1-10烷氧基、氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、羟基C2-10烷基、卤代C1- 10烷氧基、或卤代C1-10烷基，
n代表1-5中的任一个，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3′和R3″相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基，
p、p’和p″相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基，且
R5代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基。
通式[I]代表的进一步优选的BBG衍生物是，
R1代表C1-6烷氧基、氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、羟基C2-6烷基、卤代C1-6烷氧基、或卤代C1-6烷基，
n代表1-5中的任一个，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3’和R3”相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
p、p′和p″相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，且
R5代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基。
优选的BBG衍生物由通式[II]代表，
Figure G05841677920070607D000051
其中，
R1代表氢原子、-OH、C1-6烷基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
n代表1-5中的任一个，
Z代表-O-、-S-、-N＝、-OC(＝O)-或-C(＝O)O-，
Ra代表氢原子、-OH、C1-6烷基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、卤代C1-6烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3’和R3”相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C1- 6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
p、p’和p″相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子或C1-6烷基，且
R5代表氢原子、C1-6烷基、或卤代C1-6烷基。
优选地，在通式[II]中，
R1代表氢原子或C1-6烷基，
n代表1-5中的任一个，
Z代表-O-，
Ra代表C1-6烷基，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子或C1-6烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3’和R3”代表氢原子，
p、p′和p″代表4，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基，
R4和R4’相同或不同，各自代表C1-6烷基，且
R5代表氢原子、C1-6烷基。
优选的BBG衍生物由通式[III]代表，
Figure G05841677920070607D000061
其中，
Z代表-O-、-S-、-N＝、-OC(＝O)-或-C(＝O)O-，
Ra代表氢原子、-OH、C1-6烷基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，且
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子或C1-6烷基。
优选地，在通式[III]中，
Z代表-O-，
Ra代表C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基或卤代C1-6烷基，且
R4和R4’相同或不同，各自代表C1-6烷基。
优选地，在通式[III]中，
Z代表-O-，
Ra代表C1-3烷基，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-3烷基，且
R4和R4’相同或不同，各自代表C1-3烷基。
一种进一步优选的BBG衍生物、其药学上可接受的盐或其水合物是BBG染料。
C1-10烷基意思是具有1-10个碳原子的直链烷基，具有3-10个碳原子的支链烷基，或具有3-10个碳原子的环烷基。直链烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。支链烷基的例子包括异丙基、异丁基、1-甲基丙基、叔丁基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、5-甲基己基、3-乙基戊基、1-丙基丁基、1，4-二甲基戊基、3，4-二甲基戊基、1，2，3-三甲基丁基、1-异丙基丁基、4，4-二甲基戊基、5-甲基庚基、6-甲基庚基、4-乙基己基、2-丙基戊基、2，5-二甲基己基、4，5-二甲基己基、2-乙基-3-甲基戊基、1，2，4-三甲基戊基、2-甲基-1-异丙基丁基、3-甲基辛基、2，5-二甲基庚基、1-(1-甲基丙基)-2-甲基丁基、1，4，5-三甲基己基、1，2，3，4-四甲基戊基、7-甲基辛基、6-甲基壬基、8-甲基壬基、5-乙基-2-甲基庚基、2，3-二甲基-1-(1-甲基丙基)丁基、环丙基甲基、2-(环丙基)乙基、3，7-二甲基辛基、3-(环丁基)戊基、环戊基甲基和环己基甲基。环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在C1-10烷基中，优选C1-6烷基，进一步优选C1-3烷基。
C2-10烯基意思是具有2-10个碳原子并且具有至少一个双键的直链烯基，具有3-10个碳原子的支链烯基，或具有5-10个碳原子的环烯基，其例子包括乙烯基、烯丙基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、6-庚烯基、7-辛烯基、8-壬烯基、9-癸烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、2-戊烯基、2-甲基-2-己烯基和2-环戊烯基。在C2-10烯基中，优选C2-6烯基，进一步优选C2-3烯基。
C2-10炔基意思是具有2-10个碳原子并且具有至少一个三键的直链炔基，或具有4-10个碳原子的支链炔基，其例子包括2-丙炔基、3-丁炔基、4-戊炔基、5-己炔基、6-庚炔基、7-辛炔基、8-壬炔基、9-癸炔基、3-戊炔基和4-甲基-2-戊炔基。在C2-10炔基中，优选C2-6炔基，进一步优选C2-3炔基。
被一个或两个芳基取代的C1-10烷基意思是，例如，苄基、联苯甲基、2-苯乙基、2-苯丙基、1-甲基-1-苯乙基、1-甲基-2-苯戊基、2-硝基苄基、3-硝基苄基、4-硝基苄基、2，4-二硝基苄基、2，4，6-三硝基苄基、2-苯基苄基、3-苯基苄基、4-苯基苄基、2-羟基苄基、3-羟基苄基、4-羟基苄基、2-氯苄基、3-氯苄基、4-氯苄基、2-氟苄基、3-氟苄基、4-氟苄基、2-溴苄基、3-溴苄基、4-溴苄基、2-碘苄基、2-碘苄基、2，3-二氯苄基、2，4-二氯苄基、2，5-二氯苄基、2，6-二氯苄基、3，4-二氯苄基、3，5-二氯苄基、2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、2-乙基苄基、3-乙基苄基、4-乙基苄基、2-异丙基苄基、3-异丙基苄基、4-异丙基苄基、2-甲氧基苄基、3-甲氧基苄基、4-甲氧基苄基、2，3-二甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基、2，5-二甲氧基苄基、2，6-二甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、3，5-二甲氧基苄基、2-乙氧基苄基、3-乙氧基苄基、4-乙氧基苄基、2-异丙氧基苄基、3-异丙氧基苄基、4-异丙氧基苄基、2-甲氧基甲基苄基、3-甲氧基甲基苄基、4-甲氧基甲基苄基、2-异丙基甲基苄基、3-异丙基甲基苄基、4-异丙基甲基苄基、2-三氟甲基、3-三氟甲基、4-三氟甲基、2-羟基羰基苄基、3-羟基羰基苄基、4-羟基羰基苄基、2-氨基苄基、3-氨基苄基、4-氨基苄基、2-氨甲基苄基、3-氨甲基苄基、4-氨甲基苄基、2-氰基苄基、3-氰基苄基、4-氰基苄基、2-羟甲基苄基、3-羟甲基苄基、4-羟甲基苄基、2-苯氧基苄基、3-苯氧基苄基和4-苯氧基苄基。作为被一个或两个芳基取代的C1-10烷基，优选C1-6烷基，进一步优选C1-3烷基。
芳基意思是苯基、取代的苯基或多环芳基，如1-萘基或2-萘基。
羟基C2-10烷基意思是被至少一个羟基取代的C2-10烷基，其例子包括2-羟基乙基、3-羟基丙基、4-羟基丁基、5-羟基戊基、6-羟基己基、7-羟基庚基、8-羟基辛基、9-羟基壬基、10-羟基癸基、2-羟基丙基、2，3-二羟基丙基和2-羟基-3-甲基丁基。在羟基C2-10烷基中，优选羟基C2-6烷基，进一步优选羟基C2-3烷基。
卤代C1-10烷基意思是被至少一个氟原子、氯原子、溴原子或碘原子取代的C1-10烷基，其例子包括2-氯乙基、2-溴乙基、2-碘乙基、3-氯丙基、3-溴丙基、3-碘丙基、4-氯丁基、4-溴丁基、4-碘丁基、5-氯戊基、6-氯己基、7-氯庚基、8-氯辛基、9-氯壬基、10-氯癸基、2-氯丙基、2-氯丁基、2，4-二氯丁基和2-氯-3-甲基丁基。在卤代C1-10烷基中，优选卤代C1-6烷基，进一步优选卤代C1-10烷基。
C1-10烷氧基C1-10烷基意思是被具有1-10个碳的直链烷氧基、具有3-10个碳的支链烷氧基或具有3-10个碳的环烷氧基取代的具有1-10个碳原子的烷基，其例子包括2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基、2-丙氧基乙基、2-异丙氧基乙基、2-丁氧基乙基、2-异丁氧基乙基、2-叔-丁氧基乙基、2-戊氧基乙基、2-己烯基氧基乙基、3-乙氧基丙基、4-乙氧基丁基、4-乙氧基-3-甲氧基丁基和4-乙氧基-3-甲基戊基。在C1- 10烷氧基C1-10烷基中，优选C1-6烷氧基C1-6烷基，进一步优选C1-3烷氧基C1-3烷基。
卤代C1-10烷氧基意思是被至少一个氟原子、氯原子、溴原子或碘原子取代的C1-10烷氧基。在卤代C1-10烷氧基中，优选卤代C1-6烷氧基，进一步优选卤代C1-3烷氧基。
本发明的BBG衍生物的优选立体结构是具有绝对结构的旋光活性体，但是本发明的BBG衍生物可以作为对映体或对映体混合物如外消旋体存在。因此，本发明的BBG衍生物包括上述通式[I]代表的BBG衍生物的所有旋光活性体、对映体混合物如外消旋体和非对映体混合物。
药学上可接受的盐的例子包括用无机碱、氨、有机碱、无机酸、有机酸、碱性氨基酸、卤素离子等形成的盐，和分子内盐(innermolecular salts)。无机碱的例子包括碱金属(例如Na、K)和碱土金属(例如Ca、Mg)。有机碱的例子包括三甲胺、三乙胺、胆碱、普鲁卡因、乙醇胺等。无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。有机酸的例子包括对甲苯磺酸、甲磺酸、蚁酸、三氟乙酸和马来酸等。碱性氨基酸的例子包括赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸等。该化合物可以是药学上可接受的水合物。
根据本发明的一个优选实施方案，所述染色组合物可以在与眼科疾病有关的眼科手术中用作手术佐剂，所述疾病如玻璃体视网膜疾病，如黄斑裂孔、hymyopic黄斑裂孔引起的视网膜剥离、视网膜前膜、增殖性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿和增殖性玻璃体视网膜病变，和特定的白内障，如过熟白内障和先天性白内障，和分层(split-thickness)角膜移植等。根据本发明的染色组合物，能够更清楚地显示难以看到的眼膜，并且改善手术操作中的安全性。
在本发明一个进一步优选的实施方案中，所述染色组合物可以用于染色眼膜，更优选地，用于染色内界膜和/或前囊。
在本发明一个优选实施方案中，期望本发明的染色组合物含有浓度为0.1-10mg/ml，优选浓度为0.1-1.0mg/ml，最优选浓度为0.1-0.25mg/ml的BBG衍生物。在该实施方案中，提供了在低浓度和少量时具有高染色亲和力的染色组合物。
此外，根据本发明的一个实施方案，染色组合物优选地具有298mOsm的环境渗透压。根据该实施方案，本发明的染色组合物具有等于生理盐水的渗透压。因此，由于渗透压不同而引起的任何问题都得到解决。
在本发明的一个优选实施方案中，期望本发明的染色组合物显示中性pH，即pH为pH＝7.4左右。
根据本发明的第二主要方面，提供了一种用于染色和摘除眼膜的方法，包括以下步骤：制备含有BBG衍生物作为主要成分的染色组合物；用预定浓度的所述染色组合物染色眼膜；和摘除已染色的眼膜。
在本发明的一个优选实施方案中，所述眼膜是内界膜和/或前囊，但是并非限定于此。
根据本发明的第三主要方面，提供了BBG衍生物在制备用于治疗眼科疾病的染色组合物中的用途。
此外，根据本发明的第四主要方面，提供了BBG衍生物作为眼科手术的手术佐剂的用途。
本文提供的材料、方法和实施例只是说明性的，并非限制性的。通过以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1示出了在14天显示的玻璃体内注射BBG(10mg/ml，0.05ml/眼)的大鼠眼睛的光学显微镜照片。(原始放大倍数A：×200，B：×400)
图2示出了在14天显示的玻璃体内注射BBG(10mg/ml和1mg/ml，0.05ml/眼)的大鼠眼睛的透射电子显微镜照片。(原始放大倍数×2000)
图3示出了显示通过TUNEL检测的凋亡细胞死亡的照片。(原始放大倍数×400)
图4示出了显示大鼠眼中ERG的波形和最大幅度的图。
图5示出了显示在灵长类动物眼中BBG对ILM染色的照片。
图6示出了显示用于MH的BBG辅助的ILM剥离的照片。
图7示出了显示用于ERM的BBG辅助的膜剥离的照片。
图8示出了ILM的透射电子显微镜照片。
图9示出了BBG囊染色的代表性活组织显微图片。(原始放大倍数×4)。
图10示出了前房注射染料后苏木精和伊红染色的角膜切片(原始放大倍数×400)。
图11示出了显示通过TUNEL检测的凋亡细胞死亡的照片。
图12示出了通过透射电子显微镜检查显示角膜细胞和胶原细胞基质的超微结构的照片。
图13示出了通过扫描电子显微镜检查显示角膜内皮细胞的超微结构的照片。
图14示出了显示BBG辅助的CCC的照片。
具体实施方式
如前所述，评价集中于提供用于染色眼膜的染料，作为常规使用的染料如ICG或TB的替代物。因此，如下所述，组合了大量特征，获得了具有高染色亲和力和高水平安全性的染色组合物。
本发明的一个方面涉及一种当进行眼膜摘除时用于染色眼膜的染色组合物，其中该染色组合物含有亮蓝G(BBG)衍生物、其药学上可接受的盐或其水合物作为主要成分。
优选的BBG衍生物由通式[I]代表，
Figure G05841677920070607D000131
其中，
R1代表C1-10烷氧基、氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、羟基C2-10烷基、卤代C1- 10烷氧基、或卤代C1-10烷基，
n代表1-5中的任一个，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3′和R3″相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基，
p、p’和p″相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基，且
R5代表氢原子、-OH、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、被一个或两个芳基取代的C1-10烷基、C1-10烷氧基、羟基C2-10烷基、或卤代C1-10烷基。
通式[I]代表的进一步优选的BBG衍生物是，
R1代表C1-6烷氧基、氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、羟基C2-6烷基、卤代C1-6烷氧基、或卤代C1-6烷基，
n代表1-5中的任一个，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3’和R3”相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2- 6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
p、p′和p″相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，且
R5代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、被一个或两个芳基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基。
优选的BBG衍生物由通式[II]代表，
Figure G05841677920070607D000141
其中，
R1代表氢原子、-OH、C1-6烷基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
n代表1-5中的任一个，
Z代表-O-、-S-、-N＝、-OC(＝O)-或-C(＝O)O-，
Ra代表氢原子、-OH、C1-6烷基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、卤代C1-6烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3’和R3”相同或不同，各自代表氢原子、-OH、C1-6烷基、C1- 6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
p、p’和p″相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子或C1-6烷基，且
R5代表氢原子、C1-6烷基、或卤代C1-6烷基。
优选地，在通式[II]中，
R1代表氢原子或C1-6烷基，
n代表1-5中的任一个，
Z代表-O-，
Ra代表C1-6烷基，
R2和R2’相同或不同，各自代表氢原子或C1-6烷基，
m和m′相同或不同，各自代表1-4中的任一个，
R3、R3’和R3”代表氢原子，
p、p′和p″代表4，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基，
R4和R4’相同或不同，各自代表C1-6烷基，且
R5代表氢原子、C1-6烷基。
优选的BBG衍生物由通式[III]代表，
Figure G05841677920070607D000161
其中，
Z代表-O-、-S-、-N＝、-OC(＝O)-或-C(＝O)O-，
Ra代表氢原子、-OH、C1-6烷基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基、C1-6烷氧基、羟基C2-6烷基、或卤代C1-6烷基，且
R4和R4’相同或不同，各自代表氢原子或C1-6烷基。
优选地，在通式[III]中，
Z代表-O-，
Ra代表C1-6烷基或卤代C1-6烷基，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-6烷基或卤代C1-6烷基，且
R4和R4’相同或不同，各自代表C1-6烷基。
优选地，在通式[III]中，
Z代表-O-，
Ra代表C1-3烷基，
Rb和Rc相同或不同，各自代表C1-3烷基，且
R4和R4’相同或不同，各自代表C1-3烷基。
一种进一步优选的BBG衍生物、其药学上可接受的盐或其水合物是BBG染料。
C1-10烷基意思是具有1-10个碳原子的直链烷基，具有3-10个碳原子的支链烷基，或具有3-10个碳原子的环烷基。直链烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。支链烷基的例子包括异丙基、异丁基、1-甲基丙基、叔丁基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1-乙基丙基、1，1-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、5-甲基己基、3-乙基戊基、1-丙基丁基、1，4-二甲基戊基、3，4-二甲基戊基、1，2，3-三甲基丁基、1-异丙基丁基、4，4-二甲基戊基、5-甲基庚基、6-甲基庚基、4-乙基己基、2-丙基戊基、2，5-二甲基己基、4，5-二甲基己基、2-乙基-3-甲基戊基、1，2，4-三甲基戊基、2-甲基-1-异丙基丁基、3-甲基辛基、2，5-二甲基庚基、1-(1-甲基丙基)-2-甲基丁基、1，4，5-三甲基己基、1，2，3，4-四甲基戊基、7-甲基辛基、6-甲基壬基、8-甲基壬基、5-乙基-2-甲基庚基、2，3-二甲基-1-(1-甲基丙基)丁基、环丙基甲基、2-(环丙基)乙基、3，7-二甲基辛基、3-(环丁基)戊基、环戊基甲基和环己基甲基。环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在C1-10烷基中，优选C1-6烷基，进一步优选C1-3烷基。
C2-10烯基意思是具有2-10个碳原子并且具有至少一个双键的直链烯基，具有3-10个碳原子的支链烯基，或具有5-10个碳原子的环烯基，其例子包括乙烯基、烯丙基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、6-庚烯基、7-辛烯基、8-壬烯基、9-癸烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、2-戊烯基、2-甲基-2-己烯基和2-环戊烯基。在C2-10烯基中，优选C2-6烯基，进一步优选C2-3烯基。
C2-10炔基意思是具有2-10个碳原子并且具有至少一个三键的直链炔基，或具有4-10个碳原子的支链炔基，其例子包括2-丙炔基、3-丁炔基、4-戊炔基、5-己炔基、6-庚炔基、7-辛炔基、8-壬炔基、9-癸炔基、3-戊炔基和4-甲基-2-戊炔基。在C2-10炔基中，优选C2-6炔基，进一步优选C2-3炔基。
被一个或两个芳基取代的C1-10烷基意思是，例如，苄基、联苯甲基、2-苯乙基、2-苯丙基、1-甲基-1-苯乙基、1-甲基-2-苯戊基、2-硝基苄基、3-硝基苄基、4-硝基苄基、2，4-二硝基苄基、2，4，6-三硝基苄基、2-苯基苄基、3-苯基苄基、4-苯基苄基、2-羟基苄基、3-羟基苄基、4-羟基苄基、2-氯苄基、3-氯苄基、4-氯苄基、2-氟苄基、3-氟苄基、4-氟苄基、2-溴苄基、3-溴苄基、4-溴苄基、2-碘苄基、2-碘苄基、2，3-二氯苄基、2，4-二氯苄基、2，5-二氯苄基、2，6-二氯苄基、3，4-二氯苄基、3，5-二氯苄基、2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、2-乙基苄基、3-乙基苄基、4-乙基苄基、2-异丙基苄基、3-异丙基苄基、4-异丙基苄基、2-甲氧基苄基、3-甲氧基苄基、4-甲氧基苄基、2，3-二甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基、2，5-二甲氧基苄基、2，6-二甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、3，5-二甲氧基苄基、2-乙氧基苄基、3-乙氧基苄基、4-乙氧基苄基、2-异丙氧基苄基、3-异丙氧基苄基、4-异丙氧基苄基、2-甲氧基甲基苄基、3-甲氧基甲基苄基、4-甲氧基甲基苄基、2-异丙基甲基苄基、3-异丙基甲基苄基、4-异丙基甲基苄基、2-三氟甲基、3-三氟甲基、4-三氟甲基、2-羟基羰基苄基、3-羟基羰基苄基、4-羟基羰基苄基、2-氨基苄基、3-氨基苄基、4-氨基苄基、2-氨甲基苄基、3-氨甲基苄基、4-氨甲基苄基、2-氰基苄基、3-氰基苄基、4-氰基苄基、2-羟甲基苄基、3-羟甲基苄基、4-羟甲基苄基、2-苯氧基苄基、3-苯氧基苄基和4-苯氧基苄基。作为被一个或两个芳基取代的C1-10烷基，优选C1-6烷基，进一步优选C1-3烷基。
芳基意思是苯基、取代的苯基或多环芳基，如1-萘基或2-萘基。
羟基C2-10烷基意思是被至少一个羟基取代的C2-10烷基，其例子包括2-羟基乙基、3-羟基丙基、4-羟基丁基、5-羟基戊基、6-羟基己基、7-羟基庚基、8-羟基辛基、9-羟基壬基、10-羟基癸基、2-羟基丙基、2，3-二羟基丙基和2-羟基-3-甲基丁基。在羟基C2-10烷基中，优选羟基C2-6烷基，进一步优选羟基C2-3烷基。
卤代C1-10烷基意思是被至少一个氟原子、氯原子、溴原子或碘原子取代的C1-10烷基，其例子包括2-氯乙基、2-溴乙基、2-碘乙基、3-氯丙基、3-溴丙基、3-碘丙基、4-氯丁基、4-溴丁基、4-碘丁基、5-氯戊基、6-氯己基、7-氯庚基、8-氯辛基、9-氯壬基、10-氯癸基、2-氯丙基、2-氯丁基、2，4-二氯丁基和2-氯-3-甲基丁基。在卤代C1-10烷基中，优选卤代C1-6烷基，进一步优选卤代C1-10烷基。
C1-10烷氧基C1-10烷基意思是被具有1-10个碳的直链烷氧基、具有1-10个碳的支链烷氧基或具有3-10个碳的环烷氧基取代的具有1-10个碳原子的烷基，其例子包括2-甲氧基乙基、2-乙氧基乙基、2-丙氧基乙基、2-异丙氧基乙基、2-丁氧基乙基、2-异丁氧基乙基、2-叔-丁氧基乙基、2-戊氧基乙基、2-己烯氧基乙基、3-乙氧基丙基、4-乙氧基丁基、4-乙氧基-3-甲氧基丁基和4-乙氧基-3-甲基戊基。在C1-10烷氧基C1-10烷基中，优选C1-6烷氧基C1-6烷基，进一步优选C1-3烷氧基C1-3烷基。
卤代C1-10烷氧基意思是被至少一个氟原子、氯原子、溴原子或碘原子取代的C1-10烷氧基。在卤代C1-10烷氧基中，优选卤代C1-6烷氧基，进一步优选卤代C1-3烷氧基。
本发明的BBG衍生物的优选立体结构是具有绝对结构的旋光体，但是本发明的BBG衍生物可以作为对映体或对映体混合物如外消旋体存在。因此，本发明的BBG衍生物包括上述通式[I]代表的BBG衍生物的所有旋光体、对映体混合物如外消旋体和非对映体混合物。
药学上可接受的盐的例子包括用无机碱、氨、有机碱、无机酸、有机酸、碱性氨基酸、卤素离子等形成的盐，和内分子盐(innermolecular salts)。无机碱的例子包括碱金属(例如Na、K)和碱土金属(例如Ca、Mg)。有机碱的例子包括三甲胺、三乙胺、胆碱、普鲁卡因、乙醇胺等。无机酸的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。有机酸的例子包括对甲苯磺酸、甲磺酸、蚁酸、三氟乙酸和马来酸等。碱性氨基酸的例子包括赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸等。该化合物可以是药学上可接受的水合物。
本发明的BBG衍生物、其药学上可接受的盐或其水合物，特别是BBG，可以购买以及使用有机化学公知常识制备。进一步地，可以通过美国专利No.6,057,160说明书中公开的方法制备，该文件在此引入作为参考。
本发明的一个实施方案将用如下的实施例和附图加以描述。
首先，使用了所有染料，包括当前尚未用于生物体的染料，然后筛选候选染料。筛选出的染料是伊文思蓝、酸性蓝9、固绿、亮蓝FCF、靛胭脂、甲基蓝、亚甲基蓝、亮蓝G(BBG)。筛选条件特别集中于染色亲和力和安全性。在一些先导候选物中，从候选物中除去显示优良的安全性但是不能染色目标的那些，或者相反，显示良好的染色但是对视网膜有毒性的那些。然后使用大鼠对范围缩小的候选染料进行安全性评价，并根据较好的染色亲和力和安全性，BBG成为最终的候选物。下面详细叙述了BBG成为本发明的最终候选物的原因。
首先，与ICG相比，BBG染色的质量非常相似，并且能够在极低浓度(1/10-1/20)时染色目标。甚至在检查仍保留在眼内的极高浓度的溶液时，也没有证明对眼睛有明显毒性的观点。另外，由于BBG(不同于ICG)不是荧光染料，因此认为几乎不存在因眼内高照度照明而发生的对视网膜的光毒性。而且，与ICG相比，清洗后该染料在组织表面上的存留极少。再者，由于BBG是冷色型染料，而眼内组织是暖色型，可以突出染料的对比。
其次，为了评价含有BBG的染色组合物用于染色眼膜的最佳条件，进行了各种实验。而且，迄今为止BBG尚未在临床上使用，特别是对于人类而言。但是，通过本发明的最佳条件，可以提供在临床应用上既安全又具有高染色亲和力的染色组合物。
因此，根据本发明的第一主要方面，提供了一种含有BBG衍生物作为主要成分的染色组合物，用于在摘除眼膜时染色眼膜。
根据本发明的一个优选实施方案，所述染色组合物可以在与眼科疾病有关的眼科手术中用作手术佐剂，所述疾病如玻璃体视网膜疾病，如黄斑裂孔、hymyopic黄斑裂孔引起的视网膜剥离、视网膜前膜、增殖性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿和增殖性玻璃体视网膜病变，特定的白内障，如过熟白内障和先天性白内障和分层角膜移植等。根据本发明的染色组合物，能够更清楚地显示难以看到的眼膜，并且改善手术操作过程中的安全性。
在本发明一个进一步优选的实施方案中，所述染色组合物可以用于染色眼膜，更优选地，用于染色内界膜和/或前囊。
另外，根据本发明的一个实施方案，本发明的染色组合物可以与药学上可接受的载体组合。其可以制备为具有溶解溶液和药物粉末的组合的形式，或作为充满注射器容器的溶液，以及当与透明质酸组合时为凝胶态溶液的形式。最优选地，其制备为溶液形式，但并不需要限定于此。
在本发明的一个实施方案中，所述染色组合物制备为药学上可接受的溶液，但是不必限定于此。这是由于BBG的质量，其可以直接并且容易地溶解在眼内清洗溶液中，并且能够用注射器式滤器除菌。
此外，根据本发明的一个实施方案，所述染色组合物制备为溶液，其中该染色组合物溶解在眼内灌洗液、平衡盐溶液(BSS)、生理盐水溶液，或最优选地，OPEGUARD-MA(Senjyu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka，日本)中，OPEGUARD-MA是一种眼内灌洗液(眼内清洗溶液)。但是，并不需要限定于这种形式。
在本发明的一个优选实施方案中，所述染色组合物含有浓度为0.1-10mg/ml，优选浓度为0.1-1.0mg/ml，最优选浓度为0.1-0.25mg/ml的BBG。在本发明的一个实施例中，在所述染色组合物中，染色灵长类动物的ILM所需的BBG的浓度与ICG相比约为1/10。另外，为了染色前囊，所述染色组合物内的BBG在0.25mg/ml的低浓度下可以提供令人满意的染色，与其相比，ICG需要5mg/ml，TB需要1mg/ml。换句话说，根据该实施方案，可以提供在低浓度和少量时具有高染色亲和力的染色组合物。
此外，根据本发明的一个实施方案，染色组合物优选地具有298mOsm的环境渗透压。根据该实施方案，本发明的染色组合物具有等于生理盐水溶液的渗透压。以前报道在视网膜色素上皮细胞中使用ICG的缺陷可能是由于其溶液的低摩尔渗透压浓度。关于这一点，本发明一个实施方案的染色组合物具有出色的效果，因为视网膜色素上皮细胞处渗透压差异引起的缺陷——这是与细胞肿大或脱水(如细胞忽略或细胞死亡)有关的组织紊乱——没有发生。
在本发明的一个优选实施方案中，期望本发明的染色组合物显示中性pH，即pH为pH＝7.4左右。
根据本发明的第二主要方面，提供了用于染色和摘除眼膜的方法，包括以下步骤：制备含有BBG衍生物作为主要成分的染色组合物；用预定浓度的所述染色组合物染色眼膜；和摘除已染色的眼膜。
对于本发明的一个优选实施方案，所述染色眼膜的方法可以使用本领域技术人员容易理解的方法，例如，注射、输注、灌洗、确认和剥离，在本发明的一个实施例中，优选地所述染色眼膜的方法包括注射所述染色组合物。对于该实施例，另外的一个步骤如液体-气体交换不是必需的，而该步骤在对眼膜应用TB时是必需的。作为一个例子，能够仅在眼科手术期间使用时染色。
根据本发明的第三主要方面，提供了BBG衍生物在制备用于治疗眼科疾病的染色组合物中的用途。
此外，根据本发明的第四主要方面，提供了BBG衍生物作为用于眼科手术的手术佐剂的用途。
而且，在本发明的一个实施方案中，所述染色组合物和/或使用它的染色方法可以适当地作为眼科手术的一部分使用。根据本发明的一个优选实施方案，所述眼科手术是用于治疗如下疾病的手术：黄斑裂孔、hymyopic黄斑裂孔引起的视网膜剥离、视网膜前膜、增殖性糖尿病视网膜病、糖尿病黄斑水肿和增殖性玻璃体视网膜病变，特定的白内障，如过熟白内障和先天性白内障，和分层角膜移植等，最优选玻璃体视网膜疾病(特别是黄斑裂孔或视网膜前膜(ERMS))和白内障。
此外，本发明的一个优选实施方案是，对哺乳动物的眼睛，更优选地对人眼实施所述眼科手术。
提供下列实施例是为了更详细地阐述本发明。它们只是用于说明，而不是限制本发明。
实施例1
集中于安全性和染色膜的能力筛选各种染料作为候选物
为了提供能够实现这些目的的染色组合物，使用了所有染料，包括当前尚未用于生物体的染料，然后对从中筛选候选染料。筛选出的染料是伊文思蓝、酸性蓝9、固绿、亮蓝FCF、靛胭脂、甲基蓝、亚甲基蓝、亮蓝G(BBG)。另外，作为筛选条件，特别注意安全性和染色亲和力。
在一些先导候选物中，从候选物中除去显示优良的安全性但是不能染色目标的那些，或者相反，显示良好的染色但是对视网膜有毒性的那些。
然后使用大鼠对范围缩小的候选染料进行安全性评价。根据较高的染色亲和力和安全性，BBG成为最终的候选物。
然后，为了检查含有BBG的染色组合物用于染色眼膜的最佳条件，进行了各种实验。这样，获得了本发明的染色组合物。
实施例2
2.玻璃体内BBG对视网膜的影响
所有程序均符合视觉与眼科学研究协会(ARVO)关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明和日本福冈九州大学的动物保护指南。
2.1BBG溶液的表征
BBG也被称为酸性蓝90和考马斯亮蓝G。除了我们以前的出版物以外，还没有关于研究BBG在眼科应用中的毒性的报道。表1显示了不同浓度的BBG溶液的摩尔渗透压浓度和pH。发现BBG的摩尔渗透压浓度和pH类似于眼内灌洗液。
表1
  溶液   摩尔渗透压浓度(mOsm/KgH<sub>2</sub>O)   pH
  对照   298   7.33
BBG 10mg/ml 310 7.41
  BBG 1.0mg/ml   300   7.42
  BBG 0.1mg/ml   298   7.41
  BBG 0.01mg/ml   298   7.41
  盐水   285   7.4
  BSS plus(注册商标)   305   7.1
对照显示OPEGUARD
Figure G05841677920070607D000241
-MA。
2.2.在大鼠眼内进行玻璃体内BBG的手术操作
褐色挪威大鼠(Brown Norway rat)(n＝78，雄性，8周龄，Kyudo，福冈，日本)通过腹膜内注射剂量为75mg/kg体重的盐酸氯胺酮进行麻醉。如以前所述，用0.05ml纯SF6气体对每只动物的一只眼(每剂量组总共n＝6只)进行玻璃体切割。气体注射后，在手术过程中使用显微镜进行增强放大，向每只玻璃体切割后的眼睛的玻璃体腔内注射0.05ml的BBG溶液。通过在眼内灌洗液(OPEGUARD(注册商标)-MA，Senjyu Pharmaceutical Co.Ltd.，Osaka，日本)中稀释，将BBG溶液(亮蓝G，考马斯(注册商标)亮蓝G250；Signa-Aldrich，St.Louis，USA)制备为0.01、0.1、1.0和10mg/ml的浓度，并且通过0.22μm注射器式滤器除菌。使用渗透压计(OSMOSTATION，Arkray，Kyoto，日本)测定平均摩尔渗透压浓度，并测量制备的所有浓度的每种溶液的pH(表1)。根据用于人的玻璃体切割术使用的ICG溶液(2.5-5.0mg/ml)确定终浓度，以给大鼠提供产生良好染色的安全剂量的BBG。使用24只假手术的眼(注射SF6，然后0.05ml眼内灌洗液)作为对照。
2.3.光学显微镜检查
在手术后第14天(n＝30；每个剂量组和对照6只)和2个月(n＝30；每个剂量组和对照6只)摘取眼睛，在10％多聚甲醛中固定。整个眼睛大致沿垂直经线切开。石蜡包埋的切片用苏木精-伊红(HE)染色，并用光学显微镜检查每个切片。
玻璃体内注射BBG后，在2个月的时间里通过外科显微镜检查未观察到BBG的毒性作用，如角膜水肿、重度视网膜水肿或眼内炎。在手术后第14天和2个月时摘取眼睛。在第14天和2个月时观察到注射最高剂量BBG(10mg/ml)的眼睛保持正常的视网膜结构。另外，未观察到炎症细胞的浸润(图1，第14天)。第14天或2个月时，注射较低剂量BBG的组也保持正常的视网膜结构，在切片中未观察到细胞变性的迹象。
2.4.透射电子显微术(TEM)
在手术后第14天和2个月时摘取眼睛，并在1％戊二醛和1％多聚甲醛的PBS溶液中固定。标本在乙酸巴比妥缓冲液四氧化锇(2％)中后固定，在乙醇和水中脱水，并包埋在Epon中。由包埋块切成超薄切片，并放置在铜载网上。用JEM 100CX电子显微镜(JEOL，Tokyo)观察标本。
注射最高剂量BBG(10mg/ml)的一些标本在第14天(图2A，第14天)和2个月时在神经纤维的神经节细胞和Müller细胞中显示空泡化。尽管在注射1mg/mlBBG的组中也观察到相同的改变，但是空泡化等级低于10mg/ml组(图2B)。在接受较低剂量的组或对照组中未观察到空泡化。在所有组之间，视网膜，包括内核、外核和视网膜色素上皮细胞层，均未观察到明显改变。
2.5.TdT-dUTP末端缺口-末端标记(TUNEL)
使用如以前所述的TdT-dUTP末端缺口-末端标记(TUNEL)检测凋亡细胞死亡。利用恒冷切片机由在4％多聚甲醛中固定并且包埋在石蜡中的样品制备4μm的切片。用ApopTag
Figure G05841677920070607D000261
荧光素直接原位凋亡检测试剂盒(Intergen Company，New York，USA)按照厂商方案进行TUNEL染色。切片用碘化丙锭(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)共染色，从而允许用荧光显微镜(Olympus，Tokyo)观察细胞核。每个眼标本随机选择10个切片，用显微镜进行观察。
在施用最高剂量BBG(10mg/ml)的组中，在10个切片中观察到一例凋亡细胞死亡。但是，凋亡细胞比率与对照切片相比没有显著的不同(图3，第14天)。在注射较低剂量BBG的组中，在第14天在视网膜中未观察到TUNEL染色。而且，所有BBG剂量组中的视网膜细胞在2个月后都不经历凋亡细胞死亡。
2.6.视网膜电描记术
在气体注射后，向玻璃体腔内注射0.05mlBBG溶液(1mg/ml和10mg/ml)或眼内灌洗液。每个剂量组有6只大鼠，并且有6只对照。测定前证实所有大鼠都没有白内障。在14天的时间点时，以及在2个月后，将大鼠放置在只有微弱的红光照明的暗室中一夜，并通过腹膜内注射15μl/g体重的含氯胺酮(1mg/ml)、赛拉嗪(0.4mg/ml)和乌拉坦(40mg/ml)的盐水溶液麻醉。然后如以前所述进行视网膜电描记术(ERG)。用2.5％去氧肾上腺素HCl和1％托吡卡胺滴剂扩大瞳孔，在ERG记录前显示最大扩大。角膜用1％丙美卡因HCl滴剂麻醉，然后在整个实验过程中将大鼠置于加热垫上。将涂覆有1％甲基纤维素的线电极放置在角膜上记录ERG。放置在口中的类似的线电极用作参比电极，而插入尾内的针电极接地。将响应差异放大(0.8-1,200Hz)，平均，用计算机存储。针对消色差适应场(achromatic adapting field)，Ganzfeld刺激器(VPA-10；Cadwell，Kennewick，Washington，USA)中具有白色(氙)闸门闪光器(strobe flash)。首先记录暗适应(视杆介导的)ERG以检查在两个强度下的反应稳定性。然后使每只大鼠适应暗背景亮度20分钟，这是足以达到稳定反应水平的时间段。之后，在1.30log cd sec/m2的闪烁照明下激发暗适应a(视杆介导的)和暗适应b(双极和Müller-介导的)ERG。然后对刺激间期为1分钟的5次连续闪光的响应进行平均，以确定暗适应响应。大鼠然后暴露于白光适应场(1.50log cd/m2)至少25分钟，然后以1.30log cd sec/m2的闪烁照明(大鼠中的视杆脱敏条件)激发光适应b(视锥介导的)ERG。将对2Hz下进行的50次连续闪光的响应进行平均。用Student t检验评价ERG幅度的结果，p值＜0.05认为具有统计学显著性差异。
图4A表示第14天对照组和高剂量组的响应的暗适应和光适应ERG波型。在实验开始时获得的暗适应响应的幅度显示低组间变异性。尽管在高剂量组中观察到第14天的暗适应a波(图4B，第14天)的平均最大幅度以剂量依赖的方式轻微减少，但是与对照相比，最大波幅没有显著性差异(10mg/ml：p＝0.054和1.0mg/ml：p＝0.063；t检验)。而且，暗适应b波(10mg/ml：p＝0.553和1.0mg/ml：p＝0.508；t检验)和光适应b波ERG(10mg/ml：p＝0.451和1.0mg/ml：p＝0.550；t检验)证明没有明显减少，幅度之间没有统计学显著性差异(图4B，第14天)。2个月后，记录相同剂量组(1.0mg/ml和10mg/ml)中的ERG，发现暗适应a波幅的减少以类似于对照组的方式恢复。
2.7.灵长动物眼中使用BBG的ILM染色
由于ILM剥离在大鼠眼中是不可能的，本发明人研究了BBG染色灵长动物眼中ILM的能力。在该研究中使用两只3岁短尾猴的两只眼睛。将动物限制在笼子中，向大腿内肌肉注射20mg/kg盐酸氯胺酮(Sankyo Yell Pharmaceutical Products Co.Ltd.，日本)进行全身麻醉。然后将猴子转移到手术室。手术包括标准的三孔睫状环玻璃体切割术(three port pars plana vitrectomy)，通过用玻璃体切割器抽吸诱导玻璃体后部脱离，使用曲安奈德注射液进行玻璃体显示。
将10毫克BBG溶解在20ml眼内灌洗液中，使用注射器式滤器除菌。BBG的终浓度为0.5mg/ml。然后将制备的BBG溶液(0.5ml)轻轻注射到玻璃体腔内，并立即用平衡盐溶液(BSS plus(注册商标)，Santen，Osaka，日本)洗出。使用ILM镊子进行ILM的摘除。然后取出工具，用7-0polygalatin缝合线缝合巩膜切孔。术后检查包括在第1、3、14天的裂隙灯显微镜检查和检眼镜检查。在第14天行荧光素血管造影术。
灌洗玻璃体腔后，ILM染色为淡蓝色。在ILM剥离过程中，ILM的边缘和瓣清晰可见(图5A)。在ILM剥离后ILM下面的圆形区域清晰可见(图5B)。
手术后第14天在裂隙灯显微镜检查和检眼镜检查中没有观察到BBG的毒性作用，如角膜水肿、重度视网膜水肿和眼内炎。荧光素血管造影术也显示在第14天BBG没有明显的视网膜损害(图5C)。进一步的检眼镜检查显示在6个月的随访期间视网膜没有进一步的改变。
实施例3
3.BBG作为用于膜剥离的潜在染色溶液的介入临床病例系列
在各种玻璃体视网膜疾病中，吲哚菁绿(ICG)和台盼蓝(TB)染色非常有利于ILM的剥离。但是，最近出现了大量关于在实验和临床应用中ICG和TB引起的视网膜损害的报道。
根据临床前研究，选择BBG作为ILM染色的候选染料。这显然是BBG在人眼中的第一次临床研究。这是BBG在人眼中第一次已知的临床研究。
3.1.BBG在ILM染色中的应用以及在人眼中的效果和安全性(第一次尝试)
在2004年8月至9月之间，从九州大学医院(福冈，日本)的门诊招募了16名黄斑裂孔(MH)和视网膜前膜(ERMS)患者，16只眼睛。排除了诸如青光眼、眼色素层炎和角膜异常等眼科疾病患者。患者的特征在表1中示出。该研究在适宜的机构伦理委员会的批准下实施，并且按照1989年赫尔辛基宣言制定的伦理学标准进行。在手术前向患者解释了该治疗可能的优点和危险，并且获得所有患者的知情同意。手术包括三孔睫状环玻璃体切割术，通过用玻璃体切割器抽吸诱导玻璃体后部脱离，使用曲安西龙。20毫克BBG(亮蓝G250；Signa-Aldrich，St.Louis，USA)溶解于10ml眼内灌洗液(OPEGUARD(注册商标)-MA，Senjyu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka，日本)中，使用注射器式滤器(Minisart(注册商标)Sartorius AG，Goettingen，德国)除菌。BBG的终浓度为0.25mg/ml。然后将制备的0.5ml的BBG溶液(289mOsm，pH＝7.44)轻轻注射到玻璃体腔内，并立即用平衡盐溶液(BSS plus(注册商标)，Santen，Osaka，日本)洗出。ILM染色为淡蓝色。使用ILM镊子(D.O.R.C.；Dutch Ophthalmic Research CenterInternational b.v.，荷兰)进行ILM的摘除。但是，在该浓度时可能无法证实ERMS的染色。
术后检查包括裂隙灯显微镜检查、检眼镜检查、最佳矫正视力(BCVA)和眼内压。2个月后用Humphrey视野分析仪II(HumphreySystems，Dublin，California，USA)评价视野。
手术操作完全成功。所有病例的视力均恢复。没有患者的眼内压升高。未观察到视野强度的明显减少和缺陷。在观察期内没有观察到BBG引起的其他副作用(表2)。
Figure G05841677920070607D000301
表2中的缩写
MH：黄斑裂孔，ERM：视网膜外层膜，BCYA：最佳矫正视力，preop.：手术前，postop.：手术后，IOL：眼内晶状体，IOP：眼内压，VF：视野
3.2.BBG在ILM染色中的应用以及在人眼中的效果和安全性(第二次尝试)
本发明人继续研究了临床病例，获得如下结果。
在2004年8月至9月之间，对表现为黄斑裂孔(MH：10名患者的10只眼；5名男性，5名女性)或视网膜前膜(ERM：10名患者的10只眼；5名男性，5名女性)的20名连续患者的20只眼睛进行玻璃体切割术，使用BBG染色溶液，摘除膜。排除诸如青光眼、糖尿病性视网膜病、眼色素层炎和角膜疾病等眼科疾病患者。患者年龄的平均值±SD为67±11.9岁，范围为33至85岁。平均随访期为7.3±1.0个月。患者详情在表3和表4中列出。手术前和手术后眼科检查包括裂隙灯显微镜检查、检眼镜检查、最佳矫正视力(BCVA)和眼内压(IOP)。MH的闭合和中心凹厚度的测量(ERM病例)通过光学相干性断层摄影术(OCT3：Humphrey Instruments，San Leandro，CA，USA)确定。平均中心凹厚度由总共4次扫描计算得出。
从4只眼(2只眼来自MH患者，2只眼来自ERM患者)上切下的标本进行透射电子显微镜检查，以证实ILM的存在。标本在乙酸巴比妥缓冲液四氧化锇(2％)中后固定，在乙醇和水中脱水，并包埋在Epon中。从包埋块切成超薄切片，并固定在铜载网上。用JEM100CX电子显微镜(JEOL，Tokyo)观察标本。
该研究在机构审查委员会的批准下进行，并且按照1989年赫尔辛基宣言制定的伦理学标准进行。在手术前向患者解释了该治疗的可能的优点和危险，并且获得书面知情同意。
需要时进行标准晶状体乳化法。手术包括三孔睫状环玻璃体切割术，通过用玻璃体切割器抽吸诱导玻璃体后部脱离(PVD)，需要时使用曲安奈德注射液(Kenakolt-ABristol Pharmaceuticals KK，Tokyo，日本)。将BBG(亮蓝G250；Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)溶解于眼内灌洗液(OPEGUARD
Figure G05841677920070607D000321
-MA，Senjyu Pharmaceutical Co.Ltd.，Osaka，日本)中。使溶液通过0.22μm注射器式滤器除菌。BBG的终浓度为0.25mg/ml(289mOsm，pH＝7.44)。然后将制备的BBG溶液(0.5ml)轻轻注射到玻璃体腔内(图6A)，并立即用平衡盐溶液(BSS plus(注册商标)，Santen，Osaka，日本)洗出。在MH病例中，ILM立即染色成淡蓝色。使用ILM镊子进行ILM的摘除(图6B，C)。摘除ILM后，已经除去ILM的区域和周围区域之间视网膜表面颜色的差异清晰可现(图6D)。但是在ERM病例中，ERM的染色在该浓度可能无法证实(图7A)。ERM剥离后(图7B)，再次注射BBG溶液，然后立即灌洗玻璃体腔。已经除去ERM的区域的ILM被BBG良好染色(图7C)。但是，仍有残余ERM和后部玻璃体的区域没有染色。良好染色的ILM可以与未染色的残余ERM和后部玻璃体被容易地去除(图7D)。
最后，在所有病例中插入眼内晶状体，在MH病例中，进行液体-气体交换，并且置换为15％的六氟化硫气体。建议患者保持脸朝下位一周。
在手术过程中成功地从所有20只眼睛中摘除包括ERM的ILM。透射电子显微镜检查证实在所有处理的标本中存在ILM(n＝4)(图8)。手术后，到第14天，通过裂隙灯显微镜检查和检眼镜检查，没有观察到BBG注射诱导的任何急性毒性，如角膜水肿、重度视网膜水肿和重度眼内炎症，如眼内炎。
根据检眼镜检查和OCT检查，所有MH病例在解剖学上完全闭合。手术前BCVA中值为20/100(范围：20/200-20/50)。手术后BCVA中值为20/32(范围：20/200-20/20)。有9只眼睛(90％)的视力改善了2斯内伦行或更多，而有1只眼没有变化。在两个病例中，并发症包括医源性周围视网膜断裂，这在手术期内通过眼内激光光凝固法得到治疗。只有1例MH的IOP在6个月后升高(26mmHg)，并用拉坦前列素治疗(表3)。
在ERM手术病例中，用OCT测量的视网膜中心凹厚度的平均值从454.7±141.3μm(手术前)降至249.4±71.3μm(手术后)。在ERM病例中，手术后BCVA(20/100-20/12.5；中值：20/32)好于手术前BCVA(20/100-20/40；中值：20/50)(表4)。8名患者(80％)在斯内伦视力表上提高了2行或更多，而另两名患者的BCVA保持不变或提高了1行。唯一的并发症是在一例中有玻璃体出血的延长，在观察后吸收。在所有病例的随访期中没有观察到其它副作用，如视网膜色素上皮(RPE)萎缩。
表3
  病例号/年龄/性别   MH分期   术前BCVA   术后BCVA   ILM剥离   术后视网膜状态   晶状体状态术前/术后   术后LOP升高   并发症   随访(月)
  1/58/F   3   20/63   20/20   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   9
  2/77/M   4   20/200   20/200   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   8
  3/57/F   3   20/50   20/32   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   7
  4/62/F   2   20/100   20/25   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   7
  5/68/M   3   20/100   20/40   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   周围视网膜断裂   7
  6/79/M   3   20/80   20/50   +   MH闭合   IOL/IOL   -   周围视网膜断裂   7
  7/78/M   3   20/125   20/25   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   7
  8/63/F   3   20/50   20/20   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   7
  9/64/F   2   20/63   20/25   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   7
  病例号/年龄/性别   MH分期   术前BCVA   术后BCVA   ILM剥离   术后视网膜状态   晶状体状态术前/术后   术后LOP升高   并发症   随访(月)
  10/73/M   4   20/200   20/50   +   MH闭合   有晶状体/IOL   -   无   6
表3的缩写
MH：黄斑裂孔，BCVA：最佳校正视力，preop.：手术前，postop.：手术后，IOL：眼内晶状体，IOP：眼内压
表4
  病例号/年龄/性别   ERM状态   术前BCVA   术后BCVA   ILM剥离   视网膜厚度术前/术后(μm)   晶状体状态术前/术后   术后LOP升高   并发症   随访(月)
  1/33/M   3   20/63   20/20   +   759/232   IOL/IOL   -   无   9
  2/85/M   4   20/200   20/200   +   441/248   有晶状体/IOL   -   无   9
  3/72/F   3   20/50   20/32   +   423/354   有晶状体/IOL   -   无   8
  4/85/M   2   20/100   20/25   +   478/266   有晶状体/IOL   -   玻璃体出血   8
  6/66/F   3   20/100   20/40   +   501/240   有晶状体/IOL   -   无   7
  6/72/M   3   20/80   20/50   +   417/190   有晶状体/IOL   -   无   7
  7/63/F   3   20/125   20/25   +   429/232   有晶状体/IOL   -   无   7
  8/69/F   3   20/50   20/20   +   556/382   有晶状体/IOL   -   无   6
  9/56/M   2   20/63   20/25   +   228/146   有晶状体/IOL   -   无   6
  10/60/F   4   20/200   20/50   +   315/204   IOL/IOL   -   无   6
表4的缩写
ERM：视网膜外层膜，MH：黄斑裂孔，BCVA：最佳校正视力，preop.：手术前，postop.：手术后，IOL：眼内晶状体，IOP：眼内压
实施例4
4.BBG的生物相容性：BBG作为囊染色辅助剂的临床前研究
4.1.BBG的囊染色能力
使用染料的分级浓度在猪眼中评价BBG的囊染色能力。
猪眼从当地的屠宰场获得，并且在冰上运至实验室。仔细切除眼外肌和其他结缔组织，将眼睛置于手术容器上。使用如下方法制备BBG溶液。20毫克BBG(考马斯亮蓝G250；Signa-Aldrich，St.Louis，USA)溶解在10ml眼内灌洗液(OPEGUARD.-MA，Senjyu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka，日本)中，并用注射器式滤器(Minisart.Sartorius AG，Goettingen，德国)除菌。在手术显微镜下，如下检查使用BBG的囊染色。用安在注射器上的26号针头通过透明的角膜进入前房。通过经由相同入口进入的26号针头将BBG注射到前囊上(10、1、0.5、0.25、0.1和0.01mg/ml)。立即用增强的平衡盐溶液(BSS Plus
Figure G05841677920070607D000351
，Santen Pharmaceuticals，日本)灌洗前房，过量的染料容易被洗掉。
为了加深前房，注射1％透明质酸钠(Healon
Figure G05841677920070607D000352
，Pharmacia，Uppsala，瑞典)。通过用安在粘弹性注射器上的26号一次性弯针头制备小三角形前囊瓣开始CCC。使用截囊刀或撕囊术镊子完成CCC。
染料均匀地染色前囊，CCC的边缘在手术显微镜下可清楚地识别。当染料浓度提高时(从0.25mg/ml至1mg/ml，图9)，染色加深。发现产生清楚显色的高质量染色所需的最小浓度为0.25mg/ml(图9，右上)。在0.1mg/ml和0.01mg/ml时，囊染色不清楚，使用该染料未发现优点(图9，左中和左下)。前房注射也使侧孔染色。
4.2.BBG的生物相容性
出生后8周的褐色挪威大鼠(Kyudo，Fukuoka，日本)如下进行研究。通过腹膜内注射戊巴比妥麻醉大鼠，用局部1％托吡卡胺和2.5％盐酸去氧肾上腺素放大它们的瞳孔。使用安在注射器上的30号针头通过透明的角膜进入前房。然后用每种染料进行一次前房注射：BBG(10、1、0.5、0.25、0.1和0.01mg/ml)、ICG(5mg/ml)、台盼蓝(1mg/ml)和对照OPEGUARD溶液(每种染料n＝6，总共54只眼睛)。每种溶液的平均摩尔渗透压浓度和pH在表1中列出。
染料保留在前房中，然后进行2个月的活组织显微镜检查。在手术后2周和2个月时摘除眼睛。用光学显微镜检查、透射和扫描电子显微镜检查对眼睛进行分析。
4.3.光学显微镜检查
眼睛在4％多聚甲醛中固定，对半切开，包埋在石蜡中，在二甲苯中去石蜡化，在乙醇中再水合，并在磷酸缓冲液(PBS)中洗涤。4μm厚的切片用苏木精和伊红染色，并用光学显微镜观察。
每组中苏木精和伊红染色的角膜切片显示没有明显变化(BBG，ICG，TB；图10)。在光学显微镜检查中，没有观察到内皮细胞损失或角膜水肿的迹象。片状胶原层、基质细胞和上皮细胞层保持良好。在所有角膜层中都没有观察到炎症细胞浸润。
4.4.TdT-dUTP末端缺口-末端标记(TUNEL)
通过TdT-dUTP末端缺口-末端标记(TUNEL)检测凋亡细胞死亡。由在4％多聚甲醛中固定并且包埋在石蜡中的样品制备4微米厚的切片。用ApopTag
Figure G05841677920070607D000361
荧光素直接原位凋亡检测试剂盒(Intergen Company，New York，NY)按照厂商方案进行TUNEL染色。切片用碘化丙锭(Molecular Probes，Eugene，OR)共染色，从而允许通过荧光显微镜(Olympus，Tokyo)观察细胞核。每个眼标本随机选择10个切片观察(n＝3)。结果表示为平均值±标准差。
在所有组中，偶然观察到生理更新引起的角膜上皮的凋亡细胞死亡(图11，箭头)。在BBG组中，在角膜基质细胞、内皮、睫状体和晶状体细胞中没有观察到TUNEL染色(图11)。在ICG组中，在5mg/ml浓度时没有检测到明显的凋亡细胞死亡。在TB组中，在全部内皮细胞的2％中检测到角膜内皮的凋亡细胞死亡。TB组中的其它细胞不经历凋亡细胞死亡。
4.5.透射电子显微术(TEM)
摘除眼睛，在1％戊二醛和1％多聚甲醛的PBS溶液中固定前段。标本在乙酸巴比妥缓冲液四氧化锇(2％)中后固定，在乙醇和水中脱水，并包埋在Epon中。由包埋块切成超薄切片，并固定在铜载网上。用JEM 100CX电子显微镜(JEOL，Tokyo)观察标本。
在BBG组中，在10mg/ml的最高浓度下角膜细胞和胶原细胞基质的超微结构保持良好(图12，左图)。在角膜内皮中，细胞膜、良好限定的核和胞质细胞器显示没有退行性变化(图12，左下图)。ICG组显示保持良好的内皮细胞结构，但是有些内皮细胞证明有线粒体膨胀的迹象(图12，中图，箭头)。TB组由于细胞间分离而在内皮细胞层显示囊肿形成(图12，右图)，以及斑片方式的偶然的角膜内皮退化(图12，右下图)。
4.6.扫描电子显微镜术(SEM)
摘除眼睛，在1％戊二醛和1％多聚甲醛的PBS溶液中固定前段。标本在乙酸巴比妥缓冲液四氧化锇(2％)中后固定，在乙醇和水中脱水。标本在叔丁醇中饱和，并进行临界点干燥(Eiko，Tokyo)。然后利用自粘附碳片将标本置于棒(stub)上，并通过氩等离子体涂覆器(Eiko)喷射上厚度为20nm的金。然后，用JEM840扫描电子显微镜(JEOL)研究角膜的内皮表面。
在BBG暴露的角膜中，SEM显示类似于对照的正常细胞。SEM图像证明正常的六角形内皮细胞片，具有完整的边缘，没有内皮肿胀(图13，上图)。ICG组也显示在角膜内皮片中有一些细胞肿胀。偶然观察到在原位置不含变性的内皮细胞，在TB组中，在角膜中央区可见内皮细胞皱缩。细胞皱缩以零星的方式导致内皮细胞损失。
实施例5
5.亮蓝辅助的连续曲线形撕囊术
如上所述，本发明人报道了关于新染料亮蓝G(BBG)的临床前研究的结果，该染料在较低浓度时染色前囊，并且具有最低的毒性。本实施例证明了BBG在人眼囊染色中的效果。
一名70岁的白内障女性在2004年8月接受了BBG-辅助的CCC和晶状体乳化以及眼内晶状体(IOL)植入。该患者没有其它眼部疾病，如青光眼、眼色素层炎或角膜疾病。考马斯
Figure G05841677920070607D000381
BBG 250(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)以0.25mg/ml的剂量溶解在眼内灌洗液(OPEGUARD-MA；Senjyu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Osaka，日本)中，并用注射器式滤器除菌。将BBG溶液轻轻地注射到前房内，然后立即用平衡盐溶液(BSS)洗出。
根据图14，在CCC手术过程中亮蓝前囊清晰可见。向眼睛前房内注射BBG溶液(0.25mg/ml)，立即灌洗。(A)箭头指示在具有白内障的眼睛中产生的CCC。(B)箭头示出完成的CCC的边缘。(C)晶状体乳化和抽吸后，插入IOL。次日，没有观察到急性毒性(如角膜水肿、重度炎症或眼内压升高)。患者的视力从光感(LP)提高到20/20，2个月后观察到0.8％的最低角膜内皮细胞损失。
该研究在我们机构的内部审查委员会的批准下进行，并且按照1989年赫尔辛基宣言制定的伦理学标准进行。在手术前向患者解释了该治疗的可能的优点和危险，并且在手术前获得她的知情同意。
对于本领域技术人员而言，基于前面的详细描述，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。采用已经使用的术语和表述作为说明书的术语，并且不是限制性的，而应当认为在请求保护的本发明的范围内各种改变都是可能的。

Claims (6)

1.亮蓝G及其药学上可接受的盐或其水合物在制备用于治疗眼科疾病的染色组合物中的用途，其中所述染色组合物用于染色眼膜。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗包括染色和摘除内界膜(ILM)。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述治疗包括染色和摘除前囊。
4.如权利要求1所述的用途，其中在所述治疗过程中所述染色组合物具有浓度为0.1mg/ml至1.0mg/ml的BBG、其药学上可接受的盐或其水合物。
5.如权利要求1所述的用途，其中在所述治疗过程中所述染色组合物具有浓度为0.1mg/ml至0.25mg/ml的BBG、其药学上可接受的盐或其水合物。
6.如权利要求1所述的用途，其中在所述治疗过程中所述染色组合物的渗透压为298mOsm。
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