TWI660732B - 綠豆發酵萃取物用於製備促進傷口癒合的醫藥品的用途 - Google Patents

綠豆發酵萃取物用於製備促進傷口癒合的醫藥品的用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種綠豆發酵萃取物之製造方法，包含將麴菌接種於液態培養基進行培養；將綠豆進行滅菌處理後成為固態培養基，並將培養後的麴菌接種於固態培養基，並加水攪拌進行醱酵；將已醱酵後之固態培養基進行乾燥與研磨，獲得綠豆發酵物；將綠豆發酵物添加5至15倍體積之酒精進行萃取，獲得粗萃物；將粗萃物加入管柱進行層析，接著以溶劑為水比酒精為4：1之體積比例進行沖提，再以溶劑為水比酒精為1：1之體積比例進行沖提後得到沖提液，將沖提液去除溶劑後即為綠豆發酵萃取物。本發明製備方法而得的綠豆發酵萃取物能有效促進傷口癒合。

Description

綠豆發酵萃取物用於製備促進傷口癒合的醫藥品的用途
本發明係涉及一種製造方法，特別是指製造綠豆發酵萃取物的方法。本發明另涉及一種綠豆發酵萃取物，特別是指由以上製造方法所製得的綠豆發酵萃取物。本發明另涉及一種用途，特別是指綠豆發酵萃取物用於製備促進傷口癒合的醫藥品的用途。
傷口癒合的過程相當複雜，包括發炎、纖維組織增生、血管新生、膠原沉積、表皮化及傷口收縮，在癒合過程中會分泌許多生長因子促進傷口癒合。因此，良好的傷口癒合在於縮短癒合時間，且癒後皮膚品質良好即為成功的傷口癒合。
國人糖尿病人數達百萬之多，又位居台灣十大死因的第四位，糖尿病的問題複雜，慢性合併症也多；其中第二型糖尿病友的足部血液循環異常的有百分之六，截肢比率有百分之一，第二型糖尿病約占糖尿病總人口的90%，且常常會伴隨著代謝不良的症狀，例如胰島素阻抗性、葡萄糖不耐症、高胰島素血症、高脂血症、高血壓等。長期糖尿病的患者，趾端的感覺因為神經炎的關係而喪失知覺，造成趾端經常因碰撞至流血而仍不自知。此類的趾端或下肢的傷口再加上末梢血管的病變和膠原蛋白不正常，非常不容易癒合，而往往演變成慢性潰瘍。此外，一旦傷口未能及時有效處理，截肢的手術常常需一次次往上切除至膝蓋以上，因此，糖尿病傷口照護一直是一個亟待解決的問題。
有鑑於此，如何發展出促進傷口癒合的成份，現有技術實有待改善的必要。
為了克服現有技術之缺點，本發明的目的在於提供一種綠豆發酵萃取物之製造方法，以達成促進傷口癒合的功效。
為達到上述之發明目的，本發明提供一種綠豆發酵萃取物之製造方法，其中綠豆發酵萃取物包含以下步驟製備而得：將麴菌接種於液態培養基進行培養；將綠豆進行滅菌處理後成為固態培養基，並將培養後的麴菌接種於該固態培養基，並加水攪拌進行醱酵；將已醱酵後之固態培養基進行乾燥與研磨，獲得綠豆發酵物；將綠豆發酵物添加5至15倍體積之酒精進行萃取，獲得粗萃物；將粗萃物加入管柱進行層析，以溶劑為水比酒精為4：1之體積比例進行沖提，收集得到第一沖提液，再以溶劑為水比酒精為1：1之體積比例進行沖提後，收集得到第二沖提液，將該第二沖提液中的溶劑去除得到綠豆發酵萃取物。
本發明所述之「室溫」，為所屬領域具有通常知識者可通曉的溫度，為25℃±5℃。
較佳的，所述之將麴菌接種於液態培養基進行培養的步驟中，該液態培養基至少包括有水及葡萄糖。
較佳的，所述之將麴菌接種於液態培養基進行培養的步驟中，將麴菌以體積百分比為5-10%接種於該液態培養基，並放入培養箱中以溫度20-30℃、轉速100-150轉搖瓶培養1-5天。
較佳的，所述之將培養後的麴菌接種於該固態培養基，並加水攪拌進行醱酵的步驟中，固態培養基、水、菌種之比例，以1：1-3：0.05-0.12的比例調配。
較佳的，所述之將粗萃物加入管柱進行層析的步驟中，該管柱內所填充樹脂的孔徑為孔體積每克1.0毫升(mL/g pore volume)至1.5mL/g；更佳的，1.3mL/g。
本發明另提供一種綠豆發酵萃取物，其係由上述之製備方法所製得。
較佳的，所述之綠豆發酵萃取物，其包含牡荊素(vitexin)與異牡荊素(isovitexin)。
本發明另提供一種綠豆發酵萃取物用於製備促進傷口癒合的醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之綠豆發酵萃取物以及其藥學上可接受的載劑。
本發明的醫藥品係可利用熟習此技藝者所詳知的技術，將上述的綠豆發酵萃取物與一藥學上可接受之載劑製備成一適用本發明組合物之劑型。其中本發明所述之「藥學上可接受之載劑」包含，但不限於水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、乳霜基質(cream base)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收增強劑(absorption enhancers)、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑 (penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)、推進劑(propellants)表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
較佳的，所述之膠凝劑包括，但不限於明膠、卡拉膠、黃原膠(三仙膠)、海藻酸鈉、魔芋粉、瓊脂或其組合。
較佳的，所述之乳霜基質包括，但不限於甘油親水性基質。甘油親水性基質係包含油相部份與水相部份，將水相部份加入油相部份中並攪拌均勻後冷卻，即得為含甘油親水性基質。
較佳的，所述之傷口包含放射線治療傷口、褥瘡傷口或糖尿病所引起之傷口。
更佳的，所述之糖尿病所引起之傷口包括，但不限於糖尿病足部潰瘍(diabetic foot ulcer)。
較佳的，所述之醫藥品含有綠豆發酵萃取物之有效劑量係介於每日每公斤5毫克(mg/kg/day)至350mg/kg/day；更佳的，130mg/kg/day至165mg/kg/day。原則上根據2005年美國食品藥物管理局所公告之實驗初期估算方法(Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)，並參照南通特洛菲飼料科技有限公司提供之計算模式(http：//www.trophic.cn)，以小鼠體重20克、成人體重60公斤進行估算。
本發明所述之「浸膏狀」，是指用溶劑浸提不含有滲出物的植物組織(如花、葉枝、莖、樹皮、根、果實、種子皮、種子殼等)所得製品的狀態，製品中不含原用的溶劑和水分。
本發明的優點在於藉由以麴菌接種於含綠豆之固態培養基並經由發酵後、以酒精進行萃取、以溶劑為水比酒精為4：1、再以溶劑為水比酒精為1：1進行沖提的步驟，所獲得的綠豆發酵萃取物具有促進傷口癒合的效果。 此外，本發明之綠豆發酵萃取物具有促進傷口癒合的功效，且該傷口包括射線治療傷口、褥瘡傷口或糖尿病所引起之傷口。
圖1為本發明之粗萃物E之高效液相之層析圖。
圖2為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2與多種標準品比較之高效液相之層析圖；由上而下，第一列為牡荊素標準品、第二列為異牡荊素標準品、第三列為芹菜素標準品、第四列為綠豆發酵萃取物E-H2。
圖3為本發明之綠豆發酵萃取物E-H3與多種標準品比較之高效液相之層析圖；由上而下，第一列為牡荊素標準品、第二列為異牡荊素標準品、第三列為芹菜素標準品、第四列為綠豆發酵萃取物E-H3。
圖4為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2H3與多種標準品比較之高效液相之層析圖；由上而下，第一列為牡荊素標準品、第二列為異牡荊素標準品、第三列為芹菜素標準品、第四列為綠豆發酵萃取物E-H2H3。
圖5為本發明之粗萃物、綠豆發酵萃取物之細胞傷口癒合程度之柱狀圖；數據以平均值(mean)±標準誤差(SEM)表示之；測試結果以t-test來計算P值，**表示p<0.01有非常顯著差異。
圖6A為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施予放射線治療傷口處一星期之照片。
圖6B為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施予放射線治療傷口處一個月之照片。
圖6C為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施予放射線治療傷口處三個月之照片。
圖7A為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施予臀部褥瘡前之照片。
圖7B為本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施予臀部褥瘡一個月之照片。
以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。
製備例1
依中華民國發明專利公告案第I434646號所述，綠豆發酵物的製備過程包括(1)液態培養基配料、滅菌、冷卻；(2)液態培養基接種、培養；(3)固態培養基配料、滅菌、冷卻；(4)固態培養基接種、醱酵。具體步驟如下：(1)液態培養基配料、滅菌、冷卻：該液態培養基至少包括有水及葡萄糖所配製，並將配製之液態培養基以100-130℃之溫度，進行滅菌15-60分鐘，而後冷卻至室溫狀態以作培養麴菌時用；(2)液態培養基接種、培養：係將前述步驟(1)中培養麴菌用之液態培養基裝入培養瓶中，同時將欲培養之麴菌以體積百分比5-10%接種至前述培養麴菌用液態培養基中，而後將接種後液態培養基，放入培養箱中以溫度20-30℃，轉速100-150rpm搖瓶培養1-5天，藉此步驟來令菌種濃度提高；(3)固態培養基配料、滅菌、冷卻：主要係令該固態培養基成無菌狀，避免菌種(麴菌)接種時該菌種(麴菌)遭受到感染，本發明於實施中之固態培養基原料係以綠豆為主，既能有效降低成本同時方便取得且該綠豆包含有種子、種皮或其組合；較佳為種皮；此步驟中係將綠豆原料以100-130℃之溫度，加溫至少30-70分鐘予以滅菌，而後待其冷卻至25-40℃，此時該固態培養基之綠豆原料即可成為無菌狀；(4)接著進行固態培養基接種、醱酵：該步驟(4)主要係以步驟(2)所培養出之麴菌為接種之菌種，將已滅菌冷卻完成之固態培養基放置在固態醱酵槽內，再將固態培養基、水、菌種之比例，以1：1-3：0.05-0.12的比例調配，即該固 態培養基10公斤時，該添加之水量為10-30公升，而該麴菌入種量為0.5-1.2公升，當固態培養基以上述比例接種時，必須將固態培養基與水及麴菌攪拌均勻，並令該固態醱酵槽以：轉速5-15rpm、10分鐘、通風量1-3vvm(80L)、溫度25-40℃、壓力0.2-0.6kg/cm2為條件，將已接種之固態培養基於醱酵槽內培養至少3-7天；(5)待醱酵完成即可進入固態培養基乾燥與研磨，該步驟(5)主要係以溫度50-70℃、壓力-0.4-0.9kg/cm2為條件對固態培養基進行乾燥程序，完成後將烘乾後醱酵之固態培養基予以研磨成粉狀，即可獲得該綠豆發酵物。
將製備完成之該綠豆發酵物再經由以下流程，萃取純化得到綠豆發酵萃取物：(1)將綠豆發酵物粉末2公斤加20公升95%酒精靜置萃取隔夜，過濾去除殘渣後獲得萃取液，將萃取液經減壓濃縮至浸膏狀，獲得粗萃物E；(2)將粗萃物E以水比95%酒精為4：1回溶後，加入管柱進行層析，管柱內充填樹脂(大孔吸附樹脂DIAION® HP-20，孔徑為孔體積約1.30mL/g)，先以(a)溶劑為水比95%酒精為4：1之比例為沖提液進行沖提、收集得到第一沖提液，接著以(b)溶劑為水比95%酒精為1：1之比例進行沖提、收集得到第二沖提液，最後以(c)溶劑為水比95%酒精為3：7之比例進行沖提、收集得到第三沖提液。以上第一沖提液、第二沖提液、第三沖提液各別去除溶劑後呈浸膏狀，分別獲得綠豆發酵萃取物E-H1、E-H2及E-H3；此外，將沖提後的E-H2及E-H3以重量比為4.6：1進行混合，獲得綠豆發酵萃取物E-H2H3。
以高效率液相層析(high-performance liquid chromatography，HPLC)分析粗萃物E(圖1)、綠豆發酵萃取物E-H2(圖2)、E-H3(圖3)、E-H2H3(圖4)之成分，其中，各綠豆發酵萃取物的主要成分含量分別為E-H2：牡荊素 53.12%、異牡荊素17.82%；E-H3：牡荊素55.80%、芹菜素(apigenin)14.13%。E-H2H3：牡荊素59.96%，異牡荊素14.32%，芹菜素2.98%。
實施例1、綠豆發酵萃取物於細胞傷口癒合
透過傷口癒合試劑(購自Cell Biolabs，CytoSelectTM Wound Healing Assay Kit)，測試不同試驗樣品對傷口周圍細胞的增殖以及轉移現象；其中細胞為人類角質細胞(HaCaT)，每孔2x105個細胞。測試分為6組，分別為：控制組(生理食鹽水)、E組[取製備例1之粗萃物E溶於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)]、E-H2組(取製備例1之綠豆發酵萃取物E-H2溶於DMSO)、E-H2H3組(取製備例1之綠豆發酵萃取物E-H2H3溶於DMSO)、E-H3組(取製備例1之綠豆發酵萃取物E-H3溶於DMSO)。每組施予濃度為20μg/mL、施予18小時。
請參閱圖5所示，細胞傷口癒合實驗結果顯示，E-H2組相較於控制組的傷口癒合面積具有顯著增加(p<0.01)，反觀E-H2H3組、E-H3組傷口癒合面積則與控制組相當。因此，E-H2組具有最佳傷口癒合能力。
實施例2、綠豆發酵萃取物於糖尿病傷口癒合之應用
小鼠購進後體重達20克後，以鏈菌素(Streptozotocin(STZ))誘導小鼠產生高血糖，選擇誘導成功的高血糖動物(300mg/DL)，該等高血糖動物於產生高血糖症狀兩個月後進行糖尿病傷口癒合試驗。
(1)於每隻小鼠背上開三個傷口，分別以不同試驗樣品塗抹於傷口，早晚各一次，每次約0.032-0.040克，較佳為0.036克，實驗12天，比較第0、4、8、12天小鼠傷口癒合差異。測試分為6組，分別為：NI組(normal control)為不誘導高血糖之組別，後續各組均誘導為高血糖：BC組(cream base)為僅施予乳霜基質； PC組為市售藥物速癒樂(Suile®，友合生化科技股份有限公司)做為正對照；E組(取自製備例1的粗萃物E與乳霜基質以重量比1：9混合)；E-H2組(取自製備例1的綠豆發酵萃取物H2與乳霜基質以重量比1：9混合)；E-H2H3組(取自製備例1的綠豆發酵萃取物H2與H3混合後，與乳霜基質以重量比1：9混合)。
如上表1所示，在第12天時，E-H2組傷口面積相較於BC組而言顯著減少，且傷口面積接近PC組。反觀E組、E-H2H3組則與BC組並無顯著差異。因此，E-H2組具有促進糖尿病鼠傷口癒合效果顯著，且與市售藥物速癒樂的效果相當。
(2)於每隻小鼠背上開三個傷口，分別以不同試驗樣品塗抹於傷口，早晚各一次，每次約0.032-0.040克，較佳為0.036克，實驗8天，比較第0、4、8天小鼠傷口癒合差異。測試分為6組，分別為：NI組(normal control)為不誘導高血糖之組別，後續各組均誘導為高血糖： BC組(cream base)為僅施予乳霜基質；PC組為市售藥物速癒樂(Suile®，友合生化科技股份有限公司)做為正對照；2.5% E-H2(取自製備例1的綠豆發酵萃取物H2與乳霜基質以重量比0.25：9.75混合)；5% E-H2組(取自製備例1的綠豆發酵萃取物H2與乳霜基質以重量比0.5：9.5混合)；10% E-H2組(取自製備例1的綠豆發酵萃取物H2與乳霜基質以重量比1：9混合)。
如上表2所示，在第8天時，無論是2.5% E-H2組、5% E-H2組或10% E-H2組，傷口面積相較於BC組而言減少皆達到約20%，且傷口面積接近PC組。因此，不同比例之E-H2組具有促進糖尿病鼠傷口癒合效果顯著，且與市售藥物速癒樂的效果相當。
實施例3、綠豆發酵萃取物於放射線治療後之癒合應用
取製備例1綠豆發酵萃取物E-H2與凝膠劑重量比為1：9，塗抹於放射線治療後所產生之傷口處，每日塗抹兩次、每次約1-10克，較佳為5克，於一週、一個月、三個月後記錄恢復狀況。
請參閱圖6A所示，使用一週時傷口面積約為20cm2，傷口正在結痂，唇口、項部疼痛，無法下咽，但傷口已減有明顯好轉；請參閱圖6B所示，使用一個月時傷口面積約為5cm2，傷口仍未癒合但項部傷口癒合頗佳，使患者在電療時減少痛苦；請參閱圖6C所示，使用三個月後已無傷口，復元甚佳。因此，本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施用於人體傷口具有促進傷口癒合之功效。
實施例4、綠豆發酵萃取物於褥瘡之癒合應用
取製備例1綠豆發酵萃取物E-H2與凝膠劑重量比為1：9，塗抹於褥瘡之傷口處，每日塗抹兩次、每次約5-40克，較佳為25克，於一個月後記錄恢復狀況。
請參閱圖7A所示，使用前傷口面積約為100cm2，褥瘡甚大、深可見骨；請參閱圖7B所示，使用一個月時傷口面積約為9cm2，傷口處已有生成組織且未見骨。因此，本發明之綠豆發酵萃取物E-H2施用於人體傷口具有促進傷口癒合之功效。
綜上所述，本發明之綠豆發酵萃取物具有促進傷口癒合的功效，且該傷口包括放射線治療傷口、褥瘡傷口或糖尿病所引起之傷口。
根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實 施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。

Claims (9)

  1. 一種綠豆發酵萃取物用於製備促進傷口癒合的醫藥品的用途，其中醫藥品含有有效劑量之綠豆發酵萃取物以及藥學上可接受的載劑，其中綠豆發酵萃取物藉由包含以下步驟的方法製備而得：將麴菌接種於液態培養基進行培養；將綠豆進行滅菌處理後成為固態培養基，並將培養後的麴菌接種於該固態培養基，並加水攪拌進行醱酵；將已醱酵後之固態培養基進行乾燥與研磨，獲得綠豆發酵物；將綠豆發酵物添加5至15倍體積之酒精進行萃取，獲得粗萃物；將粗萃物加入管柱進行層析，以溶劑為水比酒精為4：1之體積比例進行沖提，收集得到第一沖提液，再以溶劑為水比酒精為1：1之體積比例進行沖提後，收集得到第二沖提液，將該第二沖提液中的溶劑去除得到綠豆發酵萃取物；其中將粗萃物加入管柱進行層析的步驟中，該管柱內所填充樹脂的孔徑為孔體積每克1.0毫升(mL/g pore volume)至1.5mL/g。
  2. 如請求項1所述之用途，其中將麴菌接種於液態培養基進行培養的步驟中，該液態培養基至少包括有水及葡萄糖。
  3. 如請求項1所述之用途，其中將麴菌接種於液態培養基進行培養的步驟中，將麴菌以體積百分比為5-10%接種於該液態培養基，並放入培養箱中以溫度20-30℃、轉速100-150轉搖瓶培養1-5天。
  4. 如請求項1所述之用途，其中將培養後的麴菌接種於該固態培養基，並加水攪拌進行醱酵的步驟中，固態培養基、水、菌種之比例，以1：1-3：0.05-0.12的比例調配。
  5. 如請求項1至4任一項所述之用途，其中該綠豆發酵萃取物包含牡荊素與異牡荊素。
  6. 如請求1至4任一項所述之用途，其中傷口包含放射線治療傷口、褥瘡傷口或糖尿病所引起之傷口。
  7. 如請求項5所述之用途，其中傷口包含放射線治療傷口、褥瘡傷口或糖尿病所引起之傷口。
  8. 如請求項1至4任一項所述之用途，其中該醫藥品含有綠豆發酵萃取物之有效劑量係介於每日每公斤5毫克(mg/kg/day)至350mg/kg/day。
  9. 如請求項5所述之用途，其中該醫藥品含有綠豆發酵萃取物之有效劑量係介於每日每公斤5毫克(mg/kg/day)至350mg/kg/day。
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