KR20130135207A

KR20130135207A - 피부투과성 펩타이드

Info

Publication number: KR20130135207A
Application number: KR1020130109309A
Authority: KR
Inventors: 이설훈
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2013-12-10
Also published as: KR101710227B1

Abstract

본 발명은 피부를 투과하여 약물을 전달할 수 있는 피부투과성 펩타이드 또는 그의 유도체, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체, 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물 및 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 피부투과성 펩타이드는 우수한 피부 침투 효과 뿐만 아니라 피부 잔류 효과를 나타내므로, 표적조직을 피부조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

피부투과성 펩타이드{Novel transdermal peptide}

본 발명은 피부투과성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 피부를 투과하여 약물을 전달할 수 있는 피부투과성 펩타이드 또는 그의 유도체, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체, 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물 및 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부를 통과하는 약물은 사용의 편리성에 의해서 진통패치, 금연패치, 임신 조절제등에서 사용되고 있고, 피부를 통하여 systemic 한 circulation 에 전달하려는 목적을 가진다. 이와 함께 아토피 치료제, 미백, 주름 개선용 화장품 등 피부자체의 기관에 전달하려는 목적을 가지는 경우도 있다. 이런 편리성과 기능성을 가지는 목표에도 불구하고 피부의 구조상 약물의 전달의 어려움을 가지는데, 이는 피부의 구조를 보면 이해할 수 있다. 피부는 외부에는 약 10에서 15층의 corneocyte가 존재하고, 약10um에서 45um정도의 두께를 이루고 있다. 이는 mortar와 brick 구조라 불리는 형태로 이루어져 있다. brick으로 대표되는 구조는 케라틴이 풍부한 corneocyte로 이루어져 있고, 그 사이를 ceramide, fatty acid, wax등의 구조가 mortar를 이루고 있다. 이를 통해서 내부의 수분의 손실을 막고 외부로부터의 침입을 막는 구조를 이루고 있다. 따라서, 그 목적에 충실하게 그 투과성이 아주 낮은데, 500Da 이하의 저분자 구조 성분들이 Diffusion 방식에 의해서 피부 내로 전달된다(Exp. Dermatol., 2000, 9, 165-9.). 이는 mortar 구조의 intracellular 구조의 지질 층이나, 지질 층 사이의 수용성 구조를 통해서 이루어지고, 약물의 성질에 따라서도 크게 좌우된다(Current Drug Delivery, 2005, 2, 23-3). 또한 피부표면을 직접 통과하는 방식 이외에 피부의 땀샘, 모공, 피지선 등의 구조를 이용하여 전달되기도 한다.

이러한 이유로, 분자의 크기나 성질에 관계없이 피부를 투과할 수 있고, 피부의 전체에 고르게 전달할 수 있는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되었다.

예를 들어, 한국등록특허 제1054519호에는 천연 인간 성장호르몬들과 비교하여 안정성 및 피부 투과도가 우수한 인간 성장호르몬-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1104223호에는 인간 IL-10의 기능과 동일한 기능을 하며 천연 IL-10과 비교하여 안정성 및 피부투과도가 매우 우수한 IL-10-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물이 개시되어 있으나, 이들 펩타이드는 그 자체로 기능성을 나타낼 뿐, 다른 약물의 전달용 담체로서 사용할 수 없다는 단점이 있었다. 또한, 이러한 단점을 극복하기 위하여 펩타이드로서 미국등록특허 제7,659,252호에는 피부질환의 치료 및 약학적 활성제제의 피부투과 촉진에 사용될 수 있는 피부투과성 펩타이드가 개시되어 있다. 상기 펩타이드는 우수한 피부투과도를 나타낼 뿐만 아니라 다른 약물의 경피전달용 담체로서도 사용될 수 있다는 장점이 있으나, 피부를 투과한 다음에는 체내의 순환시스템을 통해 소모되기 때문에, 피부를 표적으로 하는 약물의 경우에는 별다른 효과를 발휘하지 못한다는 단점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도, 피부에 잔류할 수 있는 특성을 가지는 피부투과성 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 가지는 피부투과성 펩타이드가 약물의 경피전달용 담체로서 사용될 수 있으면서도, 피부에 잔류할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 피부투과성 펩타이드 또는 그의 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 10중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 피부투과성 펩타이드 또는 그의 유도체를 제공한다.

상기 피부투과성 펩타이드 또는 유도체는 추가로 피부잔류성을 가질 수 있다.

본 발명에서 피부투과성, 피부잔류성, 또는 피부투과성 및 피부잔류성을 나타내는 펩타이드는 하기의 서열번호 1 내지 10중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

피부투과성 펩타이드: NQTDHLFSTFIS(서열번호 1), NGSLNTHLAPIL(서열번호 2), GGSIAASELEYY(서열번호 3), ELKQVVISDINH(서열번호 4), MVRDHPGLSGWT(서열번호 5), TSGISINKLPHT(서열번호 6), IFAALDYNLGRH(서열번호 7), DMKWTLKEWMTH(서열번호 8), QIEKHVYFNASQ(서열번호 9), TNIPSLSGILMK(서열번호 10)

본 발명의 용어 "피부투과성"이란, 펩타이드가 피부를 투과하여 피부내부로 침투할 수 있는 능력을 의미하는데, 본 발명의 펩타이드는 우수한 피부투과성을 나타낸다.

본 발명의 용어 "피부잔류성"이란, 피부를 투과한 펩타이드가 피부조직을 통과하여 순환계로 전달되지 않고, 피부내의 조직에 결합되어 피부내에 잔류하는 능력을 의미한다. 표적조직을 피부조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 경우에는, 상기 펩타이드와 결합된 성분이 피부조직 또는 피부세포에 작용할 수 있도록 피부조직에 잔류하는 특성이 우수한 담체를 사용함이 바람직하고, 본 발명의 펩타이드는 피부투과성 뿐만 아니라 피부잔류성이 우수하므로, 표적조직을 피부조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 담체로서 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "유도체"란, 본 발명의 펩타이드의 N-말단, C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 또는 아미노산이 추가되어 변형된 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 유도체는 우수한 피부투과성 또는 피부잔류성을 나타내는 한, 특별히 제한되지 않으나, 단실(dansyl)기가 결합된 유도체가 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, phage display 방법을 이용하여 피부투과성 펩타이드를 선발하고, 선발된 피부투과성 펩타이드를 포함하는 phage의 피부투과성을 확인한 결과, 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였다(표 1). 또한, 상기 펩타이드의 C 말단에 Dansyl기가 결합된 형태의 유도체를 각각 합성하고, 이들 유도체의 피부투과성을 확인한 결과, 상기 유도체 역시 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였다(표 2). 아울러, 상기 피부투과성 펩타이드를 포함하는 phage의 피부잔류성을 확인한 결과, 우수한 피부잔류성을 나타냄을 확인하였다(표 3). 또한, 상기 펩타이드의 C 말단에 단실기가 결합된 유도체를 각각 합성하고, 이들 유도체의 피부잔류성을 확인한 결과, 상기 유도체 역시 우수한 피부잔류성을 나타냄을 확인하였다(표 4).

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴현상으로 인하여 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 하기의 서열번호 11 내지 20의 염기서열을 포함할 수 있다.

피부투과성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드:

AATCAGACTGATCATCTTTTTTCGACGTTTATTTCT(서열번호 11),

AATGGTTCTCTTAATACTCATCTTGCGCCGATTCTG(서열번호 12),

GGTGGTAGTATTGCTGCTTCGGAGCTGGAGTATTAT(서열번호 13),

GAGCTGAAGCAGGTTGTGATTTCTGATATTAATCAT(서열번호 14),

ATGGTTCGGGATCATCCTGGTCTTTCTGGTTGGACG(서열번호 15),

ACTTCGGGGATTTCTATTAATAAGTTGCCGCATACT(서열번호 16),

ATTTTTGCTGCGTTGGATTATAATCTGGGTCGTCAT(서열번호 17),

GATATGAAGTGGACGCTGAAGGAGTGGATGACTCAT(서열번호 18),

CAGATTGAGAAGCATGTTTATTTTAATGCTAGTCAG(서열번호 19),

ACGAATATTCCTTCGTTGTCGGGGATTCTTATGAAG(서열번호 20)

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 피부외용제용 담체 및 피부외용제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "피부외용제"란, 유지류, 바셀린, 라놀린, 글리세롤 등의 다양한 기제에 약품을 혼합하여 쉽게 피부에 바를 수 있도록 한 고형, 반고형 또는 액상의 외용약을 의미한다. 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.

본 발명의 목적상 상기 피부외용제는 본 발명의 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하고, 적절한 피부외용제용 담체인 기제를 포함하는 제제로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명의 피부외용제용 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하고 추가적으로 피부를 통과하여 체내에 도달하려는 약물 또는 피부 자체의 기관에 전달하려는 약물이 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적인 보조제 예를 들어, 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 뿐만 아니라 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제와 함께 일반 화장품 또는 기능성 화장품의 구성요소로서 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.

본 발명의 화장료 조성물을 포함하는 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 로션, 젤, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 연고, 스틱, 패취, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체를 이용하여 약물의 피부투과를 촉진시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 약물의 피부투과를 촉진시키는 방법은 (ⅰ) 목적하는 약물 또는 물질을 상기 펩타이드 또는 그의 유도체에 결합시켜 결합체를 형성하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 약물은 상기 펩타이드 또는 그의 유도체와 직접적으로 또는 링커 등을 이용하여 간접적으로 결합할 수 있으면서도, 그의 원천적인 활성이 저하되지 않는 모든 약물을 사용할 수 있고, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 피부투과성 펩타이드는 우수한 피부 침투 효과 뿐만 아니라 피부 잔류 효과를 나타내므로, 표적조직을 피부조직으로 하는 약학적 제제 또는 화장료의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 음성 대조군, 대조군 및 S3-2를 발현시키는 파지가 각각 돼지 피부에 결합하는 양을 각각 나타내는 사진 및 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 피부투과성 펩타이드의 선발

피부 투과성 펩타이드를 선별하기 위해서 경피제제의 용출 실험 방법을 응용하였다. 이를 위해 Franz glass cell(Standard 직경 9mm, Receiver 5㎖, Permgear)을 이용하였다. Glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부(0.7mm 두께, Medikinetics)를 장착하고 상단에 파지를 처리한 뒤, 돼지피부를 투과하여 하단의 수용부(Receiver)에 잔류하는 파지를 증폭하였다. 이 과정을 1회 진행하는 것을 1round 선별한 것으로 정의하였다. 1Round에서 증폭된 파지를 가지고 다시 2Round를 진행하는 방식으로 피부 투과력이 좋은 파지를 경쟁하는 방식으로 선별하였고 총 3 Round를 수행하였다.

피부와 파지의 coating 단백질 사이에 생길 수 있는 비특이적인 결합을 줄여주기 위하여, 상단과 하단에는 각각 500㎕와 5㎖의 TBS(50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl)용액에 1% BSA(Sigma)를 용해시켜서 사용하였다.

무작위적인 펩타이드 서열을 가지는 파지를 가지고 시작하기 위해서, Ph.D-12 phage library kit(New England Biolab)를 사용하였다. 500㎕의 TBS(1% BSA)에 10⁹개의 파지를 처리하였다. 이후 16시간동안 배양하였고, 상기 수용부의 TBS 5㎖를 모두 사용하여 파지를 증폭하였다.

파지를 증폭하기 위한 숙주세포로서 E.coli ER2738(New England Biolab)를 이용하였다. 25㎖의 LB배지에 진탕 배양된 ER2738를 접종하고 O.D.(550nm) 0.5에서 투과한 파지가 있는 TBS 5㎖를 모두 처리하고 4시간 배양하였다. 이후 8000G로 원심 분리하여 E.coli와 파지를 분리하였다. 파지가 있는 상층액에 6㎖의 침전액(20% PEG6000, 2.5M NaCl)을 처리하여 파지를 침전시켰다. 8000G로 원심 분리후 침전된 파지에 TBS용액을 처리하여 파지를 분리하여 보관하였다.

최종적으로, 피부 투과성 파지가 가지는 펩타이드를 확인하기 위해서 파지를 단일 콜로니에서 증폭시켰다. 파지를 가지는 ER2738 E.coli는 LB/X-gal/IPTG 플레이트에서 파란색을 띄는 성질을 이용하였다. ER2738 배양액에 300㎕에 파지를 TBS로 적정량 희석하고 2㎕를 처리한 뒤, 이를 TOP agar 4㎖에 섞은 후 LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고 16시간 추가 배양한 뒤 청색의 콜로니를 선별하였다. 각각의 콜로니를 5㎖의 ER2738 배양액에 6시간동안 추가로 배양하고, Ph.D-13 phage spin kit(Qiagen)을 이용하여 DNA를 분리한 다음, 이들의 염기서열을 분석함으로써, 10종의 피부 투과성 펩타이드(S3-1(서열번호 1), S3-2(서열번호 2), S3-3(서열번호 3), S3-7(서열번호 4), S3-8(서열번호 5), S3-9(서열번호 6), S4-4(서열번호 7), S4-7(서열번호 8), S4-9(서열번호 9) 및 S4-10(서열번호 10))를 선별하였다.

실시예 2: 피부투과성 펩타이드를 포함하는 phage 의 피부투과성 확인

상기 실시예 1에서 선발된 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 가지는 각각의 펩타이드를 발현시킬 수 있는 파지들의 피부 투과성을 확인하였다.

구체적으로, Franz glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부를 장착하고, 피부와 파지의 coating 단백질 사이에 생길 수 있는 비특이적인 결합을 줄여주기 위하여, 상단과 하단에는 각각 500㎕와 5㎖의 TBS용액에 1% BSA를 용해시켜서 사용하였다. 처리하는 파지의 수를 10¹⁰ 개로 일정하게 맞추어서 상기 Franz glass cell의 상단에 처리하였다. 이때, 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR" (서열번호 21) 펩타이드 서열을 발현시킬 수 있는 파지를 이용하였다. 16시간동안 반응시킨 후에 투과하여 수용부에 있는 파지의 수를 측정하였다. 이를 위해 ER2738 배양액 300㎕ 및 파지를 포함하는 수용부의 TBS 10㎕를 혼합하고, 이를 TOP agar 4㎖에 섞은 후, LB/X-gal/IPTG plate 상단에 처리하고, 16시간 동안 추가로 배양한 다음, 청색 콜로니의 수를 계수하였다(표 1).

돼지피부를 투과한 Phage의 수

Phage의 종류	투과한 Phage의 수
대조군 S3-1 S3-2 S3-3 S3-7 S3-8 S3-9 S4-4 S4-7 S4-9 S4-10	3 3100 9000 2500 1400 250 360 440 720 450 350

상기 표 1에서 보듯이, 상기 선발된 10종의 펩타이드는 모두 대조군보다도 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1, S3-2, S3-3 및 S3-7은 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2가 가장 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3: 피부투과성 펩타이드 유도체의 피부투과성 확인

상기 실시예 1에서 선발된 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 가지는 각각의 펩타이드의 C 말단에 단실(Dansyl)기가 결합된 형태의 유도체를 각각 합성하고, 이들 유도체의 피부투과성을 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 각각의 펩타이드들을 화학적으로 합성하고, C'-말단에 Dansyl기를 추가한 유도체를 각각 합성하였으며, 대조군으로는 C'-말단에 Dansyl기를 추가한 "TDMNKTEIRFVR"의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 사용하였다.

그런 다음, Franz glass cell의 상단과 하단 사이에 돼지 피부를 장착하고, 상기 cell의 상단과 하단에 각각 500㎕와 5㎖의 TBS용액을 가한 다음, 상단에 각각의 유도체를 동일한 농도로 가하면서, 16시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 하단의 수용부에 존재하는 각 유도체의 양을 victor fluorescence meter(340/520)로 측정하여 투과정도를 비교하였다(표 2).

돼지피부를 투과한 펩타이드 유도체의 양

유도체의 종류	형광 세기(340/520)
대조군 S3-1 S3-2 S3-3 S3-7 S3-8 S3-9 S4-4 S4-7 S4-9 S4-10	1500 42000 70000 19000 25000 22000 18000 4400 8600 16000 9000

상기 표 2에서 보듯이, 상기 합성된 10종의 펩타이드 유도체는 모두 대조군보다도 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1, S3-2, S3-3, S3-7, S3-8, S3-9 및 S4-9는 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2가 가장 우수한 피부투과성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4: 피부투과성 펩타이드를 포함하는 phage 의 피부잔류성 확인

피부를 투과하게 되는 주요 메커니즘은 피부의 성분에 용해 되어서, 최상층에서 하층으로 확산되는 방식으로 진행되는 것이다. 이를 통하여 피부 전체에 유효물질이 효과적으로 전달될 수 있다. 피부의 표면은 각질과 각질간극 물질 등으로 이루어져 있고, 선별된 펩타이드가 피부를 잘 투과하기 위하여서는 피부 표면을 이루는 성분에 대한 용해성이 좋아야 한다. 피부성분에 대한 용해성은, 짧은 시간(10분) 피부와 반응 후 결합된 양을 측정하여 분석할 수 있다. 또한 wash-off 제품에 사용될 경우 피부와의 결합력이 좋아야 한다. 이 경우, 먼저 피부와의 결합 후 내부로 확산되게 된다. 따라서 선별된 파지의 피부 결합성을 측정하여 펩타이드의 우수성을 확인하고자 하였다.

이를 위해, 먼저 돼지 피부를 10mm X 10mm 크기로 절단하고, 상기 실시예 1에서 선별한 각각의 펩타이드를 발현시킬 수 있는 파지를 가한 다음, 상기 돼지 피부에 대한 결합정도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR" 서열을 발현시키는 파지를 이용하였다.

상기 돼지 피부에 결합한 파지의 양을 측정하기 위하여, anti-M13 antibody HRP conjugate를 이용하였다. Antibody 자체와 피부와의 결합에 의한 시그널을 제거하기 위해서 파지가 없는 대조군을 음성대조군으로 설정하였다. 절단한 돼지 피부를 1.5㎖ 튜브에 넣고 500㎕의 TBS(1% BSA)를 가한 다음, 상기 음성대조군의 경우 파지를 넣지 않고, 대조군과 측정하고자 하는 파지의 경우, 10¹⁰개의 파지를 가하여 10분간 배양하였다. 그런 다음, 1% BSA를 포함하는 TBS용액을 이용하여 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척하였다. 이어, anti-M13 antibody HRP(Horseradish peroxidase) conjugatge가 포함된 1% BSA를 포함하는 TBS용액 500㎕를 가하고, 5분간 추가로 배양하였다. 상기 배양물에 1% BSA를 포함하는 TBS용액을 가하고, 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척한 다음, 잔류하는 완충액을 모두 제거하였으며, TMB(Tetramethylbenzidine) solution(Amersham)을 추가로 가하였다. 이때, 상기 TMB는 항체에 결합된 HRP에 의해서 분해되어 파란색을 발색시킨다. 최종적으로, 0.2N 의 황산을 처리하여 반응을 정지시키고, 파란색을 노란색으로 변화시킨 다음, 흡광도(450nm)를 측정하여 파지-피부간 결합정도를 측정하였다. 각각의 흡광도에서 음성 대조군의 흡광도를 삭제하여 산출한 각각의 활성을 상호 비교하였다(표 3 및 도 1). 도 1은 음성 대조군, 대조군 및 S3-2를 발현시키는 파지가 각각 돼지 피부에 결합하는 양을 각각 나타내는 사진 및 그래프이다.

피부에 잔류하는 phage의 양

Phage의 종류	흡광도(450nM)
대조군 S3-1 S3-2 S3-3 S3-7 S3-8 S3-9 S4-4 S4-7 S4-9 S4-10	0.07 0.32 0.56 0.25 0.27 0.21 0.18 0.21 0.22 0.21 0.21

상기 표 3 및 도 1에서 보듯이, 피부에 잔류하는 각 펩타이드의 수준은 모든 펩타이드가 대조군보다도 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1, S3-2, S3-3 및 S3-7은 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 높은 수준으로 피부에 결합함을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2가 가장 높은 수준으로 피부에 결합함을 확인하였다.

실시예 5: 피부투과성 펩타이드 유도체의 피부잔류성 확인

상기 실시예 3에서 합성된 각 유도체들의 피부 결합성을 확인하기 위해서, 돼지 피부와 상기 유도체를 반응시키고, 표면에 용해된 펩타이드의 양을 측정하였다. 구체적으로, 잘라낸 돼지 피부를 1.5㎖ 튜브에 넣고 500㎕의 TBS(1% BSA)를 넣었다. 여기에 대조군과 측정하고자 하는 각 유도체를 추가하여 피부와 함께 10분간 배양하였다. 대조군으로는 "TDMNKTEIRFVR" 펩타이드를 이용하였다. 배양 이후 TBS(1% BSA)를 이용하여 12,000 RPM에서 1분간 10회 세척하고, 상기 반응이 종료된 돼지 피부를 24웰 플레이트에 옮긴 다음, 표면에 잔류하는 펩타이드의 양을 victor fluorescence meter(340/520)로 측정하여 비교하였다(표 4).

돼지 피부에 잔류한 펩타이드 유도체의 양

유도체의 종류	형광 세기(340/520)
대조군 S3-1 S3-2 S3-3 S3-7 S3-8 S3-9 S4-4 S4-7 S4-9 S4-10	4200 143000 260000 47000 98000 100000 47000 13200 37600 56000 25000

상기 표 4에서 보듯이, 피부에 잔류하는 각 펩타이드 유도체의 수준은 모든 펩타이드 유도체가 대조군보다도 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, S3-1, S3-2, S3-7 및 S3-8은 상기 10종의 펩타이드 중에서도 상대적으로 높은 수준으로 피부에 잔류함을 확인하였으며, 그 중에서도 S3-2가 가장 높은 수준으로 피부에 잔류함을 확인하였다.

<110> LG HOUSEHOLD & HEALTH CARE LTD. <120> Novel transdermal peptide <130> PA110981/KR-DIV1 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-1 <400> 1 Asn Gln Thr Asp His Leu Phe Ser Thr Phe Ile Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-2 <400> 2 Asn Gly Ser Leu Asn Thr His Leu Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-3 <400> 3 Gly Gly Ser Ile Ala Ala Ser Glu Leu Glu Tyr Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-7 <400> 4 Glu Leu Lys Gln Val Val Ile Ser Asp Ile Asn His 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-8 <400> 5 Met Val Arg Asp His Pro Gly Leu Ser Gly Trp Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-9 <400> 6 Thr Ser Gly Ile Ser Ile Asn Lys Leu Pro His Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-4 <400> 7 Ile Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Asn Leu Gly Arg His 1 5 10 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-7 <400> 8 Asp Met Lys Trp Thr Leu Lys Glu Trp Met Thr His 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-9 <400> 9 Gln Ile Glu Lys His Val Tyr Phe Asn Ala Ser Gln 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-10 <400> 10 Thr Asn Ile Pro Ser Leu Ser Gly Ile Leu Met Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-1 <400> 11 aatcagactg atcatctttt ttcgacgttt atttct 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-2 <400> 12 aatggttctc ttaatactca tcttgcgccg attctg 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-3 <400> 13 ggtggtagta ttgctgcttc ggagctggag tattat 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-7 <400> 14 gagctgaagc aggttgtgat ttctgatatt aatcat 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-8 <400> 15 atggttcggg atcatcctgg tctttctggt tggacg 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S3-9 <400> 16 acttcgggga tttctattaa taagttgccg catact 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-4 <400> 17 atttttgctg cgttggatta taatctgggt cgtcat 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-7 <400> 18 gatatgaagt ggacgctgaa ggagtggatg actcat 36 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-9 <400> 19 cagattgaga agcatgttta ttttaatgct agtcag 36 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S4-10 <400> 20 acgaatattc cttcgttgtc ggggattctt atgaag 36 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control <400> 21 Thr Asp Met Asn Lys Thr Glu Ile Arg Phe Val Arg 1 5 10

Claims

서열번호 1 및 서열번호 3 내지 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 피부투과성 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 이의 C-말단에 단실(Dansyl)기가 결합된 형태인 것인 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 추가로 피부잔류성을 나타내는 것인 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11 및 서열번호 13 내지 서열번호 20 중 어느 하나의 염기서열로 구성되는 것인 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 피부외용제용 담체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 피부외용제용 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물.