KR101894783B1 - 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물로서, 더욱 상세하게는 기존의 주름개선용 펩타이드보다 피부투과를 용이하게 하여 주름개선 화장품용도로 사용할 수 있게 개선한 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물{A cosmetic composition having improved skin permeation performance}

본 발명은 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물로서, 더욱 상세하게는 기존의 주름개선용 펩타이드보다 피부투과를 용이하게 하여 주름개선 화장품용도로 사용할 수 있게 개선한 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품의 근본적이고 궁극적인 목적이 피부장벽을 효과적으로 투과하여 효능성분을 피부 안으로 전달하여 미백과 주름개선 등의 기능성을 가지기 위한 것이다. 피부를 통한 흡수 경로는 각질층을 통한 흡수, 모낭과 피지선을 통한 흡수, 땀샘을 통한 흡수 등 3가지 경로가 있는데, 피부를 통한 활성물질의 전달은 피부의 구조적, 물리적 특성상 여러 가지 제한이 있다.

특히, 피부 각질층은 피부의 주요 구성 세포인 각질형성세포 (keratinocyte)가 자연사되어 피부 최외각층에 치밀한 구조를 이루고 있으며, 땀과 각종 지질 성분으로 인하여 pH 5 부근의 산성도를 보인다. 이러한 각질층 장벽을 투과하기 위해서는 통상적으로 분자량이 1,000 이하로 작아야 하고, 친지질 특성을 보유하고 있어야 가능하다는 보고가 있다. 일반적인 경피 흡수 원리와 경로는 각질층으로 성분의 확산 (diffusion), 분배 (division)가 이루어져 침투가 일어나고 표피를 통해 진피로 확산되며 진피에서 모세혈관으로 흡수된 후 전신 (systemic circulation)으로 전달된다. 표피와 진피에서는 성분의 이동이 각질층에 비해 훨씬 빨리 일어나며 모세혈관으로의 전달도 용이함. 그러므로 각질층은 경피 투과에 있어서 가장 큰 장벽 (skin barrier)이라 할 수 있다.

각질 형성 세포는 거의 결정구조인 keratin으로 구성되어 있어 세포 내를 통한 확산이 어렵기 때문에 intercellular 경로가 주된 흡수 경로이며 intercellular 지질에 대한 유효성분의 분배계수 (partition coefficient)에 의해 유효성분의 흡수가 결정되며, 유효성분의 흡수를 촉진시키기 위한 많은 방법이 제시되어 왔으며 현재도 활발한 연구가 진행되고 있다.

세포막 또는 각질층의 세포 간 지질과 구조적으로 유사한 지질 이중층 (lipid bilayer)으로 구성되어 있어 세포막과 융합하여 리포좀 (liposome) 내부의 활성성분을 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있는 구조의 필요성이 요구된다.

현재 약 50여 개 정도의 다양한 단백질 유래의 세포투과성 펩타이드(cell-penetrating peptide)가 보고되었고, 이들이 세포 안으로 들어가는 정확한 기작은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 일부 세포투과성 펩타이드를 사용한 연구에서 일반적인 외부 물질이 세포 내 유입 시 세포 내의 엔도좀 (endosome)에 갇혀 있다가 라이소좀 (lysome)에 의해 분해되어 세포질에 흡수되는 것과는 달리, 엔도싸이토시스 (endocytosis)에 의해 세포 내에 유입된 세포투과성 펩타이드는 엔도좀을 탈출하여 라이소좀에 의해 분해되는 것을 회피하여 세포 내로 유입 되는 것으로 밝혀져 있다. 한편, 현재까지 알려진 막 투과성을 보유한 기능성 펩타이드들 간의 주된 차이점은 외부 단백질을 융합시킬 수 있는 크기에 대한 제한성을 들 수 있다.

대한민국 등록특허 제10-1476953호 대한민국 등록특허 제10-1746787호 대한민국 등록특허 제10-1329411호 대한민국 등록특허 제10-1710227호

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 각질세포 내로 전달이 용이하게 할 수 있는 피부투과 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물은 피부투과성 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물의 피부투과성 펩타이드는 'EEMQRRPIAGV(Glutamic acid-Glutamic acid-Methionine-Glutamine-Arginine-Arginine-Proline-Isoleucine-Alanine-Glycine-Valine)'의 아미노산 서열을 가지는 것 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물이 피부투과성 펩타이드는 'EEMQRRADPIAGV(Glutamic acid-Glutamic acid-Methionine-Glutamine-Arginine-Arginine-Alanine-Aspartic acid-Proline-Isoleucine-Alanine-Glycine-Valine)'의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

이상과 같은 구성의 본 발명에 따른 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물에 의하면, 각질세포 내로 전달이 용이하게 이루어져 미백과 주름개선 등의 기능성을 가지는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

도 1은 실시예 1의 펩타이드(서열번호 1 : EEMQRRPIAGV)의 LC-MS 분석 데이터이다.
도 2는 실시예 2의 펩타이드(서열번호 2 : EEMQRRADPIAGV)의 LC-MS 분석 데이터이다.
도 3은 어떤 펩타이드도 처리하지 않은 세포를 파쇄하여 얻은 상등액을 분석한 LC/MS 크로마토그램이다.
도 4는 실시예 1을 각질 세포인 Hakat cell에 50μM 농도로 처리한 후, 세포를 파쇄하여 원심분리하여 상등액을 얻어 세포투과성 정량을 실시한 LC/MS 크로마토그램이다.
도 5는 실시예 2를 각질세포에 50μM 농도로 처리한 후, 세포를 파쇄하여 원심분리하여 상등액을 얻어 세포투과성 정량을 실시한 LC/MS 크로마토그램이다.
도 6은 대조군 1과 대조군 2를 FITC로 형광 라벨링을 한 다음, 각각 10μM, 50μM 농도로 처리하여 얻은 각질세포를 유세포 분석기로 측정결과를 나타낸 결과이다.
도 7은 실시예 1과 실시예 2를 FITC로 형광 라벨링을 한 다음, 각각 10μM, 50μM 농도로 처리하여 얻은 각질세포를 유세포 분석기로 측정결과를 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명의 실시 예를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부투과성 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 출원인은 연구를 거듭한 결과 기존에 상용하는 주름개선용 펩타이드 'EEMQRR' 보다 피부투과성을 현저히 향상시킬 수 있는 펩타이드 개발하였으며, 펩타이드 합성 전문업체에 의뢰하여 아래 실시예 1, 2의 피부투과성 펩타이드를 합성하였다.

- 서열번호 1 : EEMQRRPIAGV(Glutamic acid-Glutamic acid-Methionine-Glutamine-Arginine-Arginine-Proline-Isoleucine-Alanine-Glycine-Valine)

- MW : 1327.54

실시예 1의 펩타이드에 대한 분석 결과는 도 1의 그래프에서 확인하는 바와 같다.

- 서열번호 2 : EEMQRRADPIAGV(Glutamic acid-Glutamic acid-Methionine-Glutamine-Arginine-Arginine-Alanine-Aspartic acid-Proline-Isoleucine-Alanine-Glycine-Valine)

- MW : 1513.70

실시예 2의 펩타이드에 대한 분석 결과는 도 2의 그래프에서 확인하는 바와 같다.

본 발명에 따른 피부투과성 펩타이드의 세포 투과율을 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

[실험예 1]

LC / MS ( liquid chromatograph mass spectrometer )에 의한 세포투과성 효율의 측정

1. 측정 방법

세포투과성 펩타이드의 세포투과성을 검증하기 위하여, 10μM, 50μM 농도의 시료를 HACAT mouse embryo fibroblast cell line에 각각 처리하고, 2시간 동안 배양한다.

이때, HACAT 세포는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS) 및 5% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 500 mg/㎖을 함유하는 DMEM 배지에서 배양한다.

배양이 종결된 후, 단백질이 처리된 HACAT 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 펩타이드를 제거하기 위해 5% 트립신/EDTA (trypsin/EDTA)를 처리하고, 저온의 PBS로 3회 세척한 후 세포를 파쇄한다.

세포 파쇄 후, 12,000rpm으로 5분 원심분리하여 상등액을 취하여 여과한 후, LC/MS 로 정량한다.

2. LC/MS 크로마토그램 정량 결과

(1) 도 1은 어떤 펩타이드도 처리하지 않은 세포를 파쇄하여 얻은 상등액을 분석한 LC/MS 크로마토그램 결과이다.

(2) 도 2는 실시예 1의 펩타이드를 각질 세포인 Hakat cell에 50μM 농도로 처리한 후, 세포를 파쇄하여 원심분리하여 상등액을 얻어 세포투과성 정량을 실시한 LC/MS 크로마토그램이다.

도 1 및 도 2를 함께 참조하면, LC/MS로 정량한 결과, 도 1의 blank 대비 실시예 1을 50μM 처리한 크로마토그램에서 실시예 1의 retention time이 일치하는 피크와 분자량이 검출되었다.

(3) 도 3은 실시예 2의 펩타이드를 각질세포에 50 μM 농도로 처리한 후, 세포를 파쇄하여 원심분리하여 상등액을 얻어 세포투과성 정량을 실시한 LC/MS 크로마토그램이다.

도 3을 참조하면, LC/MS로 정량한 결과, 도 1의 blank 대비 실시예 2를 50 μM 처리한 크로마토그램에서 실시예 2의 retention time이 일치하는 피크와 분자량이 검출되었다.

3. 세포투과성 측정 결과

(1) 실시예 1, 2의 측정 결과

1) EEMQRRPIAGV의 서열을 가지는 본 발명의 피부투과성 펩타이드 시료(실시예 1)와, EEMQRRADPIAGV의 서열을 가지는 본 발명의 피부투과성 펩타이드 시료(실시예 2)를 HACAT 세포에 각각 10 μM 처리한 결과를 아래 표 1에 기재하였다.

구분	처리량	정량결과	전달효율	Protein
실시예1 (EEMQRRPIAGV)	10μM	2.68 ng/ml	0.005%	122 g
실시예2 (EEMQRRADPIAGV)	10μM	2.65 ng/ml	0.005%	113 g

위 표 1를 보면, 실시예 1, 2의 피부투과성 펩타이드는 모두 낮은 효율이지만 0.005%의 세포 내 전달 효율을 가지는 것을 확인할 수 있다.

2) 실시예 1, 2의 피부투과성 펩타이드를 HACAT 세포에 각각 50 μM 처리한 결과를 아래 표 2에 기재하였다.

구분	처리량	정량결과	전달효율	Protein
실시예1 (EEMQRRPIAGV)	50μM	0.1 g/ml	0.05%	122 g
실시예2 (EEMQRRADPIAGV)	50μM	1 g/ml	0.5%	113 g

위 표 2를 보면, 실시예 1에서는 0.05%의 세포 내 전달 효율을 보였고, 실시예 2에서는 0.5%의 높은 세포 내 전달효율을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 비교예 1, 2의 측정 결과

EEMQRR의 서열을 가지는 펩타이드 시료(비교예 1)와, EEMQRRAD의 서열을 가지는 펩타이드 시료(비교예 2)를 HACAT 세포에 각각 10 μM 처리한 결과를 아래 표 3에 기재하였다.

구분	처리량	정량결과	전달효율	Protein
비교예 1 (EEMQRR)	10μM	0	0%	103 g
비교예 2 (EEMQRRAD)	10μM	0	0%	115 g

표 3을 보면 상용으로 판매하고 있는 주름개선용 펩타이드의 세포 내 전달효율을 시험한 결과, 10 μM 농도에서 세포 전달효율이 모두 0%로 나타났다.

2) 비교예 1, 2의 펩타이드 및 비교예 2의 나노 에멀젼을 HACAT 세포에 각각 50 μM 처리한 결과를 아래 표 4에 기재하였다.

구분	처리량	정량결과	전달효율	Protein
비교예 1 (EEMQRR)	50μM	3.61 ng/ml	0.007%	115 g
비교예 2 (EEMQRRAD)	50μM	2.67 ng/ml	0.005%	117 g
비교예 2 나노 에멀젼	50μM	0	0	120 g

표 4를 보면 상용으로 판매하고 있는 주름개선용 펩타이드의 세포 내 전달효율을 시험을 위하여 50 μM 농도로 농도를 높여 시험한 결과, 세포 전달효율이 각각 모두 0.007%, 0.005%로 낮은 효율인 것을 확인할 수 있었다. 비교예 2의 나노에멀젼 형태는 세포 전달효율이 0으로 나타났다.

위 결과를 종합해 보면, 본 발명의 아미노산 서열을 가지는 실시예 1(EEMQRRPIAGV), 실시예 2(EEMQRRADPIAGV)의 펩타이드가 기존에 상용하던 주름개선용 펩타이드에 비해 세포 투과 효율이 월등히 개선되었다는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 2]

FACS ( fluorescence - activated cell sorting )에 의한 세포투과성 효율의 측정

1. 세포투과성 효율의 측정 방법

10μM, 50μM 농도의 시료를 각질 세포인 Hakat cell에 각각 처리하고, 2시간 동안 배양한다. 각질 세포를 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(10,000 units penicillin 및 10,000 g/mL streptomycin, Invitrogen)을 함유하는 RPMI1640 배지에, 5% CO₂의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양한다.

배양이 종결된 후, 각각의 시료가 처리된 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 FITC-표지 펩타이드를 제거하기 위해 트립신/EDTA을 처리하고, 냉장 보관한 인산완충용액(Phosphate buffer)으로 3회 세척한다.

세척한 세포를 회수하여, 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 분석 (FACSCalibur^TM, Beckton-Dickinson, San Diego CA, USA)을 위해 세포 (1X10⁴)를 FlowJo 세포측정 분석(FlowJo flow cytometry software, FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행한다.

2. 유세포 분석기 측정 결과

(1) 도 4는 대조군 1과 대조군 2를 FITC로 형광 라벨링을 한 다음, 각각 10 μM, 50 μM 농도로 처리하여 얻은 각질세포를 유세포 분석기로 측정결과를 나타낸 결과이다.

도 4를 참조하면 10 μM 농도로 처리한 대조군 1(보라색, 주황색)과 대조군 2(붉은색, 청색)는 처리하지 않은 시료(검은색), FITC/DMEM군(연두색)과 유사한 효율을 나타낸 것으로서, 50 μM 농도로 처리한 대조군 1 (보라색, 주황색)과 대조군 2 (붉은색, 청색)는 처리하지 않은 시료 (검은색), FITC/DMEM 군 (연두색)에 비하여 소폭 증가된 세포투과성 효율을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 도 5는 실시예 1과 실시예 2를 FITC로 형광 라벨링을 한 다음, 각각 10μM, 50μM 농도로 처리하여 얻은 각질세포를 유세포 분석기로 측정결과를 나타낸 결과이다.

10 μM 농도로 처리한 실시예 1(보라색, 주황색)과 실시예 2(붉은색, 청색)는 처리하지 않은 시료(검은색), FITC/DMEM 군 (연두색)에 비해 증가된 세포투과성 효율을 나타낸 것으로서, 50 μM 농도로 처리한 실시예 1(보라색, 주황색)과 실시예 1(붉은색, 청색)는 처리하지 않은 시료(검은색), FITC/DMEM 군(연두색)에 비하여 증가된 세포투과성 효율을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었으며, 10 μM과 비교하여 큰 차이는 없는 것으로 나타났다.

본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (3)

1. 삭제
2. 'EEMQRRPIAGV(Glutamic acid-Glutamic acid-Methionine-Glutamine-Arginine-Arginine-Proline-Isoleucine-Alanine-Glycine-Valine)'의 아미노산 서열을 가지는 피부투과성 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물.
   
3. 'EEMQRRADPIAGV(Glutamic acid-Glutamic acid-Methionine-Glutamine-Arginine-Arginine-Alanine-Aspartic acid-Proline-Isoleucine-Alanine-Glycine-Valine)'의 아미노산 서열을 가지는 피부투과성 펩타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부투과 성능이 개선된 화장료 조성물.
   
   

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