KR101800880B1 - 보습제제로서의 커먼 맬로우 추출물의 신규 용도 및 이를 함유하는 미용 조성물 - Google Patents

보습제제로서의 커먼 맬로우 추출물의 신규 용도 및 이를 함유하는 미용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화장품 보습제로서 또는 미용 조성물에서의 보습제로서의, 커먼 맬로우 추출물 용도에 관한 것이다.
Figure R1020090063258
보습제, 커먼 맬로우 추출물, 미용 조성물, 화장품

Description

보습제제로서의 커먼 맬로우 추출물의 신규 용도 및 이를 함유하는 미용 조성물{Novel use of an extract of common mallow as an hydrating agent, and cosmetic composition containing it}
본 발명은 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하고 또는 강화시키는, 커먼 맬로우 추출물의 용도; 이를 함유하는 미용조성물, 및 이러한 조성물을 사용하는 미용관리 방법에 관한 것이다.
피부 보습을 유지하는 것은, 이는 미용 조성물의 임의의 유형에 사용될 수 있는 보습 미용제제 및 특히 수분의 증발을 제한하거나 표피에서 수분의 전달을 향상시키기 위해 이러한 활성 제제들이 작용할 수 있는 새로운 타겟을 탐색하고 있는 미용 산업에서 주요 문제이다.
아쿠아포린류(AQPs)는 물 및 용액내의 작은 분자들, 예를 들어, 글리세롤과 우레아(urea)의 확산을 용이하게 하는 채널을 형성시키는 경피 단백질의 일족이다.
오늘날, 이러한 일족의 13 개 단백질들이 사람한테서 확인되었다 (AQP0에서 AQP12까지 번호매김). 이들은 몸에 널리 퍼져있고 특히, 다른 격실간의 물의 상 당한 이동이 있는 장소, 예를 들어, 신장 (물 재흡수) 또는 피부 (경피 수분 손실)과 같은 기관에 퍼져있다.
예를 들어, AQP3 및 AQP9과 같이, 아쿠아글리세로포린으로 알려진 특정 아쿠아포린류는 글리세롤, 우레아, 퓨린 및 피리미딘류과 같이, 조직의 수화 수준을 유지하는데 중요한 역할을 하는, 작은 용질에 대하여 투과성을 보인다.
AQP-3은 인체 표피 각질세포의 세포막에서 발견되는 데 모든 살아있는 표피에 걸쳐 있다 (R Sougrat 등, JID 2003, 118 : 678-685).
최근에, AQP9가 이러한 표피 세포에서 발견되었지만, 인간 표피의 상부층 (표층)에 더 국소적으로 존재하고 있다 (JM Verbavatz 등., Expression of aquaporin 9 and 10 in human keratinocytes during differentiation, 5th International Conference on Aquaporins, Nara Japan, July 2007).
탈수 환경에 가장 많이 노출되어 있는 것들 중 하나인, 피부의 최외각층에 AQP9이 국지화되어 있는 것은 AQP9이 피부의 표면 보습화를 향상시키는 데 선택될 수 있는 생물학적 타겟이 될 수 있다.
프랑스 특허 제 2　801 504 호는 AQP3의 발현을 자극하는 제제로서의 아주가 투르케스타니카(Ajuga turkestanica)의 추출물과 보습제로서의 이의 용도를 개시하고 있다.
WO 2007/007 255는 피부에서 아쿠아포린AQP3 및 AQP9의 발현을 자극하는 다양한 제제 및 이의 미용 용도를 개시하고 있다.
본 발명의 발명자들은 인간 표피 각질세포에서 AQP9의 발현이 커먼 맬로 우의 추출물에 의해 강력하게 자극된다는 것을 발견하였다.
커먼 맬로우(말바 실베스트리스 (Malva sylvestris))는 또한 야생 맬로우 또는 우드 맬로우로 알려져 있고, 말바세아(Malvacea)과의 2년생 초분식물이다. 이러한 식물의 추출물의 미용용도가 알려져 있다.
프랑스 특허 제 2　814 070 호는 식물종 커먼 맬로우(종 말바 실베스트리스) 잎의 수성 추출물을 제조하는 방법과 상기 추출물을 화장물 조성물에서 항-노화(anti-aging) 미용 성분으로서 사용하는 용도에 대하여 개시하고 있다.
따라서, 어떠한 문헌도 표피 세포에서 AQP9의 발현을 자극하는 것을 통한 맬로우 (말바 실베스트리스) 의 추출물의 보습 특성을 개시하고 있지 않다.
이러한 특징으로 인해, 그러한 추출물의 용도가 미용관리를 수행하는 미용 조성물에 특히 유리하게 되고, 이를 통해, 피부의 보습을 유지하거나 촉진하는 것을 찾을 수 있다.
본 발명의 주 목적은, 특히 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하고 또는 강화하는 신규한 피부 보습제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 그러한 보습제를 포함하는 미용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 주 목적은 또한 특히 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하고 또는 강화하는 상기 미용 조성물을 사용하는 미용관리 방법을 제공하는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 주 목적은 산업적 및 미용학적 규모로 사용될 수 있는 간단한 용액을 제공하는 것이다.
제 1 관점에 따라서, 본 발명은 따라서 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하고 또는 강화하는 보습제로서 커먼 맬로우 (말바 실베스트리스)의 추출물의 미용 조성물에서의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하고 또는 강화하는 보습제로서 커먼 맬로우(말바 실베스트리스)의 추출물의 용도를 지향한다.
본 발명에 따른 추출물은 바람직하게는, 커먼 맬로우(말바 실베스트리스) 잎의 추출물, 더욱 바람직하게는 식물의 잎을 극성 용매나 극성용매들의 혼합물로 처리하여 얻은 것이다.
본 발명에 따라서, 용어, "극성 용매"는 용매가 4 이상의 극성 지수 P'를 가지는 용매를 의미한다. 극성지수는 분자의 극성의 많고 적음을 나타내는 열역학적 크기 (용애도 및 상태 변환의)에 기초하여 계산된 크기이다. 용매의 극성 지수들에 대해서는, L.R. Snyder의 논문 (J. Chromatogr., 92 (1974), 223-230)을 참조할 수 있고, 이는 본 출원의 참조문헌에 포함되어 있다.
극성 용매 또는 혼합물을 이루는 극성 용매들은 물 C1-C4 알코올, 특히 에탄올 또는 부탄올, 또는 대안적으로 글리콜, 특히 글리세롤, 부틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜로부터 선택된다.
커먼 맬로우의 바람직한 추출물은 특히, 물 또는 물과 에탄올의 혼합물과 같이 수성 알코올 혼합물을 사용하여 얻는다.
본 발명의 특정 구체예에 따라, 커먼 맬로우의 추출물은 Silab 회사에서 "Vitactyl Clair®" 상표로 판매하는 제품과 같은 수성 추출물이다.
본 발명에 따라서, 전술한 바와 같은 커먼 맬로우의 추출물은 국소 적용시 소정의 효과를 얻는데 유효한 양으로 미용 조성물에 활성 제제로서 존재한다.
용어 "유효한 양"은 소정의 효과, 본건의 경우 피부를 보습하는 데 있어서의 작용을 얻게하는 커먼 맬로우 추출물의 양을 의미한다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 본 발명자에 의해 수행된 시험에 의하면, 커먼 맬로우 추출물에 의해 생성된 보습 효과는 상기 추출물이 적어도 하나의 트리테르펜 사포닌과 혼합될 때 상당히 향상되는 것이 나타났다.
특히, 커먼 맬로우 추출물과 적어도 하나의 트리테르펜 사포닌과의 혼합 물로 처리된 표피 세포에서 AQP9의 발현에 대하여 상당한 시너지 효과가 관찰되었다.
트리테르펜 사포닌류는, 또한 우선순위가 없이, 트리테르펜 사포노시드류로 알려져 있는 화합물로서 당과, 그 기본구조가 여섯 개 이소프렌 단위체, 즉 30 탄소수로부터 구성되는 트리테르펜으로 형성된다. 이러한 화합물은 란포티컴 카르타모이데스(Rhaponticum carthamoides), 아랄리아 만스후리카(Aralia mandshurica), 바코파 모니에라(Bacopa monniera), 브리요니아 알바(Bryonia alba), 엘루테로코커스 센티코서스(Eleutherococcus senticosus), 파낙스 진셍(Panax ginseng), 자이노스템마 펜타필럼(Gynostemma pentaphyllum), 코도놉시스 필로술라(Codonopsis pilosula), 티노스포라 코르디폴리아(Tinospora cordifolia), 휘타니아 솜니페라(Withania somnifera), 트리불러스 테레스트리스(Tribulus terrestris), 디오스코레아(Dioscorea), 스밀락스 엑셀사(Smilax excelsa), 파리스 폴리필라(Paris polyphylla), 코르너스 플로리다(Cornus florida), 유카(Yucca), 스밀락스 아리스톨로키아에폴리아(Smilax aristolochiaefolia), 아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis), 헤데라 헬릭스(Hedera helix), 트리고넬라페너그 라에쿰(Trigonellafenug raecum), 센텔라 아시아티카(Centella asiatica), 글리신 막스(Glycine max (soja)), 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris), 파세올러스 아우레우스(Phaseolus aureus), 파셀올러스 루나투스(Phaseolus lunatus), 비시아 파바(Vicia faba), 렌스 컬리나리스(Lens culinaris), 시세르 아리에툼(Cicer arietum), 비그나 안굴라리스(Vigna angularis), 비그나 문고(Vigna mungo), 옥시 트로피스 오크로세팔라(Oxytropis ochrocephala), 옥시트로피스 글라브라(Oxytropis glabra), 피섬 사티범(Pisum sativum), 소포라 파베센스(Sophora favescens), 아스파랄러스 멤브라나세우스(Asparalus membranaceus), 크로탈라리아 알비다(Crotalaria albida), 아리키스 히포제아(Arachis hypogea), 칼레가 오피시날리스(Galega officinalis), 휘스타리아 브라키보트리스(Wistaria brachybotrys), 트리폴리움 레펜스(Trifolium repens) 등과 같은 많은 식물 종, 또는 메디카고(Medicago) 속 식물, 특히 메디카고 알팔파(Medicago alfalfa) 및 메디카고 사티바(Medicago sativa (alfalfa))에 다양한 구조로 빈번하게 발견된다.
이러한 트리테르펜 사포닌류는 특히 뿌리, 덩이줄기, 잎, 꽃 및 씨앗과 같은 영양 물질이 풍부한 조직에서 발견된다.
영양물질이 풍부한 조직은, 트리테르펜 사포닌류를 함유하는 식물 추출물을 제조하기 위해, 조직이 포함하는 상기 트리테르펜 사포닌류의 추출 과정을 수행하는 선택 식물 물질을 구성하는 데, 후속적으로 이러한 화합물을 정제하고 분리하는 조건적 단계를 수행한다.
따라서, 본 발명의 제 2 과제는 커먼 맬로우 (말바 실베스트리스)의 추출물 및 적어도 하나의 트리테르펜 사포닌 또는 이를 함유하는 식물 추출물의 조합물을 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하고 또는 강화하는 보습제로서 미용 조성물에 사용하는 것에 관한 것이다.
상기 조합물의 맬로우 추출물은 바람직하게는 전술한 바와 같다.
바람직한 트리테르펜 사포닌은 식물종 센텔라 아시아티카(Centella asiatica)에 존재하는 것 들 중 하나, 특히 식(I)의 아시아티코시드:
Figure 112009042238024-pat00001
식 (II)의 마데카소시드이다:
Figure 112009042238024-pat00002
본 발명에 따라서, 제 1의 바람직한 조합물은 따라서, 상기 트리테르펜 사포닌이 아시아티코시드, 마데카소시드 또는 이들의 혼합물로서 단독 형태 또는 이를 포함하는 식물체 추출물의 형태로 있는 것이다.
더욱 바람직한 조합물은 전술한 바와 같은 맬로우 추출물 및 적어도 하나의 트리테르펜 사포닌을 함유하는 센텔라 아시아티카의 추출물의 조합물이다.
본 발명의 이러한 구체예에 따라서, 센텔라 아시아티카의 추출물은 상기 식물의 잎을 커먼 맬로우의 추출물 생성에 사용된 것과 같은 것일 수 있는 극성 용매 또는 극성 용매의 혼합물로 처리하여 얻어진다.
극성 용매 또는 혼합물을 이루는 극성 용매들은 물 C1-C4 알코올, 특히 에탄올또는 부탄올, 또는 대안적으로 글리콜, 특히 글리세롤, 부틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜로부터 선택된다.
제 3의 관점에 따라서, 본 발명은 활성 성분으로서, 커먼 맬로우(말바 실베스트리스)의 추출물 및 적어도 하나의 트리테르펜 사포닌이나 이를 함유하는 추출물의 조합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물에 관한 것이다.
하나의 바람직한 구체예에 따라서, 상기 미용 조성물은, 활성성분으로서, 말바 실베스트리스 잎의 추출물 및 센텔라 아시아티카 잎의 추출물의 조합물을 포함하며, 각 추출물은 전술한 바와 같고 특히 극성 용매 또는 극성 용매들의 혼합물을 사용하여 얻어진다.
본 발명의 특정 구체예에 따라서, 상기 미용 조성물은 말바 실베스트리스의 건조 추출물을0.0001% 내지 1 중량% 바람직하게는 0.01% 내지 0.1 중량%, 및 센 텔라 아시아티카의 건조 추출물을 0.0001% 내지 0.5 중량%, 바람직하게는 0.01% 내지 0.1 중량% 포함한다.
본 발명의 미용 조성물에서 말바 실베스트리스 추출물(A) 대 센텔라 아시아티카 추출물(B)의 중량비(A/B)는 1/10 내지 500/1, 바람직하게는 1/5 내지 50/1 및 더욱 바람직하게는 1/2 내지 20/1이다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 상기 보습제는 담체에, 바람직하게는 단층 또는 다층 리포좀내에 적어도 부분적으로 캡슐화되어 있다.
그러한 담체 내에 활성 성분을 포함시키는 것은 각질층을 통해 상기 보습제의 확산을 용이하게 하여 표피의 더 깊은 층에 도달하게 하고 그럼으로써 이의 보습 효과를 그 속에서 작용하게 한다.
캡슐화된 보습제는 수성 젤 유형의 미용 조성물 내로 내포됨으로써, 대안적으로는 수중유 에멀젼 유형의 미용 조성물의 경우 알지네이트로 바람직하게 안정화될 수 있다.
본 발명에 따른 미용 조성물은 글리콜류, 특히 글리세롤, 또는 천연 폴리올류, 천연 또는 합성 세라마이드류, 우레아, 히아룰론 산 또는 대안적으로는 아주가 투르케스타니카의 추출물, 반다 코엘룰레아의 추출물, 레티노 산 또는 D-자일로스와 같이 보습 특성을 가지는 하나 이상의 다른 분자 또는 식물 추출물을 포함할 수 있다.
이러한 분자 또는 추출물은 또한 AQP9의 발현의 자극과는 다른 기작에 따라 피부 보습 효과를 가지는 것으로, 따라서 본 발명의 활성 성분의 것과 보충적 역할을 할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 사용될 수 있는 다른 미용 제제 중에서, 하기의 것이 특히 언급될 수 있다:
- 피부 표면 박리를 조덜하는 표피 칼리크레인을 자극하는 제제, 특히 노팔의 추출물,
- 각질층의 수장벽 효과 및 피부의 부드러움에 필수 역할을 하는 표피 지질의 합성을 자극하는 제제, 특히 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus) L. 또는 루파 실린드리카(Luffa cylindrical)의 씨앗 추출물,
- 각질세포의 종말 분화 또는 트랜스글루타미네이즈를 자극하여 사세포 (corneocyte) 및 피부 장벽, 특히 β-에크디손 또는 칼슘 글루코네이트나 칼슘 피롤리돈카르복실레이트와 같은 칼슘 유도체의 형성을 강화하는 제제 또는 대안적으로 표피 재생을 자극하는 활성제제, 특히 소맥배아 오일,
- 탄탄한 접착 형성을 촉지하여 세포내 수분 손실을 제한하는 제제, 특히 카스타네아 사티바(Castanea sativa) 또는 산치(Sanchi) 사포닌류의 추출물,
- 눈 밑의 다크 서클을 방지하는 미용제제, 특히 아스코빌 글로코시드 또는 헤스페레틴,
- D-자일로스나 자일로스 유도체, 특히 C-글리코시드, 예를 들어, C-β-D-자일로피라노시드-n-프로판-2-온, C-β-D-(3,4,5-트리아세톡시)-자일로피라노시드-n-프로판-2-온 또는 C-β-D-자일로피라노시드-2-히드록시-프로판-2-온, 및 이의 유도체들과 같은, 표피 글리코사미노글리칸(GAG) 합성을 자극하는 제제.
적어도 하나의 활성제제 외에, 상기 미용 조성물은 상기 조성물을 제조하는 데 유용한 미용학적 허용 부형제를 또한 포함한다.
상기 조성물은 특히, 보습제로서 사용된 식물 추출물(들)을 용해하거나 분산시키는 데 사용된 용매 또는 용매들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 용매 및 용매들의 혼합물은 상기 추출에 사용된 것과 동일 또는 상이할 수 있다.
본 발명에 따른 미용 조성물은 혈청, 로션, 에멀젼, 크림, 히드로젤, 바람직하게는 마스크 또는 대안적으로는 스틱이나 패치의 형태로 있을 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 제 4 관점에 따라서, 본 발명의 주제는 미용 관리 방법에 관한 것으로서, 안면 또는 신체 피부의 적어도 하나의 관심 부위에, 커먼 맬로우의 추출물 또는 이 추출물과 적어도 하나의 트리테르펜 사포닌이나 이를 함유한 식물 추출물과의 조합물을 활성성분으로서 포함하는 미용 조성물을 적용하여 피부의 보습 상태를 회복시키고, 유지하거나 강화하는 및/또는 피부 건조의 증상 발현을 방지하거난 지연하는 효과를 얻는 것을 측징으로 한다.
특정 일구체예에 따라서, 표피에서 AQP9의 발현 자극은 지방산을, 피부 표면에서 각질세포내 지질의 필수 구성성분인 모노-, 디- 및 트리글리세라이드로 에스테르화하게 하는 글리세롤의 확산을 향상시킨다.
상기 미용관리 방법은 따라서 또한 건조 피부의 재지방화를 용이하게 하여 표피의 표층에 포함된 수분의 증발에 대하여 피부의 장애 효과를 향상시키는 것에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적, 특성 및 장점들은 하기 예증적 설명으로부터 명쾌 하게 나타날 것이고, 이는 전적으로 예증으로서만 주어지고 본 발명의 범위를 여하한 이유에서 제한하지 않는 몇 개 실시예로 설명된다. 이러한 실시예에서, 다른 언급이 없으면, 온도는 섭씨이고, 압력은 기압이며, 양과 퍼센트는 중량기준이다.
실시예
재료 및 방법
본 연구는 유선 또는 복부 수술의 수술 잔류물로부터 분리된 정상 인간 각질세포(NHK) 상에서 수행되었다. NHK는 표피를 분리하기 위해 써모라이신으로 처리된 인간 피부의 샘플로부터 분리된다.
1. 세포 배양
인간 피부의 샘플로부터 분리된 NHK T75 플라스크 내의 전 KSFM 배지 (Invitrogen Gibco, 17005-034)에서, 37℃ 및 5% CO2에서 완전포화 (subconfluence) 전까지 배양한 후, 트립신 처리하고 -196℃의 냉동튜브 내 P1에서 냉동시켰다.
해동후, T75 플라스크 내의 전 KSFM 배지에서 한번 계대바양하였다. 포화전 단계에서, NHK를 트립신 처리하고 Lab-Tek II 8-웰 배양 시스템 (Nalge Nunc International)에서 웰당 20,000 세포 비율로 접종하였다. 4 개 웰을 하나의 처리 조건으로 하였다.
2. 처리
24 시간 배양 후, 세포를 시험될 다양한 활성 제제로 처리하였다.
활성제제 시험:
프랑스 Silab사로부터 Vitactyl Clair® 상품명으로 판매되는 말바 실베스트리스 잎의 추출물. 이 추출물은 2.1 w/w% 고형분을 함유하는 수성 용액의 형태이다.
분말 형태의 센텔라 아시아티카 잎 추출물 (INCI: 센텔라 아시아티카 잎 추출물) (센텔라 아시아티카 헤테로시드류, Bayer HealthCare). 이러한 추출물의 트리테르펜 사포닌 (아시아티코시드 및 마데카소시드)의 함량은 70중량% 이상이다.
처리 용액의 제조:
센텔라 아시아티카의 분말 추출물 50 mg을 DMSO 500 μL에 녹였다 (원액, 100 mg/ml). 이 원액 100 μL을 KSFM 10 ml에 희석하였다 (1 mg/mL 용액).
별도로, 커먼 맬로우 추출물의 상업 용액 (Vitactyl Clair®)을 KSFM 배지에 희석하여 각각 처리 용액의 ml 당 건조 중량 105μg 및 210μg에 해당하는, 상기 출발 상업 용액의 0.5v/v% 및 1v/v% 이하의 처리 용액을 수득하였다.
처리:
상기 추출 용액의 농도는 건조 추출물 중량/KSFM 배지 ml로 표시된다:
-　대조군 (KSFM 배지)
-　DMSO 대조군 (KSFM 배지 + DMSO 1/1000)
- 말바 실베스트리스 추출물 105 μg/ml (0.5%)
-　말바 실베스트리스 추출물 210 μg/ml (1%)
-　센텔라 아시아티카 추출물 11　μg/ml
-　센텔라 아시아티카 추출물 33　μg/ml
-　M. 실베스트리스 추출물 105 μg/ml + C 아시아티카 추출물 11 μg/ml
-　M. 실베스트리스 추출물 105 μg/ml + C. 아시아티카 추출물 33 μg/ml
-　M. 실베스트리스 추출물 210 μg/ml + C. 아시아티카 추출물 11 μg/ml
-　M. 실베스트리스 추출물 210 μg/ml + C. 아시아티카 추출물 33 μg/ml
세포를 약 50%의 포화도에서 48시간 처리하였다. 처리 후, 세포는 포화 단계에 달하게 하였다.
3. 면역표지(Immunolabelling)
48 시간 처리 후, KSFM을 흡입하였다. 세포를 PBS(PBS 정제, Invitrogen Gibco)로 세척한 후 포르말린 (완충된 중성 10% 포르말린 용액, Sigma)을 사용하여 10분간 슬라이드 상에 고정하였다. PBS로 세척후, 배양 챔버를 0.1% Triton 용 액(Triton X-100, Sigma)으로 10 분간 채우고, PBS로 두 번 세척하였다.
제 1 단계에 따라, 세포를 먼저 PBS/1% BSA (BSA, Sigma)의 용액으로 30 분간 실온에서 처리하였다. 다음 PBS/BSA 용액을 슬라이드로부터 제거하였다.
제 2 단계에 따라, 세포를 100 배 희석된 일차 항-AQP9 항체 용액 (염소 다중클론성 sc-14989)으로 60 분간 실온에서 처리하였다. 슬라이드를 PBS 용액으로 세척하였다.
제 3 단계에 따라, 상기 세포를 200 배 희석된 이차 항-염소 항체 용액 (Alexa Fluor 546, 토끼 항-염소 IgG, Molecular Probes)으로 처리하였다. 세포 액을 이차 항체 용액에 20,000 배 희석된 Sytox green (Molecular Probes)으로 염색하였다. 슬라이드를 암흑 상태에서 60 분간 실온에서 배양하고 PBS로 세척하였다.
4. 적재
슬라이드 배양 챔버를 철거하고 적재 배지 (형광 적재 배지Fluorescent Mounting Medium, DAKO) 수 방울을 세포에 적가하고 24 x 60 mm 슬라이드로 덮었다.
슬라이드를 암전 상태에서 4℃에서 보관하였다.
5. 공촛점 현미경의 사진 획득
LaserSharp 2000 소프트웨어(BioRad)를 사용하는 공촛점 현미경 (Zeiss Axioplan microscope, 및 BioRad 크립톤-아르곤 레이저)으로 사진을 찍었다.
x20 대물 렌즈를 사용하여 동일한 획득 변수 (획득, 홍채) 에 따라서 각 조건마다, 붉은 형광 (AQP9 발현) 및 녹색 형광 (세포 핵)으로 4 장의 사진을 얻었다. 다음 영상을 조합하여 합성 영상을 얻었다.
6. 영상 분석
사진은 라이카 QWin 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 프로그램을 만들어 세포의 수에 비하여 AQP9 발현을 정량하였다.
분석은 수 개 단계로 실행되었다:
- 단계 1: 분석될 영상의 개봉 (도 1)
원 사진들의 조합으로 결과된 영상은 AQP9의 표지 (1)를 붉은색으로 및 세포핵 (2)의 표지를 녹색으로 나타내고 있다.
- 단계 2: AQP9 표지의 검출
영상 분석 소프트웨어는 AQP9의 표지에 대한 양성적인 픽셀을 검출한다. 각 세포에 존재하는 AQP9의 양에 해당하는, 검출된 붉은색 픽셀의 수만큼 측정될 것이다.
- 단계 3: 세포핵의 검출
상기 소프트웨어는 세포핵에 해당하는 녹색 픽셀을 검출한다. 대상체의 수만큼 측정될 것이다.
-단계 4: 측정 면적의 결정
측정 면적은 첨부된 도 1에서 나타난 전체 현미경 면적에 의해 형성된다.
- 단계 5: 결과 표시
-AQP9 표지에 의해 표시되는 면적
-세포핵 수 = 세포수
-면적 측정
7. 통계 분석
통계 분석에 하기 모집단의 평균값, 표준편차 및 신뢰구간 (a = 0.05)을 계산하였다:
-세포당 AQP9 발현율 (AQP9의 면적/세포 수)
-필드당 세포 수, 세포 증식을 표시
실시예 1 : 말바 실베스트리스 추출물의 활성
하기 표 1은 각 시험 용액으로 처리한 결과를 나타낸다. 이 표는 도 2의 막대그래프로 다시 표시되어 있다.
세포당 발현된 AQP9의 면적으로 표시하기 위해 AQP9 발현을 표준화하였고, 세포 수는 관찰된 샘플에서의 핵수를 계수하여 결정된다.
처리 AQP9 발현/ 세포
평균 (표준편차)		 시험
대조군 NT 7.18 (2.79)
대조군 용매 (DMSO) 11.5 (2.72)
C. 아시아티카 추출물 11 μg/ml 11.0 (4.62) NS
C. 아시아티카 추출물 33 μg/ml 15.1 (4.00) NS
맬로우 추출물 105 μg/ml 27.1 (3.46) S
맬로우 추출물 210 μg/ml 21.0 (4.90) S
맬로우 추출물 105 μg/ml
+ C. 아시아티카 추출물 11 μg/ml		 41.5 (5.44) S
맬로우 추출물 105 μg/ml
+ C. 아시아티카 추출물 33 μg/ml		 37.7 (6.96) S
맬로우 추출물 210　μg/ml
+ C. 아시아티카 추출물 11 μg/ml		 45.7 (8.18) S
맬로우 추출물 210 μg/ml
+ C. 아시아티카 추출물 33 μg/ml		 41.7 (3.86) S
결론
상기 말바 실베스트리스 추출물은 표피세포에서 AQP9의 발현을 유의하게 자극한다. 말바 실베스트리스 및 센텔라 아시아티카의 추출물의 조합물은 AQP9의 발현에 대하여 시너지 효과를 가진다.
실시예 2 : 커먼 맬로우 잎의 추출물을 포함하는 보습액
커먼 맬로우 (말바 실베스트리스) 잎의 추출물은 건조 추출물의 2.1 w/w%를 함유하는 수성액 (Vitactyl Clair®, Silab)이다.
퍼센트는 최종 조성물의 중량에 대한 중량 기준으로 표시된 것이다.
%
말바 실베스트리스 추출물의 수용액 1.0
펜옥시에탄올 0.9
아크릴레이트류/C10 -30 알킬아크릴레이트 가교중합체 (Pemulen TR-1) 0.5
스테아레스-2 (Brij 72 플레이크) 1.2
스테아레스-21 (Brij 721 P) 1.1
이소노닐 이소노나노에이트 7.4
스테아릴 알코올 0.3
95% 세틸 알코올 0.3
디멘티콘 100 CS 0.3
분말 테트라소듐 EDTA 0.2
토코페릴 아세테이트 0.2
수산화 나트륨 < 0.1
향료 < 0.1
정제수 qs 100
이 조성물은 수중유 에멀젼으로 매일 안면 피부에 적용하여 소정의 보습 효과를 얻을 수 있다.
실시예 3 : 커먼 맬로우의 추출물을 함유하는 보습 크림.
맬로우 추출 용액은 실시예 2에서 사용된 것과 동일하다.
센텔라 아시아티카의 추출물은 분말형태로, 센텔라 아시아티카 헤테로시드의 상품명으로 판매된다. 이러한 분말을 물에 최소 3 w/w%로 녹여 실시예의 조성물에 사용된다.
퍼센트는 최종 조성물의 중량에 대한 중량 기준으로 표시된것이다.
%
센텔라 아시아티카의 추출물 0.1
말바 실베스트리스 추출물 1.2 w/w% 수용액 1.0
펜옥시에탄올 0.7
아크릴레이트류/C10 -30 알킬 아크릴레이트 가교중합체 0.3
암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트 /vp 공중합체
(Aristoflex AVC) 0.4
스테아레스-2 1.0
스테아레스-21 0.9
이소노닐 이소노나노에이트 6.2
스테아릴 알코올 0.5
95% 세틸 알코올 0.5
글리세릴 트리카프레이트/카프레이트 2.2
분말 테트라소듐 EDTA 0.2
토코페릴 아세테이트 0.2
향료 0.2
수산화 나트륨 < 0.1
정제수 qs 100
이 조성물은 수중유 에멀젼으로 매일 안면 피부에 적용하여 소정의 보습 효과를 얻을 수 있다.
실시예 4 : 커먼 맬로우 추출물 및 센텔라 아시아티카 추출물의 조합물을 보습제로 포함하는 혈청
맬로우 추출물 및 센텔라 아시아티카 추출물의 용액을 실시예 2에 따라 제조하였다.
%
말바 실베스트리스 추출물 1.2 w/w% 용액 1.0
센텔라 아시아티카 추출물 0.1
식물 글리세롤 5.0
디소듐 EDTA 이수화물 0.1
펜옥시에탄올 0.5
스클레로티엄 검 (Amigel) 1.0
아크릴레이트류/C10-30 알킬 아크릴레이트 가교중합체 0.2
전분 알루미늄 옥테닐석시네이트 (Dry Flo Plus) 2.0
1,3-부틸렌 글리콜 3.0
폴리소르베이트 20 (Tween20) 1.0
토코페릴 아세테이트 0.2
수산화 나트륨 < 0.1
향료 < 0.1
정제수 qs 100
이 조성물은 수용액으로 매일 안면 피부에 적용하여 소정의 보습 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 세포 핵의 검출 및 AQP9발현의 검출을 알게하는 면역표지의 맥락에서 단락 5 이하에서 설명된 방법에 따라 분석된 영상이다.
도 2는 하기 설명된 방법에 따라서 측정된, 세포당 AQP9의 발현율을 나타낸다.

Claims (17)

  1. 피부의 보습 상태를 회복, 유지 또는 강화하는 제제, 피부 건조의 징후의 출현에 대하여 예방 또는 지연 효과를 얻기 위한 제제, 표피의 표층에 함유된 수분의 증발에 대하여 피부 장벽 효과를 향상시키기 위해 건조 피부를 재지방화하는 것을 용이하게 하는 제제로부터 선택된 것으로서, 커먼 맬로우 잎의 추출물과 센텔라 아시아티카 잎의 추출물의 조합으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 미용 제제.
  2. 삭제
  3. 삭제
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  12. 제 1 항에 있어서, 커먼 맬로우 추출물을 0.001 중량% 내지 5 중량% 및 센텔라 아시아티카 추출물을 0.0001 중량% ~ 0.1 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 커먼 맬로우 추출물 및 센텔라 아시아티카 추출물의 건조 추출물 중량비는1/5 내지 50/1 인 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 추출물의 조합물은 단일층 또는 다중층 리포좀에 적어도 부분적으로 캡슐화된 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 글리콜류, 글리세롤 또는 천연 폴리올류, 천연 또는 합성 세라마이드류, 우레아, 히알루론산, 아주가 투르케스타니카 추출물, 반다 코엘룰레아 추출물 또는 레티노 산과 같이, 보습 특성을 가지는 하나 이상의 분자 또는 식물 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 노팔 추출물, 헬리안투스 안누스(Helianthus annuus), 루파 실린드리카 (Luffa cylindrical) 씨앗의 추출물, 베타-에크디손, 칼슘 글루코네이트나 칼슘 피롤리돈카르복실레이트와 같은 칼슘 유도체, 소맥배아 오일, 카스타네아 사티바(Castanea sativa), 산치(Sanchi) 사포닌류 추출물, 아스코빌 글루코시드, 헤스페레틴, D-자일로스 또는 자일로스 유도체, C-β-D-자일로피라노시드-n-프로판-2-온, C-β-D-(3,4,5-트리아세톡시)자일로피라노시드-n-프로판-2-온 또는 C-β-D-자일로피라노시드-2-히드록시-프로판-2-온 및 이의 유도체들과 같은 C-글리코시드로부터 선택된 하나 이상의 미용 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
  17. 삭제
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