KR20120104036A - 모공을 통해 피부를 투과하는 경피 전달용 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 모공을 통해 피부를 투과하는 경피전달용 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 의해 동정된 모공 투과 경피전달용 펩타이드 리간드는 경피 경로를 통한 거대 약물 분자의 체내 전달을 촉진시키는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

모공을 통해 피부를 투과하는 경피 전달용 펩타이드{Transdermal peptides traversing across hair follicles in the skin}
본 발명은 모공을 통해 피부를 투과하는 경피 전달용 펩타이드에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 모공을 통한 경피 전달 메카니즘을 통해 거대 약물 입자의 체내 전달을 촉진할 수 있는 SSHTISF, FPQPPQR, AFTPAKT 및 SPWIPAV 펩타이드에 관한 것이다.
경피 약물 전달 시스템(Transdermal Drug delivery System; TDS)은 국부적용, 간 초회통과 회피, 약물의 지속적 방출, 환자의 편의성 등으로 인해 최근 약물 전달 시스템(Drug Delivery System; DDS) 중 각광받는 전달 방식 중 하나이다[Prausnitz and Langer, 2008]. 최근 큰 분자량의 약물(macromolecular drug)을 효과적으로 전달하기 위한 리포좀(liposome) 또는 나노 파티클(nano-particle), 펩타이드 리간드(peptide ligand) 등의 촉진제(enhancer) 관련 연구가 다수 보고되고 있으며[Lademann et al., 2007, Chen et al., 2006], 여러 연구자들은 이러한 촉진제가 모공, 피지선 등 피부 조직의 주변기관(skin appendages)을 통해 약물을 효과적으로 전달시키는 것으로 보고 있다[Amoh et al., 2007, Toll et al., 2004, Vogt et al., 2006].
파지 디스플레이(phage display) 기법은 다양한 DDS 전략을 위하여 전달 매개체로서의 펩타이드 리간드를 효과적으로 동정하는 방법 중 하나이며, DDS 전략 중 특히 표적 전달(targeting delivery)과 편의적 전달(convenient delivery) 전략에 많이 이용되고 있다[Chen et al., 2006, Kang et al., 2008, Wan et al., 2009].
약물의 경피 전달과 관련하여, 대한민국 등록특허 10-0062547호 ‘단백 및 펩타이드성 약물의 경피투여 조성물’에는 용매와 고분자 전해질이 수용되어 있는 용매저장층과 아미노산의 펩타이드 결합단위와 3개 이상인 단백 및 펩타이드성 약물이 반투과성막으로 분리되어 있으면서, 상기 반투과성막을 통해 나오는 용매와 고분자 전해질 및 가속제로 이루어진 이온화제에 의해 상기 약물을 이온화시키고 이 이온화된 약물은 전기적인 힘에 의해 투여기구 밖으로 방출되도록 하여 피부침에 의해 형성된 통로를 통하여 상기 이온화된 약물이 경피투여되도록 패취형 투여기구를 이용하여 전기적인 힘에 의해 단백 및 펩타이드성 약물을 경피투여하는 것을 특징으로 하는 단백 및 펩타이드성 약물의 경피투여 조성물이 기재되어 있고,
대한민국 특허출원 10-2006-7022824호 ‘인플루엔자 백신의 경피전달 장치 및 방법’에는 면역학적 활성제를 함유하는 생체적합성 코팅이 상부에 배치된 각질층-피어싱용 미세돌출부를 복수개 지닌 미세돌출부재를 포함하는, 면역학적 활성제를 경피 전달하기 위한 시스템이 기재되어 있으며,
대한민국 특허출원 10-2006-7010339호 ‘치료용 펩타이드 및 단백질의 폴리머 컨쥬게이트의 피복된미세돌출부를 통한 전달’에는 생체적합성 코팅이 상부에 배치된 복수의 각질층 피어싱용 미세돌출부를 구비한 미세돌출부재를 포함하고, 상기 생체적합성 코팅은 펩타이드 및 단백질 컨쥬게이트로 이루어진 군으로부터 선택된 생물학적 활성제를 포함하는, 생물학적 활성제를 환자에게 경피 전달하는 장치가 기재되어 있다.
또한, 대한민국 등록특허 10-0461458호 ‘다중층 리포좀 및 그의 제조방법’에는 입자 크기가 200 내지 5000nm이며, 내부에 생리활성 유효성분을 포집할 수 있는 경피흡수용 다중층 리포좀 및 이의 제조방법이 기재되어 있다.
그러나, 선행기술중 어디에도 본 발명에 기재된 바와 같은 모공을 통해 약물을 전달하는 경피전달 펩타이드에 대하여는 전혀 시사 또는 기재된 바가 없다.
최근까지의 경피약물전달 방법은 각질층(stratum corneum)을 통한 전달과 관련된 접근이 대부분을 차지하고 있지만, 이는 전달 가능한 약물이 크기(1 kDa 미만) 또는 높은 소수성(high hydrophobicity) 등의 특징을 충족시켜야만 하는 문제 때문에, 큰 분자량의 약물(protein, oligo-DNA/RNA 등)을 경피 경로로 전달하는 데에는 어려움이 있었다. 최근 투과 촉진제를 이용함으로써 각질층을 제외한 피부 조직 주변기관을 통해 전달 효율을 증진시키려는 연구가 활발히 보고되고 있지만, 촉진제의 크기나 성질, 수동적 투과 등에 따라 사용에 제약이 있는 문제점이 있다.
그러므로, 본 발명은 파지 디스플레이를 통해 피부투과 효율이 높은 펩타이드 리간드를 동정하여 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 효율적인 피부투과 펩타이드 리간드를 in vivo 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 동정하고, 동정된 피부투과 펩타이드 리간드의 효능을 검증하는 것으로 구성되어 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 파지 디스플레이 기법을 이용한 경피투과 재조합 파지 선별의 구체적인 단계는 다음과 같다:
무작위 파지-펩타이드 라이브러리를 래트(rat)에 경피 투여한다. 바람직하게는 Ph.D.-M13 파지-펩타이드 라이브러리를 이용한다.
피부투과한 파지를 수거하기 위해 피부 도말후 일정 시간이 지난 후에 심장 혈액을 채혈한다. 복부 도말하는 경우, 30 ~ 60분후에 심장 혈액에서 가장 많은 양의 파지가 회수된다.
수거된 파지 혼합물을 감염 호스트를 통해 증폭시킨다. 바람직하게는, 감염 호스트로서 대장균(E. coli) ER 2738를 사용한다.
증폭된 파지를 이용하여 반복 라운드(바이오패닝)를 실시한다. 바람직한 바이오패닝 횟수는 3회이다.
최종 라운드에서 회수된 피부투과 파지의 DNA 서열 및 펩타이드 서열을 동정한다. 본 발명에서 동정된 4개 펩타이드는 ST1 펩타이드(SSHTISF: Ser-Ser-His-Thr-Ile-Ser-Phe), ST2 펩타이드(FPQPPQR: Phe-Pro-Gln-Pro-Pro-Gln-Arg), ST3 펩타이드(AFTPAKT: Ala-Phe-Thr-Pro-Ala-Lys- Thr) 및 ST4 펩타이드(SPWIPAV: Ser-Pro-Trp-Ile-Pro-Ala-Val)이다.
상기 펩타이드의 경피 효능은 상기 펩타이드를 함유한 재조합 파지를 피부에 도말하고, 혈액 채취로부터 회수된 경피 파지를 실시간 PCR 정량법을 이용하여서 확인한다. 실시간 PCR 정량법에서 이용가능한 파지 특이적 프라이머는 하기와 같다:
Figure pat00001
또한, 상기 펩타이드의 경피 효능은 대조구 파지의 경피 효능과 비교해서도 확인된다. 바람직하게, 본 발명에서 바람직한 대조구 파지 클론은 Ph.D.-7 파지-펩타이드 라이브러리에서 무작위 선택된 것이고, 그 특이적 프라이머로는 바람직하게 5‘-TCTATTCTCACTCTGCGCCT-3'가 사용된다.
또한, 본 발명에서 파지 투과 경로는 면역형광염색법을 통해 확인된다.
본 발명에 의해 동정된 모공 투과 경피전달 펩타이드 리간드는 경피 경로를 통한 거대 약물 분자의 체내 전달을 촉진시키는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 파지 디스플레이 기법을 이용한 경피투과 재조합 파지의 선별 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2에서 A는 혈액을 통해 수거된 파지-펩타이드 라이브러리 및 야생형 M13의 양을 경시적으로 나타낸 것이고, B는 혈액을 통해 수거된 파지-펩타이드 라이브러리 및 야생형 M13의 양을 바이오패닝 라운드 별로 나타낸 것이다.
도 3은 파지 디스플레이를 통해 선별된 경피전달 펩타이드 ST1, ST2, ST3 및 ST4와 이들의 개별 파지 확인용 프라이머 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 파지의 혼합액 처리 후 실시간 PCR 정량법을 이용한 개별 파지의 경피투과 효율을 검정하는 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 실시간 PCR 정량법에 사용된 개별 파지 프라이머 세트의 특이성 및 감도를 나타낸 그래프이다.
도 6에서 A는 ST1, ST2, ST3 및 ST4 파지 혼합액의 경피투과 효율을 각 파지 별로 나타낸 그래프이고, B는 상기 파지 혼합액의 경피투과 효율을 30분, 60분, 90분 및 120분 기준으로 나타낸 그래프이며, C는 실시간 PCR 정량 및 플락 정량을 통해 계수된 파지 수치를 나타낸 그래프이다.
도 7에서 A는 ST3 파지와 대조군 C2 파지의 경피투과 효율을 비교한 그래프이고, B는 ST3 파지, 대조군 C2 파지 및 야생형 파지의 경피 투과량을 피부 도말 30분, 60분, 120분 및 240분 후에 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, C 내지 F는 면역형광염색법을 이용하여 파지가 모공을 통해 이동하였음을 나타낸 영상이다.
본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 파지 디스플레이를 이용한 경피전달 펩타이드의 스크리닝
래트(스프래그 둘리(Sprague Dawley), 250g, 대한민국 소재의 샘타코(Samtako))을 틸레타민(tiletamine)(25mg/kg, I.p.)와 졸라제팜(zolazepam)(25mg/kg, I.p.)으로 마취 후 복부를 제모한 다음 파지 라이브러리를 도말하여 심장에서 혈액 샘플링을 통해 피부를 투과한 파지를 회수함으로써 경피전달 펩타이드를 표지하고 있는 재조합 파지를 스크리닝 하였다(도 1).
파지 스크리닝에 사용된 파지 라이브러리로는 미국 New England Biolab(NEB) 사의 Ph.D-7 M13 파지 라이브러리를 이용하였으며, 2x1011 pfu/200 ul PBS(pH 7.9)의 라이브러리를 전기제모기에 의해 제모된 복부 피부(2 cm x 2 cm)에 도말하였다.
도말 후 심장을 통해 0, 15, 30, 60분에 500 ul씩의 혈액을 수집하여 동량의 산성 버퍼(0.1M glycine-HCl, pH 2.0) 처리 및 14,000×g에서 2분 원심분리를 통해 혈중 파지를 회수하였고, 회수된 상층액에 2M Tris-base 20 ul를 처리하여 중화한 다음 회수된 샘플을 LB/tetracyclin/IPTG/X-gal 아가 플레이트에 도말하여 혈액 mL 당 파지 수(pfu)를 정량하였다.
우선 최적의 바이오패닝(biopanning)을 위해 피부 투과 파지를 혈액으로부터 회수하기 위한 적정 회수 시간을 조사하였으며, 회수된 파지는 파지 라이브러리의 복부 도말 후 30~60분 사이의 정치 시간 때 가장 많이 회수되었다(도 2A).
이후 30분 및 60분 때 회수된 파지들을 모두 섞어 감염 호스트인 대장균 ER2738(NEB, USA)을 통해 증폭하였고, 증폭된 파지는 각 라운드 별 동량(2x1011 pfu)씩 처리함으로써 총 3차례의 반복 라운드(바이오패닝)를 수행하였다. 최종 3차 스크리닝 라운드에서 회수된 피부투과 파지는 선행 라운드 및 대조구(wild-type M13 파지; New England Biolab, USA)를 이용한 실험에서 회수된 파지보다 약 400배 이상 증가되었음을 확인하였다(도 2B).
회수된 3차 라운드 샘플에서 재조합 파지의 펩타이드 서열들을 확인하기 위하여 무작위로 선발된 개별 파지의 DNA를 추출, 시퀀싱(sequencing)을 통해 DNA 서열을 확인하였다. 시퀀싱 프라이머로는 재조합 파지의 펩타이드 coding region-gIII에서부터 -96번째 존재하는 서열에 대한 5‘-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’ 프라이머(-96gIII reverse primer; Bioneer, Korea)를 이용하였다. 확인된 펩타이드를 coding 하는 DNA 서열은 7개 아미노산 서열로 translation되어 최종적으로 182개의 펩타이드 서열 집단을 동정하였다.
실시예 2: 1차 스크리닝을 통한 4종의 후보 펩타이드 리간드 선별
In vivo 스크리닝 후 확인된 182개 서열에 대해 정렬 프로그램(alignment program)인 Clustal X(Thomson et al., 1997)를 이용하여 아미노산 서열들의 상동성을 확인하였으며, 그 중 동일하게 16번 출현한 ST1 펩타이드(SSHTISF), 9번 출현한 ST2 펩타이드(FPQPPQR)와 ST3 펩타이드(AFTPAKT), 그리고 8번 출현한 ST4 펩타이드(SPWIPAV)를 출현 빈도 우위에 따라 선별하였다(도 3). 아울러 각 후보 펩타이드를 표지하는 재조합 파지를 이용하여 이들의 피부투과 효능을 실시간 PCR 정량법을 통해 효과적으로 비교 평가하기 위한 파지 특이적 프라이머를 설계 및 합성(대한민국 소재의 바이오니어(Bioneer))하였다(도 3). 각 프라이머(forward)들은 각 펩타이드의 DNA 서열을 포함함으로써 그 특이성을 갖으며, 역방향(reverse) 프라이머는 공통적으로 -96gIII 프라이머(도 3)를 이용하여 분석을 진행하였다.
실시예 3: 실시간 PCR 정량법을 통한 재조합 파지의 효능 평가 및 정량방법 간 비교 평가
설계된 파지 특이적 프라이머의 감도와 선택성을 조사하기 위해, 독립적인 증폭 후 준비된 각 네 종류의 파지(1x106 pfu/ul) DNA와 각 5 pmol forward/reverse 프라이머, 1 U Taq 폴리머라아제/PCR 완충제/10mM dNTP (NEB, USA), ddH2O를 섞어 25 ul의 최종 부피로 맞추어 95℃ 5분(1회 사이클)/95℃ 30초-50℃ 30초-72℃ 60초(35회 사이클)/72℃ 7분(1회 사이클)의 온도 조건을 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 분석 후 아가로즈 겔 전기영동을 통해, 결과적으로 하나의 파지에 특이적인 프라이머는 다른 세 후보 파지에 대한 증폭효과가 없음을 확인하였다(도 4A).
다음으로 실시간 PCR(i-cycler; Bio-rad, USA) 분석 시 각 프라이머 세트가 해당 파지를 특이적으로 증폭할 수 있는지를 검정하였다. DNeasy kit(Qiagen, USA)를 이용, 혈액으로부터 파지 DNA를 포함한 total genomic DNA를 추출하였고, 추출한 DNA 샘플 5ul와 Bio-Rad SYBR pre-mixture (Bio-Rad, USA) 10 ul, 그리고 ddH2O를 포함하여 최종 20 ul의 샘플 부피를 맞추어 분석을 실시하였다. 결과적으로 도 4B에서와 같이, 파지의 프라이머 세트는 각각의 파지 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있음을 용융 곡선(melting curve) 분석을 통해 확인하였다. 또한 실시간 PCR에 의한 파지의 정량을 수치화하기 위하여, 파지 수(copy number)와 그에 따른 CT(threshold cycle)값에 대한 상관관계 그래프를 도출하였다(그림 4C). 이는 각각의 파지를 102 ~ 106 copy numbers/5ul 로 준비한 후 위와 같은 조건으로 실시간 PCR을 수행하여 각 희석액에 대한 CT값을 측정함으로써 결과를 얻을 수 있었다. 상관관계 그래프는 네 종류의 파지가 섞여있는 샘플을 이용한 실시간 PCR 정량 분석 시 파지 DNA의 수치화를 위한 기준선(standard curve)으로서 이용되었다.
이후 도 5에서와 같이, 1차 스크리닝을 통해 선별된 재조합 파지 후보들을 동일량씩(1x1011 pfu) 함께 섞어 제모된 래트 복부에 도말 후, 시간별 혈액 채취를 통해 피부를 투과한 파지를 회수하였다. 시간별 파지 회수 및 DNA 추출, 실시간 PCR 분석 방법은 실시예 1과 실시예 3에서 기술한 것과 동일하다. 회수된 파지 각각의 피부투과 효능을 평가하기 위해 실시간 PCR 정량법을 이용하여 투과 효율을 비교하였을 때, 4종의 재조합 파지 중 AFTPAKT 펩타이드 리간드(ST3)를 표지하고 있는 ST3 파지가 피부투과 효율이 가장 높음(*p<0.05)을 확인하였다(도 6A). 혈액 샘플 내 파지 수는 도 6A에서처럼 실시간 PCR을 통한 각 파지의 정량 분석과 함께, 후보 파지와 대조구 파지의 효율 비교를 위해 기존의 플락 정량(plaque titration) 방법을 통해서도 정량화 되었다. 동일 방법으로 대조구 파지 동량(C2 파지; 4x1011 pfu)을 이용하여 수행하였을 때 결과적으로, 혼합된 후보 파지의 피부투과량이 대조구 파지의 투과량보다 각 시간별로 현저하게 떨어짐(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)을 확인하였다(도 6B). 아울러 실시간 PCR 정량법의 정확도를 비교하기 위해 실시간 PCR 정량 및 플락 정량(plaque titration)에 의해 수행된 혈액 ml 당 전체 파지 수치를 비교하였고, 실제로 플락 정량법보다 실시간 PCR 정량법의 경우에서 약 20% 이상의 파지가 계수됨으로써 해당 방법을 통한 정량의 정확성을 비교 및 확인할 수 있었다(도 6C).
실시예 4: ST3 펩타이드에 의한 파지의 경피전달 효과 재검정 및 투과 경로 확인
최종 선발된 ST3 파지는 대조구 C2 파지와 동량(1x1011 pfu)으로 섞어 처리되었을 때도 대조구 파지보다 유의적으로 많은 양(**p<0.01)이 검출되었으며(도 7A), ST3 파지, 대조구 C2 파지, 또는 야생형 M13 파지 각각을 개별적으로 서로 다른 실험동물에 처리하였을 때 역시 ST3 파지의 피부투과 효율이 유의적으로 가장 높음(*p<0.05, ***p<0.001)을 확인하였다(도 7B). 개별 처리를 통한 실험은 각 파지(1x1011 pfu)를 마취 및 제모된 래트 복부에 도말 후, 30분/60분/120분/240분에 혈액으로부터 파지를 회수한 다음 플락 정량을 통해 수치화하였다. 이를 통해 동정된 ST3 펩타이드는 거대분자로써의 자신의 파지 파티클을 4시간까지 지속적으로 경피 투과 시킬 수 있는 능력을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.
아울러, 파지의 투과 경로를 확인하기 위해 면역형광염색법을 수행하였다. ST3 파지와 C2 대조구 파지를 각각 도말한 다음 1시간 이후에 마취된 래트로부터 도말한 부위의 피부 조직을 취하였다. 조직은 4℃ PBS(pH 7.4)를 이용하여 3회 세척된 후 4% 파라포름알데하이드 용액에 담겨져 4℃에서 2 시간 동안 고정(fixation) 작업을 실시하였다. 고정 작업 후에는 차가운 PBS로 3회 세척한 다음 조직을 30% 수크로즈 용액에 넣어 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 조직은 적당한 크기로 절단(chopping)되어 OCT(Optimal cutting temperature) 용액에 담겨 -70℃에서 급속 냉동되었고, 냉동된 조직 덩어리(block)를 동결박편기(Cryotome HM 505E; Microm, Germany)를 이용하여 10 um 두께로 절편하였다. 조직 절편은 30분 동안 10% FBS, 20mM HEPES가 포함된 PBS 용액 내에서 블로킹(blocking)된 다음 마우스 항-M13 g8p 항체(Abcam, UK)로 1시간 처리되었다. 1차 항체 처리 후 5분씩 3회의 PBS 세척과정을 거친 다음 2차 항체로써 alexa-488이 표지된 goat anti-mouse IgG 항체(Molecular Probes, USA)를 1시간 처리하여 파지를 형광 녹색으로 염색 완료하였고, 마지막으로 DAPI 시약을 이용하여 핵을 푸른색으로 염색하였다. 결과적으로, ST3 펩타이드 리간드는 모공(hair follicle)을 통해 자신의 파지를 혈액까지 전달할 수 있다는 것을 시각적으로 확인하였다(ST3 파지; 그림 7C와 7D, 대조구 C2 파지; 그림 7E와 7F).
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Transdermal peptides traversing across hair follicles in the skin <130> 20110311 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transdermal pepride traversing across hair follicles in the skin <400> 1 Ser Ser His Thr Ile Ser Phe 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transdermal pepride traversing across hair follicles in the skin <400> 2 Phe Pro Gln Pro Pro Gln Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transdermal pepride traversing across hair follicles in the skin <400> 3 Ala Phe Thr Pro Ala Lys Thr 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transdermal pepride traversing across hair follicles in the skin <400> 4 Ser Pro Trp Ile Pro Ala Val 1 5

Claims (2)

  1. SSHTISF, FPQPPQR, AFTPAKT 및 SPWIPAV로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 모공 투과 펩타이드.
  2. SSHTISF, FPQPPQR, AFTPAKT 및 SPWIPAV로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 경피전달용 펩타이드.
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