DE10242318A1

DE10242318A1 - Orthopoxvirusantigene und deren Verwendung

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Publication number: DE10242318A1
Application number: DE10242318A
Authority: DE
Inventors: Ingo Dr. Drexler; Volker Dr. Erfle; Caroline Dr. Staib; Gerd Dr. Sutter
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2002-09-12
Filing date: 2002-09-12
Publication date: 2004-03-18
Also published as: EP1398380A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer T-Zellreaktion, die durch Pocken-Vakzinen oder Orthopoxvirusvektor-Vakzinen in einem Säugetier induziert wurden und betrifft immunogene Orthopoxvirus-Antigene und die diese kodierenden Nukleinsäuren. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendung in der protektiven Immunisierung gegen eine Pockeninfektion.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer T-Zellreaktion, die durch Pocken-Vakzinen oder Orthopoxvirusvektor-Vakzinen in einem Säugetier induziert wurden und betrifft immunogene Orthopoxvirus-Antigene und die diese kodierenden Nukleinsäuren. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendung in der protektiven Immunisierung gegen eine Pockeninfektion.
Trotz der weltweiten Ausrottung des natürlich vorkommenden Variolavirus bleiben die Pocken eine potentielle Bedrohung sowohl für zivile als auch militärische Bevölkerungsteile. Es werden neue, sichere Pocken-Vakzinen bzw. Impfstoffe entwickelt und es existiert ein dringender Bedarf nach Verfahren zur Evaluierung der Wirksamkeit einer Vakzine im Anschluss an eine Immunisierung.
Die Anthrax-Attacken in den Vereinigten Staaten haben ein theoretisches Bioterrorismus-Szenarium in eine realistische Bedrohung verwandelt. Das Variolavirus, die Ursache der humanen Pocken erwies sich als eines der infektiösen Mittel, die mit höchster Priorität zur Präventionsforschung und zur therapeutischen Forschung gelistet wurden (1). Es wurde vorausgesagt, dass dessen böswillige Verwendung eine rasche Epidemie in menschlichen Populationen zur Folge hat, weil eine nur geringe Immunität besteht, seit die Vakzinierung mit dem Orthopoxvirus-Verwandten (Vacciniavirus) beendet wurde (2). Das Vacciniavirus gehört zur Art der Orthopoxviren der Familie der Pockenviren.
Bestimmte Stämme der Vacciniaviren wurden viele Jahre lang als Lebendvakzinen zur Immunisierung gegen Pocken verwendet, beispielsweise der Elstree-Stamm des Lister Instituts im Vereinigten Königreich. Wegen der Komplikationen, die sich aus der Vakzinierung ergeben können (Schär, Zeitschr. für Präventivmedizin 18, 41–44 [1973]) und seit der Erklärung durch die WHO aus dem Jahr 1980, dass die Pocken ausgerottet wurden, werden heutzutage nur noch Menschen mit hohem Risiko gegen Pocken geimpft.
Vacciniaviren wurden ebenfalls als Vektoren zur Produktion und zur Lieferung bzw. Transport von Fremdantigenen verwendet (Smith et. al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407 [1984]). Dies bringt DNA-Sequenzen (Gene) mit sich, die für Fremdantigene kodieren, die mit Hilfe von DNA Rekombinationstechniken in das Genom der Vacciniaviren eingebracht wurden. Wenn das Gen an einem Ort in die virale DNA integriert wird, der für den Lebenszyklus des Virus nicht essentiell ist, kann das neu produzierte rekombinante Vaccina-Virus infektiös sein, d.h. es ist zur Infizierung fremder Zellen und somit zum Exprimieren der integrierten DNA-Sequenz in der Lage (EP Patentanmeldungen Nr. 83 286 und Nr. 110 385). Die auf diese Weise hergestellten rekombinanten Vaccina-Viren können einerseits als Lebendvakzine bzw. -impfstoffe zur Prophylaxe von Infektionen und andererseits zur Herstellung von heterologen Proteinen in eukaryontischen Zellen verwendet werden.
Die Wirksamkeit von in vivo produzierten replikationskompetenten Vacciniaviren als virale Lebendvakzinen wurde eindrucksvoll durch die weltweite Ausrottung des natürlich vorkommenden Variolavirus (3) demonstriert. Immer noch sind wegen der nachteiligen Ereignisse, die mit einer Vaccina-Virus-Vakzinierung verbunden sind, sichere Vakzinen der zweiten Generation, die in Gewebskultur gezüchtet werden, ein dringender Bedarf (4). Jedoch wird dieser Bedarf von der wissenschaftlichen Herausforderung begleitet, die Wirksamkeit einer Vakzine in Abwesenheit der natürlich vorkommenden Pockenerkrankung und die Frage der Impfstoffsicherheit in Individuen mit Immunmängeln zu bestimmen, die durch eine HIV-Infektion oder durch eine iatrogene Immunsuppression verursacht sind, (5).
Tatsächlich existiert nur ein sehr eingeschränktes Wissen um die immunologischen Korrelate einer Schutzimpfung, weil die Pocken-Vakzinierung vor mehr als 20 Jahren endete. Der hohe Grad an Sequenzkonservierung zwischen viralen Proteinen, die von Orthopoxvirus-Genomen kodiert werden, korreliert mit der Möglichkeit für Art-weite kreuzreagierende protektive Immunreaktionen. Während Mittel existieren, die induzierten Antikörper durch Virus-Neutralisierung, Hämagglutinationshemmung, Komplementbindung oder ELISA nach Impfung von Menschen zu überwachen wurde die zellvermittelte Immunität kaum überprüft (für einen Überblick siehe (6)). Immer noch legt die Erfahrung mit individuellen menschlichen Impfpatienten und die Arbeit in Tiermodellen die lebenswichtige Rolle der zellvermittelten Immunreaktionen für den Schutz nahe (7, 8). Das Langzeitgedächtnis der zellulären Immunität wird durch virusspezifische zytotoxische T-Zellen (CTL) demonstriert, die sogar noch Jahrzehnte nach der Erstimpfung (9) nachweisbar sind.
Die Immunerkennung durch die meisten T-Lymphozyten tritt durch Oberflächenwechselwirkungen ein, die einen spezifischen T-Zell-Rezeptor (T cell receptor = TCR) auf dem Lymphozyten und ein Antigen auf der Zielzelle einschließen. Anders als Antikörper erkennen TCR keine intakten Antigene. Mit wenigen Ausnahmen erkennen sie nur Antigenbruchstücke in Form von Peptiden, die auf der Zelloberfläche von Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex = MHC) präsentiert werden. Die Fähigkeit von T-Zellen, ein Antigen nur dann zu erkennen, wenn es durch MHC-Moleküle präsentiert wird, wird als „MHC-Restriktion" bezeichnet. Die reagierenden T-Zellen werden als MHC-restringierte Lymphozyten bezeichnet. Es existieren zwei Klassen von MHC-Molekülen, nämlich Klasse I und Klasse II, die funktionell durch die Art des Antigens unterschieden werden, an das sie binden, und durch die Untergruppe der T-Zellen, mit denen sie in Wechselwirkung stehen. Die Dichotomie zwischen Klasse I- und Klasse II-Molekülen betrifft ihre unterschiedlichen Rollen in der T-Zell-Aktivierung. Klasse I-Moleküle präsentieren Peptide an MHC-restringierte CD8 positive zytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Diese Zellen lysieren Zielzellen direkt; es ist deswegen biologisch zutreffend, dass sie Peptide erkennen, die von intrazellulären Antigenen abstammen, die durch Klasse I-Moleküle präsentiert werden. Weil Klasse I-Moleküle von nahezu allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden, sind CTL darüber hinaus in der Lage praktisch alle Zellen zu erkennen und zu zerstören, wenn sie den geeigneten MHC-Peptid-Komplex präsentieren. Andererseits präsentieren Klasse II-Moleküle Peptide an CD4 positive T-Helferzellen, deren primäre Funktion darin besteht, Zytokine zu sezernieren bzw. abzusondern, die die Aktivitäten anderer Lymphozyten, einschließlich von B-Zellen, Makrophagen und CTL fördern. Sie spielen eine dominante Rolle im Aufbau einer Immunreaktion.
Jedoch fehlen umfangreiche Informationen über relevante Orthopoxantigene und Epitop-Spezifitäten von virusspezifischen CTL-Reaktionen.
Es ist deswegen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Orthopoxvirus-Antigene bereit zu stellen, die beim Nachweis von Immunreaktionen gegen Pocken-Vakzinen oder Orthopoxvirus-Vektor-Vakzinen und als Vakzine zur protektiven Immunisierung gegen eine Pockeninfektion verwendet werden können.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.
Hierin wird zum ersten Mal über die Identifizierung von immundominanten humanen Leukozyten-Antigen A*0201-restringierten Epitopen berichtet, die von zytotoxischen CDB+ T-Zellen erkannt und unter den Orthopoxviren, einschließlich den Variola-Viren, stark konserviert sind. Dies hat eine Analyse von epitopspezifischen T-Zell-Reaktionen im Anschluss an eine Vakzinierung von transgenen Mäusen ermöglicht und erlaubte eine Korrelation der Immunogenität mehrerer Vacciniaviren, einschließlich der stark attenuierten, replikationsdefizienten modifizierten Vacciniaviren Ankara (Modified Vaccinia Virus Ankara = MVA) mit einer Schutzwirkung gegen eine lethale respiratorische Pockenvirus-Bedrohung. Die Daten stellen eine neue Basis bereit, um die Wirksamkeit einer sicheren zweiten Generation von Pockenvirus-Vakzinen rational zu beurteilen und legen nahe, dass derartige Vakzine bereits vorliegen könnten.
Gemäß eines ersten Grundgedankens stellt die vorliegende Erfindung ein immunogenes Orthopoxvirus-Antigen bereit, das zumindest eines der Peptide der SEQ ID NO: 1-50 oder Varianten hiervon umfasst, wobei die Varianten eine oder mehrere Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen im Vergleich zum jeweiligen Peptid von SEQ ID NO: 1-50 umfassen, wobei die immunogene Aktivität dieser Variante der Aktivität des nicht modifizierten Peptids nach SEQ ID NO: 1-50 im Wesentlichen gleich ist. SEQ ID NO: 18 repräsentiert ein besonders bevorzugtes Antigen, von dem sich herausgestellt hat, dass es in Säugetieren eine ausgezeichnete immunogene Aktivität bzw. Wirksamkeit aufweist. Das Peptid von SEQ ID NO: 18 wird im folgenden auch als „VP35#1" bezeichnet. In zwei unterschiedlichen Experimenten induzierte VP35#1 T-Zell-Reaktionen, die 37 und 68 mal höher als diejenigen eines Kontroll-Peptids waren (hTyr). Weitere bevorzugte Peptide der vorliegenden Erfindung, die außerordentliche Immunreaktionen induziert haben, sind die nach SEQ ID NO: 7, 10, 11, 13, 15, 23, 24, 28 und 36.
Der Begriff immunogene Aktivität wie hierin verwendet betrifft die immunogene Funktion der erfindungsgemäßen Peptidsequenzen Immunreaktionen hervorzurufen, insbesondere Immunreaktionen, die von zytotoxischen CDB+ T-Zellen vermittelt werden.
Die Peptid-Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen auch alle Sequenzen, die sich von den hierin offenbarten Sequenzen durch Aminosäure-Additionen, -Insertionen, -Deletionen und -Substitutionen unterscheiden.
Vorzugsweise sind derartige Aminosäure-Substitutionen das Ergebnis der Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, d.h. konservative Aminosäuresubstitutionen. Aminosäuresubstitutionen können auf Grundlage der Ähnlichkeit der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie, und/oder der amphipathischen (amphiphilen) Natur der involvierten Reste vorgenommen werden. Beispiele für unpolare (hydrophobe) Aminosäuren sind Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein
„Insertionen" oder „Deletionen" liegen typischerweise im Bereich von ungefähr 1, 2 oder 3 Aminosäuren. Die mögliche Variation kann experimentell bestimmt werden, indem systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken hergestellt werden und indem die sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ih rer Aktivität untersucht werden. Hierfür sind für den Fachmann nicht mehr als Routineexperimente erforderlich. Die Begriffe Insertionen oder Deletionen wie hierin verwendet umfassen Insertionen oder Deletionen, die im entsprechenden Peptid der Erfindung benachbart auftreten oder die alternativ durch ein oder mehrere der Aminosäuren des nicht modifizierten Peptids der Erfindung getrennt auftreten. Beispielsweise können in einem Peptid der Erfindung, das 10 Aminosäuren umfasst, die Aminosäuren in den Positionen 3, 4 und 5 oder in den Positionen 2, 4 und 7 deletiert werden. Demgemäß können auch Insertionen an den angezeigten oder anderen Positionen durchgeführt werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere Epitope enthalten oder können einen Teil eines Epitopes bilden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise zumindest 8-10, besonders bevorzugt zumindest 9 Aminosäuren.
Aminosäure-Additionen bestehen typischerweise aus nicht mehr als 100, vorzugsweise nicht mehr als 80, besonders bevorzugt nicht mehr als 50 und am meisten bevorzugt nicht mehr als 20 Aminosäuren, die den Peptiden der vorliegenden Erfindung jeweils an ihrem N- und C-Terminus hinzugefügt werden. Es sei erwähnt, dass nur solche Additionen in dieser Erfindung betrachtet werden, die die immunogene Aktivität der Peptide der vorliegenden Erfindung, d.h. insbesondere die HLA-A*0201 restringierte zelluläre Immunogenität der hierin offenbarten Peptide nicht negativ beeinflussen.
Es wird grundsätzlich in dieser Anmeldung bevorzugt, dass die Varianten der erfindungsgemäßen Aminosäuren zumindest 50%, besonders bevorzugt 70%, am meisten bevorzugt 80% Sequenzidentität zu den Peptiden von SEQ ID NO: 1-50 zeigen.
Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung auch erfindungsgemäße Peptide wie oben erläutert, die glykosyliert sind, beispielsweise O-glykosyliert. Diese Glykosylierung kann beispielsweise an einem oder mehreren der in der Sequenz enthaltenen Treonine oder Serine auftreten. Glykosylierte Peptide gemäß dieser Erfindung können die Immunreaktion weiter fördern, und dadurch zu einem verbesserten Immunschutz gegen Pocken-Infektionen führen.
Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für ein oder mehrere der oben beschriebenen Peptide kodiert, ebenso wie eine isolierte Nukleinsäure, die ein Transkriptionsprodukt einer der obigen Nukleinsäuren ist oder die an die obigen Nukleinsäuren unter moderat stringenten Bedingungen hybridisiert. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin immunogene Antigene bereit, die von diesen Nukleinsäuren kodiert sind. Der Begriff „Nukleinsäuresequenz" betrifft ein Heteropolymer aus Nukleotiden oder die Sequenz dieser Nukleotide. Die Begriffe „Nukleinsäure" und „Polynukleotid" werden hierin austauschbar verwendet und bezeichnen ein Heteropolymer von Nukleotiden.
Die Stringenz der Hybridisierung, wie hierin verwendet, betrifft Bedingungen, unter denen Polynukleotid-Doppelstränge stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist die Stabilität eines Doppelstranges eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Die Stringenzniveaus, die zur Hybridisierung verwendet werden, können vom Fachmann leicht abgewandelt werden.
Der Begriff schwach stringente Hybridisierung bezeichnet Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denharts Lösung, 6 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C, gefolgt von Waschen in 1 × SSPE, 0,2% SDS bei 50°C äquivalent sind. Denhart´s Lösung und SSPE sind dem Fachmann genauso wie andere geeignete Hybridisierungspuffer wohl bekannt.
Eine moderat stringente Hybridisierung bedeutet Bedingungen, die es der DNA erlauben, an eine komplementäre Nukleinsäure zu binden, die ungefähr 60% Identität, vorzugsweise ungefähr 75% Identität, besonders bevorzugt ungefähr 85% Identität zu dieser DNA aufweist; wobei eine Identität von mehr als ungefähr 90% zu dieser DNA besonders bevorzugt wird. Moderat stringente Bedingungen sind vorzugsweise Bedingungen, die eine Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denharts Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C äquivalent sind.
Hochstringente Hybridisierung bedeutet Bedingungen, die die Hybridisierung nur von solchen Nukleinsäuresequenzen ermöglichen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabile Doppelstränge bilden (d.h., wenn ein Doppelstrang in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, ist er unter den hierin betrachteten hochstringenten Bedingungen nicht stabil).
Weiterhin können Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu identifizieren und zu gewinnen, die im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt. Kurz gesagt kann jede Nukleinsäure mit einer gewissen Homologie zu einer in dieser Erfindung dargelegten Sequenz oder einem Fragment hiervon, als Sonde zur Identifizierung einer ähnlichen Nukleinsäure durch Hybridisierung unter moderat stringenten bis hochstringenten Bedingungen verwendet werden. Solche ähnlichen Nukleinsäuren können dann isoliert, sequenziert und analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie im Umfang der wie hierin beschriebenen Erfindung liegen.
Im allgemeinen umfasst der Begriff „Nukleinsäure", wie hierin verwendet, sowohl RNA als auch DNA, einschließlich cDNA, genomischer DNA und synthetischer (beispielsweise chemisch synthetisierter) DNA. Die Nukleinsäure kann doppelsträngig oder einsträngig sein. Wenn sie einsträngig ist, kann die Nukleinsäure als Sense-Strang oder Antisense-Strang vorliegen. Zusätzlich kann die Nukleinsäure ringförmig oder linear sein.
Der Begriff „isoliert" wie hierin in Bezug auf Nukleinsäuren verwendet betrifft eine natürlich vorkommende Nukleinsäure, die mit den beiden Sequenzen, mit denen sie (eine am 5`Ende und eine am 3`Ende) im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem sie gewonnen wird, unmittelbar benachbart ist, nicht unmittelbar benachbart ist.
Beispielsweise kann eine isolierte Nukleinsäure ohne Einschränkung ein rekombinantes DNA-Molekül irgendeiner Länge sein, vorausgesetzt, dass die Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise dieses rekombinante DNA-Molekül in einem natürlich vorkommenden Genom unmittelbar flankieren entfernt sind oder fehlen. Somit schließt eine isolierte Nukleinsäure ohne Einschränkung eine rekombinante DNA ein, die als getrenntes Molekül existiert (beispielsweise eine cDNA oder ein genomisches DNA-Fragment erzeugt durch PCR oder Behandlung mit einer Restriktionsendonuklease) unabhängig von anderen Sequenzen, ebenso wie rekombinante DNA, die in einen Vektor, ein sich autonom replizierendes Plasmid, ein Virus (beispielsweise ein Retrovirus, Adenovirus oder Herpesvirus) oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten eingebaut ist. Zusätzlich kann eine isolierte Nukleinsäure ein rekombinantes DNA-Molekül einschließen, das Teil eines Hybrids oder einer Fusions-Nukleinsäuresequenz ist.
Der Begriff „isoliert" schließt ebenfalls jede nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäure ein, weil nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäuresequenzen in der Natur nicht zu finden sind und in einem natürlich-vorkommenden Genom keine unmittelbar benachbarten Sequenzen aufweisen. Beispielsweise wird eine nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäure wie beispielsweise eine gentechnisch erzeugte Nukleinsäure als eine isolierte Nukleinsäure angesehen. Eine gentechnisch erzeugte Nukleinsäure kann unter Verwendung herkömmlicher molekularer Klonierungstechniken oder chemischer Nukleinsäuresynthesetechniken hergestellt werden. Isolierte nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäuren können von anderen Sequenzen unabhängig sein oder in einen Vektor, ein sich autonom replizierendes Plasmid, einen Virus (beispielsweise einen Retrovirus, Adenovirus oder Herpesvirus) oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten eingebaut sein. Zusätzlich kann eine nicht-natürlich vorkommende Nukleinsäure ein Nukleinsäuremolekül einschließen, das Teil eines Hybrids oder einer Fusionsnukleinsäuresequenz ist.
Gemäß eines weiteren Aspektes stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der eine oder mehrere der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in einem Expressionsvektor bereitgestellt. Dieser Expressionsvektor umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Regulationssequenzen. Der Begriff "Expressionsvektor" betrifft im Allgemeinen ein Plasmid oder einen Phagen oder ein Virus oder einen Vektor zum Exprimieren eines Polypeptids aus einer DNA (RNA) Sequenz. Ein Expressionsvektor kann eine Transkriptions-einheit umfassen, die eine Anordnung des Folgen den aufweist: (1) ein genetisches Element oder Elemente mit einer regulatorischen Rolle in der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancer, (2) eine Struktursequenz oder kodierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Protein translatiert wird und (3) geeignete Transkriptionsstart- und -terminationssequenzen. Struktureinheiten, die zur Verwendung in Hefen oder eukaryontischen Expressionssystemen vorgesehen sind, schließen vorzugsweise eine Leadersequenz ein, die die extrazelluläre Sekretion eines translatierten Proteins durch einen Wirt ermöglicht. Es kann alternativ, wenn ein rekombinantes Protein ohne eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methionin-Rest einschließen. Dieser Rest kann oder kann nicht anschließend von dem exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um das Endprodukt bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Wirte, beispielsweise Wirtszellen bereit, die so transformiert wurden, dass sie die erfindungsgemäßen Polynukleotide enthalten. Der Begriff „Transformation" bzw. „Transformierung" bedeutet die Einführung von DNA in eine geeignet Wirtszelle, so dass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch Chromosomenintegration.
Beispielsweise können solche Wirtszellen Nukleinsäuren der Erfindung, eingeführt in die Wirtszelle unter Verwendung bekannter Transformationsverfahren, enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Wirtszellen bereit, die gentechnisch verändert wurden, so dass sie die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung exprimieren, wobei sich solche Polynukleotide in funktioneller Verbindung mit einer Regulationssequenz befinden, die für die Wirtszelle heterolog ist, und die die Expression der Polynukleotide in der Zelle steuert.
Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Wirtszelle, wie beispielsweise eine Pflanzenzelle, eine Säugetierzelle oder eine niedere eukaryontische Wirtszelle, wie beispielsweise eine Hefezelle sein oder kann eine Insektenzelle sein, oder die Wirtszelle kann eine eukaryontische Zelle sein, beispielsweise eine bakterielle Zelle sein. Die Einführung des rekombinanten Konstruktes in die Wirtszelle kann durch Kalziumphosphattransfektion, die DEAE, Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation bewirkt werden (Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).
Die am meisten bevorzugten Zellen sind solche, die das spezielle Polypeptid oder Protein normalerweise nicht exprimieren oder die das Polypeptid oder Protein auf einem niedrigen natürlichen Niveau bzw. Konzentration exprimieren. Reife Proteine können in Säugetierzellen, Hefen, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle geeigneter Promotoren exprimiert werden. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten und die entsprechenden Verfahren sind bei Sambrook et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, New York (1989) beschrieben.
Die Säugetierzelle ist bevorzugt eine CHO, COS, HeLa, 293T, HEH oder BHK-Zelle.
Bakterielle Zellen umfassen Streptokokken, Staphylokokken, E. coli, Streptomyces und Bacillus subtilis -Zellen. E. coli und Bacillus subtilis werden bevorzugt. Ebenfalls können Pilzzellen verwendet werden, wie beispielsweise Hefezellen (von Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia) und Aspergilluszellen. Als Insektenzellen werden Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 Zellen bevorzugt. Als Pflanzenzellen können Zellen von N. tabacum oder Arabidopsis thaliana verwendet werden.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung werden Antigen präsentierende Zellen bereitgestellt, die mit einem oder mehreren der Peptide der vorliegenden Erfindung gepulst worden sind. Vorzugsweise sind diese Antigen präsentierenden Zellen dendritische Zellen oder B Zellen.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung bereit, die ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide oder der vorher erwähnten Antigen präsentierenden Zellen umfasst. Bezüglich Erklärungen, wie solche Peptide und Antigen präsentierenden Zellen (APC's) in einem diagnostischen Verfahren zu verwenden sind, siehe unten.
Zusätzlich wird ein diagnostischer Kit zum Nachweis einer Immunreaktion gegen Pocken-Vakzinen oder Orthopoxvirus-Vektor-Vakzinen bereitgestellt, der zumindest ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptide und/oder der erfindungsgemäßen APC's umfasst.
Gemäß eines weiteren Aspektes wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Peptide der Erfindung oder eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Eine solche Zusammensetzung kann weiterhin (zusätzlich zum Inhaltsstoff und dem Träger) Verdünnungsmittel, Füllmittel, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Lösungsvermittler und andere Materialien enthalten, die in der Technik wohl bekannt sind. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein untoxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Inhaltsstoff (der aktiven Inhaltsstoffe) nicht stört. Die Eigenschaften des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab. Die therapeutische Zusammensetzung kann weiterhin weitere Mittel bzw. Wirkstoffe enthalten, die die Aktivität bzw. Wirksamkeit oder Anwendung bei Behandlung verbessern bzw. erleichtern. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Mittel können in der therapeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um eine synergistische Wirkung zu erzeugen oder um Nebenwirkungen zu minimieren.
Techniken zur Formulierung bzw. Zubereitung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Ausgabe, zu finden.
Die Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Dosis des jeweiligen Inhaltsstoffes. Eine therapeutisch wirksame Dosis betrifft diejenige Menge der Verbindung die ausreicht, um Symptome zu lindern, beispielsweise eine Behandlung, Heilung, Vorbeugung oder Linderung solcher Bedingungen bzw. Zustände, speziell bei der Induktion einer Immunreaktion im behandelten Patienten. Geeignete Verabreichungswege können beispielsweise eine parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer und subkutaner Injektionen ebenso wie intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale Injektionen einschließen. Die intravenöse Verabreichung an den Patienten wird bevorzugt.
Eine typische Zusammensetzung zur intravenösen Infusion kann bis zu 250 ml sterile Ringer'sche Lösung und 10 mg Inhaltsstoff enthalten. Siehe Remingtons Pharmaceutical Science (15. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PS. 1980). Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Vakzine.
Wie oben erwähnt findet diese Vakzine Anwendung zur Verwendung in der protektive Immunisierung gegen eine Pockeninfektion.
Gemäß eines weiteren Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung ein ex vivo Verfahren zum Nachweis einer T-Zell-Reaktion, die durch Pocken-Vakzinen oder Orthopoxvirus-Vektor-Vakzinen induziert wurde, das die nachfolgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen einer Probe, die T-Zellen von einem Subjekt enthält, wobei das Subjekt mit einer Pocken-Vakzine oder einer Orthopoxvirus-Vektor-Vakzine immunisiert wurde,
b) Co-Kultivieren der Probe mit einem oder mehreren Peptiden der vorliegenden Erfindung oder einer wie hierin offenbarten diagnostischen Zusammensetzung unter Bedingungen, die eine Aktivierung der T-Zellen erlauben, und
c) Bestimmen der Aktivität der T-Zellen, die in der Probe enthalten sind, die gegen irgendeine in b) angezeigte Aminosäure spezifisch ist.

Wie hierin verwendet sind Pockenvakzinen Vakzinen auf Grundlage von Orthopoxvirus-Antigenen, die zur Vakzinierung von menschlichen Personen geeignet sind, und diese sind vorzugsweise Orthopoxvirus-Lebendvakzinen, vorzugsweise auf Basis des Vacciniavirus. Vacciniaviren, die zur Verwendung als Pockenvakzine geeignet sind, schließen bekannte Vacciniavirus-Impfstämme, beispielsweise die New York City Board of Health-, Elstree- oder Lister- oder Kopenhagen-Stämme und attenuierte Vacciniaviren, einschließlich des Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA), NYVAC, LC16m8, defekter Viren, die Deletionen essentieller Gensequenzen beinhalten (beispielsweise D4R) oder Viren mit einer modulierten Virulenz oder Immunogenität ein, die auf das Vorliegen spezifischer Mutationen und/oder Deletionen in nicht essentiellen Gensequenzen zurückzuführen ist (beispielsweise Thymidinkinasegen, VGF-Gen oder E3L-Gensequenzen) oder die rekombinante Gensequenzen (beispielsweise IL-2 oder IL-15-Gensequenzen) tragen.
Orthopoxvirus-Vektor-Vakzinen basieren auf rekombinanten Orthopoxviren, die heterologe Gensequenzen von Pathogenen exprimieren und die Fähigkeit aufweisen, pathogene Antigene zu transportieren, um Immunreaktionen zu induzieren oder zu stimulieren. Rekombinante Orthopoxviren sind vorzugsweise rekombinante Vacciniaviren, einschließlich attenuierter Viren einschließlich dem modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA), NYVAC, LC16m8, defekter Viren, die Deletionen essentieller Gensequenzen beinhalten (beispielsweise D4R) oder Viren mit einer modulierten Virulenz oder Immunogenität, die auf das Vorhandensein spezifischer Mutationen und/oder Deletionen in nicht essentiellen Gensequenzen zurückzuführen ist (beispielsweise das Thymidinkinasegen, VGF-Gen oder E3L-Gensequenzen) oder die rekombinante Gensequenzen (beispielsweise I1-2 oder IL-15-Gensequenzen) tragen. Bevorzugte Pathogene schließen Viren (beispielsweise HIV-I, HCV), Bakterien (beispielsweise Mycobakterium tuberculosis), Parasiten (Plasmodium falciparum) und Tumore (beispielsweise Melanom) ein.
Der Begriff Aktivierung wie hierin verwendet ist als Stimulierung von T-Zellen definiert. Der Cokultivierungsschritt, der in b) durchgeführt wird ist notwendig, um T-Zellen zu aktivieren, die in der Probe enthalten sind. Dies kann entweder durch direkte Aufbringung der Aminosäuren der vorliegenden Erfindung auf die Probe, bevorzugt die Blutprobe, die vom Patienten gewonnen wurde, durchgeführt werden. Somit können mononukleäre Periphärblutzellen (peripheral blood mononuclear cells = PBMC), die die T-Zellen enthalten und die einfach aus Patientenblutproben hergestellt werden können, APC's (beispielsweise B-Zellen) bereitstellen, die durch die erfindungsgemäßen Peptide gepulst werden.
Alternativ können die gepulsten APC's getrennt hergestellt werden, bevor sie in Schritt b) angewendet werden, und zwar einfach indem APC's, vorzugsweise autologe APC's, mit den erfindungsgemäßen Peptiden gemäß in der Technik bekannter Verfahren gepulst und dann die Probe mit den APC's cokultiviert wird. Diese APC's sind vorzugsweise so ausgewählt, dass sie das geeignete MHC Klasse I-Molekül exprimieren.
Die T-Zellen, deren Aktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt werden kann, sind vorzugsweise zytotoxische T-Zellen, besonders bevorzugt CD8+ T-Zellen.
Die Aktivität der T-Zellen im obigen Schritt c) kann durch Verfahren bestimmt werden, die per se in der Technik bekannt sind. Weitere Informationen sind beispielsweise in Immunology, 5. Ausgabe, 2001, zu finden.
Gemäß einer Ausführungsform kann diese Bestimmung mittels eines ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assays durchgeführt werden. Insbesondere kann die T-Zellfunktion durch ein ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay unter Verwendung eines T-Zell-Bioassays bestimmt werden, der auf dem Abtöten einer Zielzelle durch eine zytotoxische T-Zelle basiert. Dieser Assay basiert auf der Aufnahme von radioaktiv markiertem Natriumchromat, Na₂ ⁵¹CrO₄, durch lebende Zellen, die dieses Natriumchromat nicht wieder spontan freisetzen. Wenn diese markierten Zellen getötet werden, wird das radioaktive Chromat freigesetzt und seine Gegenwart im Überstand der Gemische aus Zielzellen und zytotoxischen T-Zellen kann gemessen werden. Ein Beispiel von Zielzellen sind T2-Zellen, die mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Aminosäuren gepulst wurden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bestimmung in Schritt c) durch Messen der Menge der Zytokine in den T-Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck können die nachfolgenden Verfahren verwendet werden:
Zunächst können die Zytokine durch intrazelluläres Zytokin-Staining bzw. -Färben gemessen werden.
Der Ansatz des intrazellulären Zytokin-Färbens beruht auf der Verwendung von Stoffwechselgiften, die den Proteinexport aus der Zelle hemmen. Dann akkumuliert das Zytokin innerhalb des endoplasmatischen Retikulums und des vesikulären Netzwerks der Zelle. Wenn die Zellen anschließend fixiert und durch Verwendung milder Tenside permeabel gemacht werden, können Antikörper Zugang zu diesen intrazellulären Kompartimenten erlangen und sind dazu in der Lage, das Zytokin nachzuweisen.
Alternativ werden die Zytokine extrazellulär durch einen ELISPOT-Assay gemessen. Der ELISPOT-Assay ist eine Modifikation eines ELISA-Antigen-Einfang-Assays. Er stellt einen exzellenten Ansatz zur Messung der Häufigkeit von T-Zell-Reaktionen dar. Populationen von T-Zellen werden mit dem interessierenden Antigen stimuliert und man lässt sie dann sich auf Kunststoffplatten absetzen, die mit Antikörpern beschichtet sind und die gegen das zu untersuchende Zytokin gerichtet sind. Alle von der T-Zelle sezernierten Zytokine werden durch den Antikörper auf dieser Kunststoffplatte eingefangen. Nach einer definierten Zeitspanne werden die Zellen entfernt und ein zweiter Antikörper für das Zytokin wird der Platte zugesetzt, so dass sich ein Kreis von gebundenem Zytokin zeigt, der die Position jeder aktivierten T-Zelle umgibt, wobei jeder Fleck gezählt wird und die Kenntnis der Anzahl der T-Zellen, die der Platte ursprünglich zugesetzt wurden, eine einfache Berechnung der Häufigkeit von T-Zellen ermöglicht, die das spezielle Zytokin sezernieren.
Die Probe, die die zu untersuchende T-Zelle enthält ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit, besonders bevorzugt eine Blutprobe eines Säugetiers, vorzugsweise eines Menschen. Somit kann die Probe in einfacher Weise von einem Patienten gewonnen werden und somit kann der Grad eines Immunschutzes gegen eine Pockeninfektion folgend einer Vakzinierung in einfacher Weise bestimmt werden.
Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt werden: mononukleäre Periphärblutzellen (PBMC), die die T-Zellen enthalten, können in einfacher Weise aus Patientenblutproben hergestellt werden. Die Virusantigen-spezifischen T-Zellen innerhalb der PBMC-Zubereitung können (i) direkt ex vivo oder (ii) weiter in in vitro Kulturen für weiteres, beispielsweise funktionelles, Testen, vermehrt werden. Das Letztere schließt typischerweise die Messung der Massenzytoxizität ein, die von CD8+-T-Zellen vermittelt wird, die in vitro stimuliert und in Co-Kulturexperimenten unter Verwendung (beispielsweise Peptid-spezifischer) Antigene und autologer Antigen präsentierender Zellen (APC) für mehrere Tage/Wochen vermehrt wurden. Für eine ex vivo Analyse werden die Antigen-spezifischen T-Zellen einer PBMC-Zubereitung typischerweise mit Peptiden und/oder APC für mehrere Stunden bevor sie getestet werden Kurzzeit-stimuliert, beispielsweise unter Verwendung eines ELISPOT, um einen IFN-γ Spot bildende Zellen zu messen, oder unter Anwendung eines MHC Klasse I-Peptid- Tetramer-Assays oder intrazellulärer Zytokin-Nachweis-Assays (beispielsweise IFN-γ), um Antigen-spezifische T-Zellen durch Durchflußzytrometrie zu quantifizieren und zu charakterisieren.
Soweit nichts anderes angegeben ist, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe die hierin verwendet werden die Bedeutung auf, die ihnen üblicherweise vom Fachmann auf dem Gebiet zugeordnet werden. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen, die hierin erwähnt wurden sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes entscheidet die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen. Zusätzlich sind die Materialien und Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und sollen nicht als einschränkend aufgefasst werden.
Die Erfindung wird nunmehr durch Beispiele und die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, die Folgendes darstellen:
1 HLA-A*0201-restringierte Peptid-Epitope, die von Vacciniavirus-kodierten Proteinen abstammen. (a) Peptid-spezifische HLA-A*0201-restringierte IFNγ-Sekretion von Milzzellen, die von Vacciniavirus-immunisierten HHD-Mäusen gewonnen wurden. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit 10⁸ IU MVA vakziniert. Zehn Tage nach der Infektion wurde die Milz gewonnen, die Milzzellen gepoolt und Fraktionen mit den oben angezeigten A*0201-bindenden Peptiden inkubiert. Die Milzzellen wurden auf das Vorhandensein von Peptid-spezifischen CD8+-Zellen untersucht. Die Größenordnung der jeweiligen T-Zell-Reaktion ist als Prozentsatz von Zytokin sezernierenden CD8+-Zellen innerhalb der lebenden CD8+ T-Zell-Population (Prozent CD8+) dargestellt. Die Peptid-spezifischen Reaktionen, die mehr als doppelt so hoch wie die Hintergrundreaktion gegen ein irrelevantes HLA-A*0201-bindendes Peptid (huTyr 369) waren und die als Negativkontrolle verwendet wurden, wurden als positiv berechnet und sind in fett gedruckten Buchstaben geschrieben. Die durch ein Sternchen markierten Zahlen betreffen Ergebnisse aus zwei unabhängigen Experimenten. Die D8L-Peptide entsprechen SEQ ID NO: 1-7, die A10L-Peptide den Sequenz ID NO: 8-17 etc. (b) Alignment der VP35#1-Peptidsquenzen, die von Pockenvirusgen-Produkten gewonnen wurden, die dem Vacciniavirus H3L-Gen kodierten Protein homolog sind.
Vacciniavires-Stämme Modified vaccinia virus Ankara (VV-MVA; AAB 96447), Kopenhagen (W-Cop; AAA48090), Western Reserve (W-WR; AAB59838) und Tian Tan (VV-Tan; AAF33961); der Affenpockenvirus-Stamm Zaire-96-I-16 (MPXV-ZRE; AAL40551); das Kamel-Pocken-Virus-Isolat M-96 (CPXV-K/M96; NP 570489); der Ectromelia-Virus (EV; www.sanger.ac.uk); die Variola maior Virusstämme Bangladesh-1975 (VAR-BSH; AAA60834) und Indian-1967 (VAR-IND; CAA49027); der Variola minor Virusstamm Garcia-1966 (VMN-GAR; CAB54686); der Yaba-like disease Virus (YAB-YLD; CAC21312); Molluscum contagiosum-Virus Subtyp 1 (MC1; AAC55212); das Geflügelpocken-Virus (FPV-FCV; AAF44484); Orf-Virus-Stämme NZ2 (Orf-NZ2; AF097215); OV/20 (ORF-OV/20; AY040085) und OV/7 (Orf-OV/7; AY040084); Myxoma-Virus Stamm Lausanne (MYX-LAU; AAF 14959); das Lumpy skin disease-Virus-Isolat Neethling 2490 (LSD-NEE; AAK85035); das Schweinepocken-Virus-Isolat 17077-99 (SPV-KAS; AF410153).
2: HLA-A*0201-restringierte zelluläre Immunogenität verschiedener Pocken-Vakzinen. (a und b) Peptid-spezifische intrazelluläre Zytokin-Freisetzung von Milzzellen, die aus vakzinierten HHD-Mäusen gewonnen wurden. Die Mäuse wurden i.p. (a) mit 2,5 × 10⁵ PFU (= plaque forming unit = Plaque bildenden Einheiten) von replikationskompetenten Vacciniaviren CVA oder Wyeth oder mit 10⁸ IU replikationsdefizienten Vacciniaviren MVA immunisiert; #1 und #2 betreffen individuelle Mäuse die untersucht wurden; i.m. (b) mit verschiedenen Virus-Dosen: 2,5 × 10⁵ PFU CVA oder Wyeth, oder 10⁸ IU, 10⁶ IU, 10⁵ IU und 10⁴ IU für MVA. Durchflusszytometrische Analysen wurden mit Zellen durchgeführt, die mit EMA, PE-anti-CD8, APC-anti-CD62L und FITC-anti-IFNγ oder anti-TNFα oder der jeweiligen FITC-markierten Isotypen-Kontrolle gefärbt wurden. Milzzell-Zubereitungen wurden bezüglich des Vorhandenseins von VP35#1 Peptid-spezifischen, aktivierten (CD62L) CD8+-Zellen untersucht. Die Größenordnung der induzierten 7-Zell-Reaktion ist als Prozentsatz der Zytokin-sezernierenden CD8+-Zellen dargestellt, innerhalb der lebenden (EMA-) und der CD8-Zellpopulation. (c) spezifische Lyse von Peptid-gepulsten menschlichen Zielzellen durch VP35#1 Peptid-spezifsche CTL, die aus vakzinierten HHD-Mäusen gewonnen wurden. Effektor-CTLs wurden durch einfache i.p. Immunisierung von Tg-Mäusen entweder mit
erzeugt. Die CTLs wurden bezüglich ihrer Toxizität im angegebenen E:T-Verhältnis in einem 4 Stunden ⁵¹CR Freisetzungs- Assay gegen T2-Targets untersucht, die entweder mit dem VP35#1-Peptid oder dem Influenza M1 58-66-Peptid zu 1 μM gepulst wurden.
3 Analyse der Virus-Virulenz und Vakzin-induzierter Schutz in einem Mausmodell für eine respiratorische Pockenvirusinfektion. (a und b) Charakterisierung von Infektionen mit MVA, CVA und WR. Mäuse (n = 8-10) wurden auf intranasalem Weg mit
beimpft. Körpergewicht (a) und Körpertemperatur (b) wurden täglich überwacht und sind als Durchschnitt für jede Gruppe ausgedrückt. (c – f) Schutzwirkung der Vakzinierung. Mäuse (n = 10) wurden intramuskulär mit

Wyeth (e und f) immunisiert. Drei Wochen nach der Vakzinierung wurden die Tiere intranasal mit 1 × 10⁶ PFU WR beimpft. Individuelle Tiergewichte (c und e) und Anzeichen einer Erkrankung (d und f) wurden täglich überwacht und sind als Mittelwert für jede Gruppe ausgedrückt. Pseudo-vakzinierte
und Pseudo-challenged
Mäuse dienten als Kontrollgruppen.
Verfahren
Viren. Vacciniavirus-Stämme Wyeth-New York City Board of Health und Western Reserve wurden ursprünglich von Bernard Moss (NIH, Bethesda, USA) bereitgestellt, die Vacciniavirus-Stämme CVA und MVA wurden ursprünglich von Anton Mayr (Universität München, Deutschland) bezogen und CVA aus der zweiten und MVA aus der 582. (geklontes Isolat F6) Passage auf CEF (chicken embryo fibroblasts = Hühnerembryofibroblasten) wurden für diese Studie verwendet. Alle Viren wurden vermehrt und gemäß Standardmethodik titriert (10). Um Vaccinia-Zubereitungen zu erzeugen wurden die Viren routinemäßig durch Ultrazentrifugation durch Saccharose gereinigt und in 10 mM Tris pH 7,4, 120 mM NaCl Salz-Puffer gereinigt.
Screening nach HLA-A*0201-restringierten Peptiden. HLA-A*0201-restringierte Peptid-Epitope, die von Vacciniavirus-kodierten Proteinen gewonnen wurden, wurden durch Epitop-Vorhersage unter Verwendung der SYFPEITHI-Datenbank (11) ausgewählt. Das konvertierte innere Tyrosinase 369-377 Peptid YMDGTMSQV und das Influenza-Virus A/PR/8/34 Matrixprotein M1 58-66 Peptid GILGFVFTL, von denen bei den bekannt ist, dass sie an HLA-A*0201 binden (12) wurden als Negativkontrollen verwendet. Die Reinheit der Peptide wurde durch Massenspektrometrie und HPLC als > 90% sichergestellt.
Tiermodelle. Weibliche sechs bis acht Wochen alte transgene HHD^+/+ β₂m^–/– D^b/– Mäuse (HHD) (13) wurden für die Immunisierungsexperimente verwendet, indem 0,5 oder 0,1 ml Volumina Virus-Vakzine auf dem intraperitonealen oder intramuskulären Weg eingeimpft wurden und indem an den Tagen 10 bis 28 nach der Vakzinierung HLA-A*0201-restringierte T-Zell-Reaktionen überwacht wurden. Für Schutz-Assays wurden Gruppen weiblicher BALB/c-Mäuse (n = 8 bis 10) intramuskulär einmal mit der 0,1 ml Virus-Vakzine geimpft. Drei Wochen nach der Immunisierung wurden die Tiere anästhetisiert, intranasal mit Vacciniavirus Western Reserve verdünnt in 30 μl Phosphatgepufferter Salzlösung infiziert und zumindest weiterhin drei Wochen unter täglichen Messungen des individuellen Körpergewichts und unter Überprüfung von Anzeichen einer Erkrankung wie früher beschrieben (14) überwacht. Tiere, die unter einer ernsthaften systemischen Infektion litten und die > 30% Körpergewicht verloren wurden getötet. Die mittlere Veränderung des Körpergewichts wurde als Prozentsatz des Durchschnittsgewichts für jede Gruppe am Tag der Challenge berechnet. Die Körpertemperatur wurde mit einem Electronic Laboratory Animal Monitoring System (BioMedic Data Systems, Marywood, NJ) unter Verwendung eines subkutan implantierten – batteriefreien Mikrochip-Transponders und eines DAS-5004 Pocket Scanners zur Datensammlung bestimmt. Durchschnittliche Änderungen der Körpertemperaturen wurden berechnet, indem die Grundtemperatur vor der Herausforderung (Tage –3 bis 0) jeder Gruppe von jedem nachfolgenden Zeitpunkt abgezogen wurden.
Zytokin-Färbungs-Assays. Zehn Tage nach der Vakzinierung wurden die Milzzellen aus Vacciniavirus-immunisierten HHD-Mäusen präpariert und 5 Stunden mit A*0201-bindenen Peptiden bei 10^– ⁶ M inkubiert. Nach zwei Stunden wurde Brefeldin A in einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugesetzt (GolgiPlug^TM; PharMingen Becton Dickinson). Die Zellen wurden lebend/tot in PBS/1%BSA/1μg/ml Ethidiummonoazidbromid (EMA; Molecular Probes) gefärbt und bezüglich einer unspezifischen FcγIII und -II rezeptorvermittelten Bindung mit 5μg/ml gereinigtem anti-CD16/CD32 (FC Block^TM; PharMin gen Becton Dickinson) 20 Minuten lang bei 4°C blockiert. Nach leichter Inaktivierung von EMA wurde das Zelloberflächenfärben mit PE-anti-CD8 (53-6,7) und APC-Anti-CD62L (Mel-14) 30 Minuten bei 4°C durchgeführt. Anschließend wurde ein intrazelluläres Zytokin-Färben 30 Minuten bei 4°C, indem FITC-anti-IFNγ (XMG1,2) oder FITC-anti-TNFα (MP6-XT22) oder die jeweilige FITC-markierte IgG1 Isotyp-Kontrolle (R3-34) aufgebracht wurden, unter Verwendung des Cytofix/Cytoperm^TM-Kits (alle PharMingen Becton Dickinson) durchgeführt. Die Milzzellen wurden durch Durchflußzytometrie (FACScalibur) unter Verwendung der CellQuest^®-Software (beide Becton Dickinson) untersucht.
Chrom-Freisetzungs-Assays. Zehn Tage nach der Vakzinierung wurden die Milzzellen von geprimten Mäusen mit bestrahlten (3.000 Rad) und LPS-aktivierten syngenen Milzzell-Simulatoren co-kultiviert, die mit VP35#1 oder dem Tyrosinase 369-377 Kontrollpeptid zu 5μg/ml und dem humanen β2-Microglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zu 10μg/ml gepulst wurden. Nach 6 Tagen Kultur wurde die lytische Aktivität der sich ergebenden CTL-Effektorzellen in verschiedenen E/T-Verhältnissen in einem 4-Stunden-Standard ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay bestimmt (12). Als Ziele dienten T2-Zellen, die zu 1μm mit VP35#1 Peptid gepulst wurden. Das Tyrosinase 369-377-Peptid oder das Influenza M1 58-66-Peptid dienten als Kontroll-Peptide zum Pulsen von Stimulator- oder Zielzellen.
Ergebnisse
Das Genom des Vacciniavirus, des repräsentativsten Mitglieds der Art Orthopoxvirus kodiert mehr als 200 virale Proteine, die als mögliche Antigene dienen können (15). Bei unserem Versuch, Immunkorrelate für eine erfolgreiche Pockenvirus-spezifische Immunisierung zu identifizieren konzentrierten wir uns auf Vacciniavirus-Genprodukte, die (i) hohe Aminosäurehomologien mit Variolavirus-Antigenen teilen (16), (ii) bezüglich der Induktion von Virus-spezifischen Antikörpern als immundominant bekannt sind (17, 18) oder die (iii) nicht strukturelle Virusproteine sind, die während der viralen frühen Gen-Expression produziert wurden und die möglicherweise bevorzugt für eine MHC Klasse I-assoziierte Immunpräsentation geeignet sind (19). Wegen der dominan ten Repräsentation von HLA-A*02 in menschlichen Populationen versuchten wir Pockenvirus-Polypeptide zu identifizieren, die eine HLA-A*0201-spezifische Restriktion von Peptid-Epitopen ermöglichen. Unter Verwendung einer Epitop-Vorhersage, wie sie durch die SYFPEITHI-Datenbank der MHC-Liganden und Peptide angeboten wird (11) suchten wir acht Vacciniavirus-Polypeptid-Sequenzen (1a) aus und definierten Peptide mit der höchsten Wahrscheinlichkeit zur Bindung mit HLA-A*0201. Diese Peptide wurden darauf bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, eine Zytokin-Produktion in stimulierten Milzzellen von Vacciniavirus-infizierten HLA-A*201 transgenen Mäusen (HHD) zu stimulieren (13). Durch Überwachung von T-Zellen durch FACS-Analyse nach IFNγ-spezifischer intrazellulärer Färbung konnten wir vielfache Peptide identifizieren, die die IFNγ-Freisetzung oberhalb von Hintergrund- bzw. Störpegelniveaus induzierten und die das Peptid VP35#1 einschlossen, das eine besondere stimulierende Fähigkeit für bis zu 0,7% aller CD8+ 7-Zellen aufwies (1a). VP35#1 ist Teil eines 35 kDA Vacciniavirus-Envelope-Proteins, das durch den ORF H3L kodiert wird und das als ein immundominantes Antigen beschrieben ist (18, 20). Ein Vergleich der VP35#1-Sequenz mit den bekannten H3L-Genhomologen, die aus verschiedenen Pockenviren gewonnen wurden zeigen eine vollständige Konservierung des Peptids zwischen Orthopox-Viren, einschließlich Variola maior und Variola minor. Interessanterweise ist VP35#1 ebenfalls in der heterologeren Proteinsequenz des Yaba-like-Disease-Virus, eines Mitgliedes der Art Yatapox-Virus konserviert, die Infektionen bei Menschen verursachen kann (21), wohingegen Aminosäuresubstitutionen in den Sequenzen von Pockenviren aus anderen Arten (1b) auftreten.
Um VP35#1-spezifische T-Zell-Reaktionen vergleichsweise zu charakterisieren, die nach einer Immunisierung induziert wurden, vakzinierten wir HHD-Mäuse mit den unterschiedlichen Vacciniavirus-Stämmen New York City Board of Health (Wyeth), Chorioallantois Vacciniavirus Ankara (CVA) oder Modified Vacciniavirus Ankara (MVA), die alle bereits als Pocken-Vakzine verwendet wurden. Wyeth und CVA sind replikationskompetente Viren, die auf lebenden Kalbs- oder primären Rindergewebskulturen zur Produktion von Pocken-Vakzinen gezüchtet wurden und für die intradermale Multifunktions-Vakzinierung bei Menschen verwendet wird (5, 22). MVA wurde ursprünglich aus CVA durch Serienpassage bzw. Reihenpassage in Hühnerembryofibroblasten-Kulturen (CEF) entwickelt und wurde in Deutschland als sichere aus Gewebskultur her gestellte Vakzine getestet (23). MVA ist streng Wirtsbereich-beschränkt, dient als Vektor-Virus für die rekombinante Genexpression und als Kandidaten-Vakzine zum Transport heterologer Antigene (24, 25).
Indem wir auf unsere frühere Erfahrung unter Verwendung von MVA Vektor-Vakzinen in transgenen HI.A-A*0201 Mäusen vertrauten, immunisierten wir Tiere mit 10⁸ infektiösen Einheiten (IU = infectious units) MVA durch den interperitonealen (i.p.) Weg (12). Im Gegensatz hierzu wurden Vakzinen auf Grundlage von replikationskompetenten Viren CVA und Wyeth i.p. in einer Dosis von 2,5 × 10⁵ Plaque-bildenden Einheiten (PFU) gegeben, entsprechend einer infektiösen Dosis an CVA, die, wenn sie kürzlich in Mäusen verwendet wurde, gelegentlich generalisierende Infektionen, jedoch keine Mortalität zur Folge hatten (26). Eine einzelne Beimpfung aller Vacciniaviren ermöglichte die Induktion von VP35#1 spezifischen aktivierten CD8+-T-Zellen, wie durch FACS-Analyse von frisch hergestellten Milzzellen nach intrazellulärer Färbung nach IFNγ und TNFα gezeigtwurde (2a). Die höchsten Konzentrationen an VP35#1 reaktiven T-Zellen, die IFNγ ebenso wie TNFα sezernieren, wurden nach Vakzinierung mit CVA nachgewiesen, wohingegen Immunisierungen mit Wyeth oder MVA vergleichbare Reaktionen hervorriefen, beispielsweise im Bereich von 0,36–1,33% IFNγ freisetzenden T-Lymphozyten aller Milz-CD8+ T-Zellen. Um die Vakzinen in einem realistischeren Szenario zur Vakzinierung zu überprüfen, analysierten wir Immunreaktionen in HHD-Mäusen, die einmal auf dem intramuskulären Weg beimpft wurden. Wir wollten zusätzlich mögliche Wirkungen eines MVA-Replikationsmangels überwachen und schlossen Tiere ein, die abnehmende Dosen einer MVA-Vakzine zugeführt bekamen. Trotz der weniger „systemischen" Natur dieses Vakzinierungs-Weges fanden wir ähnliche Konzentrationen von VP35#1-spezifischen T-Zell-Reaktionen, wie sie nach intraperitonealer Injektion beobachtet wurden (2b). Überraschenderweise zeigt die Vakzinierung mit MVA unter Verwendung von Dosen von 10⁵ bis 10⁸ IU vergleichbare Immunreaktionen, wohingegen wir keine VP35#1-spezifischen T-Zellen nach Impfung von MVA-Vakzinen nachweisen konnten, die eine geringere Infektivität enthielten (2b, 10⁴ IU). Um die Peptid-reaktiven T-Zellen ebenfalls auf ihre zytotoxischen Fähigkeiten zu überprüfen untersuchten wir Milzzellen aus HF-ID-Mäusen, die mit MVA, CVA oder Wyeth gegen VP35#1-spezifische menschliche Tierzellen (2c) vakzi niert wurden. Eine effiziente spezifische Lyse wurde bei Effektorzellen aus allen vakzinierten Probanden gefunden. Wiederum wurden die höchsten Zytoxitätsniveaus nach Vakzinierung mit CVA, eng gefolgt von CTL-Reaktionen erzielt, die mit MVA und Wyeth induziert wurden.
Eine Auswertung der Wirksamkeit der Vakzine bezüglich ihrer protektiven Fähigkeiten ist eine weitere bedeutende Aufgabe zur Entwicklung neuer Orthopoxvirus-spezifischer Vakzinen. Um festzustellen, ob unsere Daten bezüglich der Immunogenität der Vakzine sich mit dem Schutz durch die Vakzine vergleichen lassen, zogen wir Vorteil aus der Tatsache, dass eine respiratorische Infektion von Mäusen ein wohl etabliertes Tiermodell zur Überwachung der Virulenz von Vacciniaviren, einschließlich von Virus-Mutanten, darstellt (27, 14). Eine Überwachung der Infektion von BALB/c-Mäusen mit CVA oder Vacciniavirus Western Reserve (WR), einem Laborstamm, der ebenfalls bezüglich seiner Virulenz in Mäusen sehr gut charakterisiert ist, beobachteten wir den Ausbruch eines typischen Erkrankungsmusters, das ungefähr sieben Tage nach Infektion gipfelte und das durch einen Verlust von Körpergewicht begleitet wurde (3a), zusätzlich einer reduzierten Fähigkeit, die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten ( 3b) und typischen Erkrankungszeichen, einschließlich eines gestörten Pelzwachstums, eines gekrümmten Rückens, und respiratorischer Symptome. Entsprechend früher etablierter lethaler Dosen 50 (LD50) für WR (27) hatte eine Impfung von 3 × 10⁴ PFU WR den Tod von zwei von acht Tieren zur Folge, wohingegen alle bis auf eines der Tiere die Infektion mit 5 × 10 + 5⁵ PFU CVA überlebten. Im Gegensatz hierzu wurden Impfungen von 10⁸ IU MVA ohne irgendwelche Anzeichen einer Erkrankung, die auffällig wurden, toleriert, ein Ergebnis, das auch in diesem Modellsystem den avirulenten Phänotyp von replikationsdefizienten MVA bestätigt, der bereits in der Literatur beschrieben wurde (23). Dieser hohe Attenuierungsgrad (zusammen mit seiner Immunogenität) macht MVA zu einem offensichtlichen Kandidaten für eine Orthopoxvirus-Vakzine der zweiten Generation, wenn auch mit einem Bedarf danach, seine protektiven Fähigkeiten zu evaluieren.
Zuletzt vakzinierten wir dann BALB/c-Mäuse durch einzelne intramuskuläre Injektionen von 10²–10⁸ IU MVA-Vakzine, um unsere Immunisierungsexperimente zur Bestimmung der zytotoxischen T-Zell-Reaktion in HHD-Mäusen anzupassen. Drei Wo chen nach der Immunisierung setzten wird die Tiere einer respiratorischen Infektion mit 10⁶ PFU WR aus, was zumindest 20 LD50 dieses Virus-Stammes (27) entsprach. Wie in den 3c und 3d dargestellt überlebten alle Tiere, die 10⁵ IU oder eine höhere Dosis einer MVA-Vakzine empfingen, die Challenge bzw. Herausforderung, wohingegen kein Schutz nach Impfung mit 10⁴ oder weniger IU MVA ersichtlich war. Eine Überwachung des Körpergewichts und von Krankheitsanzeichen legte nahe, dass die Schutzniveaus gut mit der erhöhten Dosis der Vakzine korrelierten. Keine Krankheitszeichen und nur eine kurze vorübergehende Reduktion des Körpergewichts war bei Mäusen ersichtlich, die mit 10⁶ IU MVA immunisiert wurden. Dieses Schutzniveau ähnelte der Wirksamkeit von Vakzinierungen mit 10⁵ PVU Wyeth sehr stark, das wir als Kontroll-Vakzine verwendeten, und das einen replikationskompetenten Vacciniavirus mit einer wohl etablierten protektiven Fähigkeit darstellt (3e, 3f).
Wir identifizierten hier eine Reihe von Vacciniavirus-abgeleiteten Peptiden, die Epitope für HLA-A*0201-restringierte CDB+-T-Zell-Reaktionen repräsentieren. Während Immunreaktionen gegen vielfache MHC I und MHC II-restringierte Virus-Antigene wahrscheinlich für die in vivo Kontrolle von Pockenvirus-Infektionen von Bedeutung sind, können diese Epitope eine ausführlichere experimentelle Überwachung der zellulären Immunreaktionen ermöglichen, die durch Pockenvirus-spezifische Immunisierung einschließlich einer Vakzinierung von HLA-A*0201-positiven Menschen induziert werden. Das hoch immunogene und gut konservierte Peptid VP35#1 wird aus einem Viius-Antigen prozessiert, das bereits als ein Ziel von immundominanten Antikörper-Reaktionen beschrieben wurde (18). Unter Berücksichtung, dass ein Antikörper-Screening zur Identifizierung von menschlichen Tumor-Antigenen, die CTL-Ziele sind, verwendet werden kann (28), könnte eine weitere Auswertung der Virus-Proteine, von denen bekannt ist, dass sie gute Antikörper-Reaktionen hervorrufen, zur Gewinnung weiterer immundominanter Pockenvirus-spezifischer T-Zell-Epitope von Nutzen sein. Die Identifizierung des VP35#1 Epitops ermöglichte zum ersten Mal einen direkten Vergleich der T-Zell-Reaktionen, die durch lebende Vacciniaviren induziert wurden, in einer einzigen Antigen-spezifischen Art ex vivo. Unserer Daten legen nahe, dass unterschiedliche Vacciniavirus-Stämme bezüglich ihrer Fähigkeit, Epitop-spezifische T-Zellen anzuregen, bis zu einem gewissen Grad variieren können, ähnlich zu den Beobachtungen, die früher bezüglich neutralisierender Antikörper vorgenommen wurden, die nach einer Pockenvirus-Infektion gefunden wurden (29). Wir wiesen Spitzen-T-Zell-Reaktionen nach einer Immunisierung mit CVA nach, von denen beschrieben wurde, dass sie eine höhere Inzidenz vielfacher Läsionen veranlassen, die sich an der Impfstelle entwickeln, wenn sie als Pocken-Vakzine in Deutschland getestet wurde (22). Nach Vakzinierung mit dem weniger virulenten, jedoch replikationskompetenten Stamm Wyeth oder hoch attenuierten replikationsdefizienten MVA fanden wir vergleichbare Mengen an VP35#1-spezifischen T-Zellen. Dieses Ergebnis erinnerte an die vergleichbaren Immunogenitäten, die für Wyeth- und MVA-Vektor-Vakzinen nach Vakzinierung von Rhesusmakaken gegen den Simian Immunodeficiency-Virus (30) festgestellt wurden. Die Tatsache, dass wir nach Immunisierung mit entweder 10⁸, 10⁶ oder 10⁵ IU MVA ziemlich auffällige T-Zell-Reaktionen vorfanden, jedoch keine spezifischen T-Zellen nachwiesen, wenn geringere Dosen an MVA-Vakzine gegeben wurden, kann auf das Erfordernis nach Schwellenkonzentrationen von Antigenen zur Induktion spezifischer T-Zellen hinweisen. Wichtigerweise demonstrieren unsere in vivo Titrationen von MVA, dass eine Impfung von Vakzin-Dosen, die nachweisbare VP35#1-spezifische CD8+-T-Zellen induzierte, ebenfalls gegen eine lethale respiratorische Infektion mit dem virulenten Vacciniavirus Western Reserve schützte. Die Auswirkung einer Herausforderung wurde am genauesten durch Änderungen des Tierkörpergewichtes widergespiegelt, gefolgt vom Ausbruch von Krankheitsanzeichen. Wir zeigen darüber hinaus, dass in hohem Maße attenuiertes MVA trotz seiner wahrscheinlichen Unfähigkeit, sich in vivo zu replizieren, Niveaus eines Impfschutzes bereitzustellen, die denjenigen des herkömmlichen Vacciniavirus Wyeth induzierten Niveaus gleich sind, jedoch mit dem Erfordernis einer ungefähr zehnfach höheren Dosierung. Das letztere kann als Kompensation für die in vivo Replikation von Wyeth interpretiert werden, die natürlicherweise höhere Antigen-Konzentrationen nach Immunisierung bereitstellt. Während wir denken, dass sowohl CD4+ als auch CD8+-T-Lymphozyten für die in vivo Kontrolle von Orthopoxvirus-Infektionen von Bedeutung sind (8) ermöglicht die neue Kenntnis von Virus-abgeleiteten Peptid-Spezifitäten, die Rolle von Epitop-spezifischen CD8+-T-Zellen im Impfschutz sorgfältig zu evaluieren. Zusammengenommen legen unsere hierin präsentierten Ergebnisse nahe, dass MVA eine geeignete Vakzine gegen Pocken darstellen kann, wenn irgendwelche Ereignisse seine breit angelegte Verwendung in Menschen notwendig machen sollten, d.h. ist sicherer und sogar genauso wirksam, wie die gegenwärtige Vakzine.
Literatur:

1. Lane, H. C., Montagne, J. L. & Fauci, A. S. (2001) Nat. Med. 7, 1271-1273.
2. Gani, R. & Leach, S. (2001) Nature 414, 748-751.
3. Fenner, F., Henderson, D. A., Arita, I., Jezek, Z. & Ladnyi, I. (1988) Smallpox and its eradication (World Health Organization, Geneva).
4. Birmingham, K. & Kenyon, G. (2001) Nat. Med. 7, 1167.
5. Rosenthal, S. R., Merchlinsky, M., Kleppinger, C. & Goldenthal, K. L. (2001) Emerg. Infect. Dis. 7, 920-926.
6. Henderson, D. A. & Moss, B. (1999) in Vaccines, eds. Plotkin, S. A. & Orenstein, W. A. (W.B. Saunders Company, Philadelphia), Vol. Chapter 6.
7. Freed, E. R., Duma, R. J. & Escobar, M. R. (1972) Am. J. Med. 52, 411-420.
8. Karupiah, G., Buller, R. M. L., Vanrooijen, N., Duarte, C. J. & Chen, J. H. (1996) J. Virol. 70, 8301-8309.
9. Demkowicz, W. E., Jr., Littaua, R. A., Wang, J. & Ennis, F. A. (1996) J. Virol. 70, 2627-2631.
10. Moss, B. & Earl, P. L. (1991) in Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Seidman, J., Smith, J. & Struhl, K. (John Wiley & Sons, New York), pp. 16.16.1-16.16.7.
11. Rammensee, H., Bachmann, J., Emmerich, N. P., Bachor, O. A. & Stevanovic, S. (1999) Immunogenetics 50, 213-219.
12. Drexler, I., Antunes, E., Schmitz, M., Wolfel, T., Huber, C., Erfle, V., Rieber, P., Theobald, M. & Sutter, G. (1999) Cancer Res. 59, 4955-4963.
13. Pascolo, S., Bervas, N., Ure, J. M., Smith, A. G., Lemonnier, F. A. & Perarnau, B. (1997) J. Exp. Med. 185, 2043-2051.
14. Alcami, A. & Smith, G. L. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11029-11034.
15. Goebel, S. J., Johnson, G. P., Perkus, M. E., Davis, S. W., Winslow, J. P. & Paoletti, E. (1990) Virology 179, 247-266.
16. Massung, R. F., Liu, L.-I., Qi, J., Knight, J. C., Yuran, T. E., Kerlavage, A. R., Parsons, J. M., Venter, J. C. & Esposito, J. J. (1994) Virology 201, 215-240.
17. Rodriguez, J. F., Paez, E. & Esteban, M. (1987) J. Virol. 61, 395-404.
18. Zinoviev, V. V., Tchikaev, N. A., Chertov, O. Y. & Malygin, E. G. (1994) Gene 147, 209-214.
19. Bronte, V., Carroll, M. W., Goletz, T. J., Wang, M., Overwijk, W. W., Marin cola, F., Rosenberg, S. A., Moss, B. & Restifo, N. P. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 3183-3188.
20. da Fonseca, F. G., Wolffe, E. J., Weisberg, A. & Moss, B. (2000) J. Virol. 74, 7508-7517.
21. Lee, H. J., Essani, K. & Smith, G. L. (2001) Virology 281, 170-192.
22. Herrlich, A. & Mayr, A. (1957) Arch. Virusforsch. 7, 284-296.
23. Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. & Stickl, H. (1975) Infection 3, 6-14.
24. Sutter, G. & Moss, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851.
25. Sutter, G., Wyatt, L. S., Foley, P. L., Bennink, J. R. & Moss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040.
26. Meyer, H., Sutter, G. & Mayr, A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 1031-1038.
27. Lee, M., Roos, J., McGuigan, L., Smith, K., Cormier, N., Cohen, L., Roberts, B. & Payne, L. (1992) J. Virol. 66, 2617-2630.
28. Sahin, U., Türeci, Ö., Schmitt, H., Cochlovius, B., Johannes, T., Schmits, R., Stenner, F., Luo, G., Schobert, I. & Pfreundschuh, M. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813.
29. Benenson, A. S., Cherry, J. D., Mclntosh, K., Connor, J. D., Alling, D. W., Nakano, J., Rolfe, U. T., Schanberger, J. E., Todd, W. A., DeCastro, F., Horvath, F. L., Bairan, A., Phillips, I. A., Galasso, G. J. & Matthels, M. J. (1977) J. Infect. Dis. 135, 135-144.
30. Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B. & Lifson, J. (1996) J. Virol. 70, 3741-3752.

Claims

Immunogenes Orthopoxvirus-Antigen, das zumindest eines der Peptide der SEQ ID NO: 150 oder Varianten hiervon umfasst, wobei die Varianten ein oder mehrere Additionen, Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen im Vergleich zum jeweiligen Peptid der SEQ ID NO: 1-50 umfasst, und wobei die immunogene Aktivität der Variante der Aktivität des jeweiligen unmodifizierten Peptids von SEQ ID NO: 1-50 im wesentlichen gleich ist.
Isolierte Nukleinsäure, die für eines oder mehrere der Peptide von Anspruch 1 kodiert.
Isolierte Nukleinsäure, die ein Transkriptionsprodukt der Nukleinsäure von Anspruch 2 ist.
Isolierte Nukleinsäure, die an die Nukleinsäuren nach Anspruch 2 oder 3 unter moderat stringenten Bedingungen selektiv hybridisiert.
Immunogenes Antigen, das von einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 bis 4 kodiert wird.
Vektor, der ein oder mehrere der Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 2-4 umfasst.
Expressionsvektor, der eine oder mehrere der Nukleinsäuresequenzen nach einem der Ansprüche 2-4 und eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfasst.
Vektor nach Anspruch 6 oder 7, der ein Plasmid ist.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 6-8 transformiert wurde.
Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine eukaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Säugetierzelle, Pflanzenzelle, Hefezelle oder eine Insektenzelle ist.
Säugetierzelle nach Anspruch 11, die eine CHO, COS, HeLa, 293T, HEH oder BHK Zelle ist
Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine prokaryontische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, die E. coli oder Bacillus subtilis ist.
Antigen-präsentierende Zelle, die mit einem oder mehreren Peptide nach Anspruch 1 gepulst worden ist.
Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 15, die eine dentritische Zelle oder eine B-Zelle ist.
Diagnostische Zusammensetzung, die ein oder mehrere der Peptide nach Anspruch 1 und/oder eine Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 15 oder 16 umfasst.
Diagnostischer Kit zum Nachweis einer Immunreaktion, die durch Pocken- oder Orthopoxvirusvektor-Vakzinen induziert wurde, der zumindest ein oder mehrere Peptide nach Anspruch 1 oder eine Antigen-präsentierende Zelle nach Anspruch 15 oder 16 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer der Peptide nach Anspruch 1, eine oder mehrere der Nukleinsäuren nach Anspruch 2-4 oder einen Vektor nach Anspruch 6-8 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19, die eine Vakzine ist.
Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20 in der protektiven Immunisierung gegen eine Pockeninfektion in einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen.
Ex vivo Verfahren zum Nachweis einer T-Zell-Reaktion, die durch Pocken-Vakzinen oder Orthopoxvirus-Vektor-Vakzinen in einem Säugetier, vorzugsweise einem menschlichen Patienten, induziert wurden, das die folgenden Schritt umfasst: a) Bereitstellen einer Probe, die T-Zellen von einem Patienten enthält, wobei der Patient mit einer Pocken-Vakzine oder einer Orthopoxvirus-Vektor-Vakzine immunisiert wurde und b) Co-Kultivieren der Probe mit einem oder mehreren Peptiden nach Anspruch 1 oder einer diagnostischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 unter Bedingungen, die eine Aktivierung der T-Zellen ermöglichen, und c) Bestimmen einer spezifischen Aktivität von T-Zellen, die in der Probe enthalten sind, gegen irgendein in b) angezeigtes Peptid.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die T-Zellen CD8+-T-Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Bestimmung in Schritt c) durch einen ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die Bestimmung in Schritt c) durch Messen der Menge an Zytokinen in diesen T-Zellen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Zytokine durch intrazelluläres Zytokin-Färben gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Zytokine durch einen ELISPOT-Assay gemessen werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 22-27, wobei die Probe eine menschliche Körperflüssigkeit, vorzugsweise eine Blutprobe ist.