CN114605523A

CN114605523A - 一种反相色谱纯化制备利拉鲁肽的方法

Info

Publication number: CN114605523A
Application number: CN202011408320.2A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 叶贤龙; 郭志谋; 于伟
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-06-10

Abstract

本发明公开一种高效的利拉鲁肽的纯化分离方法，涉及一种色谱技术纯化利拉鲁肽的改进方法。本方法采用高效液相反相制备色谱技术对利拉鲁肽进行分离纯化，该制备方法以反相色谱填料为基质，对纯化工艺条件中重要参数进行优化，如缓冲盐种类、浓度、pH、流动相梯度及上样量等，使样品具有适当的保留和良好的峰形；采用优化后的纯化工艺可以获得高纯度利拉鲁肽。本发明方法具有高选择性、载样量大、收率高等优势，本发明所要解决的技术问题是现有制备方法分离纯化困难、产品的总收率和纯度低。本发明为缩短生产周期、降低生产成本、提高产品质量提供了一种新的方法。

Description

一种反相色谱纯化制备利拉鲁肽的方法

技术领域

本发明属于色谱技术纯化分离多肽的制备领域。具体涉及一种色谱技术纯化制备利拉鲁肽的方法。

背景技术

利拉鲁肽为人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide1，GLP-1)类似物，GLP-1是由前激素转换酶(PC1)在肠黏膜的L细胞内将胰高血糖素原(proglucagon)剪切为其羧基端的肽链序列。GLP-1有2种生物活性形式，一种是GLP-1(7-37)，另一种是GLP-1(7-36)酰胺。两者仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1作用靠受体介导，可结合并激活GLP-1受体。

利拉鲁肽与GLP-1(7-37)有97％同源性，它是将GLP-1(7-37)的Lys34替换成Arg34，Lys26侧链上连接一条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))，并切除多余氨基酸而获得。其在体内通过酰基化与白蛋白结合，自联形成稳定的七聚体，从皮下组织缓慢降解，不易被二肽基肽酶-4(DPP-4)降解，减少肾脏滤过作用，血浆半衰期长达13h，降糖作用大于24h。临床结果显示利拉鲁肽具有显著降低2型糖尿病患者的HbAlc水平、体重及改善β细胞功能。美国糖尿病学会(ADA)和欧洲糖尿病研究协会(EASD)在2009年出版的共识中建议，选用GLP1类似物减重和避免低血糖风险，将HbA1c降至小于8％时使用。英国国家健康与临床优化研究所(NICE)建议，对于肥胖患者(BMI＞25kg/m^-2)可以将GLP1类似物作为替代胰岛素使用。

目前市售的利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司研制的，2010年被FDA批准上市，利用酿酒酵母以胞外分泌方式表达Arg34GLP-1(7-37)(如WO98/008871)。国内也有多家公司利用重组表达利拉鲁肽并进入临床阶段。通过诺和诺德公开文献可知利拉鲁肽制备需从发酵表达开始，经过澄清、捕获、沉淀以及多步纯化得到较纯的前体，酰化后通过阴离子交换层析及反相高效液相色谱等纯化制备终产品。如CN200480024090.2利用阴离子交换色谱纯化去除酰化后外消旋化氨基酸杂质，如CN200480024089.X利用RP-HPLC去除酰化后利拉鲁肽相关杂质。

现公开及生产上使用的纯化利拉鲁肽的方法也存在步骤较多、收率低及纯度不高的问题，同时使用的高效液相反相色谱现工艺的成本高。马艳池等以固相合成得Arg34GLP-1(7-37)，经由谷氨酸介导的肽链棕榈酰化，制备获得利拉鲁肽，经RP-HPLC纯化得到纯度为96.77％的样品，而总收率较低，约12.8％。CN102584982A专利将固相合成的利拉鲁肽溶于乙腈水溶液获得粗肽溶液后，通过4步HPLC纯化获得利拉鲁肽，得到纯度为98.4％的活性药物，总收率约61.3％。CN103275208A专利通过改变固相合成的原料，避免相关杂质产生，经RP-HPLC纯化后获得的样品纯度约98.6％，最大单一杂质控制在0.3％以下，总收率约20.2％。目前利拉鲁肽的工艺生产中产生的杂质的性质与其相似，故纯化制备高纯度利拉鲁肽成品的难度较大；针对利拉鲁肽现有纯化制备方法存在难题，急需寻找一种高效率的利拉鲁肽分离纯化且适合工业化的生产工艺。

本发明通过对利拉鲁肽的反相色谱纯化分离的工艺条件进行优化摸索及峰展宽比较后得到最适的纯化制备参数，应用该纯化工艺条件方法可以高效的制备高纯度的利拉鲁肽样品。本发明的方法适用于液相分析色谱、半制备色谱、特别是液相制备色谱，可以广泛的应用于利拉鲁肽的工业化放大制备。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利拉鲁肽的纯化制备方法，具体而言，本发明设计一种采用工业制备级液相色谱技术高效纯化制备高纯度利拉鲁肽的新方法，目的在于解决目前在利拉鲁肽纯化制备过程中所存在的收率低及成本高的问题。

为了实现上述发明目的，本发明采用高效液相色谱纯化制备利拉鲁肽的方法步骤如下：

1)溶样：称取适量利拉鲁肽粗品，加入一定体积的盐溶液或纯水，采用稀氨水滴定溶解，用0.22μm滤膜过滤，待用；

2)纯化工艺条件的优化：摸索并研究步骤1)中处理的利拉鲁肽样品在反相色谱纯化分离条件及其色谱保留峰展宽，优化并筛选出合适的色谱填料、载样量、流动相(有机溶剂种类、盐种类、盐浓度、pH值)、流动相梯度、流速等工艺参数；

3)纯化制备：采用2)中优化的工艺条件进行利拉鲁肽样品的纯化分离制备，通过观察紫外峰形来指导收集馏分，对各馏分进行纯度分析，合并纯度较高馏分；

4)脱盐：对纯化制备的合并馏分进行低温离心浓缩，重复2-3次，即得高纯度的脱盐后的利拉鲁肽产品。

在进一步的实施方案中，本发明的的利拉鲁肽样品的状态可以是固体粉末或液体；样品的色谱纯度为35-95％；样品的浓度为0.1-100mg/mL。

在进一步的实施方案中，本发明步骤2)中利拉鲁肽反相色谱纯化工艺参数优化的条件包括所述有机溶剂为可以为甲醇、乙醇、乙腈或者异丙醇；所述缓冲盐为Na⁺、K⁺、H⁺、NH⁴⁺之一种或多种为阳离子，CH₃COO^-、HCOO^-、Cl^-、HCO^3-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^3-、ClO^4-、SO₃ ^2-之一种或多种为阴离子的盐；所述缓冲盐溶液浓度为1-1000mM，缓冲盐溶液pH为2.0-11.0。

在进一步的实施方案中，本发明步骤2)中利拉鲁肽纯化的高效反相色谱柱筛选的填料基质可以为硅胶或高分子聚合物；填料配基的碳原子数为4-30的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为5-100μm，孔径为

比表面积为100～500m²/g；色谱柱内径为4.6-1600mm，柱床高度为50-1000mm。

在进一步的实施方案中，本发明步骤2)中利拉鲁肽反相色谱纯化工艺优化的条件包括色谱柱的载样量为固定相重量的0.01-20％；色谱的上样和洗脱流速为20-350cm/h；起始有机溶剂的含量为2-40％；梯度洗脱为流动相中有机相与盐相的体积比(V/V)范围由5:95-80:20在20-200min内变为40:60-95:5；洗脱方式为等度洗脱和梯度洗脱，或是两种方式联合的洗脱方法。

在进一步的实施方案中，本发明步骤3)中根据非线性色谱原理的方法学优化得到的利拉鲁肽反相色谱纯化分离工艺参数如下：流动相中有机相种类优选乙腈及乙醇、缓冲盐种类优选乙酸铵和甲酸铵体系、盐浓度优选75-150mM、溶液pH优选为7.5-8.5。

在进一步的实施方案中，本发明步骤(3)中所述的拉鲁肽反相色谱纯化的工艺优化得到的参数还包括填料基质优选硅胶，配基优选为C8和C18，填料粒径优选7-15μm，孔径为

线性流速优选为50-100cm/h。

在进一步的实施方案中，本发明步骤3)中利拉鲁肽的反相色谱纯化制备条件优化得到的工艺参数如下：流动相中有机相种类优选乙腈及乙醇、缓冲盐种类优选乙酸铵和甲酸铵体系、盐浓度优选75-150mM、溶液pH优选为7.5-8.5。

在进一步的实施方案中，本发明步骤3)中利拉鲁肽纯化制备的温度条件为4-40℃；检测波长为254-280nm；馏分接取的方式可以由紫外峰或体积指导收集。

本发明所述的一种利拉鲁肽的纯化分离方法，其特征在于：利拉鲁肽粗品溶液采用单针上柱吸附、解析并进行分段收集；或采用多针分批连续方式上柱、解析的连续进样纯化方式，且对每批解析液进行分段收集。

本发明方法具有的特点包括：

(1)高效性：为解决当前利拉鲁肽纯化制备遇到的问题，本发明采用非线性色谱理论纯化方法学摸索出最适的纯化工艺条件，在该条件下利拉鲁肽在色谱纯化上具有较好的峰形及杂质分离度，可以解决杂质选择性不足的问题。本发明筛选的利拉鲁肽纯化制备方法具有收率高、周期时间短、后处理简单；且易于实现工业化生产。

(2)高重复性：本发明方法工艺操作简单可控、稳定，重现性高。

(3)生产工艺成本低和环境友好：本发明工艺使用较少的有机溶剂量及成本低。

附图说明

图1是利拉鲁肽原液的高效液相色谱分析图。

图2是实施例1中优化的工艺参数条件下利拉鲁肽纯化分离的制备谱图。

图3是实施例1中纯化制备的利拉鲁肽样品的高效液相色谱分析图。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1

称取500mg利拉鲁肽粗品溶于pH 8.0流动相A缓冲液中(浓度30mg/mL)，加质量浓度10％稀氨水调节pH约9.5至固体粉末完全溶解至透明，使用0.22μm滤膜过滤。流动相A为90％75mM乙酸铵/水+10％乙腈，pH 8.0，流动相B为10％75mM乙酸铵/水+90％乙腈，pH 8.0。采用高效液相色谱方法对原液纯度进行分析；分析图谱见图1。

采用优化好的工艺条件进行利拉鲁肽粗样在高效反相色谱柱上的纯化分离，收集目标峰馏分，纯化制备谱图见图2。对洗脱的各馏分进行HPLC分析，合并纯度较高的馏分再通过HPLC分析，分析结果见谱图3。纯化制备条件如下：色谱柱(C8，9μm，

10*250mm)；流速(2.8mL/min)；上样量(1.3％)；梯度(0-5min 30-40％B，5-50min 40-60％B，50-55min60-95％B，55-60min 95％B)；波长(254nm)。对高纯度的合并馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的利拉鲁肽纯品粉末。

本实施例中，HPLC分析条件如下：

色谱柱：Tnature C18(4.6*150mm，5μm，

)

流动相：A相：0.1％三氟乙酸/水(V/V)

B相：0.1％三氟乙酸/乙腈(V/V)

检测波长：215nm

柱温：35℃

流速：1mL/min

梯度条件：(0-3min 30-45％B，3-15min 45-75％B，15-18min 75-90％B)

实施例2

称取1.2g利拉鲁肽粗品溶于pH 7.5流动相A缓冲液中(浓度40mg/mL)，加稀氨水调节pH约9.5至固体粉末完全溶解至透明，使用0.22μm滤膜过滤。流动相A为70％50mM碳酸氢铵/水+30％乙腈，pH 7.5，流动相B为10％50mM碳酸氢铵/水+90％乙腈，pH 7.5。采用高效液相色谱方法对原液纯度进行分析。

采用优化好的工艺条件进行利拉鲁肽粗样在高效反相色谱柱上的纯化分离，收集目标峰馏分。对洗脱的各馏分进行HPLC分析。纯化制备条件如下：色谱柱(C8I，10μm，

2.0*300mm)；流速(10mL/min)；上样量(1.8％)；梯度(0-6min 30-35％B，6-65min 35-55％B，65-70min 55-95％B，70-75min 95％B)；波长(254nm)。合并纯度较高的馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的利拉鲁肽纯品粉末。

实施例3

称取3g利拉鲁肽粗品溶于pH 8.5流动相A缓冲液中(浓度20mg/mL)，加稀氨水调节pH约9.5至固体粉末完全溶解至透明，使用0.22μm滤膜过滤。流动相A为90％50mM甲酸铵/水+10％乙腈，pH 8.5，流动相B为10％50mM甲酸铵/水+90％乙腈，pH 8.5。采用高效液相色谱方法对原液纯度进行分析。

采用优化好的工艺条件进行利拉鲁肽粗样在高效反相色谱柱上的纯化分离，收集目标峰馏分。对洗脱的各馏分进行HPLC分析。纯化制备条件如下：色谱柱(C18PE，9μm，

5.0*250mm)；流速(50mL/min)；上样量(1.5％)；梯度(0-6min 30-42％B，6-60min42-62％B，60-65min 62-95％B，65-70min 95％B)；波长(254nm)。合并纯度较高的馏分进行离心浓缩干燥处理，即得精制的利拉鲁肽纯品粉末。

由图1分析结果可知，利拉鲁肽粗样的纯度约74.2％，采用高效反相色谱纯化利拉鲁肽样品的制备色谱峰形控制的较好(见图2)，经分析纯化后馏分的纯度约98.5％，收率达90％以上，纯化前后样品中杂质含量显著降低。综上可知，采用本发明中利拉鲁肽的纯化方法学优化的纯化工艺条件具有高纯度、高收率、溶剂使用量、馏分收集体积及成本低等优势。此发明方法可广泛应用于利拉鲁肽及GLP-1类似物药物的高效纯化工艺开发中。

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种反相色谱纯化制备利拉鲁肽的方法，其步骤如下：

(1)溶样：称取利拉鲁肽粗品，加入盐溶液或纯水，采用质量浓度9.0％—12.0％稀氨水滴定至完全溶解，用0.1-0.45μm滤膜过滤，待用；

(2)纯化制备：进行利拉鲁肽样品的纯化分离制备，通过观察紫外峰形来指导收集馏分，按峰收集；流动相中有机相与盐相溶液；

所述有机溶剂种类可以为甲醇、乙醇、乙腈或者异丙醇中的一种或二种以上；盐相溶液中的缓冲盐为Na⁺、K⁺、H⁺、NH⁴⁺之一种或多种为阳离子，CH₃COO^-、HCOO^-、Cl^-、HCO^3-、PO₄ ^3-、HPO₄ ^2-、H₂PO₄ ^3-、ClO^4-、SO₃ ^2-之一种或多种为阴离子的盐；所述缓冲盐溶液浓度为1-1000mM，缓冲盐溶液pH为2.0-11.0；

(3)脱盐：对馏分进行低温离心浓缩，重复2-3次，即得利拉鲁肽产品。

2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中所述的利拉鲁肽粗品的状态可以是固体粉末或液体；样品的色谱纯度为35-95％；样品的浓度为0.1-100mg/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)反相色谱纯化利拉鲁肽，色谱柱的载样量为固定相重量的0.01-20％；色谱的上样和洗脱流速为20-350cm/h；

起始有机溶剂的含量为2-40％；梯度洗脱为流动相中有机相与盐相的体积比(V/V)范围由5:95-80:20在20-200min内变为40:60-95:5；洗脱方式为等度洗脱或梯度洗脱，或是两种方式联合的洗脱方法。

4.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)高效反相色谱柱的填料基质可以为硅胶或高分子聚合物；填料配基的碳原子数可以为4-30的正链烷基中的一种或多种；填料粒径为5-60μm，孔径为

5.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)中所述的利拉鲁肽的反相色谱纯化制备条件优化得到的工艺参数如下：流动相中有机相种类优选乙腈和/或乙醇、缓冲盐种类优选乙酸铵和/或碳酸氢铵体系、盐浓度优选75-150mM、溶液pH优选为7.5-8.5。

6.根据权利要求1所述的方法，步骤(3)中所述的拉鲁肽反相色谱纯化填料基质优选硅胶，配基优选为C8和C18，填料粒径优选7-15μm，孔径为

线性流速优选为50-100cm/h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中利拉鲁肽纯化制备的温度条件为4-40℃；检测波长为254-280nm。