CN103180335B - 用于制备地加瑞克及其中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备十肽地加瑞克、其受保护的前体以及其他有用中间体的液(或溶液)相制备方法。本发明还涉及可用于所述溶液相制备方法的多肽以及地加瑞克自身的纯化。地加瑞克可以通过使根据式(II)：(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(II)的地加瑞克前体或其盐或溶剂化物经过在有机溶剂中用裂解剂的处理而获得，其中P1是氨基保护基；优选乙酰基；P4是氢或羟基保护基，优选羟基保护基；P6是氢或氨基保护基；优选氨基保护基；并且P8是氨基保护基。

Description

用于制备地加瑞克及其中间体的方法
技术领域
本发明涉及用于制备十肽地加瑞克(Degarelix)、其受保护前体以及其他有用中间体的液(或溶液)-相制备方法。本发明还涉及可用于所述溶液相制备方法的多肽以及地加瑞克自身的纯化。
发明背景
前列腺癌是工业化世界中导致男性发病和死亡的主要原因。地加瑞克，也被称为FE200486，是第三代促性腺激素释放激素(GnRH)受体拮抗剂(GnRH阻滞剂)，其已经被开发并在最近被批准用于需要雄激素阻断疗法的前列腺癌患者(Doehn等，Drugs2006，vol.9，No.8，pp.565-571；WO09846634)。地加瑞克通过直接且竞争性阻滞脑垂体中的GnRH受体而起作用，并且与其他GnRH拮抗剂一样，不会引起经由下丘脑-脑垂体-性腺轴的促黄体激素产生的初始刺激，并且因此不会引起睾酮激增或临床爆发(VanPoppel，CancerManagementandResearch(癌处理和研究)，2010：239-52；VanPoppel等，Urology，2008，71(6)，1001-1006)；James，E.F.等，Drugs，2009，69(14)，1967-1976)。
地加瑞克是一种合成的直链十肽，其含有七个非天然氨基酸，其中五个是D-氨基酸。在该十肽的主链中具有十个手性中心。在序列的位置5处的氨基酸残基在侧链取代中具有额外的手性中心，产生总共十一个手性中心。其CAS登记号是214766-78-6(游离碱的)，并且其以商标FirmagonTM可商购获得。该药物物质在化学上被命名为D-丙氨酰胺，N-乙酰基-3-(2-萘基)-D-丙氨酰-4-氯-D-苯丙氨酰-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰-L-丝氨酰-4-[[[(4S)-六氢-2，6-二氧代-4-嘧啶基]羰基]氨基]-L-苯丙氨酰-4-[(氨基羰基)氨基]-D-苯丙氨酰-L-亮氨酰-N6-(1-甲基乙基)-L-赖氨酰-L-脯氨酰-并且由以下化学结构(下文也称为式I)表示：
地加瑞克的结构也可以表示为：
Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2
其中Ac是乙酰基，2Nal是2-萘基丙氨酸，4Cpa是4-氯苯丙氨酸，3Pal是3-吡啶基丙氨酸，Ser是丝氨酸，4Aph是4-氨基苯丙氨酸，Hor是氢化乳清酰(hydroorotyl)，Cbm是氨基甲酰基，Leu是亮氨酸，Lys(iPr)是N6-是异丙基赖氨酸，Pro是脯氨酸而Ala是丙氨酸。
为了描述本发明的目的，地加瑞克中的每个氨基酸将被赋予如下的简化符号：
AA1是D-2Nal，AA2是D-4Cpa，AA3是D-3Pal，AA4是Ser，AA5是4Aph(L-Hor)，AA6是D-Aph(Cbm)，AA7是Leu，AA8是Lys(iPr)，AA9是Pro并且AA10是D-Ala。
因此，例如，地加瑞克可以表示为Ac-AA1-AA10-NH2，四肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser可以表示为Ac-AA1-AA4并且六肽4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2可以表示为AA5-AA10-NH2。
之前已经使用如在WO98/46634和Jiang等，J.Med.Chem.2001，44，453-467中报道的Boc-固相肽合成(SPPS)方法来制备地加瑞克。基本地，首先在二甲基甲酰胺(DMF)/CH2Cl2中使用二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)作为活化剂或偶联剂，将Boc-保护的D-Ala与MBHA树脂进行偶联。在D-Ala与该树脂偶联后，合成通过以下继续进行：洗涤、解除封闭然后偶联下一个氨基酸残基，直到完成所述十肽。在添加链中的下一个氨基酸之前，在5-位的4Aph和在6-位的D-4Aph的侧链伯氨基在它们被添加并分别用L-Hor和Cbm修饰时通过Fmoc进行保护。这需要以下的额外步骤：首先除去利用哌啶的侧链保护，将在肽树脂(peptidoresin)上的新游离的氨基与异氰酸叔丁酯或L-氢化乳清酸(L-hydrooroticacid)反应，利用水合茚三酮试验确保该反应完全，然后在添加下一个氨基酸残基之前洗涤该肽树脂(同样见Sorbera等，DrugsoftheFuture(未来的药物)2006，Vol.31，No.9，pp755-766)。
虽然至今Boc-SPPS方法已经提供了足够量的地加瑞克，但是对此多肽增长的需求意味着需要不断更大的量。Boc-SPPS，需要HF裂解，不适合大规模工业合成。实际上，WO98/46634提及SPPS仅适于至多1kg的有限量，而典型的肽溶液合成，或液相肽合成(LPPS)，优选用于更大量的产品。WO98/46634没有详细说明应当如何进行这样的合成。虽然已经报道了存在地加瑞克的液相肽合成[EMEAReport：AssessmentReportforFirmagonTM(Degarelix)(EMEA报告：FirmagonTM(地加瑞克)的评估报告)：Doc.Ref.EMEA/CHM/635761/2008]，但是至今该方法的细节没有被公开。
WO97/34923和WO99/26964是涉及用于制备生物活性肽的液相方法的文献。WO99/26964具体涉及具有作为GnRH拮抗剂的活性的十肽的液相合成。WO99/26964列出了用于制备GnRH拮抗剂的SPPS方法的大量固有局限，包括树脂的有限容量，需要大大过量的试剂和氨基酸，以及需要保护所有反应性侧链如Ser中的羟基，Aph和D-Aph中的芳族氨基，Lys(i-Pr)中的ε-异丙基氨基。
WO99/26964提出一种液相方法，其包括首先制备具有充分精心设计的侧链的十肽的5位和6位的中心肽片段，然后通过″4-2-4″、″3-3-4″或″3-4-3″片段装配模式装配所述肽。例如，在GnRH拮抗剂AzalineB的制备中，将四肽与六肽偶联从而形成所需的十肽。当将相同的片段装配模式尝试用于地加瑞克时，发生Ser氨基酸(AA4)的外消旋化，产生约20％的杂质L-Ser。该杂质带入到最终的十肽中并且难以除去。此外，当按照WO99/26964中描述的程序通过将Ser单元添加到三肽AA1-AA3中来制备四肽AA1-AA4时，来自苄基酯基团水解的四丁基铵离子在随后的操作中不能被完全除去并且将带入到最终的产品中。还发现，在地加瑞克合成中，当L-二氢化乳清酸与4Amp偶联以制备AA5时，L-氢化乳清酰基团重排为其乙内酰脲乙酰基类似物。与地加瑞克的溶液相合成相关的这些和其他问题现在已经被克服，并且本文中首次公开了该十肽的一种新的溶液相多肽合成。
发明概述
如在WO97/34923和WO99/26964中描述的用于制备地加瑞克的SSPS方法的问题和LLPS方法的缺点现在已被克服并且是本发明的主题。
总体上，本发明涉及十肽地加瑞克的液相合成
在一方面，本发明涉及一种用于制备具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地加瑞克或其药用盐或溶剂化物的液相方法，所述方法包括以下步骤：使根据下式II的地加瑞克前体、或其盐或溶剂化物经过用裂解剂的处理：
式II的化合物因此对应于
(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(II)
其中AA1至AA10与式(I)的相同，
P1是氨基保护基或乙酰基；
P4是氢或羟基保护基，优选羟基保护基；
P6是氢或氨基保护基；优选氨基保护基；并且
P8是氨基保护基。
优选地，如果存在，保护基P1与P8是互不相关的，即两个保护基可以被独立地裂解。
在一个优选实施方案中，P1是乙酰基，并且P4和P8各自是可以在单一步骤中被裂解的保护基，并且P6是氢或可以与保护基P4和P8一起被裂解的保护基。保护基的裂解优选通过用三氟乙酸(TFA)处理式II的前体来进行。尤其优选的是，P4、P6和P8是选自叔丁基(tBu)和叔丁氧基羰基(Boc)中的保护基，并且最优选这样的式II的前体，其中P4是tBu，P6是氢或tBu，并且P8是Boc。
本发明还涉及一种用于液相制备由式(II)表示的中间体或其药用盐或溶剂化物的方法，所述方法包括以下步骤：将由式(III)表示的第一多肽或其盐，
(P1)AA1-AA2-AA3(III)
与由式(IV)表示的第二多肽或其盐
AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IV)在液体试剂介质中在肽偶联剂存在下，任选地与有机胺碱一起进行偶联，从而形成由式(II)表示的十肽。在此情况中，AA1至AA10、P4、P6和P8与式(II)的相同。
所述盐包括酸性盐如盐酸盐和碱性盐如碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。
根据本发明，由式(IV)表示的第二多肽可以通过将保护基PN从以下化合物(IVa)中除去来制备：
(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IVa)
PN优选是N-端氨基保护基并且更优选是可以通过氢化消除的保护基如苄氧基羰基。
式(IVa)的化合物可以通过将由式(V)表示的多肽和由式(VI)表示的多肽或这些化合物的盐进行偶联而获得：
(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7(V)
AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(VI)
其中AA4至AA10、PN、P4、P6和P8与式(IVa)的相同。
本发明还涉及可用于本发明的液相制备方法的由式(II)至(VI)表示的多肽。
附图说明
图1显示合成用于肽合成的AA1和AA2的衍生物的流程图。
图2显示合成用于肽合成的AA2-AA3的衍生物的流程图。
图3显示合成Ac-AA1-AA3的流程图。
图4显示合成AA6-AA7的衍生物的流程图。
图5显示合成AA5-AA7的衍生物的流程图。
图6显示合成Z-AA4-AA7的流程图。
图7显示合成AA9-AA10的流程图。
图8和9显示合成Z-AA8-AA10的流程图。
图10显示合成Z-AA4-AA10的流程图。
图11显示合成式II的前体的流程图。
图12显示从式II的前体合成地加瑞克以及纯化和冻干的流程图。
发明详述
现在将更详细地描述本发明。
去保护步骤
在第一方面，本发明涉及一种用于制备具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地加瑞克或其药用盐或溶剂化物的液相方法。所述方法包括以下步骤：从根据式II((P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)的地加瑞克前体、或其盐或溶剂化物，在含有其中溶解了该前体和裂解剂的有机溶液中将如果存在的保护基(P4)、(P6)和(P8)裂解。
式II中的AA1至AA10具有与在式(I)中相同的含义，并且P1是氨基保护基或乙酰基，优选乙酰基。
P8是氨基保护基。优选地，P8是本领域中已知的任何侧链保护基，如在E.Gross&J.Meienhofer，ThePeptides：Analysis，Structure，Biology(肽：分析、结构、生物学)，Vol.3：ProtectionofFunctionalGroupsinPeptideSynthesis(肽合成中官能团的保护)(AcademicPress，N.Y.，1981)中描述的那些。合适的实例包括9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、苄氧基羰基(Cbz或Z)，和取代的Cbz，如，例如，2-溴-苄氧基羰基(2-Br-Z)，2-氯-苄氧基羰基(2-Cl-Z)，对氯苄氧基羰基，对6-硝基苄氧基羰基，对溴苄氧基羰基，和对甲氧基苄氧基羰基，邻氯苄氧基羰基，2，4-二氯苄氧基羰基，2，6-二氯苄氧基羰基等；脂肪族尿烷型保护基，如叔丁氧基羰基(Boc)，叔戊基氧基羰基，异丙基氧基羰基，2-(对联苯基)-异丙基氧基羰基等；环烷基尿烷型保护基，如环戊基氧基羰基，金刚烷基氧基羰基，和环己基氧基羰基；烯丙基氧基羰基(Alloc)，乙酰基(Ac)，苯甲酰基(Bz)，三氟乙酰基(Tfa)，甲苯磺酰基(Tos)，苄基(Bn)，三苯基甲基(Trt)，邻硝基苯基-亚磺酰基(Nps)，叔丁基-二甲基甲硅烷基氧基羰基，[2-(3，5-二甲氧基苯基)-丙基-2-氧基羰基](Ddz)，2，2，2-三氯乙基氧基羰基(Troc)，联苯基异丙基氧基羰基(Bpoc)，和邻硝基苄氧基羰基。优选的保护基是Fmoc、Boc和Alloc，其中Boc是最优选的。
P4是氢或羟基保护基，优选羟基保护基。Ser(P4)的羟基优选是C4-C6烷基(例如叔丁基，环己基)，乙酰基(Ac)，三苯甲基，苄基，苄基醚如对甲氧基苄基，或其他取代的苄基如对硝基苄基，对氯苄基，邻氯苄基，和2，6-二氯苄基，四氢吡喃基，三(C1-C6)烷基甲硅烷基，2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)，4-二甲基氨基甲酰基苄基和O-苯氧基乙酰基醚。
尤其优选的是叔丁基、苄基和9-芴基甲基醚，叔丁基是最优选的。
P6是氢或氨基保护基，优选氨基保护基。优选的保护基包括C4-C6烷基(例如叔丁基，环己基)，乙酰基(Ac)，三苯甲基，苄基，苄基醚如对甲氧基苄基，或其他取代的苄基如对硝基苄基，对氯苄基，邻氯苄基，和2，6-二氯苄基，四氢吡喃基，三(C1-C6)烷基甲硅烷基，2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)，4-二甲基氨基甲酰基苄基和O-苯氧基乙酰基醚。尤其优选的是叔丁基、苄基和9-芴基甲基醚，叔丁基是最优选的。
用于除去保护基的裂解剂取决于保护基性质并在本领域中是熟知的。
优选的Ser羟基保护基P4的裂解剂是：
·三氟乙酸(TFA)、HCl或甲磺酸，尤其用于叔丁基醚作为保护基
·H2/Pd-C、HF或三氟甲磺酸，尤其用于苄基醚作为保护基，和
·SiCl4/苯甲醚，尤其用于2-(甲基亚磺酰基)苄基醚作为保护基；
优选的用于氨基保护基P8的裂解剂是：
·三氟乙酸(TFA)、HCl或甲磺酸，尤其用于氨基甲酸叔丁酯作为保护基
·H2/Pd-C、HF或三氟甲磺酸，尤其用于氨基甲酸苄酯作为保护基，和
·哌啶、DBU和DEA，尤其用于Fmoc作为保护基
优选的溶剂包括DCM、DMF、NMP、二烷，EtOH，无水(neat)HF和TFA。
尤其优选的是显示在下表1中的不同裂解条件：
表1：裂解条件
参考文献：Chem.Rev.2009，109，2465-2504(AlbertIsidro-Llobet)
典型地，将式II的前体在有或没有另外的溶剂下，在室温(20至25℃)溶解在裂解剂，优选TFA中达20至30小时，优选24小时。当保护基已被除去(优选地，转化率＞95％，产率，最优选＞99％)时，然后优选地将粗地加瑞克倒入缓冲的水-乙醇混合物中以提供粗地加瑞克的缓冲溶液，用于后续纯化。优选的pH的优选范围为2至4，更优选的范围为2.5至3.5，并且最优选为约3。
去保护步骤的具体实施方案显示在图12和实施例4(见步骤12)中。
纯化和冻干
优选地，使用色谱技术如制备型反相色谱法(RPC)来纯化粗地加瑞克的溶液。
然后优选地将所得的产物冻干。
3+7偶联
在另一方面，本发明还涉及一种用于液相制备由式(II)表示的中间体或其药用盐或溶剂化物的方法，所述方法包括以下步骤：将由式(III)表示的第一多肽或其盐
(P1)AA1-AA2-AA3(III)
与由式(IV)表示的第二多肽或其盐
AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IV)
在液体试剂介质中在肽偶联剂和任选的有机胺碱存在下进行偶联，从而形成由式(II)表示的十肽。在此情况中，AA1至AA10、P1、P4、P6和P8与式(II)的相同。所述盐包括酸性盐如盐酸盐和碱性盐如碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。
偶联反应在其中溶解有两种肽和肽偶联剂以及任选的有机胺碱的有机溶液中进行。也可以存在肽偶联添加剂和/或有机胺。
有机溶剂、肽偶联剂、肽偶联添加剂和有机胺碱可以是LPPS领域中已知的那些中的任何物质。
典型的有机溶剂是THF、NMP(N-甲基吡咯烷酮)、DCM、DMF、DMSO和它们的混合物。最优选的溶剂是DMSO。
典型的肽偶联剂是以下中的一种或多种：邻-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，邻-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，邻-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲(TBTU)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)(BOP)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷基(PyBOP)，N，N-双-(2-氧代-3-唑烷基)膦酰二氯(BOP-Cl)，六氟磷酸溴-三-吡咯烷基-(PyBroP)，氯甲酸异丁酯(IBCF)，1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)，1，3-二异丙基-碳二亚胺(DIC)，1-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(WSCDI)，N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)，氯甲酸异丙酯(IPCF)，2-(5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺基)-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲(TNTU)，丙基膦酸酐(PPAA)和2-琥珀酰亚胺基-1，1，3，3-四甲基四氟硼酸脲(TSTU)。
一种优选的偶联剂是DCC。DCC优选在没有有机胺下使用。在一个尤其优选的实施方案中，DCC联合DMSO一起使用。DCC优选相对于所述三肽以1.3至2，最优选1.4至1.6当量的量使用。
另一种优选的偶联剂是DIC，其优选联合6-氯-HOBt一起，任选地与铜盐一起使用。
典型的肽偶联添加剂是1-羟基-1H-苯并三唑(HOBt)、6-氯-HOBt和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)。
典型的有机胺碱是NMM、DIPEA、TEA和可力丁。
尤其优选的是使用DMSO作为溶剂并且DCC作为偶联剂来进行偶联反应。
偶联步骤的具体实施方案显示在图11和实施例4(见步骤11)中。
七肽的合成
式IV的化合物，即AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2，优选通过消除以下化合物IVa的保护基PN获得：
(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IVa)
而AA4至AA10、P4、P6和P8具有与以上相同的含义，而PN是N-端氨基保护基。在一个优选实施方案中，PN是可以通过氢化消除的保护基，例如使用氢和钯催化剂(如Pd/C)。最优选的保护基PN是苄氧基羰基(Z)。
PN的消除步骤的具体实施方案显示在图11和实施例4(见步骤11)中。
式(IVa)的化合物可以通过偶联由式(V)表示的多肽与由式(VI)表示的多肽、或这些化合物中的一种或两种的盐来获得，
(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7(V)
AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(VI)
其中AA4至AA10、P4、P6和P8与式(IVa)的相同。偶联反应在其中溶解了该两种肽和肽偶联剂的有机溶液中进行。也可以存在肽偶联添加剂和/或有机胺。可以使用与如上所述相同的肽偶联剂、有机溶剂、肽偶联添加剂和有机胺。在一个优选实施方案中，DCC用作偶联剂，任选地利用乙酸乙酯作为溶剂。
式V的四肽的合成
在一个优选实施方案中，式V的四肽，即(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7，通过包括以下步骤的方法制备：
(a)提供(PN2)AA5-AA6(P6)-AA7(PC)，其中P6具有与以上式IVa中相同的含义，(PN2)是N-端氨基保护基或氢，并且(PC)是可以通过氢化裂解的C-端羧基保护基；
(b)如果存在，除去氨基保护基(PN2)；
(c)氢化H-AA5-AA6(P6)-AA7(PC)以获得H-AA5-AA6(P6)-AA7；并且
(d)使H-AA5-AA6(P6)-AA7与(PN)AA4(P4)的活化酯反应以提供(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7，其中(P4)是羟基保护基或氢，P6是氢或氨基保护基，并且PN是可以优选通过氢化消除的保护基，例如使用氢和钯催化剂(如Pd/C)。
最优选的保护基PN是苄氧基羰基(Z)。
优选的(PN)AA4(P4)的活化酯是4-硝基苯基酯(ONp)。
因此，优选地，所述苄基酯在AA5-AA7中间体中被除去从而提供N-和C-未保护的AA5-AA7。然后使此三肽与预先活化的丝氨酸(例如Z-Ser(tBu)-ONp)反应。
地加瑞克制备
本发明因此涉及地加瑞克的制备，上述去保护步骤是该制备的必需步骤。在一个优选实施方案中，该去保护步骤在上述3+7偶联之后。在一个甚至更优选的实施方案中，所述3+7偶联在上述的七肽合成之后，即所述方法包括以下步骤：
a)合成AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2，或其盐或溶剂化物；
b)将AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2和(P1)AA1-AA2-AA3进行偶联以提供(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)，或其盐或溶剂化物；
c)使(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2)或其盐或溶剂化物去保护，从而提供地加瑞克或其溶剂化物或盐。
AA1至AA10和P1、P4、P6和P8具有与如上所定义的相同含义。
在一个尤其优选的实施方案中，
·P1是乙酰基；
·P4是用TFA、优选tBu可裂解的保护基；
·P6是氢或用TFA、优选tBu可裂解的保护基；
·P8是用TFA、优选Boc可裂解的保护基。
在最优选的实施方案中，使用上述的七肽合成来制备七肽。此外，优选地，去保护步骤之后是以上所述的纯化和冻干方法。
在地加瑞克或其前体的合成中，并且尤其是在所有包含具有氢化乳清酰部分的肽的步骤中，pH优选保持低于9，优选低于8.5，甚至更优选低于8。优选使用弱碱如NaHCO3用于pH调节。尤其优选的是，偶联步骤后的所有萃取在2至9、优选2.5至8的pH范围内进行(见实验部分中的步骤6、7、10和11)。另外优选在萃取或洗涤步骤之前加入C4-5脂肪族醇如正丁醇或2-丁醇。
中间体
本发明还涉及由式(II)至(VI)表示的多肽，其可用于本发明的液相制备方法。
式(II)的优选实施方案
(P1)AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(II)
表2
化合物 P1 P4 P6 P8
IIa Ac tBu tBu Fmoc
IIb Ac tBu tBu Boc
IIc Ac H H Alloc
IId Ac H H Boc
IIe Ac tBu H Boc
IIf Boc tBu tBu Fmoc
IIg Fmoc tBu tBu Boc
IIh Boc tBu H Fmoc
IIi Fmoc tBu H Boc
IIj Ac H tBu Boc
IIk Ac H tBu Fmoc
IIl Ac H H Fmoc
优选的实施方案包括这些化合物的盐。
式(III)的优选实施方案
(PN)AA1-AA2-AA3(III)
表3
化合物 PN
IIIa Ac
IIIb Boc
优选的实施方案包括这些化合物的盐。
式(IV)/(IVA)的优选实施方案
(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IV)
表4
化合物 P4 P6 P8 PN
IVa tBu tBu Fmoc H
IVb tBu tBu Boc H
IVc H H Alloc H
IVd H H Boc H
IVe tBu H Boc H
IVf H H Fmoc H
IVg tBu H Fmoc H
IVh tBu tBu Fmoc Z
IVi tBu tBu Boc Z
IVj H H Alloc Z
IVk H H Boc Z
IVl tBu H Boc Z
IVm H tBu Boc Z
IVn H H Fmoc Z
IVo tBu H Fmoc Z
IVp H tBu Fmoc Z
优选的实施方案包括这些化合物的盐。
式(V)的优选实施方案
(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7(V)
表5
化合物 P4 P6 PN
Va tBu tBu Z
Vb tBu H Z
Vc H tBu Z
Vd H H Z
优选的实施方案包括这些化合物的盐和溶剂化物。
式(VI)的优选实施方案
AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(VI)
表6
化合物 P8
VIa Boc
VIb Alloc
Vic Fmoc
当保护基不存在时，官能团是去保护的基团(例如＞NH)。
优选的实施方案包括这些化合物的盐。
实验部分
实验部分中使用的材料
实验部分中使用的材料列于以下。
化学品：
氨水NH3(aq)
乙腈C2H3N
正丁醇C4H10O
2-丁醇C4H10O
异丙醇(isopropanol)C3H8O
乙酸丁酯C5H12O2
乙醇，99.9％C2H6O
甲醇CH4O
庚烷C7H16
净化水H2O
乙酸乙酯C3H8O2
乙酸C2H4O2
乙酸铵C2H7NO2
乙酰基咪唑C5H6N2O
三乙胺C6H15N
N-甲基吗啉C5H11NO
N-甲基吡咯烷酮C5H9NO
N，N′-二环己基碳二亚胺C13H22N2
二环己基胺C12H23N
N，N′-二异丙基碳二亚胺C7H14N2
N，N-二甲基乙二胺C4H12N
N，N-二甲基甲酰胺C3H7NO
二价亚砜C2H6OS
1-羟基苯并三唑C6H5N3O
对硝基苯酚C6H5NO3
N-羟基琥珀酰亚胺C4H5NO3
氯甲酸异丁酯C5H9ClO2
氯化钠NaCl
氢氧化钠水溶液，NaOH(aq)
盐酸水溶液，HCl(aq)
磷酸H3PO4
硫酸氢钠NaHSO4
碳酸氢钠NaHCO3
甲磺酸CH4SO3
三氟乙酸C2HF3O2
炭负载钯，5％Pd-C
氢气H2
甲苯C7H8
起始材料：
实施例1：中间体Ac(1-3)ONa：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7]的合成
Boc-D-4Cpa-OH的活化和分离
步骤1(反应步骤)
将Boc-D-4Cpa-OH(299.75g)溶解在iPrOH(3.53kg)中，将该混合物搅拌并加入HOSu(0.184kg)和DIC(0.164kg)，并在0℃搅拌1小时。将沉淀滤出并用iPrOH洗涤。固体在减压下干燥从而得到Boc-D-4Cpa-OSu[1]。
Boc-D-2Nal-OH的活化和分离
步骤2(反应步骤)
将Boc-D-2Nal-OH(315.38g)溶解在iPrOH(5.35kg)中并加入IBC(157.07g)和NMM(116.7g)。在冷却至-10℃后，加入水(42mL)、iPrOH(1.1kg)和HOSu(230.14g)的混合物以及另外的NMM(10.11g)，并将该混合物搅拌30min。加入水(0.82L)并将沉淀滤出，并用iPrOH洗涤并在减压下干燥从而得到Boc-D-2Nal-OSu[2]。
合成Boc(2-3)OH：Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH
步骤3(反应步骤)
将来自步骤1的H-D-3Pal-OHx2HCl(0.251kg)和Boc-D-4Cpa-OSu[1](0.397kg)溶解在DMSO(3.33L)中并加入NMM(318.8g)。将该混合物在20℃搅拌6小时。加入水(17L)并通过加入HCl将pH调至pH4.25。将沉淀滤出，并分散在水中。然后将获得的浆体(slurry)过滤并用水洗涤。固体在减压下干燥从而得到生Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH[3]。
合成中间体Ac(1-3)ONa：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7](式IIIa的化合物)
步骤4(反应步骤)
将来自步骤3的Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH[3](447.93g)溶解在AcOEt(3.4L)和AcOH(675mL)的混合物中，将该混合物在5℃冷却，其后加入MSA(672.77g)。反应在10℃继续2小时并向该溶液加入TEA(1214.28g)从而得到H-D-4Cpa-D-3Pal-OH[4]。
将来自步骤2的Boc-D-2Nal-OSu[2](412.44g)添加到H-D-4Cpa-D-3Pal-OH[4]中，在20℃搅拌24小时。加入25％NH3水溶液(0.154L)和正丁醇(4.5L)，并将该混合物在45℃搅拌1小时。
溶液用以下进行洗涤：
·水
·pH9.5的水(在搅拌的同时用NaOH水溶液调节pH)
·水
将AcOH(4.5L)加入到有机相中并将该溶液在减压下浓缩至油状物。将该油状物重新溶解在AcOH(4.5L)中，并在减压下再次浓缩从而得到作为油状物的Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[5]。
将Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[5]溶解在水(0.09L)和AcOH(1.8L)中。加入MSA(672.77g)并将该混合物在低于35℃下搅拌2小时。该溶液用TEA(779.16g)中和。将溶液在减压下浓缩至油状物。将该油状物重新溶解在甲苯(2.5L)中并在减压下再次浓缩至油状物。重复最后一个步骤从而得到H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[6]。
将H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[6]溶解在甲苯(2.0L)中并加入乙酰基咪唑(132.14g)在甲苯(0.25L)中的溶液。将溶液在20℃搅拌2小时，并加入水(0.1L)。
加入正丁醇(4.5L)，并将该有机混合物在35℃用以下进行洗涤：
·5％NaCl水溶液
·甲醇和酸性pH5.5的水(在搅拌的同时用NaOH水溶液调节pH)
·甲醇和pH11的水(在搅拌的同时用NaOH水溶液调节pH)
·甲醇和10％NaCl水溶液
向来自萃取的搅拌的有机相中，在20℃在1小时内加入庚烷(15L)，并将所得的混悬液在20℃保持搅拌1小时。沉淀通过过滤分离，并将其混悬在庚烷(3.5L)中。再次过滤该混悬液。重复最后的用庚烷的洗涤步骤和过滤。然后将固体在减压下干燥从而得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7]。
实施例2：中间体Z(4-7)OHxDCHA：Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D- 4Aph(tBuCbm)-Leu-OHxDCHA[15]的合成
合成中间体Boc(6-7)OBzl：Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl
步骤5(反应步骤)
将Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OH(379.45g)溶解在NMP(0.76L)和AcOEt(4.4kg)中。在于-4℃冷却后，加入IBC(150.2g)和NMM(101.1g)，并将溶液在-7℃搅拌0.5小时从而得到Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct[8]。
将H-Leu-OBzlxTOS(491.88g)溶解在NMP(1.5L)中并加入AcOEt(2.7kg)，之后加入NMM(126.4g)。随后将此溶液转移至Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct[8]，并在-10℃搅拌1小时。然后，加入水(0.5L)。
反应混合物在20℃用以下进行洗涤：
·pH8.5的水(在搅拌的同时用NaOH水溶液调节pH)
·pH2.0的水(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·水
将有机相在减压下浓缩至油状物。将该油状物重新溶解在AcOEt(0.6kg)中并在减压下再次浓缩至油状物。将剩余的油状物溶解在AcOEt(0.6kg)中。在20℃在搅拌的同时加入庚烷(15.5L)。通过过滤分离沉淀，并用庚烷洗涤，随后在减压下干燥从而得到Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[9]。
合成Boc-(5-7)-OBzl：Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl
步骤6(反应步骤)
将来自步骤5的Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[9](582.7g)溶解在AcOEt(3.15kg)中。加入MSA(481g)，并在低于15℃搅拌5小时，并加入TEA(406g)。加入DMF(0.333kg)，之后加入TEA(101g)和NMM(51g)从而得到H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[10]。
将Boc-4Aph(L-Hor)-OH(462.46g)溶解在DMF(2.09kg)和AcOEt(1.44kg)中。加入IBC(150.24g)和NMM(111.27g)，并在-10℃搅拌0.5h从而得到Boc-4Aph(L-Hor)-OAct[11]。
将H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[10]添加到Boc-4Aph(L-Hor)-OAct[11]中，并在-10℃搅拌1.5小时。然后，加入AcOEt(5.4kg)和正丁醇(6.0L)。
有机相在20℃用以下进行洗涤：
·约pH8的5％NaHCO3水溶液(在搅拌的同时用NaHCO3水溶液调节调节pH)
·pH2.5的10％NaCl水溶液(在搅拌的同时用H3PO4水溶液调节pH)
将DMF(0.9L)加入到有机相中，然后将其在减压下浓缩至油状物。在搅拌的同时将溶液倒入水(14L)中。在过滤器上分离沉淀，并用水洗涤。固体在减压下干燥从而得到Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[12]。
合成中间体Z(4-7)OHxDCHA：
Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OHxDCHA(式Va的化合物)
步骤7(反应步骤)
将来自步骤6的Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[12](885.02g)加入到MSA(961.1g)和AcOEt(7.2kg)的混合物中并加入2-丁醇(2L)，并且将所得的混合物在0℃搅拌6小时。然后用TEA(909.0g)中和MSA。
加入分散在2-丁醇(1L)中的5％Pd/C(88.5g)并将混合物在压力下在20℃氢化3小时。然后，将Pd/C滤掉，并用2-丁醇洗涤从而得到含有H-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH[13]的溶液。
将Z-Ser(tBu)-OH(413.5g)溶解在MeCN(2.5L)中并将该溶液冷却至-5℃。加入HONp(195g)，之后加入DCC(278.5g)，并将该混合物在20℃搅拌24小时。然后将混合物过滤，并用MeCN洗涤从而得到Z-Ser(tBu)-ONp[14]。
将NMM(354.2g)、DMF(4.75kg)和Z-Ser(tBu)-ONp[14]加入到H-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH[13]的溶液中，并将该混合物在20℃保持搅拌3天。
所得的混合物用以下进行洗涤：
·pH2.5的10％NaCl水溶液(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·酸性pH(pH2.5)的水(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·7.5％NaHCO3水溶液
·5％NaCl水溶液(pH2.5)(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·10％NaCl水溶液
向最终的有机相中加入DCHA(181g)并将有机相在减压下浓缩至油状物。将该油状物重新溶解在iPrOH(3.14kg)中并在减压下再次浓缩至油状物。将剩余的油状物重新溶解在iPrOH(3.14kg)中，并在搅拌的同时将该溶液倒入AcOEt(31.5kg)中。在20℃继续搅拌1小时直至沉淀，然后通过过滤分离沉淀，并用AcOEt洗涤。将固体在减压下在30℃干燥30小时从而得到Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OHxDCHA[15]。中间体Z(4-7)OHxDCHA[15]的纯度≥80％(HPLC)。
步骤7中间体Z(4-7)OH[15]
实施例3：中间体H(8-10)NH 2 ：H-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH 2 [21]的合成
合成Boc(9-10)NH2：Boc-Pro-D-Ala-NH2
步骤8(反应步骤)
将Boc-Pro-OH(226.02g)溶解在iPrOH(1.73kg)中。将反应混合物冷却至-5℃。加入IBC(143.4g)和NMM(106.2g)，并将混合物在5℃搅拌0.5小时从而得到Boc-Pro-OAct[16]。
将H-D-Ala-NH2xHCl(124.57g)混悬于iPrOH(1.57kg)和NMM(106.2g)的混合物中。将该混悬液加入到Boc-Pro-OAct[16]中。将反应混合物在10℃保持搅拌3小时。然后加入DMEDA(10.6ml)。将混合物过滤，并将滤液在减压下浓缩至油状物。将该油状物用AcOEt(1.125kg)新溶解并再次浓缩。
将残留的油状物溶解在AcOEt(1.8kg)和正丁醇(0.6L)的混合物中。有机相用以下进行洗涤：
·pH2.5的15％NaCl水溶液(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·pH9.5的15％NaCl水溶液(在搅拌的同时用NaOH水溶液调节pH)
将有机相在减压下浓缩，重新溶解在AcOEt(1.08kg)中并再次浓缩至油状物。
在20℃加入AcOEt(0.33kg)和庚烷(0.75L)的混合物并搅拌16小时。将所得的沉淀过滤并在过滤器上用AcOEt和庚烷的混合物洗涤。然后将固体在减压下干燥从而得到Boc-Pro-D-Ala-NH2[17]。
合成中间体H(8-10)NH2：H-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2(式VIa的化合物)
步骤9(反应步骤)
将来自步骤8的Boc-Pro-D-Ala-NH2[17](313.89g)溶解在MSA(528.61g)和iPrOH(0.785kg)的混合物中，并将该溶液在45℃搅拌1小时。然后用TEA(607.14g)将该混合物中和从而得到H-Pro-D-Ala-NH2[18]。
将Z-Lys(iPr，Boc)-OHxDCHA(603.83g)混悬在AcOEt(1.17kg)中并用以下进行洗涤：
·12％NaHSO4水溶液
·水
·15％NaCl水溶液
将来自萃取的Z-Lys(iPr，Boc)-OH[19]的有机相加入到H-Pro-D-Ala-NH2[18]中。加入溶解在AcOEt(0.135kg)中的HOBt(183.79g)和DCC(227.0g)，并将该混合物在20℃搅拌0.5小时。然后，加入水(0.2L)。将该混合物过滤并用AcOEt洗涤。将合并的滤液在减压下浓缩至油状物。将该油状物溶解在AcOEt(0.9kg)中，过滤并将该溶液用以下进行洗涤：
·pH2.5的水(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·pH9的水(在搅拌的同时用NaOH水溶液调节pH)
·pH7的10％NaCl水溶液(在搅拌的同时用HCl水溶液或NaOH水溶液调节pH)
将有机相在减压下浓缩从而得到Z-Lys(iPro，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[20]。
将Z-Lys(iPro，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[20]溶解在乙醇(0.04kg)和水(0.5L)中，并加入5％Pd/C(50g)。通过加入6MHCl将浆体酸化至pH2.5，并在20℃氢化。在反应完成后，通过过滤除去催化剂，并通过加入32％NaOH将pH升至pH7.0。随后通过在减压下蒸发除去乙醇。将正丁醇(1L)加入到所得的水相中，并且用NaOH水溶液将pH调节至碱性pH9，并开始萃取。重复该步骤。将合并的有机相在减压下浓缩至油状物。
将该油状物溶解在AcOBu(0.5L)中，在减压下在20℃浓缩并重新溶解在AcOBu(0.5L)中。然后，在50℃在1小时内加入庚烷(2L)。将混悬液在0℃保持搅拌16小时。通过过滤分离沉淀并用庚烷洗涤。最后，固体在减压下干燥从而得到H-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[21]。中间体H(8-10)NH2[21]的纯度≥95％(HPLC)。
步骤9中间体H(8-10)NH2[21]
实施例4：片段缩合至最终中间体(式II的化合物)
中间体Z(4-10)NH2：Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22](式IVg的化合物)
步骤10(反应步骤)
将来自步骤7的Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OHxDCHA[15](1153.41g)溶解在DMF(2.1kg)中。然后，将HOBt(153.2g)连同AcOEt(6.9kg)和来自步骤9的H-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[21](569.5g)一起加入。当所有固体溶解时，加入MSA(96.1g)。将溶液冷却至低于5℃并加入溶解在AcOEt(0.810kg)中的DCC(309.5g)。将温度升至20℃并将反应继续24小时。Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OHxDCHA[15]的转化率为≥96％(HPLC)。加入AcOEt(4.95kg)和水(5.5L)，并搅拌混合物，并过滤。在搅拌的同时，将7.5％NaHCO3(aq)(35L)加入到滤液中。分离各相并将有机层用以下进一步洗涤：
·7.5％NaHCO3
·pH3的水(在搅拌的同时用HCl水溶液调节pH)
·水
将最终的有机相在减压下浓缩至油状物。利用EtOH(0.405kg)并且随后利用AcOEt(0.45kg)将该油状物再次浓缩。将剩余的油状物溶解在EtOH(0.405kg)中，并加入AcOEt(0.45kg)和AcOBu(4.6L)。在20℃在1小时内将该溶液加入到庚烷(27.6L)中。然后，过滤沉淀，并用庚烷洗涤。固体在减压下最大程度地干燥从而得到Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22]。Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22]的纯度≥70％(HPLC)。
最终中间体Ac(1-10)NH2：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24]
步骤11(反应步骤)
将来自步骤10的Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22](1409.67g)加入到EtOH(10.98kg)和水(3.2L)的混合物中，并进行搅拌直到溶液均质。加入5％Pd/C(211g)。在20℃在利用HCl水溶液将pH控制在pH2.5下将混合物进行氢化。
通过过滤除去催化剂，并利用NaOH水溶液将pH调至pH3.8。将滤液在减压下浓缩至油状物。将EtOH(4.7kg)加入到该油状物中并再次浓缩。然后，将AcOEt(5.4kg)加入到该油状物中并再次浓缩，并再次重复这个过程从而得到H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23]。
将H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23]分散在AcOEt(1.125kg)中，然后加入HOBt(153.16g)并将混合物冷却至0℃。将来自步骤4的Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-ONa[7](609.05g)溶解在DMSO(2.5L)中，将该溶液与含有H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23]的浆体混合，并加入溶解在AcOEt(0.45kg)中的DCC(309.5g)。将混合物在5℃搅拌24小时。[23]的转化率≥96％(HPLC)。
加入水(150mL)和DMSO(0.5L)并在20℃继续搅拌超过3小时。将沉淀过滤，并用AcOEt和DMSO的混合物洗涤。将滤液合并，并加入正丁醇(17L)。该有机溶液用以下进行洗涤：
·pH2.5的水(在搅拌的同时HCl水溶液用调节pH)
·7％NaHCO3(aq)
·10％NaCl水溶液(如果需要，在搅拌的同时利用HCl水溶液将混合物的pH中和至pH7.0)
加入DMF(4.75kg)并将有机相在减压下浓缩至油状物。在20℃在1小时内在剧烈搅拌下将该油状物缓慢加入到水(50L)中。在过滤器上分离沉淀，并用水洗涤两次。随后将固体在减压下干燥从而得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24][最终中间体]。[24]的纯度≥70％(HPLC)
实施例5：最终中间体Ac(1-10)NH 2 去保护而得到粗地加瑞克[25]
步骤12(反应步骤)
将来自步骤11的Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr，Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24](式IIb的化合物)(1844.59g)在20℃溶解在TFA(28.3kg)中。将溶液在20℃搅拌24小时(除去3个保护基)。[24]的转化率≥99％(HPLC)。
然后将反应混合物与水(74L)、AcONH4(19.1kg)、AcOH(18.4L)和EtOH(14.52kg)的冷溶液(低于10℃)混合。在两种溶液混合期间，将温度保持在低于25℃。如有必要，用TFA或AcONH4将最终溶液的pH调节至pH3，从而得到Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2[25][粗地加瑞克]的溶液。
步骤13(纯化和冻干)
将粗地加瑞克的溶液泵送通过反相柱。利用EtOH/在水中的0.12％TFA的梯度将地加瑞克从柱上洗脱。使用EtOH/在水中的1％AcOH的梯度在反相柱上再次纯化纯度≥95％的馏分。将高纯度的馏分进行冻干。

Claims (13)

1.一种用于液相制备由式(II)表示的十肽或其药用盐或溶剂化物的方法，
(P1)AA1-AA2-AA3-(P4)AA4(P4)-AA5-(P6)AA6(P6)-AA7-(P8)AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(II)
其中AA1是D-2Nal，AA2是D-4Cpa，AA3是D-3Pal，AA4是Ser，AA5是4Aph(L-Hor)，AA6是D-Aph(Cbm)，AA7是Leu，AA8是Lys(iPr)，AA9是Pro，AA10是D-Ala；
P1是氨基保护基或乙酰基；
P4是氢或羟基保护基；
P6是氢或氨基保护基；并且
P8是氨基保护基，
所述方法包括以下步骤：将由式(III)表示的第一多肽或其盐
(P1)AA1-AA2-AA3(III)
与由式(IV)表示的第二多肽或其盐
AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7–AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IV)
在液体试剂介质中在肽偶联剂存在下进行偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中P1是乙酰基；P4是羟基保护基，P6是氢或氨基保护基；并且P8是氨基保护基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其后面是以下步骤：使根据式II的地加瑞克前体、或其盐或溶剂化物经过用裂解剂的处理，
其中，
P1是氨基保护基；
P4是氢或羟基保护基；
P6是氢或氨基保护基；并且
P8是氨基保护基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中P1是乙酰基；P4是羟基保护基，P6是氢或氨基保护基；并且P8是氨基保护基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中P1是乙酰基；P4是tBu，P6是氢或tBu，并且P8是Boc。
6.一种用于制备由式(IV)表示的多肽的方法，
(P4)AA4–AA5-AA6(P6)–AA7–AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(IV)
其中，
P4是氢或羟基保护基；
P6是氢或氨基保护基；并且
P8是氨基保护基，
所述方法通过将由式(V)表示的多肽或其盐或溶剂化物与由式(VI)表示的多肽或其盐或溶剂化物进行偶联，
(PN)AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7(V)，
AA8(P8)-AA9-AA10-NH2(VI)
然后除去去保护基PN，其中AA4至AA10、P4、P6和P8与权利要求1中的相同，并且PN是能够通过氢化除去的保护基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中PN是苄氧基羰基，其通过在Pd/C催化剂存在下氢化化合物(PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2而被除去。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中所述由式(IV)表示的多肽随后用于根据权利要求1-5中任一项的方法。
9.一种用于制备化合物(PN)AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7的方法，其中AA4至AA7、P4和P6与权利要求1中的相同，并且PN是能够通过氢化除去的保护基，所述方法包括以下步骤：
(a)提供(PN2)AA5-AA6(P6)–AA7(PC)，其中P6具有如上所述的相同含义，(PN2)是N-端氨基保护基或氢，并且(PC)是能够通过氢化裂解的C-端羧基保护基；
(b)除去如果存在的氨基保护基(PN2)；
(c)氢化H-AA5-AA6(P6)–AA7(PC)以获得H-AA5-AA6(P6)–AA7；并且
(d)使H-AA5-AA6(P6)–AA7与(PN)AA4(P4)的活化酯反应，从而提供(PN)AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7，其中AA4具有如上所述的相同含义，(P4)是羟基保护基或氢，并且PN是能够通过氢化消除的保护基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中地加瑞克溶液通过根据权利要求1-5中任一项所述的方法获得。
11.根据权利要求1、6或9所述的方法，其中将pH保持低于9。
12.根据权利要求11所述的方法，其中将pH保持低于8。
13.由以下各式表示的多肽化合物：
AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7–AA8(P8)-AA9-AA10-NH2,
(PN)AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7–AA8(P8)-AA9-AA10-NH2
(PN)AA4(P4)–AA5-AA6(P6)–AA7
或盐或溶剂化物，
其中AA4是Ser，AA5是4Aph(L-Hor)，AA6是D-Aph(Cbm)，AA7是Leu，AA8是Lys(iPr)，AA9是Pro，AA10是D-Ala；
P4是氢或羟基保护基；
P6是氢或氨基保护基；并且
P8是氨基保护基，并且PN是保护基。
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