BR112013010360B1 - Processos para produção de polipeptídeos, processos para preparar degarelix, e compostos de polipeptídeo - Google Patents

Processos para produção de polipeptídeos, processos para preparar degarelix, e compostos de polipeptídeo Download PDF

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Abstract

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE DEGAREALIX E SEUS INTERMEDIÁRIOS. A presente invenção refere-se a um processo de produção de fase líquida (ou solução) para preparação de decapeptídeo de Degarelix, seu precursor protegido, e outros intermediários últeis. A invenção adicionalmente se refere a polipeptídeos úteis no processo de produção de fase de solução, e à purificação do próprio Degarelix. O Degarelix pode ser obtido pela sujeição de um precursor de Degarelix, de acordo com a fómula (II): (P1) AA1-AA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9- AA10-NH2 (II), ou um sal ou solvato deste, a um tratamento com um agente de clivagem em um solvente orgânico, em que P1 é um grupo de proteção de amino; preferivelmente acetila; P4 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de hidroxila, preferivelmente um grupo de proteção de hidroxila; P6 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de amino; preferivelmente um grupo de proteção de amino; e P8 é um grupo de proteção de amino.

Description

[Campo Técnico]
[0001] A presente invenção se refere a um processo de produção de fase líquida (ou solução) para preparação de decapeptídeo de Degarelix, seu precursor protegido, e outros intermediários úteis. A invenção adicionalmente se refere a polipeptídeos úteis no processo de produção fase de solução e à purificação do próprio Degarelix.
[Antecedentes da Invenção]
[0002] O câncer de próstata é uma causa condutora de morbidez e mortalidade de homens no mundo industrializado. Degarelix, também conhecido como FE200486, é um antagonista de receptor de hormônio de liberação de gonadotropina de terceira geração (GnRH) (um bloqueador de GnRH) que foi desenvolvido e recentemente aprovado para pacientes com câncer de próstata em necessidade de terapia de ablação de andrógeno (Doehn et al., Drugs 2006, vol. 9, No. 8, pp. 565-571; WO 09846634). O Degarelix age por bloqueio imediato e competitivo de receptores de GnRH na pituitária e, similar a outros antagonistas de GnRH, não causa uma estimulação inicial de produção de hormônio de luteinização, via o eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal, e, portanto, não causa aumento repentino de testosterona ou ostentação clínica (Van Poppel, Cancer Management and Research, 2010:2 39-52; Van Poppel et al., Urology, 2008, 71(6), 1001-1006); James, E.F. et al., Drugs, 2009, 69(14), 1967-1976).
[0003] O Degarelix é um decapeptídeo linear sintético contendo sete amino ácidos não naturais, cinco dos quais são D-amino ácidos. Ele tem dez centros quirais no suporte do decapeptídeo. O resíduo de amino ácido na posição 5 na sequência tem um centro quiral adicional na substituição de cadeia lateral dando onze centros quirais no total. Seu número de registro no CAS é 214766-78-6 (de base livre) e é comercialmente disponível sob a Marca comercial Firmagon™. A substância de fármaco é quimicamente designada como D- Alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-alanil-4-cloro-D-fenilalanil-3-(3- piridinil)-D-alanil-L-seril-4-[[[(4S)-hexahidro-2,6-dioxo-4- pirimidinil]carbonil]amino]-L-frenilalanil-4-[(aminocarbonil)amino]-D- fenilalanil-L-leucil-N6-(l-metiletil)-L-lisyl-L-prolil- e é representada pela estrutura química abaixo (em seguida também referida como Fórmula I):
Figure img0001
[0004] A estrutura do Degarelix pode também ser representada como:
[0005] Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)- Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2
[0006] onde Ac é acetil, 2Nal é 2-naftilalanina, 4Cpa é 4- clorofenilalanina, 3Pal é 3-piridilalanin, Ser é serina, 4Aph é 4- aminofenilalanina, Hor é hidroorotil, Cbm é carbamoil, Leu é leucina, Lys(iPr) é N6-isopropilisina, Pro é prolina, e Ala é alanina.
[0007] Para a proposta de descrever esta invenção, cada amino ácido no Degarelix será dado a notação conforme segue:
[0008] AA1 é D-2Nal, AA2 é D-4Cpa, AA3 é D-3Pal, AA4 é Ser, AA5 é 4Aph(L-Hor}, AA6 é D-Aph(Cbm), AA7 é Leu, AAs é Lys(iPr), AA9 é Pro e AA10 é D-Ala.
[0009] Desse modo, como um exemplo, Degarelix pode ser representado como AC-AAI-AAÍIO-NH2, o tetrapeptídeo Ac-D-2Nal-D- 4Cpa-D-3Pal-Ser pode ser representado como Ac-AA1-AA4 e o hexapeptídeo 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2 como AA5-AA10-NH2.
[00010] Degarelix foi previamente preparado usando metodologia de síntese de peptídeo de fase sólida-Boc (SPPS) conforme reportado em WO 98/46634 and Jiang et al., J. Med. Chem. 2001,44, 453-467.
[00011] Basicamente, Boc-protegido D-Ala é primeiro acoplado a resina MBHA em dimetilformamida (DMF)/CH2Cl2 usando diisopropilcarbodiimida (DIC) e 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) como agentes de ativação ou de acoplamento. Uma vez que D-Ala é acoplada à resina, a síntese procede por lavagem, desbloqueio e, em seguida, acoplamento do próximo resíduo de amino ácido até que o decapeptídeo tenha sido completado. Os grupos amino primários de cadeia lateral de 4Aph na posição-5, e de D-4Aph na posição-6, são protegidos por Fmoc quando eles são adicionados e modificados com L-Hor e Cbm, respectivamente, antes do próximo amino ácido na cadeia ser adicionado. Isto requer as etapas adicionais de primeiro remover a proteção de cadeia lateral com piperidina, reação do grupo amino recentemente livrado no peptidoresina com terc-butil isocianato, ou ácido L-hidroorótico, assegurando que a reação seja completa com um teste de ninhidrina e, em seguida, lavagem do peptidoresina antes da adição do próximo resíduo de amino ácido (ver, também, Sorbera et al., Drugs of the Future 2006, Vol. 31, No. 9, pp 755-766).
[00012] Enquanto que a metodologia de Boc-SPPS tem proporcionado quantidades suficientes de Degarelix até agora, a demanda de crescimento para este polipeptídeo significa que quantidades ainda maiores são requeridas. Boc-SPPS, que requer clivagem de HF, não é adequado para síntese de grande escala industrial. De fato, WO 98/46634 menciona que SPPS é somente adequado para quantidades limitadas de até 1 kg, enquanto que síntese de solução de peptídeo clássica, ou síntese de peptídeo de fase líquida (LPPS), é preferida para quantidades maiores de produto. WO 98/46634 não especifica como tal síntese deve ser realizada. Enquanto que a existência de uma síntese de peptídeo de fase líquida de Degarelix foi reportada [EMEA Report: Assessment Report for Firmagon™ (Degarelix): Doc. Ref. EMEA/CHMP/635761/2008], como de agora, nenhum detalhe de tal processo foi publicamente revelado.
[00013] WO 97/34923 e WO 99/26964 são documentos relacionados a processos de fase líquida para a preparação de peptídeos biologicamente ativos. WO 99/26964 é particularmente relacionado com a síntese de fase líquida de decapeptídeos tendo atividade como antagonistas de GnRH. WO 99/26964 lista um número de limitações inerentes da metodologia de SPPS para produção de antagonistas de GnRH, incluindo a capacidade limitada da resina, o grande excesso de reagentes, e amino ácidos requeridos, bem como a necessidade de proteger todas as cadeias laterais reativas, tal como o grupo hidroxi em Ser, os grupos amino aromático em Aph e D-Aph, o grupo ε-i- propilamino em Lys(i-Pr).
[00014] WO 99/26964 propõe um processo de fase líquida que envolve primeiro preparação dos fragmentos de peptídeo central das posições 5 e 6 de um decapeptídeo com as cadeias laterais totalmente elaboradas e, em seguida, reunindo o peptídeo através de um padrão de reunião de fragmento "4-2-4", "3-3-4" ou "3-4-3". Por exemplo, na preparação do antagonista de GnRH Azalina B, um tetrapeptídeo é acoplado com um hexapeptídeo para formar o decapeptídeo desejado. Quando o mesmo padrão de reunião de fragmento é tentado para Degarelix, a racemização do amino ácido Ser (AA4) ocorre, resultando em cerca de 20% de impureza de L-Ser. Esta impureza é transportada no decapeptídeo final, e é difícil de remover. Adicionalmente, quando da preparação do tetrapeptídeo AA2-AA4 pela adição da unidade de Ser ao tripeptídeo AA1-AA3, seguindo o procedimento descrito em WO 99/26964, íons de tetrabutilamônia a partir da hidrólise do grupo benzil éster não são removidos completamente durante as operações subsequentes, e foram transportados através do produto final. Foi adicionalmente verificado que na síntese de Degarelix, o grupo de L-hidroorotil rearranja a seu análogo de hidantoinacetil quando ácido L- dihidroorótico é acoplado com 4Amp para preparar AA5. Estes e outros problemas com a síntese de fase de solução de Degarelix foram agora superados, e uma nova síntese de polipeptídeo de fase de solução deste decapeptídeo é aqui revelada pela primeira vez. [Sumário da invenção]
[00015] Os problemas de métodos de SSPS para preparação de Degarelix e os problemas de métodos de LLPS conforme descritos em WO 97/34923 e WO 99/26964, foram agora superados e são o objetivo desta invenção.
[00016] Em geral, esta invenção se refere a uma síntese de fase líquida do decapeptídeo Degarelix.
[00017] Em um aspecto, a invenção se refere a um processo de fase líquida para preparação de Degarelix tendo a fórmula Ac-AA1AA10- NH2, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato deste, compreendendo a etapa de submeter um precursor de degarelix de acordo coma seguinte fórmula II, ou um sal ou solvato deste, a um tratamento com a agente de clivagem:
Figure img0002
[00018] O composto de Fórmula II, desse modo, corresponde a
[00019]
Figure img0003
[00020] onde AA1 a AA10 são os mesmos como para fórmula (I),
[00021] P1 é um grupo de proteção de amino, ou acetil;
[00022] P4 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de hidroxil, preferivelmente um grupo de proteção de hidroxil;
[00023] P6 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de amino; preferivelmente um grupo de proteção de amino; e
[00024] P8 é um grupo de proteção de amino.
[00025] Preferivelmente, o grupo de proteção P1, se presente, é ortogonal a P8, isto é, ambos grupos de proteção pode ser clivado independentemente.
[00026] Em uma concretização preferida, P1 é acetil, e cada P4 e P8 são grupos de proteção que podem ser clivados em uma etapa simples, e P6 é hidrogênio, ou um grupo de proteção que pode ser clivado junto com os grupos de proteção P4 e P8. A clivagem dos grupos de proteção é preferivelmente efetuada pelo tratamento do precursor de fórmula II com ácido trifluoroacético (TFA). É particularmente preferido que P4, P6 e P8 são grupos de proteção selecionados de terc-butil (tBu) e t- butiloxicarbonil (Boc), e mais preferido é um precursor de fórmula II no qual P4 é tBu, P6 é hidrogênio ou tBu, e Ps é Boc.
[00027] A presente invenção também se relaciona a um processo para a produção de fase líquida do intermediário representado pela fórmula (II), ou sal farmaceuticamente aceitável, ou solvato deste, compreendendo a etapa de acoplar um primeiro polipeptídeo representado pela fórmula (III)
[00028]
Figure img0004
[00029] ou a sal deste, com um segundo polipeptídeo representado pela fórmula (IV)
[00030]
Figure img0005
[00031] ou sal deste, em um meio de reagente líquido na presença de um reagente de acoplamento de peptídeo, opcionalmente junto com uma base de amina orgânica, para formar um decapeptídeo representado pela fórmula (II). Neste caso, AA1 a AA10, P4, P6 e P8 são os mesmos como para a fórmula (II).
[00032] Os sais incluem sais ácidos, tais como hidrocloretos, e sais básicos, tais como sais de metal alcalino, sais de metal alcalino terroso, e sais de amônia.
[00033] De acordo com a invenção, o segundo polipeptídeo representado pela fórmula (IV) pode ser preparado por eliminação do grupo protetor PN a partir do seguinte composto (IVa):
[00034]
Figure img0006
[00035] PN é preferivelmente um grupo de proteção de amino N- terminal, e, mais preferivelmente, um grupo de proteção que pode ser eliminado por hidrogenação, tal como benziloxicarbonil.
[00036] O composto de fórmula (IVa) pode ser obtido por acoplamento de um polipeptídeo representado pela fórmula (V) com um polipeptídeo representado pela fórmula (VI)
[00037]
Figure img0007
[00038]
Figure img0008
[00039] ou sais destes compostos, onde AA4 a AA10, Pn, P4, P6 e P8 são os mesmos como para a fórmula (IVa).
[00040] A invenção também se relaciona aos polipeptídeos representados pelas fórmulas (II) a (VI) que são úteis no processo de produção de fase líquida da invenção.
[Figuras]
[00041] A Figura 1 mostra um fluxograma para a síntese de derivados de AA1 e AA2 para a síntese de peptídeo.
[00042] A Figura 2 mostra um fluxograma para a síntese de um derivado de AA2-AA3 para a síntese de peptídeo.
[00043] A Figura 3 mostra um fluxograma para a síntese de Ac-AA1- AA3.
[00044] A Figura 4 mostra um fluxograma para a síntese de um derivado de AA6-AA7.
[00045] A Figura 5 mostra um fluxograma para a síntese de um derivado de AA5-AA7.
[00046] A Figura 6 mostra um fluxograma para a síntese de Z-AA4- AA7.
[00047] A Figura 7 mostra um fluxograma para a síntese de AA9- AA10.
[00048] As Figuras 8 e 9 mostram um fluxograma para a síntese de Z-AA9-AA10.
[00049] A Figura 10 mostra um fluxograma para a síntese de Z-AA4- AA10.
[00050] A Figura 11 mostra um fluxograma para a síntese do precursor de fórmula II.
[00051] A Figura 12 mostra um fluxograma para a síntese de Degarelix a partir do precursor de fórmula II, e a purificação e liofilização. [Descrição Detalhada da Invenção]
[00052] A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes.
Etapa de desproteção
[00053] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um processo de fase líquida para preparação de Degarelix tendo a fórmula AC-AAI-AAIO-NH2, ou um sal farmaceuticamente aceitável, ou solvato deste. O processo compreende a etapa de clivagem dos grupos de proteção (P4), (P6), e (P8), se presentes, a partir do precursor de Degarelix, de acordo com a fórmula para ((PI)AAI-AA2-AA3-AA4(P4)- AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AAIO-NH2), ou um sal ou solvato deste, em uma solução orgânica compreendendo o precursor e um agente de clivagem dissolvido neste.
[00054] AA1 a AA10 na fórmula II têm o mesmo significado como na fórmula (I), e P1 é um grupo de proteção de amino, ou acetil, preferivelmente acetil.
[00055] P8 é um grupo de proteção de amino. Preferivelmente, P8 é qualquer grupo de proteção de cadeia lateral conhecido na técnica, tal como aqueles descritos em E. Gross & J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Academic Press, N.Y., 1981). Exemplos adequados incluem 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), benziloxicarbonil (Cbz ou Z), e Cbz substituído, tais como, por exemplo, 2-bromo-benziloxicarbonil (2- Br-Z), 2-cloro-benziloxicarbonil (2-CI-Z), p-clorobenziloxicarbonil, p-6- nitrobenziloxicarbonil, p-bromobenziloxicarbonil, e p- metoxibenziloxicarbonil, o-clorobenziloxicarbonil, 2,4- diclorobenziloxicarbonil, 2,6-diclorobenziloxicarbonil, e similares; grupos de proteção tipo uretano alifático, tais como, t-butiloxicarbonil (Boc), t-amiloxicarbonil, isopropiloxicarbonil, 2-(p-bifenilil)- isopropiloxicarbonil, e similares; grupos de proteção tipo uretano cicloalquil, tais como ciclopentiloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, e Ciclo-hexiloxicarbonil; alitoxicarbonil (Alloc) acetil (Ac), benzoil (Bz), trifluoroacetil (Tfa), toluenosulfonil (Tos), benzil (Bn), trifenilmetil (Trt), o- nitrofenil-sulfenil (Nps), t-butil-dimetilsililoxicarbonil, [2-(3,5- dimetoxifenil)-propil-2-oxicarbonil] (Ddz), 2,2,2-tricloroetiloxicarbonil (Troc), bifenililisopropiloxicarbonil (Bpoc), e o-nitrobenziloxicarbonil. Grupos de proteção preferidos são Fmoc, Boc e Alloc, com Boc sendo mais preferidos.
[00056] P4 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de hidroxil, preferivelmente um grupo de proteção de hidroxil. O grupo hidroxil de Ser (P4) é preferivelmente um C4-C6 alquil (por exemplo, t-butil, Ciclo- hexil), acetil (Ac), tritil, benzil, a benzil éter, tal como p-metoxibenzil, ou outros benzis substituídos tais como p-nitrobenzil, p-clorobenzil, o- clorobenzil, e 2,6-diclorobenzil, tetrahidropiranil, tri(C1-C6)alquilsitil, 2- metoxoetoximetil (MEM), 4-dimetilcarbamóleobenzil e O-fenoxiacetil éteres.
[00057] Particularmente preferidos são t-butil, benzil e 9-fluorenilmetil éteres, t-butil sendo mais preferido.
[00058] P6 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de amino, preferivelmente um grupo de proteção de amino. Grupos de proteção preferidos incluem C4-C6 alquil (por exemplo, t-butil, Ciclo-hexil), acetil (Ac), tritil, benzil, um benzil éter, tais como p-metoxibenzil, ou outros benzis substituídos, tais como p-nitrobenzil, p-clorobenzil, o-clorobenzil, e 2,6-diclorobenzil, tetrahidropiranil, tri(C1-C6)alquisilil, 2- metoxietoximetil (MEM), 4-dimetilcarbamóleobenzil e O-fenoxiacetil éteres. Particularmente preferidos são t-butil, benzil e 9-fluorenilmetil éteres, t-butil sendo mais preferido.
[00059] O agente de clivagem usado para remover os grupos de proteção depende da natureza do grupo de proteção, e são bem conhecidos na técnica.
[00060] Agentes de clivagem preferidos para o grupo de proteção de hidroxil Ser P4 são:
[00061] • ácido trifluoroacético (TFA), HCl, ou ácido metanosulfônico, particularmente para t-butil éter como um grupo de proteção e H2/Pd-C, HF, ou ácido trifluorometano-sulfônico, particularmente para benzil éter como um grupo de proteção, e
[00062] • SiCI4/anisol, particularmente para 2-(metilsulfinil)benziléter como um grupo de proteção;
[00063] Agentes de clivagem preferidos para o grupo de proteção de amino P8 são: • ácido trifluoroacético (TFA), HCl, ou ácido metanosulfônico, particularmente terc-butil carbamatos como grupo de proteção • H2/Pd-C, HF, ou ácido trifluorometano-sulfônico, particularmente para benzil carbamatos como grupo de proteção, e • Piperidina, DBU e DEA, particularmente para Fmoc como grupo de proteção
[00064] Solventes preferidos incluem DCM, DMF, NMP, dioxano, EtOH, Neat HF, e TFA.
[00065] Particularmente preferidas são as condições de clivagem diferentes indicadas na seguinte tabela 1: Tabela 1: Condições de clivagem
Figure img0009
Figure img0010
Referência: Chem. Rev. 2009, 109, 2465-2504 (by Albert Isidro-Llobet)
[00066] Tipicamente, o precursor de fórmula II é dissolvido em um agente de clivagem, preferivelmente TFA, com ou sem um solvente adicional, à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 20 a 30 horas, preferivelmente 24 horas. Quando o grupo de proteção foi removido (preferivelmente a conversão é > 95% de rendimento, mais preferivelmente > 99%), o Degarelix bruto é, em seguida, preferivelmente empobrecido em uma mistura de água-etanol tamponada para proporcionar uma solução tamponada de Degarelix bruto para purificação subsequente. O pH preferido está preferivelmente na faixa de 2 a 4, mais preferivelmente na faixa de 2,5 a 3,5, e, mais preferivelmente, aproximadamente 3.
[00067] Concretizações específicas da etapa de desproteção são mostradas na Figura 12 e Exemplo 4 (ver Etapa 12).
Purificação e liofilização
[00068] A solução de Degarelix bruto é preferivelmente purificada usando técnicas cromatográficas tal como cromatografia de fase reversa preparativa (RPC).
[00069] O produto resultante é, em seguida, preferivelmente liofilizada.
Acoplamento 3 + 7
[00070] Em um aspecto adicional a presente invenção também se relaciona a um processo para a produção de fase líquida do intermediário representado pela fórmula (II), ou sal farmaceuticamente aceitável, ou solvato deste, compreendendo a etapa de acoplamento de um primeiro polipeptídeo representado pela fórmula (III)
[00071]
Figure img0011
[00072] ou um sal deste, com um segundo polipeptídeo representado pela fórmula (IV)
[00073]
Figure img0012
[00074] ou um sal deste, em um meio de reagente líquido na presença de um reagente de acoplamento de peptídeo e, opcionalmente, uma base de amina orgânica, para formar um decapeptídeo representado pela fórmula (II). Neste caso, AA1 a AA10, P1, P4, P6 e P8 são os mesmos como para a fórmula (II). Os sais incluem sais ácidos tais como hidrocloretos, e sais básicos, tais como sais de metal alcalino, sais de metal alcalino terroso, e sais de amônia.
[00075] A reação de acoplamento é realizada em uma solução orgânica onde os dois peptídeos e um reagente de acoplamento de peptídeo e, opcionalmente, uma base de amina orgânica, são dissolvidos na mesma. Um aditivo de acoplamento de peptídeo e/ou uma amina orgânica podem também estarem presentes.
[00076] Os solvente orgânico, reagente de acoplamento de peptídeo, aditivo de acoplamento de peptídeo, e base de amina orgânica, podem ser qualquer daqueles conhecidos na técnica de LPPS.
[00077] Solventes orgânicos típicos são THF, NMP (N-metil pirrolidona), DCM, DMF, DMSO, e misturas destes. O solvente mais preferido é DMSO.
[00078] Reagentes de acoplamento de peptídeo típicos são um ou mais de o-(7-azabenzotriazoi-l-il)-l, 1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HATU), o-(benzotriazoi-l-il)-l,l,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU), o-(benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TBTU), benzotriazole-1-il-oxi- tris(dimetilamino)fosfônio hexafluorofosfato (BOP), benzotriazole-l-il- oxi-tris-pirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PyBOP), N,N-bis-(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfônico dicloreto (BOP-CI), bromo-tris-pirrolidino-fosfônio hexafluorofosfato (PyBroP), iso-butilcloroformato (IBCF), 1,3 diCiclo- hexilcarbodiimida (DCC), 1,3-diisopropil-carbodiimida (DIC), 1- (dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloreto (WSCDI), N- etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (EEDQ), isopropilcloroformato (IPCF), 2-(5-norbornen-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TNTU), propano ácido fosfônico anidrido (PPAA) e 2- succinimido-l,l,3,3-tetrametulurônio tetrafiuoroborato (TSTU).
[00079] Um agente de acoplamento preferido é DCC, DCC é preferivelmente usado sem uma amina orgânica. Em uma concretização particularmente preferida, DCC é usado em combinação com DMSO. DCC é preferivelmente usado em uma quantidade de 1,3 a 2, mais preferivelmente 1,4 a 1,6 equivalentes com relação ao tetrapeptídeo.
[00080] Outro agente de acoplamento preferido é DIC, que é preferivelmente usado em combinação com 6-cloro-HOBt, opcionalmente junto com sais de cobre.
[00081] Aditivos de acoplamento de peptídeo típicos são 1-hidroxi- lH-benzotriazole (HOBt), 6-cloro-HOBt, e l-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt).
[00082] Bases de amina orgânica típicas são NMM, DIPEA, TEA, e coilidina.
[00083] É particularmente preferido efetuar a reação de acoplamento usando DMSO como solvente, e DCC como agente de acoplamento.
[00084] Concretizações específicas da etapa de acoplamento são mostradas na Figura 11 e Exemplo 4 (ver Etapa 11).
Síntese do heptapeptídeo
[00085] O composto de fórmula IV, isto é, AA4(P4)-AA5-AA6(P6)- AA7-AA8(P8)-AA9-AA10-NH2, é preferivelmente obtido pela eliminação do grupo de proteção PN do seguinte composto IVa:
[00086]
Figure img0013
[00087] Enquanto que AA4 a AA10, P4, P6 e P8 têm o mesmo significado conforme acima, PN é um grupo de proteção de amino N- terminal. Em uma concretização preferida, PV é um grupo de proteção que pode ser eliminado por hidrogenação, por exemplo, usando hidrogênio e um catalisador de paládio (tal como Pd/C). O grupo de proteção mais preferido PN é benziloxicarbonil (Z).
[00088] Concretizações específicas da etapa de eliminação de PN são mostradas na Figura 11 e Exemplo 4 (ver Etapa 11).
[00089] O composto de fórmula (IVa) pode ser obtido por acoplamento de um polipeptídeo representado pela fórmula (V) com um polipeptídeo representado pela fórmula (VI)
[00090]
Figure img0014
[00091]
Figure img0015
[00092] ou sais de um ou ambos destes compostos, onde AA4 a AA10, P4, P6 e P8 são os mesmos como para fórmula (IVa). A reação de acoplamento é realizada em uma solução orgânica onde os dois peptídeos e um reagente de acoplamento de peptídeo são dissolvidos na mesma. Um aditivo de acoplamento de peptídeo e/ou uma amina orgânica podem também estarem presentes. Os mesmos reagentes de acoplamento de peptídeo, solventes orgânicos, aditivos de acoplamento de peptídeo e aminas orgânicas, conforme descritos acima, podem ser usados, em uma concretização preferida, DCC é usado como um reagente de acoplamento, opcionalmente com etil acetato como solvente.
Síntese do tetrapeptídeo de Fórmula V
[00093] Em uma concretização preferida, o tetrapeptídeo de fórmula V, isto é, (PN)AA4(P4)-AA5AA6(P6)-AA7 é preparado por um processo compreendendo as seguintes etapas: (a) provisão de (PN2)AA5-AA6(P6)-AA7(PC), no qual P6 tem o mesmo significado conforme acima na fórmula IVa, (PN2) é um grupo de proteção de amino N-terminal ou hidrogênio, e (Pc) é um grupo de proteção carboxil C-terminal que pode ser clivado por hidrogenação; (b) remoção do grupo de proteção de amino (PN2); se presente; (c) hidrogenação de H-AA5-AA6(P6)-AA7(PC) para obter H- AAS-AA6(P6)-AA7; e (d) reação de H-AA5-AA6(P6)AA7 com um éster ativado de (PN)AA4(P4) para proporcionar (PN)AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7, no qual (P4) é um grupo de proteção de hidroxil, ou hidrogênio, P6 é hidrogênio, ou um grupo de proteção de amino, e PN é um grupo de proteção que pode preferivelmente ser eliminado por hidrogenação, por exemplo, uso de hidrogênio e um catalisador de paládio (tal como Pd/C).
[00094] O grupo de proteção PN mais preferido é benziloxicarbonil (Z).
[00095] O éster ativado mais preferido de (PN)AA4(P4) é um 4- nitrofenil éster (ONp).
[00096] Consequentemente, preferivelmente, o benzil éster é removido no intermediário AA5-AA7 para proporcionar ambos N- e C- AA5-AA7 não protegidos. Este tripeptídeo é, em seguida, reagido com serina pré-ativada (por exemplo, Z-Ser(tBu)-ONp).
Produção de Degarelix
[00097] A presente invenção, desse modo, se refere a produção de Degarelix, a etapa de desproteção acima discutida sendo uma etapa essencial desta produção. Em uma concretização preferida, esta etapa de desproteção segue o 3 + 7 acoplamento acima discutido. Em uma concretização ainda mais preferida, o 3 + 7 acoplamento segue a síntese do heptapeptídeo discutida acima, isto é, o processo compreende as seguintes etapas: a) Síntese de AA4(P4)-AA-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)AAQAAI0- NH2, ou um sal ou solvato destes; b) Acoplamento de AA4(P4AA-AA6(P6)-AA7-AA8(P8}- AA9AA10NH2 e (PI)AAI-AA2-AA3 para proporcionar (PI)AAI-AA2-AA3- AA4(P4)-AA5-AA6(P6)-AA7-AA8(P8)-AA9-AAIO-NH2), ou um sal ou solvato destes; c) Desproteção de (PI)AAIAA2-AA3-AA4(P4)-AA5-AA6(P6)- AA7-AA8(P8)-AA9-AAIO-NH2), ou um sal ou solvato destes, para proporcionar degarelix, ou um solvato ou sal destes.
[00098] AAI a AA10 e PI, P4, P5, e P8 têm os mesmos significados conforme definido acima.
[00099] Em uma concretização particularmente preferida, . PI é acetil; . P4 é um grupo de proteção que é clivável com TFA, preferivelmente tBu; . P5 é um hidrogênio, ou um grupo de proteção que é clivável com TFA, preferivelmente tBu; . P6 é um grupo de proteção que é clivável com TFA, preferivelmente Boc.
[000100] Na concretização mais preferida, o heptapeptídeo é produzido usando a síntese de heptapeptídeo descrita acima. Além disso, a etapa de desproteção é preferivelmente seguida pelos métodos de purificação e de liofilização descritos acima.
[000101] Na síntese de degarelix, ou seus precursores, e, particularmente, em todas as etapas contendo um peptídeo com a porção hidroorotil, o pH é preferivelmente mantido abaixo de 9, preferivelmente abaixo de 8,5, ainda mais preferido estando abaixo de 8. É preferido usar uma base fraca tal como NaHCO3 para ajuste do pH. É particularmente preferido que todas as extrações após as etapas de acoplamento sejam efetuadas dentro de uma faixa de pH de 2 a 9, preferivelmente 2,5 a 8 (ver etapas 6, 7,10, e 11 na seção experimental). É adicionalmente preferido adicionar C4-C5 álcool alifático, tais como n-butanol ou 2-butanol antes da etapa de extração ou etapa de lavagem.
Intermediários
[000102] A invenção também se relaciona aos polipeptídeos representados pelas fórmulas (II) a (VI) que são úteis no processo de produção de fase líquida da invenção.
[000103] Concretizações preferidas de fórmula (II)
Figure img0016
[000104]
Figure img0017
Tabela 2
Figure img0018
[000105] Concretizações preferidas incluem sais destes compostos.
[000106] Concretizações preferidas de fórmula (III)
Figure img0019
Figure img0020
[00107] Concretizações preferidas incluem sais destes compostos.
[000108] Concretizações preferidas de fórmula (IV)/(IVA)
Figure img0021
[000109]
Figure img0022
Tabela 4
Figure img0023
[000110] Concretizações preferidas incluem sais destes compostos.
[000111] Concretizações preferidas de fórmula (V)
Figure img0024
[000112]
Figure img0025
Tabela 5
Figure img0026
[000113] Concretizações preferidas incluem sais e solvatos destes compostos.
[000114] Concretizações preferidas de fórmula (VI)
Figure img0027
[000115]
Figure img0028
Tabela 6
Figure img0029
[000116] Quando um grupo de proteção não está presente, o grupo funcional é o grupo desprotegido (por exemplo, >NH).
[000117] Concretizações preferidas incluem sais destes compostos.
Seção Experimental Materiais Usados na Seção Experimental
[000118] Os materiais usados na seção experimental são listados abaixo.
[000119] Químicos: amônia aquosa NH3(aq) Acetonitrila C2H3N n-Butanol C4H10O 2-Butanol C4H10O Isopropanol (isopropanol) C3H8O Butil acetato C5H12O2 Etanol, 99,9%C2H6O Metanol CH4O Heptano C7H16 Água purificada H2O Etil acetato C3H8O2 Ácido acético C2H4O2 Acetato de amônia C2H7NO2 Acetil imidazole C5H6N2O Trietilamina C6H15N N-Metilmorfolina C5H11NO N-etil pirrolidona C5H9NO N,N-DiCiclo-hexilcarbodiimida C13H22N2 Diciciohexilamina C12H23N N,N-Diisopropilcarbodiimida C7H14N2 N,N-Dimetiletilenodiamina C4H12N N,N-Dimetilformamida C3H7NO Dimetil sulfóxido C2H6OS l-Hidroxibenzotriazole C6H5N3O p-Nitrofenol C6H5NO3 N-Hidroxisuccinimida C4H5NO3 isobutil cloroformato C5H9ClO2 Cloreto de Sódio NaCl Hidróxido de Sódio aquoso NaOH (aq) Ácido Hidroclórico aquoso HCl (aq) Ácido Fosfórico H3PO4 Sódio hidrogenosulfato NaHSO4 Sódio hidrogenocarbonato NaHCO3 Ácido Metanosulfônico CH4SO3 Ácido Trifluoroacético C2HF3O2 Paládio em carvão, 5% de Pd-C Hidrogênio H2 Tolueno C7H8 Materiais de Partida: N-t-Butiloxicarbonil-D-4- clorofenilalanina Boc-D-4Cpa-OH C14H18NO4 N-t-Butiloxicarbonil-D-2- naftilalanina Boc-D-2Nal-OH C18H21NO4 D-3-Piridilalanina hidrocloreto H-D-3Pal OH x 2HCl C8H12Cl2N2O2 N-a-t-Bitiloxicarbonil-N- 4-(t-Butilcarbamoil)-D-4- Aminofenilalanina Boc-D-4Aph(tBuCbm)OH C19H29N3O5 N-a-t-Butiloxicarbonil-N-4-( L-Hidroorotil)- D-4-Aminofenilalanina Boc-D-4Aph(L-Hor) C19H24N4O7 Leucina benzil éster p-tisolato H-Lei-Obzl x TOS C20H27NO5 N-Benziloxicarbonil-O-t-butil-serina Z-Ser-(tBu)-OH C18H15NO5 N-t-Butilcarboxicarbonil-prolina Boc-Pro-OH C10H17NO4 D-Alaninamida hidrocloreto H-D-Ala-NH2 x HCl C3H8CW2 N-α-Benziloxicarbonil-N-ε- t-butiloixicarbonil-N-ε-isopropil- lisina-sal de diCiclo-hexilamina Z-Lys(iPr,Boc)-OH x DCHA C34H57N3O7
Exemplo 1: Síntese de intermediário Ac(l-3)ONa: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-P- 3Pal-ONa[7] Ativação de Boc-D-4Cpa-OH e Etapa de Isolamento 1 (Etapa de reação)
[000120] Boc-D-4Cpa-OH ( 299,75 g) é dissolvido em iPrOH ( 3,53 kg), a mistura é agitada e HOSu (0,184 kg) e DIC (0,164 kg) são adicionados, e agitada a 0°C por 1 hora. O precipitado é filtrado e lavado com iPrOH. O sólido é secado sob pressão reduzida para produzir BOC-D-4Cpa- OSu[l].
A ativação de Boc-D-2Nal-OH e etapa de isolamento 2 (Etapa de reação)
[000121] Boc-D-2Nal-OH (315,38 g) é dissolvido em iPrOH (5,35 kg) e IBC (157,07 g) e NMM (116,7 g) são adicionados. Uma mistura de água (42 mL), iPrOH (1,1 kg) e HOSu (230,14 g) é adicionado após resfriamento a -10°C junto com NMM adicional (l0,11 g), e a mistura agitada 30 min. Água (0,82 L) é adicionada, e o precipitado é filtrado, e lavado com iPrOH, e secado sob pressão reduzida para produzir Boc- D-2Nal-OSu[2].
Síntese de Boc(2-3)OH: Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH Etapa 3 (Etapa de reação)
[000122] H-D-3Pal-OH x 2 HCl (0,251 kg) e Boc-D-4Cpa-OSu [1] (0,397 kg) da etapa 1 são dissolvidos em DMSO (3,33 L) e NMM (318,8 g) é adicionado. A mistura é agitada a 20°C por 6 horas. Água (17 L) é adicionada, e o pH é ajustado por adição de HCl a pH 4,25. O precipitado é filtrado e disperso em água. A pasta fluida obtida é, em seguida, filtrada e lavada com água. O sólido é secado sob pressão reduzida para produzir Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH[3].
Síntese de Intermediário Ac(l-3)ONa: Ac-D-2NaI-D-4Cpa-D-3Pal- ONa[7] (Composto de fórmula IIIa) Etapa 4 (Etapa de reação)
[000123] Boc-D-4Cpa-D-3Pal-OH [3] (447,93 g) da etapa 3 é dissolvido em uma mistura de AcOEt (3,4 L) e AcOH ( 675 mL), a mistura é resfriada a 5°C onde, em seguida, MSA ( 672,77 g) é adicionado. A reação continua a 10°C por 2 horas e à solução é adicionado TEA (1214,28 g) para produzir H-D-4Cpa-D-3Pal-OH[4].
[000124] Boc-D-2Nal-OSu [2] (412,44 g) da etapa 2 é adicionado a H- D-4Cpa-D-3Pal-OH [4], agitado por 24 horas a 20°C. 25% de NH3 aquoso (0,154L)e n-butanol (4,5L) são adicionados, e a mistura é agitada a 45°C por 1 hora. A solução é lavada com: • Água • Água a pH 9,5 (pH é ajustado enquanto agita com NaOH aq.) • Água
[000125] AcOH (4,5 L) é adicionado à fase orgânica e a solução é concentrada em um óleo sob pressão reduzida. O óleo é re-dissolvido em AcOH (4,5 L) e reconcentrado sob pressão reduzida para produzir Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[5] como um óleo.
[000126] Boc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH [5] é dissolvido em água (0,09 L) e AcOH (1,8 L). MSA (672,77 g) é adicionado, e a mistura é agitada a abaixo de 35°C por 2 horas. A solução é neutralizada com TEA (779,16 g). A solução é concentrada sob pressão reduzida em um óleo. O óleo é re-dissolvido em tolueno (2.5 L) e reconcentrado sob pressão reduzida a um óleo. A última etapa é repetida para produzir H- D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-OH[6].
[000127] H-D-2Nal-D-4Cpa-D-3PaJ-OH [6] é dissolvido em tolueno (2,0 L), e uma solução de acetil imidazole (132,14 g) em tolueno (0,25 L) é adicionada. A solução é agitada a 20°C por 2 horas, e água (0,1 L) é adicionada. n-Butanol (4,5 L) é adicionado, e a mistura orgânica é lavada a 35°C com: • 5% de NaCl aquoso • Metanol e água a pH acídico pH 5,5 (pH é ajustado enquanto se agita com NaOH aq.) • Metanol e água a pH 11 (pH é ajustado enquanto se agita com NaOH aquoso) • Metanol e 10% de NaCl aquoso
[000128] À fase orgânica agitada a partir das extrações, heptano (15 L) é adicionado a 20°C por 1 hora, e a suspensão resultante é deixada com agitação a 20°C por 1 hora. O precipitado é isolado por filtração, e suspenso em heptano (3,5 L). A suspensão é filtrada novamente. A última etapa de lavagem com heptano e a filtração é repetida. O sólido é, em seguida, secado sob pressão reduzida para produzir Ac-D-2Nal- D-4Cpa-D-3Pat-ONa[7]. Especificações para intermediários keV Etapa 4 Intermediário Ac(l-3)ONa [7] Controle de Qualidade Critérios de Aceitação Descrição "Pó branco a levemente amarelo (inspeção visual)" Identificação (1) "587,2=0,4Da (MS)" Identificação (2) "2Nal 0,9-1,1,3Pal 0,9-1,1, 3Pal 0,9-1,1 (AAA)" Pureza quiral L-2Nal <1,3%, L-4Cpa <0,7%, L-3Pal <2,0% (GC- MS) Pureza >90% (HPLC, Área %)
Exemplo 2: Síntese de intermediário Z(4-7)OH x DCHA: Z-Ser(tBu)- 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH x DCHA[15] Síntese de Intermediário Boc(6-7)OBzl: Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu- OBzl Etapa 5 (Etapa de reação)
[000129] Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OH (379,45 g) é dissolvido em NMP (0,76 L) e AcOEt (4,4 kg). Após resfriamento a - 4°C, IBC (150,2 g) e NMM (101,1 g) são adicionados, e a solução agitada a -7°C por 0,5 hora, para produzir Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct[8].
[000130] H-Leu-OBzl TOS (491,88 g) é dissolvido em NMP (1,5 L) e AcOEt (2,7 kg) é adicionado, seguido por NMM (126,4 g). Esta solução é subsequentemente transferida ao Boc-D-4Aph(tBuCbm)-OAct [8], e agitada a - 10°C por 1 hora. Em seguida, água (0,5 L) é adicionada.
[000131] A mistura de reação é lavada a 20°C com: • Água a pH 8,5 (pH é ajustado enquanto se agita com NaOH aquoso) • Água a pH 2,0 (pH é ajustado enquanto se agita com NaCl aquoso) • Água
[000132] A fase orgânica é concentrada sob pressão reduzida em um óleo. O óleo é re-dissolvido em AcOEt (0,6 kg) e reconcentrado sob pressão reduzida a um óleo. O óleo remanescente é dissolvido em AcOEt (0,6 kg). Heptano (15,5 L) é adicionado enquanto se agita a 20°C. O precipitado é isolado por filtração, e lavado com heptano, e subsequentemente secado sob pressão reduzida para produzir Boc-D- 4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[9].
Síntese de Boc-(5-7)-OBzi: Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu- OBzl Etapa 6 (Etapa de reação)
[000133] Boc-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzi [9] (582,7 g) da etapa 5 é dissolvido em AcOEt (3,15 kg). MSA (481 g) é adicionado e agitado abaixo de 15°C por 5 horas, e TEA (406 g) é adicionado. DMF (0,333 kg) é adicionado, seguido por TEA (101 g) e NMM (51 g), para produzir H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[10].
[000134] Boc-4Aph(L-Hor)-OH (462,46 g) é dissolvido em DMF (2,09 kg) e AcOEt (1,44 kg). IBC (150,24 g) e NMM (111,27 g) são adicionados, e agitados a -10°C por 0,5 hora para produzir Boc-4Aph(L- Hor)-OAct[ll].
[000135] H-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [10] é adicionado ao Boc- 4Aph(L-Hor)-OAct [11] e agitado a -10°C por 1,5 horas. Em seguida, AcOEt (5,4 kg) e n-butanol (6.0 L) são adicionados. A fase orgânica é lavada a 20°C com: • 5% de NaHCO3 aquoso a cerca de pH 8 (pH é ajustado enquanto se agita com NaHCO3 aquoso) • 10% de NaCl aquoso a pH 2,5 (pH é ajustado enquanto se agita com H3PO4 aquoso)
[000136] DMF (0,9 L) é adicionado à fase orgânica, que é, em seguida, concentrado sob pressão reduzida a um óleo. A solução é derramada em água (14 L) enquanto se agita. O precipitado é isolado em um filtro, e lavado com água. O sólido é secado sob pressão reduzida para produzir Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl[12].
Síntese de intermediário Z(4-7)OH x DCHA: Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D- 4Aph(tBuCbm)-Leu-OH x DCHA (Composto de fórmula Va) Etapa 7 (Etapa de reação)
[000137] Boc-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OBzl [12] (885,02 g) da etapa 6 é adicionado a uma mistura de MSA (961,1 g) e AcOEt (7,2 kg) e 2-butanol (2 L) é adicionado, e a mistura agitada resultante a 0°C por 6 horas. MSA é, em seguida, neutralizado com TEA (909,0 g). 5% de Pd/C(88.5g) disperso em 2-butanol (1 L) é adicionado, e a mistura é hidrogenada sob pressão a 20°C por 3 horas. Em seguida, o Pd/C é filtrado e lavado com 2-butanol para produzir a solução contendo H- 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH [13]. Z-Ser(tBu)-OH (413,5 g) é dissolvido em MeCN (2,5 L), e a solução é resfriada a -5°C. HONp (195 g) é adicionado, seguido por DCC (278,5 g), e a mistura agitada a 20°C por 24 horas. A mistura é então filtrada e lavada com MeCN para produzir Z-Ser(tBu)-ONp [14]. NMM (354,2 g), DMF (4,75 kg) e Z- Ser(tBu)-ONp [14] são adicionados à solução de H-4Aph(L-Hor)-D- 4Aph(tBuCbm)-Leu-OH [13], e a mistura é deixada com agitação a 20°C por 3 dias. A mistura resultante é lavada com: • 10% de NaCl aquoso a pH 2,5 (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso) • Água a pH acídico (pH 2,5) (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso) • 7,5% de NaHCO3 aquoso. • 5% de NaCl aquoso a (pH 2,5) (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso) • 10% de NaCl aquoso
[000138] À fase orgânica final, DCHA (181 g) é adicionado, e a fase orgânica é concentrada sob pressão reduzida a um óleo. O óleo é re- dissolvido em iPrOH (3,14 kg) e reconcentrado sob pressão reduzida a um óleo. O óleo remanescente é re-dissolvido em iPrOH (3,14 kg) e, enquanto se agita, a solução é derramada em AcOEt (31,5 kg). A agitação é continuada a 20°C por 1 hora até precipitação, e o precipitado é então isolado por filtração, e lavado com AcOEt. O sólido é secado sob pressão reduzida a 30°C por 30 horas para produzir Z-Ser(tBu)- 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH x DCHA[15]. Pureza do intermediário Z(4-7)OH x DCHA[15] é >80% (HPLC). Etapa 7 Intermediário Z(4-7)GH [15] Controle de Qualidade Critérios de Aceitação Descrição "Pó branco a amarelo (inspeção visual)" Identificação (1) "972.5±0.4Da (MS)" (MS)" Identificação (2) "Ser 0,9-1,L 4Aph 1,8-2,2, Leu 0,94,1 (AAA)" Pureza quiral D-Ser <2,0%, D-4Aph 47-53%, D-Leu <0,7% (GC- MS) Pureza (I) [4Aph5 (Hidantoinacetil)] Z(4-7)OH DCHA <0,5% (HPLC, Área%) Pureza (2) >80 % (HPLC, Área %)
Exemplo 3: Síntese de Intermediário H(8-10)NH2: H-Lys(iPr.Boc)-Pro- D-Ala-NH2[21] Síntese de Boc(9-10)NH2: Boc-Pro-D-Ala-NH2 Etapa 8 (Etapa de reação)
[000139] Boc-Pro-OH (226,02 g) é dissolvido em iPrOH (1,73 kg). A mistura de reação é resfriada a -5°C.
[000140] IBC (143,4 g) e NMM (106,2 g) são adicionados, e a mistura é agitada a 5°C por 0,5 hora para produzir Boc-Pro-OAct[16].
[000141] H-D-Ala-NH2 x HCl (124,57 g) é suspendo em uma mistura de iPrOH (1,57 kg) e NMM (106,2 g).
[000142] A suspensão é adicionada ao Boc-Pro-OAct [16]. A mistura de reação é deixada com agitação a 10°C por 3 horas. Em seguida, DMEDA (10,6 ml) é adicionado. A mistura é filtrada, e o filtrado é concentrado sob pressão reduzida a um óleo. O óleo é re-dissolvido e reconcentrado com AcOEt (1,125 kg).
[000143] O óleo residual é dissolvido em uma mistura de AcOEt (1,8 kg) e n-butanol (0,6 L). A fase orgânica é lavada com: • 15% de NaCl aquoso a pH 2,5 (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso). • 15% de NaCl aquoso a pH 9,5 (pH é ajustado enquanto se agita com NaOH aquoso).
[000144] A fase orgânica é concentrada sob pressão reduzida, re- dissolvida em AcOEt (1,08 kg) e reconcentrada a um óleo.
[000145] Uma mistura de AcOEt (0,33 kg) e heptano (0,75 L) é adicionada a 20°C e agitada por 16 horas. O precipitado resultante é filtrado e lavado com uma mistura de AcOEt e heptano no filtro. O sólido é, em seguida, secado sob pressão reduzida para produzir Boc-Pro-D- Ala-NH2[17].
Síntese de Intermediário H(8-10)NH2: H-LysCiPoBocl-Pro-D-Ala-NHz (Composto de fórmula VIa) Etapa 9 (Etapa de reação)
[000146] Boc-Pro-D-Ala-NH2 [17] (313,89 g) da Etapa 8 é dissolvido em uma mistura de MSA (528,61 g) e iPrOH (0,785 kg), e a solução é agitada a 45°C por 1 hora. A mistura então é neutralizada com TEA (607,14 g) para produzir H-Pro-D-Ala-NH2[18]. Z-Lys(iPr,Boc)-OH x DCHA (603.83 g) é suspenso em AcOEt (1,17 kg) e lavado com: • 12% de NaHSO4 aquoso • Água • 15% de NaCl aquoso
[000147] A fase orgânica de Z-Lys(iPr,Boc)-OH [19] a partir das extrações é adicionada a B-Pro-D-Ala-NH2 [18]. HOBt (183,79 g) e DCC (227,0 g) dissolvido em AcOEt (0,135 kg) são adicionados, e a mistura agitada a 20°C por 0,5 hora. Em seguida, água (0,2 L) é adicionada. A mistura é filtrada e lavada com AcOEt. Os filtrados combinados são concentrados sob pressão reduzida a um óleo. O óleo é dissolvido em AcOEt (0.9 kg), filtrado, e a solução é lavada com: • Água a pH 2,5 (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso) • Água a pH 9 (pH é ajustado enquanto se agita com NaOH aquoso) • 10 % de NaCl aquoso a pH 7 (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso ou NaOH aquoso).
[000148] A fase orgânica é concentrada sob pressão reduzida para produzir Z-Lys(iPro,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[20].
[000149] Z-Lys(iPro,Boc)-Pro-D-Ala-NH2 [20] é dissolvido em etanol (0,04 kg) e água (0,5 L) e 5% de Pd/C (50 g) são adicionados. A pasta fluida é acidificada a pH 2,5 por adição de HCl 6M e hidrogenada a 20°C. Após a reação ser completada, o catalisador é removido por filtração, e pH é elevado a pH 7,0 pela adição de 32% de NaOH. O etanol é subsequentemente removido por evaporação sob pressão reduzida. n- Butanol (1 L) é adicionado à fase aquosa resultante, e o pH é ajustado a pH alcalino 9 com NaOH aquoso, e a extração começa. Esta etapa é repetida. As fases orgânicas combinadas são concentradas sob pressão reduzida a um óleo.
[000150] O óleo é dissolvido em AcOBu (0,5 L), concentrado sob pressão reduzida a 20°C, e re-dissolvido em AcOBu (0.5 L). Em seguida, heptano (2 L) é adicionado a 50°C por 1 hora. A suspensão é deixada com agitação a 0°C por 16 horas. O precipitado é isolado por filtração e lavado com heptano. Finalmente, o sólido é secado sob pressão reduzida para produzir H-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[21]. Pureza de intermediário H(8-10)NH2[21] é >95% (HPLC). Etapa 9 Intermediário H(8-10)NH2 [21] Controle de Qualidade Critérios de Aceitação Descrição "Pó branco a pó levemente amarelo (inspeção visual)" Identificação (1) "456.3±0.4Da (MS)" Identificação (2) "Lys(iPr) 0,9-1,1, Pro 0,9-1,1, Ala 0,9-1,1 (AAA)" Pureza quiral D-Lys(iPr) <0,3%, D-Pro <0,3%, L-Ala <0,5% (GC-MS) Pureza >95 % (HPLC, Área %)
Exemplo 4: Condensações de Segmento á intermediários finais (Composto de Fórmula II) Intermediário Z(4-10)MH2: Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)- Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[22] (Composto de fórmula IVg) Etapa 10 (Etapa de reação)
[000151] Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH x DCHA [15] (1153,41 g) da Etapa 7 é dissolvido em DMF (2,1 kg). Em seguida, HOBt (153,2 g) é adicionado junto com AcOEt (6,9 kg) e H-Lys(iPr,Boc)- Pro-D-Ala-NH2 [21] (569,5 g) da etapa 9. Quando todos os sólidos são dissolvidos, MSA (96,1 g) é adicionado. A solução é resfriada abaixo de 5°C e DCC (309,5 g) dissolvido em AcOEt (0.810 kg) é adicionado. A temperatura é elevada a 20°C, e a reação continua por 24 horas. A conversão de Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-OH x DCHA [15] é >96% (HPLC). AcOEt (4,95 kg) e água (5,5 L) são adicionados, e a mistura é agitada, e filtrada. Enquanto se agita, 7,5% de NaHCOβ (aq) (35L) é adicionado ao filtrado. As fases são separadas e a camada orgânica é adicionalmente lavada com: • 7,5% de NaHCOβ • Água a pH 3 (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso) • Água
[000152] A fase orgânica final é concentrada sob pressão reduzida a um óleo. O óleo é reconcentrado com EtOH (0,405 kg) e subsequentemente com AcOEt (0,45 kg). O óleo remanescente é dissolvido em EtOH (0,405 kg), e AcOEt (0.45 kg) e AcOBu (4,6 L) são adicionados. A solução é adicionada a heptano (27,6 L) a 20°C por 1 hora. Em seguida, o precipitado é filtrado e lavado com heptano. O sólido é secado sob pressão reduzida ao máximo para produzir Z- Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala- NH2[22]. Pureza de Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu- Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2 [22] é >70% (HPLC).
Intermediários finais Ac(l-10)NH2: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal- Ser(tBuHAph(L-Hor)-D- 4Aph(tBuCbm}-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala- NH2[24] Etapa 11 (Etapa de reação)
[000153] Z-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)- Pro-D"Ala-NH2 [22] (1409,67 g) da Etapa 10 é adicionado a uma mistura de EtOH (10,98 kg) e água (3,2 L), e agitada até que a solução esteja homogênea. 5% de Pd/C (211 g) é adicionado. A mistura é hidrogenada a 20°C com controle de pH a pH 2,5 com HCl aquoso.
[000154] O catalisador é removido por filtração e o pH é ajustado a pH 3,8 com NaOH aquoso. O filtrado é concentrado sob pressão reduzida a um óleo. EtOH (4,7 kg) é adicionado ao óleo e reconcentrado. Em seguida, AcOEt (5,4 kg) é adicionado ao óleo e reconcentrado, e este processo é repetido novamente para produzir H-Ser(tBu)-4Aph(t-Hor)- D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[23].
[000155] H-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr;Boc)- Pro-D-Ala-NH2 [23] é disperso em AcOEt (1,125 kg), em seguida HOBt (153,16 g) é adicionado, e a mistura é resfriada a 0°C. Ac-D-2Nal-D- 4Cpa-D-3Pal-ONa [7] (609,05 g) da Etapa 4 é dissolvido em DMSO (2,5 L), esta solução é misturada com a pasta fluida contendo H-Ser(tBu)- 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbrn)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2 [23], e DCC (309,5 g) dissolvido em AcOEt (0,45 kg) é adicionado. A mistura é agitada a 5°C por 24 horas. A conversão de [23] é >96% (HPLC).
[000156] Água (150 mL) e DMSO (0,5 L) são adicionados, e a agitação é continuada a 20°C por mais do que 3 horas. O precipitado é filtrado e lavado com uma mistura de AcOEt e DMSO. Os filtrados são combinados, e n-butanol (17 L) é adicionado. A solução orgânica é lavado com: • Água a pH 2,5 (pH é ajustado enquanto se agita com HCl aquoso) • 7% de NaHCO3(aq) • 10% de NaCl aquoso (pH na mistura é neutralizado a pH 7,0, se necessário, enquanto se agita com HCl aquoso)
[000157] DMF (4,75 kg) é adicionado, e a fase orgânica é concentrada sob pressão reduzida a um óleo. O óleo é vagarosamente adicionado à água (50 L) a 20°C por 1 hora sob agitação vigorosa. O precipitado é isolado em um filtro, e lavado duas vezes com água. O sólido é subsequentemente secado sob pressão reduzida para produzir Ac-D- 2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(tBuCbm)-Leu- Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2[24][Ontermediário Final]. Pureza de [24] é >70% (HPLC)
Exemplo 5: Desproteção de Intermediário Final e Ac(l-10)NH2 para Degarelix bruto [25] Etapa 12 (Etapa de reação)
[000158] Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(tBu)-4Aph(L-Hor)-D- 4Aph(tBuCbm)-Leu-Lys(iPr,Boc)-Pro-D-Ala-NH2 [24] (Composto de fórmula IIb)(1844,59 g) da etapa 11 é dissolvido em TFA (28,3 kg) a 20°C. A solução é agitada a 20°C (remoção de 3 grupos de proteção) por 24 horas. A conversão de [24] é >99 % (HPLC).
[000159] A mistura de reação é então misturada com uma solução fria (abaixo de 10°C) de água (74 L), AcONH4 (19,1 kg), AcOH (18,4 L) e EtOH (14.52 kg). Durante mistura das duas soluções, a temperatura é mantida abaixo de 25°C. O pH da solução final é ajustado a pH 3 com TFA ou AcONH4, se necessário, para produzir a solução de Ac-D-2Nal- D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(L-Hor)-Pro-D- Ala-NH2[25][Degarelix bruto].
Etapa 13 (Purificação e liofilização)
[000160] A solução de degarelix bruto é bombeada através de uma coluna de fase reversa. O Degarelix é eluído a partir da coluna com um gradiente de EtOH/0,12% de TFA em água. Frações com uma pureza >95% são repurificadas em uma coluna de fase reversa usando um gradiente de EtOH/1% de AcOH em água. Frações de alta pureza são liofilizadas.

Claims (11)

1. Processo para produção em fase líquida de um decapeptídeo representado pela fórmula (II)
Figure img0030
em que AAI é D-2Nal, AA2 é D-4Cpa, AA3 é D-3Pal, AA4 é Ser, AA5 é 4Aph(L-Hor), AA6 é D-Aph(Cbm), AA7 é Leu, AA8 é Lys(iPr), AA9 é Pro, AA10 é D-Ala; PI é um grupo de proteção de amino selecionado a partir de 2-bromo-benziloxicarbonil (2-Br-Z), 2-cloro-benziloxicarbonil (2-CI-Z), p-clorobenziloxicarbonil, p-6-nitrobenziloxicarbonil, p-bromobenziloxicarbonil, , p-metoxibenziloxicarbonil, o-clorobenziloxicarbonil, 2,4-diclorobenziloxicarbonil, 2,6-diclorobenziloxicarbonil; grupos de proteção tipo uretano alifático, t-butiloxicarbonil (Boc), t-amiloxicarbonil, isopropiloxicarbonil, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonil; grupos de proteção tipo uretano cicloalquil, ciclopentiloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, ciclo-hexiloxicarbonil; alitoxicarbonil (Alloc), acetil (Ac), benzoil (Bz), trifluoroacetil (Tfa), toluenosulfonil (Tos), benzil (Bn), trifenilmetil (Trt), o-nitrofenil-sulfenil (Nps), t-butil-dimetilsililoxicarbonil, [2-(3,5-dimetoxifenil)-propil-2-oxicarbonil] (Ddz), 2,2,2-tricloroetiloxicarbonil (Troc), bifenililisopropiloxicarbonil (Bpoc), e o-nitrobenziloxicarbonil; P4 é hidrogênio ou um grupo de proteção de hidroxila, selecionado a partir de C4-C6 alquil, t-butil, ciclo-hexil, acetil (Ac), tritil, benzil, um benzil éter, p-metoxibenzil, benzis substituídos, p-nitrobenzil, p-clorobenzil, o-clorobenzil, 2,6-diclorobenzil, tetrahidropiranil, tri(C1-C6)alquilsitil, 2-metoxoetoximetil (MEM), 4-dimetilcarbamóleobenzil e o-fenoxiacetil éteres; P6 é hidrogênio ou um grupo de proteção de amino, selecionado a partir de C4-C6 alquil (por exemplo, t-butil, ciclo-hexil), acetil (Ac), tritil, benzil, um benzil éter, tais como p-metoxibenzil, benzis substituídos, p-nitrobenzil, p-clorobenzil, o-clorobenzil, 2,6-diclorobenzil, tetrahidropiranil, tri(C1-Cβ)alquisilil, 2-metoxietoximetil (MEM), 4-dimetilcarbamóleobenzil e o-fenoxiacetil éteres; e P8 é um grupo de proteção de amino selecionado a partir de 2-bromo-benziloxicarbonil (2-Br-Z), 2-cloro-benziloxicarbonil (2-CI-Z), p-clorobenziloxicarbonil, p-6-nitrobenziloxicarbonil, p-bromobenziloxicarbonil, , p-metoxibenziloxicarbonil, o-clorobenziloxicarbonil, 2,4-diclorobenziloxicarbonil, 2,6-diclorobenziloxicarbonil; grupos de proteção tipo uretano alifático, t-butiloxicarbonil (Boc), t-amiloxicarbonil, isopropiloxicarbonil, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonil; grupos de proteção tipo uretano cicloalquil, ciclopentiloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, ciclo-hexiloxicarbonil; alitoxicarbonil (Alloc), acetil (Ac), benzoil (Bz), trifluoroacetil (Tfa), toluenosulfonil (Tos), benzil (Bn), trifenilmetil (Trt), o-nitrofenil-sulfenil (Nps), t-butil-dimetilsililoxicarbonil, [2-(3,5-dimetoxifenil)-propil-2-oxicarbonil] (Ddz), 2,2,2-tricloroetiloxicarbonil (Troc), bifenililisopropiloxicarbonil (Bpoc), e o-nitrobenziloxicarbonil, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de acoplar um primeiro polipeptídeo representado pela fórmula (III)
Figure img0031
ou um sal do mesmo, com um segundo polipeptídeo representado pela fórmula (IV)
Figure img0032
ou um sal do mesmo, em um meio de reagente líquido na presença de um reagente de acoplamento de peptídeo, que é um ou mais de o-(7-azabenzotriazoi-l-il)-l, 1,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HATU), o-(benzotriazoi-l-il)-l,l,3,3-tetrametilurônio hexafluorofosfato (HBTU), o-(benzotriazol-l-il)-l,l,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TBTU), benzotriazole-1-il-oxi- tris(dimetilamino)fosfônio hexafluorofosfato (BOP), benzotriazole-l-il- oxi-tris-pirrolidinofosfônio hexafluorofosfato (PyBOP), N,N-bis-(2-oxo-3- oxazolidinil)fosfônico dicloreto (BOP-CI), bromo-tris-pirrolidino-fosfônio hexafluorofosfato (PyBroP), iso-butilcloroformato (IBCF), 1,3 diciclo- hexilcarbodiimida (DCC), 1,3-diisopropil-carbodiimida (DIC), 1-(dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloreto (WSCDI), N-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina (EEDQ), isopropilcloroformato (IPCF), 2-(5-norbornen-2,3-dicarboximido)- 1,1,3,3-tetrametilurônio tetrafluoroborato (TNTU), propano ácido fosfônico anidrido (PPAA) e 2-succinimido-l,l,3,3-tetrametulurônio tetrafiuoroborato (TSTU).
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que PI é acetila, P4 é um grupo de proteção de hidroxila, como definido na reivindicação 1, P6 é hidrogênio ou um grupo de proteção de amino, como definido na reivindicação 1, e P8 é um grupo de proteção de amino, como definido na reivindicação 1.
3. Processo em fase líquida para preparar Degarelix, caracterizado pelo fato de que compreende um processo como definido na reivindicação 1 ou 2, seguido por um processo que compreende a etapa de submeter o decapeptídeo representado pela fórmula II ou um sal do mesmo a um tratamento com um agente de clivagem para remover os grupos de proteção P4, P6 e P8.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que PI é acetila, P4 é tBu, P6 é hidrogênio ou tBu, e P8 é Boc.
5. Processo em fase líquida para preparação de um polipeptídeo representado pela fórmula (IV)
Figure img0033
caracterizado pelo fato de que compreende acoplar um polipeptídeo representado pela fórmula (V), ou um sal do mesmo, com um polipeptídeo representado pela fórmula (VI), ou um sal do mesmo,
Figure img0034
e, em seguida, remover o grupo de proteção PN, em que AA4 a AA10, P4, P6 e P8 são os mesmos como definidos na reivindicação 1, e PN é benziloxicarbonil (Z).
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que PN é benziloxicarbonila que é removida por hidrogenação do composto
Figure img0035
Figure img0036
na presença de um catalisador Pd/C.
7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de ser seguido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
8. Processo em fase líquida para produção de um composto de
Figure img0037
, em que AA4 a AA7, P4 e P6 são os mesmos como definidos na reivindicação 1, e PN é benziloxicarbonil (Z), caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) prover
Figure img0038
, em que P6 tem o mesmo significado conforme acima, (PN2) é benziloxicarbonil (Z) ou hidrogênio, e (PC) é um éster benzil (OBzl) ; (b) remover o grupo de proteção de amino (PN2), se presente; (c) hidrogenar
Figure img0039
para obter
Figure img0040
Figure img0041
e (d) reagir
Figure img0042
com um éster ativado de
Figure img0043
para prover
Figure img0044
, em que AA4 tem o mesmo significado conforme acima, (P4) é um grupo de proteção de hidroxila, como definido na reivindicação 1, ou hidrogênio, e PN é benziloxicarbonil (Z).
9. Processo para preparação de uma solução de degarelix, caracterizado pelo fato de ser pelo processo como definido na reivindicação 3 ou 4, em que o composto
Figure img0045
é obtido pelo processo como definido na reivindicação 8.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pH é mantido abaixo de 9, preferivelmente abaixo de 8.
11. Compostos de polipeptídeo, caracterizados pelo fato de serem representados pelas seguintes fórmulas:
Figure img0046
, em que AA4 é Ser, AA5 é 4Aph(L-Hor), AA6 é D-Aph(Cbm), AA7 é Leu, AA8 é Lys(iPr), AA9 é Pro, AA10 é D-Ala; PI é um grupo de proteção de amino, como definido na reivindicação 1; P4 é hidrogênio ou um grupo de proteção de hidroxila, como definido na reivindicação 1; P6 é hidrogênio ou um grupo de proteção de amino, como definido na reivindicação 1; e P8 é um grupo de proteção de amino, como definido na reivindicação 1 e PN é benziloxicarbonil (Z).
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