CN107417771A - 一种法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法，采用半胱氨酸特殊保护基4‑甲氧基三苯甲基及特定脱除条件，可定点，专一脱除半胱氨酸保护基而不对其他氨基酸保护基作用，仅半胱氨酸巯基游离，并作为唯一反应位点，从而避免副反应的发生，采用反,反‑法尼基溴作为法尼基修饰原料，可于固相体系中简单、高效的实现半胱氨酸法尼基修饰，从而达到合成目标产物的目的，工艺简单，结构确定，杂质少，利于纯化，收率高。

Description

一种法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及法尼基修饰的半胱氨酸多肽的合成方法。
背景技术
法尼基半胱氨酸英文名称farnesylcysteine法尼基半胱氨酸蛋白质分子(如G蛋白的γ亚基)中半胱氨酸残基经法尼基修饰后的衍生物,可帮助蛋白质定位于细胞质膜的内表面，30％人类肿瘤皆与Ras基因突变、Ras蛋白表达水平增高有关。Ras蛋白在法尼基修饰后才能定位于细胞膜内侧，从而发挥促进生长的作用，导致肿瘤细胞恶性增殖。这一过程的关键步骤是在法尼基转移酶(FTase)的催化作用下，Ras蛋白羧基端的CaaX(CaaX的组成中C为Cys，a为疏水性氨基酸，X为甲硫氨酸和丝氨酸等)被法尼基化。
根据法尼基转移酶的结构分析和催化机理研究，法尼基转移酶抑制剂以法尼基转移酶为作用靶点抑制修饰酶作用，从而抑制Ras突变性肿瘤以及一些Ras上游某种蛋白过度表达的肿瘤细胞生长,对正常的细胞则无明显毒性。法尼基转移酶抑制剂的研究主要集中在下4类化合物：(一)CaaX四肽及其模拟物；(二)法尼基焦膦酸酯(FPP)模拟物；(三)双底物模拟物；(四)天然产物。其中含CaaX四肽的化合物反应专一性好，酶识别能力强，利于较为系统的研究，并进行生物活性评价。
因此，能抑制法尼基转移酶的活性、阻止Ras蛋白的CaaX端基法尼化的化合物，将是一类具有潜在应用价值的抗癌药物，法尼基转移酶抑制剂成为药物分子设计的新靶点，引起了国外许多着名药物研究机构和药物公司的关注。
鉴于CaaX端基法尼化的多肽在生物医学领域的应用前景，本发明针对可作为法尼基转移酶抑制剂的CaaX端基法尼基化的多肽作为发明立足点，目的在于发明一种简单、高效的合成工艺路线及合成方法，实现CaaX端基法尼基化的多肽的合成。
处于此种目的，我们在研究相关合成工艺的过程中发现，现有技术工艺较为复杂，耗时较长。该技术主要采用先合成纯化得到含游离巯基的多肽，再进行半胱氨酸法尼基修饰，序列中的其他氨基酸中活性基团无保护，易于发生其他副反应，此种方法难以确定法尼基反应位点，另外还需要严格控制投料比例，避免多余原料产生的杂质；根据反应原理，过程中需添加碱性试剂以促进反应的进行，而在碱性反应体系游离的巯基易于氧化从而产生二聚体杂质，阻碍法尼基修饰的进行；反应结束后还需进行后处理，提取出目标产物，过程繁琐；较多的副反应和反应位置的不确定为后期纯化和鉴定造成极大的困难，影响最终的收率和结构的确定。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法，该方法能够克服现有技术的缺陷，且简单、高效。
本发明的法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Wang Resin与活化后的氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH在溶剂中发生反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Fmoc-Ser(tBu)-Resin。
(2)脱除步骤(1)中得到的连接有氨基酸的树脂Fmoc保护基，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
H-Ser(tBu)-Resin。
(3)将步骤(2)中得到的H-Ser(tBu)-Resin与保护氨基酸Fmoc-Ile-OH发生耦合反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Fmoc-Ile-Ser(tBu)-Resin。
(4)重复步骤(2)和(3)，依次反应下列氨基酸：Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(MMT)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
H-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(MMT)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
其中，半胱氨酸Cys选择Fmoc-Cys(MMT)-OH作为原材料，进行多肽的固相合成。
(5)将二碳酸二叔丁酯(Boc酸酐)与步骤(4)中得到的多肽片段在溶剂中发生反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(MMT)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
(6)脱除步骤(5)中多肽片段中的保护基MMT(4-甲氧基三苯甲基)，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
(7)步骤(6)中得到的多肽片段与反,反-法尼基溴在溶剂中发生反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
(8)裂解步骤(7)中得到的多肽片段，经纯化，得到氨基酸序列如下的法尼基修饰的半胱氨酸多肽：
H-Met-Glu-Asp-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser-COOH。
进一步的，步骤(1)中，所述反应中加入用于缩合的缩合剂N,N-
二异丙基碳二亚胺(DIC)。其中，DIC的用量相当于约3倍
Wang Resin的摩尔量。
进一步的，步骤(1)中，所述反应中还加入有催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)。
其中，DMAP的用量相当于约0.1倍Wang Resin的摩尔量。
进一步的，步骤(2)中，用于脱除Fmoc保护基的试剂为哌啶、DMF、三乙胺、二乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)和吗啉中的一种或几种。优选哌啶与DMF的混合液。
其中，哌啶与DMF的体积比为2:8。
进一步的，步骤(3)中，所述反应中加入缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)。
其中，HBTU的用量相当于约3倍Wang Resin的摩尔量。
进一步的，步骤(3)中，所述反应中还加入用于活化氨基酸的活化剂。
进一步的，所述活化剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)三乙胺、二乙胺和N-甲基吗啡啉中的一种或几种。
其中，DIEA的用量相当于约10倍Wang Resin的摩尔量
进一步的，步骤(5)中，所述反应中还加入活化氨基酸的活化剂。
所述活化剂为N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和N-甲基吗啡啉中的一种或两种。
其中，DIEA的用量相当于约10倍Wang Resin的摩尔量。
进一步的，步骤(6)中，用于脱除步骤(5)中多肽片段中的保护基MMT(4-甲氧基三苯甲基)的试剂为三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷(DCM)、乙酸汞和硝酸银中的一种或几种。优选TFA和DCM的混合液。
所述TFA和DCM的体积比为1:99。
进一步的，步骤(8)中，裂解步骤(7)中得到的多肽片段的裂解液为三氟乙酸(TFA)、水、1,2-乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)、苯甲醚、间甲酚和苯甲硫醚中的一种或几种。
进一步的，所述裂解液包括体积百分数为92-98％的TFA、1-3％的水、1-3％的EDT和0.8-1.2％的TIS。
所述裂解液优选包括体积百分数为95％的TFA、2％的水、2％的EDT和1％的TIS。
进一步的，所述溶剂为DMF、DCM、DMSO和NMP中的一种或几种。优选DMF。
进一步的，所述反应均在气体保护下进行。优选氮气。
其中，裂解液用量为10ml/g。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
1、本发明实现了含半胱氨酸法尼基修饰多肽的固相合成工艺；
2、本发明采用半胱氨酸上巯基保护基为4-甲氧基三苯甲基(MMT)及特定脱除条件，可定点，专一脱除半胱氨酸保护基而不对其他氨基酸保护基作用，仅半胱氨酸巯基游离，并作为唯一反应位点，从而避免副反应的发生；
3、本发明采用反,反-法尼基溴作为法尼基修饰原料，可于固相体系中简单、高效的实现半胱氨酸法尼基修饰，从而达到合成目标产物的目的，工艺简单，结构确定，杂质少，利于纯化，收率高；
4、本发明固相合成体系中多肽空间位置固定且肽与肽之间距离较远无碰撞机会，整个过程氮气保护，可以避免二聚体的产生，保证作为活性位点的巯基在游离状态，利于法尼基修饰的进行；
5、本发明固相合成体系中未反应的过量原料都可通过洗涤树脂的方式轻松去除，不会对后续反应造成影响，且利于减少粗肽中的杂质含量。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明的实施例1中产品高效液相色谱仪检测分析图；
图2是本发明的实施例1中产品电喷雾质谱仪检测分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：
H-Met-Glu-Asp-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser-COOH的合成，包括以下步骤：从多肽的C端向N端合成：
一、称量0.4mmol/g Wang Resin 2g(合成规模为0.8mmol)放入反应管中，加DMF(15ml/g)，氮气鼓吹30min，使之充分溶胀。
二、连接多肽的第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入0.46g Fmoc-Ser(tBu)-OH用适量DMF溶解完全，加入2.4mmolDIC，再加入0.08mmolDMAP，通氮气反应120min，吡啶：乙酸酐＝1:1封头30min。得到Fmoc-Ser(tBu)-Resin。
三、脱除Fmoc保护基：去掉反应液，加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，5min，抽掉反应液，再加20％哌啶/DMF溶液(15ml/g)，15min。抽掉哌啶溶液，DMF洗涤树脂6次，去除脱除保护基试剂的残留。取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min,变深蓝色说明保护基Fmoc已脱除，得到H-Ser(tBu)-Resin。
四、氨基酸耦合反应：加入2.4mmol的保护氨基酸Fmoc-Ile-OH用适量DMF溶解完全,再加入2.4mmolHBTU和8mmol的DIEA,通氮气反应40min，通过沙芯抽滤掉反应溶剂，DMF洗涤树脂5次，去除过量的保护氨基酸。取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，无色说明反应完全，得到Fmoc-Ile-Ser(tBu)-Resin。
五、按照肽链中的氨基酸顺序，重复步骤三、四，反应下列氨基酸：Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(MMT)-OH,，Fmoc-Ala-OH，
Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，
Fmoc-Met-OH，其中半胱氨酸C选择特殊保护基的
Fmoc-Cys(MMT)-OH作为原材料，得到
H-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(MMT)-Val-Ile-Ser(tBu)
-Resin。
六、在反应管中，加入2.4mmol的Boc酸酐，适量DMF溶解，再加入8mmol的DIEA，氮气反应30min，通过沙芯抽滤掉反应溶剂，DMF洗涤树脂5次，去除过量的保护氨基酸。取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min，无色说明反应完全，得到
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(MMT)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
七、配置20ml 1％TFA/DCM溶液，加入反应管中，通氮气反应1h，脱除半胱氨酸保护基MMT,DMF洗涤树脂6次,得到Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
八、2mmol反,反-法尼基溴溶于20mlDMF，加入反应管中，通氮气反应90min，用DMF洗涤树脂6次，得到
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin。
九、配制裂解液(10ml/g)：TFA 95％；水2％；EDT 2％；TIS 1％，裂解树脂120min，抽滤去除树脂得滤液，冰乙醚析出白色固体，使用离心机离心，白色固体用冰乙醚洗涤6次，烘干得到白色粉末粗肽834mg，即H-Met-Glu-Asp-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser-COOH。
十、将粗肽用水/乙腈溶解，用反向C18色谱柱的高效液相色谱仪进行分离纯化，流动相：A液0.1％TFA的水溶液，B液0.1％的乙腈溶液，检测波长为220nm，将含目标产物溶液冻干，得到纯品356mg，收率42.7％。
纯品用30％乙腈/70％水溶解，浓度1mg/ml，用反向C18色谱柱的高效液相色谱仪检测，如图1所示，根据峰面积归一法，得到纯度较高目标产物，纯度为96.48％；用电喷雾质谱仪检测MS，如图2所示，ESI正离子图谱表明产品质谱正确(目标产物理论分子量1168.48)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种法尼基修饰的半胱氨酸多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Wang Resin与活化后的氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH在溶剂中发生反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Fmoc-Ser(tBu)-Resin；
(2)脱除步骤(1)中得到的连接有氨基酸的树脂Fmoc保护基，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
H-Ser(tBu)-Resin；
(3)将步骤(2)中得到的H-Ser(tBu)-Resin与保护氨基酸Fmoc-Ile-OH发生耦合反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：Fmoc-Ile-Ser(tBu)-Resin；
(4)重复步骤(2)和(3)，依次反应下列氨基酸：Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(MMT)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Met-OH，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
H-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(MMT)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin；
(5)将二碳酸二叔丁酯与步骤(4)中得到的多肽片段在溶剂中发生反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(MMT)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin；
(6)脱除步骤(5)中多肽片段中的保护基4-甲氧基三苯甲基，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin；
(7)步骤(6)中得到的多肽片段与反,反-法尼基溴在溶剂中发生反应，得到氨基酸序列如下的多肽片段：
Boc-Met-Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser(tBu)-Resin；
(8)裂解步骤(7)中得到的多肽片段，经纯化，得到氨基酸序列如下的法尼基修饰的半胱氨酸多肽：
H-Met-Glu-Asp-Pro-Ala-Cys(farnesyl)-Val-Ile-Ser-COOH。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述反应中加入用于缩合的缩合剂N,N-二异丙基碳二亚胺。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述反应中还加入有催化剂4-二甲氨基吡啶。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用于脱除Fmoc保护基的试剂为哌啶、DMF、三乙胺、二乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和吗啉中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述反应中加入缩合剂2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述反应中还加入用于活化氨基酸的活化剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述活化剂为N,N-二异丙基乙胺、三乙胺、二乙胺和N-甲基吗啡啉中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，用于脱除脱除步骤(5)中多肽片段中的保护基MMT(4-甲氧基三苯甲基)的试剂为三氟乙酸、二氯甲烷、乙酸汞和硝酸银中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(8)中，裂解步骤(7)中得到的多肽片段的裂解液为三氟乙酸、水、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷、苯甲醚、间甲酚和苯甲硫醚中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述裂解液包括体积百分数为92-98％的三氟乙酸、1-3％的水、1-3％的1,2-乙二硫醇和0.8-1.2％的三异丙基硅烷。
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