CN110183509A - 一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的新方法，其包括如下步骤：在灯照射下，将多肽或蛋白溶于水中制成多肽或蛋白溶液，加入过氧化二异丙苯和TCEP，之后调节pH至6.0‑7.0，加入含有半胱氨酸的多肽或蛋白，在0‑40℃下搅拌反应得到产物，其中，过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为100：100:1‑1：1：1，多肽或蛋白溶液的浓度为1mM‑0.1M。本发明条件温和、选择性好、收率高、特别适合脱除多肽或蛋白质中半胱氨酸上的巯基。

Description

一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的新方法
技术领域
本发明涉及药物领域以及生物工程技术领域，尤其涉及一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的新方法。
背景技术
随着生物医学的快速发展，多肽及蛋白质的化学合成也越来越多地受到人们的关注。通过化学合成的方法，人们不仅可以将20种天然氨基酸以外的非天然氨基酸插入序列的任意位置，而且能够实现特定位点的蛋白翻译后修饰。然而传统的酰胺缩合反应难以实现较长肽链（50个氨基酸以上）的合成，并伴有产率低、易消旋等缺点。为此，人们希望能够通过化学选择性的连接过程对两段未保护的肽链进行偶联，在连接位点形成天然的肽键且不导致差向异构化。1994年，芝加哥大学的Stephen Kent教授课题组报道了一种基于半胱氨酸的天然化学连接（Native Chemical Ligation, NCL）反应（Science, 1994,266,776）,此法是多肽合成中常用的一种非常有效的连接两个肽段的策略。这种方法可以将一个含有N-端半胱氨酸的肽链和一个含有C-端硫酯的片段连接在一起从而方便高效地合成更长的多肽。然而，半胱氨酸的丰度较低（蛋白中的丰度为1.4%），极大地限制了NCL在蛋白合成方面的应用。
为了进一步拓展这种方法的应用，Dawson等人发展了Pd/Al2O3和雷尼镍催化的脱除多肽上巯基的方法，从而使得自然化学连接法可以用于丙氨酸这样的连接位点。后来Danishefsky和Wan等人进一步发展了TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine)/VA-044/t-BuSH体系，用于在自然化学连接法中脱除巯基。但是由于许多多肽化合物会吸附在钯和镍等金属催化剂以及自由基引发剂上，使得上述方法的应用受到了限制。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种条件温和、选择性好、收率高的选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的新方法。
本发明解决其技术问题，采用的技术方案是，提出一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的新方法，其包括如下步骤：在灯照射下，将多肽或蛋白溶于水中制成多肽或蛋白溶液，加入过氧化二异丙苯和TCEP，之后调节pH至6.0-7.0，加入含有半胱氨酸的多肽或蛋白，在0-40℃下搅拌反应得到产物，其中，过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为100：100:1-1：1：1，多肽或蛋白溶液的浓度为1mM-0.1M。
采用上述技术方案，以过氧化二异丙苯作（DCP）为引发剂，TCEP作为硫捕捉剂，以水作为溶剂，在光照以及0-40℃条件下多肽或蛋白可以反应，可以脱除多肽或蛋白中半胱氨酸上的巯基，反应路线如下所示：
作为上述技术方案的优选，通过LC-MS来监控反应结束。
作为上述技术方案的优选，反应结束后产物用HPLC纯化，之后冻干得到纯化产物，产物或纯化产物使用HNMR和/或ESI-MS检测。
作为上述技术方案的优选，所述灯为日光灯，功率为5-100W。
作为上述技术方案的优选，所述日光灯功率为20-60W。
作为上述技术方案的优选，过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为10:10:1-50:50:1
作为上述技术方案的优选，所述过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为30:30:1。
作为上述技术方案的优选，反应的温度为20-40℃。
本发明以过氧化二异丙苯作为引发剂，TCEP作为硫捕捉剂，以水作为溶剂，在光照条件下即可实现半胱氨酸的脱巯基反应，本方法反应的条件温和、选择性好、收率高，特别适合脱除多肽或蛋白质中半胱氨酸上的巯基。
附图说明
图1为实施例1中HNMR对纯化产物的核磁共振分析图谱。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
在30W日光灯照射下，将2.0mmol谷胱甘肽（化合物1）溶于20ml水中，加入4.0mmol的过氧化二异丙苯和4.0mmol的TCEP，之后用1.0mol/L的NaOH溶液调节pH至6.0，在0℃下搅拌反应生成产物（化合物2），24小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为85%。反应式：
使用HNMR对纯化产物进行分析，如图1所示，1HNMR(400MHz,D2O):δH 4.47(q,J = 7.3Hz,1H),4.00(t,J=6.6Hz,1H), 3.93(d,J=3.7Hz,2H),2.61-2.74(m,2H),2.29-2.42(m,2H),1.53(d,J=7.3Hz,3H)；使用ESI-MS对纯化产物进行分析：ESI-MS calcd forC10H17N3O6[M-H]+m/z=274.25，found:274.28。
实施例2：
在100W日光灯照射下，将0.5mmol多肽（化合物3）溶于10ml水中，加入5mmol的过氧化二异丙苯和5mmol的TCEP，之后用0.2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，在40℃下搅拌生成产物（化合物4），通过LC-MS来监控，20小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为85%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测，ESI-MS calcd for C35H53N11O13[M +Na]+m/z =858.37, [M +H]+m/z = 836.39, found: 858.39，836.58。
实施例3：
在5W日光灯照射下，将0.01mmol多肽（化合物5）溶于10ml水中，加入1mmol的过氧化二异丙苯和1mmol的TCEP，之后用0.6mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5，在20℃下搅拌生成产物（化合物6），通过LC-MS来监控，28小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为80%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测：ESI-MScalcd for C37H61N13O11[M +H]+m/z=864.47,[M+H]2+m/z= 432.74,found:864.53，432.84。
实施例4：
在40W日光灯照射下，将0.1mmol多肽（化合物7）溶于10ml水中，加入3.0mmol的过氧化二异丙苯和3.0mmol的TCEP，之后用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH至6.5，在20℃下搅拌生成产物（化合物8），通过LC-MS来监控，28小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为92%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测：ESI-MS calcd for C59H85N15O20[M +Na]+m/z=1347.38, [M+H]+m/z=1324.60,found:1347.04，1324.83。
实施例5：
在60W日光灯照射下，将0.05mmol多肽（化合物9）溶于10ml水中，加入1.5mmol的过氧化二异丙苯和1.8mmol的TCEP，之后用0.8mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，在25℃下搅拌生成产物（化合物10），通过LC-MS来监控，23小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为90%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测：ESI-MS calcd for C42H68N14O14[M +Na]+m/z=1015.49, [M+H]+m/z= 993.51,found:1015.55，993.56。
实施例6：
在20W日光灯照射下，将0.6mmol多肽（化合物11）溶于10ml水中，加入0.6mmol的过氧化二异丙苯和0.6mmol的TCEP，之后用0.9mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，在35℃下搅拌生成产物（化合物12），通过LC-MS来监控，25小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为78%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测：ESI-MS calcd for C42H68N14O14[M +Na]+m/z=1180.61, [M+H]+m/z=1158.62, found:1180.91，1158.87。
实施例7：
在80W日光灯照射下，将0.8mmol多肽（化合物13）溶于10ml水中，加入1.6mmol的过氧化二异丙苯和3.0mmol的TCEP，之后用0.7mol/L的NaOH溶液调节pH至6.0，在32℃下搅拌生成产物（化合物14），通过LC-MS来监控，26小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为80%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测：ESI-MS calcd for C37H61N13O11[M +Na]+m/z=511.24, [M+H]+m/z=488.25, found:511.39，488.37。
实施例8：
在70W日光灯照射下，将0.02mmol多肽（化合物15）溶于10ml水中，加入1.6mmol的过氧化二异丙苯和0.8mmol的TCEP，之后用0.7mol/L的NaOH溶液调节pH至6.0，在39℃下搅拌生成产物（化合物16），通过LC-MS来监控，25小时后反应结束，之后产物用HPLC纯化，冻干得到纯化产物，纯度为88%。反应式：
使用ESI-MS对纯化产物进行检测：ESI-MS calcd for C42H68N14O14[M +Na]+m/z=943.44, [M+H]+m/z=921.46,found:943.30，921.25。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (7)

1.一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于，包括如下步骤：在灯照射下，将多肽或蛋白溶于水中制成多肽或蛋白溶液，加入过氧化二异丙苯和TCEP，之后调节pH至6.0-7.0，加入含有半胱氨酸的多肽或蛋白，在0-40℃下搅拌反应得到产物，其中，过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为100:100:1-1:1:1，多肽或蛋白溶液的浓度为1mM-0.1M。
2.根据权利要求1所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：通过LC-MS来监控反应结束。
3.根据权利要求1或2所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：反应结束后产物用HPLC纯化，之后冻干得到纯化产物，产物或纯化产物使用HNMR和/或ESI-MS检测。
4.根据权利要求1所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：所述灯为日光灯，功率为5-100W。
5.根据权利要求4所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：所述日光灯功率为20-60W。
6.根据权利要求1所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为10:10:1-50:50:1
根据权利要求1所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：所述过氧化二异丙苯、TCEP和多肽的摩尔比为30:30:1。
7.根据权利要求1所述的一种选择性脱除多肽中半胱氨酸上巯基的方法，其特征在于：反应的温度为20-40℃。
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