JP2008512644A - ポリペプチドのn−末端置換用化合物、これを用いたポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明によるアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法は、非常に高い信頼度でタンパク質の相対的な定量分析ができ、MS/MSスペクトラム上でyタイプイオンとbタイプイオンを明確に区分できるため、高い信頼度のタンパク質同定が可能である。
【選択図】図4
Description
(b)前記C−末端がアルギニンまたはリシンであるオリゴペプチド混合物のうち一つは12C、32Sまたはこれら両方を含むN−末端置換用化合物で誘導体化させ、残る一つは、13C、33Sまたはこれら両方を含むN−末端置換用化合物で誘導体化させる段階と、
(c)前記2種類の誘導体化したオリゴペプチド混合物を混合し、逆相液体クロマトグラフィ(Reverse-Phase Liquid Chromatography:以下、“RPLC”という。)を経させる段階と、
(d)質量分析器を用いてベースピーククロマトグラム及びMS/MSスペクトルを得る段階と、
(e)前記得られたスペクトルを解釈する段階と、を備えるポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法を提供する。
、化合物(IX)の場合は、スルホン酸基はないものの、高い酸度を有するため、気体相においてオリゴペプ
チドにH+を提供できる。一方、化合物(IV)、(VI)、(VII)の場合には、オリゴペプチドと対応する化
合物との反応後に、H2O2等の酸化剤を用いて、反応後生成される化学種の末端のSHを酸化させることによって、スルホン酸基を生成する。化合物(III)の場合には、オリゴペプチドと対応する化合物との反応
後、チオエステル基を加水分解してチオール基を生成したのちH2O2等の酸化剤を使って酸化させることによって、スルホン酸基を生成する。
1−(1) 13 C−スルファニル酸の製造
氷浴中、4mlの濃硫酸を、13Cで置換されたアニリン(1ml、10mmol)(Aldrich社製造)に滴加し、この結果物を180〜190℃で6時間加熱した後、室温に冷却し、冷水を添加した。これによって得られた沈殿物をろ過したのち冷水で洗浄して固体を得た。このようにして得られた固体を沸騰水に溶解させた後、活性炭で脱色して直ちにろ過した後4℃で結晶化した。このろ過物を冷却して得られた結晶を真空乾燥して、13C−スルファニル酸(13C-sulfanilic acid)600mg(収率32%)を得た。
ESI−MS(negative mode):m/z=172Da([M−H]-)
1−(2) 13 C−4−スルホフェニルイソチオシアネートの製造
13C−スルファニル酸100mg(0.58mmol)を3Mの塩酸5.3mlに溶解させた溶液に、チオホスゲンを四塩化炭素に溶解させた67%(v:v)溶液(0.38ml、3.28mmol)を添加し、その結果物を常温で12時間激しく撹はんした。この混合物から水分を酢酸エチル(AcOEt)を用いて抽出し、無水MgSO4を用いて乾燥したのちろ過した。このろ過体を減圧下で濃縮させて油状の残分を得、0.5MのNaHCO3溶液(1.2ml)を添加して残分を中和した。その結果物を、凍結乾燥させて13C−4−スルホフェニルイソチオシアネートのナトリウム塩118mg(収率86%)を得た。
ESI−MS(negative mode):m/z=214Da([M−H]-)
FT−IR:2085cm-1(N=C=S)
予備実施例1
1−(1)オリゴペプチドサンプルの製造
12C−SPITCと13C−SPITCがオリゴペプチドに定量的に反応するか否かを実験するために、アナフィラトキシン(anaphylatoxin)C3a断片70−77(ASHLGLAR)10nmolを1:1ピリジン/水溶液5μlに溶解させて、オリゴペプチド溶液(A)を用意した。
実施例1で製造された13C−SPITCと12C−SPITCが1:1のモル比で混合されている試薬1mgを、ピリジン/水/エタノール(1:1:2)溶液200μlに溶解して、12C−SPITC及び13C−SPITC混合ストック溶液を、使用直前に製造した。この5μlの前記12C−SPITC及び13C−SPITC混合ストック溶液に、前記製造されたオリゴペプチド溶液(A)をそれぞれ混合し、前記オリゴペプチド−SPITC溶液のpHを約8に調節した。この溶液を、エッペンドルフサーモミキサー(Brinkmann instrument社製造)を使って徐々に撹はんしなから50℃で1時間反応させた。その後、この溶液を高速真空濃縮器内で完全に蒸発させ、この結果物を5μlの0.05%トリフルオロ酢酸(以下、“TFA”という。)及び0.2%酢酸水溶液に混入した。次にその混合物を、長さ4cm、内径400μlのPEEKチューブ(Upchurch scientific社製造)に炭素数18の分岐状炭化水素粒子(孔隙の大きさ300、粒子の大きさ5μm、Phenomenex社製造)をパッキングして自社製作したマイクロコラムを用いて直ちにマイクロ脱塩過程を経るようにした。このマイクロ脱塩過程は、前記ペプチド溶液5μlを前記マイクロコラムに6ポートスイッチングバルブ(Valco International社製造)を用いて注入し、0.05%TFA及び0.2%酢酸水溶液100μlで洗浄した後、100μlのアセトニトリルを用いて展開させることによって行った。この結果物を高速真空濃縮器内で完全に乾燥させ、今後の実験のために−20℃で保管した。
上記で得られたSPITC誘導されたペプチドを、100μlの0.1%とり振る尾路酢酸(TFA)及び90%アセトニトリル水溶液に混入した。この溶液を直接シリンジに入れて20μl/hrの溶出速度で注射して、MS実験とMS/MS実験を行った。質量分析器には4重極イオントラップ質量分析器(QIT−MS、製品名LTQ、ThermoFinnigan社製造)を使用した。スプレー放出部位を脱溶媒管の入口に高精度に合わせるために、光学xyz−トランスレーショナルステージ(translational stage、460A series;Newport社製造)が備えられた自社製作したナノ電気噴霧イオン化インターフェースを、前記質量分析器に装着した。電気噴霧を形成すべく2kVの電圧を装置に印加した。衝突誘導分解(Collision induced dissociation:以下、“CID”という。)エネルギーは、25%に調節した。MS/MS実験では2イオン種を共にCIDすべく、m/z=15Daの分離間隔(isolation width)を適用した。
2−(1)オリゴペプチド混合物サンプルの製造
実際タンパク質試料に対して本発明による方法の定量性を確認するために、馬心臓ミオグロビン(horse heart myoglobin)に対して実験をした。この馬心臓ミオグロビンは、トリプシンを用いて完全分解させると21種のオリゴペプチドを生成する。ミオグロビン10μlを60μlの100mM NH4HCO3緩衝液に溶かして90℃で10分間変性させた。その後、この溶液を室温まで冷却し、40μlのメタノールと200ngのトリプシンを添加(タンパク質対酵素の割合50:1)して、37℃で15時間分解した。このオリゴペプチドサンプルを急速真空濃縮器(Thermo Savant社製造)を使って完全に乾燥させ、今後の実験のために−20℃で保管した。
上記で得られたオリゴペプチド(B)の平均分子量は800Da、ミオグロビン10μlから由来したオリゴペプチドの総モル数は12.5nmolと仮定し、上記予備実施例1−(2)における方法と同じ方法でオリゴペプチドの誘導体化を行った。
2−(3)cRPLC/MS/MS分析
上記で得られたSPITC誘導体化したオリゴペプチド混合物を50μlの0.05%TFA及び0.2%酢酸水溶液に溶解させた後、この溶液5μl(オリゴペプチド混合物約1μl)を、自社製作した液体クロマトグラフィ(毛細管RPLC;capillary-RPLC)システムのサンプルループ(loop)に注入しカラムに注射した。質量分析器としては、上記予備実施例1で使用した、自社製作したナノ電気噴霧イオン化インターフェースが装着されている4重極イオントラップ質量分析器(QIT−MS、LTQ社製造)を使用し、前記インターフェースは、脱溶媒管に対してスプレーエミッタの位置を正確に調節するために、光学xyz−トランスレーショナルステージ(xyz-translational stage、460Aシリーズ、Newport社製造)を採用した。また、前記インターフェースは、ステンレススチール接合管を介して前記分離カラムと電子スプレーエミッタとの間を直接連結することによって、LCと質量分析器間の余分の空間を最小化するように設計された。電気噴霧を発生させるために2kVの電圧を前記接合管に印加した。前記液体クロマトグラフィは超高圧RPLCシステムであり、移動相(溶媒X:0.05%TFA及び0.2%酢酸水溶液、溶媒Y:0.1%TFA及び90%アセトニトリル水溶液)が2つのISCOシリンジポンプ(Model 100DM、ISCO社製作)を使って10,000psi下で運搬されるようにした。移動相溶媒は、パッキングされた毛細管カラム(内径75μm、外径360μm、長さ1m、毛細管はPolymicro Technologiesで製作)とフロースプリッタ(flow splitter)を通る前に磁石撹はんされるステンレススチールミキサーで均一に混合された。前記カラムは、炭素数18の分岐状炭化水素粒子(孔隙の大きさ300、粒子の大きさ5μm、Phenomenex社製造)を用いて実験室で製作し、200分間指数関数的な勾配変化で溶媒Yの含量を0%から80%まで変化させた。ミオグロビンの質量分析を通じた配列分析を行うためにQIT−MSはデータ−従属タンデムMSモードで作動させた。これは、先行するMSスキャンで最も豊富に検出された2イオンに対して後続するMS/MSを連続して実施するようにする方式のことをいう。一方、CIDエネルギーは35%に調節し、MS/MSは2イオン種を共にCIDするためにm/z=15Daの分離間隔(isolation width)を適用した。
2−(1)オリゴペプチド混合物サンプルの製造
実際2種類のタンパク質サンプルに対する1:1定量テストとデノボシーケンシングテストをするために、2種類の同一のイーストエノラーゼ(トリプシンを使って完全分解させた時、52種のオリゴペプチドを生成)100μlのサンプルCとDを、予備実施例2−(1)における方法と同じ方法で分解した後、急速真空濃縮器(Thermo Savant社製造)を用いて完全乾燥させたのち、今後の実験のために−20℃で保管した。
上記で得られたオリゴペプチド(C及びD)の平均分子量を800Daと仮定し、上記実施例1で製造された13C−SPITCと12C−SPITCのそれぞれ1mgを、1:1:2ピリジン/水/エタノール溶液200μlにそれぞれ溶解させた13C−SPITCと12C−SPITCストック溶液を、使用直前に製造して使用することによって誘導体化を行った。サンプルCの誘導体化には12C−SPITCを使用したし、サンプルDの誘導体化には13C−SPITCを使用した以外は、上記予備実施例1−(2)と同じ方法で行った。それぞれの反応結果物を100μlの0.05%TFA及び0.2%酢酸水溶液に混入させ、それぞれ0.5μlずつを混合して、体積比1:1の混合溶液を用意した後、全体体積が5μlとなるように4μlの0.05%TFA及び0.2%酢酸水溶液を添加し、今後の実験のために−20℃で保管した。
上記で用意された誘導体化したサンプルC、D混合物(体積比1:1)に対して上記予備実施例2−(3)による方法と同じ方法にしてRPLC/MS/MS実験は行われた。この時のベースピーククロマトグラムを図4(c)に示し、その中で選択された一部ピークに対するMS/MSスペクトルを前記クロマトグラムの上部に共に示す。
3−(1)オリゴペプチド混合物サンプルの製造
上記実施例2−(1)と同じ方法でイーストエノラーゼに対するオリゴペプチドサンプルを製造した。
上記得られたオリゴペプチド(C及びD)の誘導体化は、上記実施例2−(2)による方法と同じ方法で行われた。それぞれの反応結果物を100μlの0.05%TFA及び0.2%酢酸水溶液に混入した。そしてSPITCで誘導体化したサンプルCの量を0.5μlと固定し、サンプルの適量を加えて、サンプルC、Dの体積比が1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10となるように前記誘導体化したサンプルを混合して混合溶液を用意した。
上記予備実施例2−(3)による方法と同じ方法で、前記誘導体化したサンプルC及びDの1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10の混合物に対して6回のcRPLC/MS/MS実験を行い、上記実施例2−(3)と類似する結果を得た。実際サンプルC及びDの定量のために、既存に商用化している検索プログラムであるSEQUESTを用いて、データベースで生成された全てのトリプシンの分解によるオリゴペプチドは13C−SPITCが誘導体化されているとの仮定下、まず、13C−SPITCが誘導体化されているペプチドを検索した。この検索から同定結果を得た後、この結果を用いて定量分析プログラムであるXPRESS(Systems Biology社製造)を稼動し、前記ピークと−6Daの差を見せるピーク(12C−SPITCが誘導体化されているオリゴペプチド)を検索して、相対的な定量データを得た。この結果によって、各実験当たり約30個程度のオリゴペプチドに対してペプチド定量数値を獲得した。この定量数値の平均と標準偏差を求めて下記表2に示す。また、この表2に基づいて、期待値対実際得られた測定値に対するグラフを図5に示す。
Claims (11)
- (a)2種類のポリペプチドサンプルのそれぞれをタンパク質分解酵素を用いて分解することによって、C−末端がアルギニンまたはリシンである2種類のオリゴペプチド混合物を得る段階と、
(b)前記C−末端がアルギニンまたはリシンであるオリゴペプチド混合物のうち一つは12C、32Sまたはこれら両方を含むN−末端置換用化合物で誘導体化させ、残る一つは、13C、33Sまたはこれら両方を含むN−末端置換用化合物で誘導体化させる段階と、
(c)前記2種類の誘導体化したオリゴペプチド混合物を混合し、逆相液体クロマトグラフィを経させる段階と、
(d)質量分析器を用いてベースピーククロマトグラム及びMS/MSスペクトルを得る段階と、
(e)前記得られたスペクトルを解釈する段階と、
を備えることを特徴とする、ポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。 - 前記タンパク質分解酵素は、トリプシン、エンドプロテイナーゼLys−CまたはエンドプロテイナーゼArg−Cであることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
- 前記タンパク質分解酵素は、トリプシンであることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
- 前記質量分析器は、マトリクス支援レーザー離脱/イオン化法(MALDI)タイプ質量分析器であることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
- 前記質量分析器は、電子スプレーイオン化法(ESI)タイプ質量分析器であり、前記逆相液体クロマトグラフィと直接連結されていることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
- 前記(b)段階のpHは、7〜9の範囲であることを特徴とする、請求項2または6に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
- リシンの誘導体化段階は、リシンのε−アミノ基は誘導体化させず、リシンのN−末端のみ誘導体化させることを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
- 前記(e)段階は、商業的に入手可能なソフトウェアプログラムまたはデータベースを利用することを特徴とする、請求項2に記載のポリペプチド内のアミノ酸配列決定方法及びアミノ酸定量分析方法。
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