JP5951644B2 - シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含む非天然型アミノ酸及びその使用 - Google Patents
シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含む非天然型アミノ酸及びその使用 Download PDFInfo
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Description
X1は、
(式中、
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−であり;
R2は、水素,ハロゲン,C1〜C4アルキル基,CF3,CN,C1〜C4アルコキシ基,−O−CF3,C2〜C5アルカノイルオキシ基,C1〜C4アルキルアミノカルボニルオキシ基又はC1〜C4アルキルチオ基を表す);
X2は、−CH2−,−O−,−S−,−NH−,−C(O)−,−OC(O)−,−C(O)O−,−NH−C(O)−もしくは−C(O)−NH−を表すか;又は、
X2は、>CH−もしくは>N−を表すか(式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して3員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH<,−NH−CH<もしくは−CH2−N<を表すか(式中、2つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して4員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH2−CH<,−NH−CH2−CH<,−CH2−NH−CH<,−CH2−CH2−N<,
X3は、C1〜C6アルキレン基,−(CH2−CH2−O)m−,−(CH2−O)p又は単結合を表し;
X4は、−NH−,−C(O)−NH−,−NH−C(O)−,−NH−CH(NH2)−,−CH(NH2)−NH−,−NH−C(NH)−NH−,−C(O)−NH−CH(NH2)−,−C(O)−NH−C(NH)−NH−,NH−CH(NH2)−C(O)−又は−NH−C(NH)−NH−C(O)−を表し;
X5は、水素、C1〜C6アルキル基、C1〜C6アルコキシ−C1〜C2アルキル基、C2〜C7アルカノイルオキシ−C1〜C2アルキル基又はC2〜C7アルカノイルスルファニル−C1〜C2アルキル基を表し;
R1は、−OH又は−NH2を表し;
nは、1〜4の整数を表し;
mは、1〜6の整数を表し;及び、
pは、1〜6の整数を表す。]
a)以下の(i)〜(iii)を含む翻訳システムを提供する工程;
(i)アミノアシルtRNA合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド;
(ii)本発明の化合物又は塩;
(iii)セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するtRNA、又は、前記tRNAをコードするポリヌクレオチド;及び、
(iv)目的のポリペプチドをコードし、1つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
(ここで、アミノアシルtRNA合成酵素(i)は、化合物又は塩(ii)を用いてtRNA(iii)を特異的にアシル化することができる);
b)ポリヌクレオチド(iv)を翻訳させて、それにより目的のポリペプチドのセレクターコドンによってコードされた位置に化合物(ii)を導入する工程;並びに、
c)任意に、得られたポリペプチドを回収する工程。
X1は、
(式中、
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−であり;
R2は、水素,ハロゲン,C1〜C4アルキル基,CF3,CN,C1〜C4アルコキシ基,−O−CF3,C2〜C5アルカノイルオキシ基,C1〜C4アルキルアミノカルボニルオキシ基又はC1〜C4アルキルチオ基を表す);
X2は、−CH2−,−O−,−S−,−NH−,−C(O)−,−OC(O)−,−C(O)O−,−NH−C(O)−もしくは−C(O)−NH−を表すか;又は、
X2は、>CH−もしくは>N−を表すか(式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して3員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH<,−NH−CH<もしくは−CH2−N<を表すか(式中、2つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して4員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH2−CH<,−NH−CH2−CH<,−CH2−NH−CH<,−CH2−CH2−N<,
X3は、C1〜C6アルキレン基,−(CH2−CH2−O)m−,−(CH2−O)p又は単結合を表し;
X4は、−NH−,−C(O)−NH−,−NH−C(O)−,−NH−CH(NH2)−,−CH(NH2)−NH−,−NH−C(NH)−NH−,−C(O)−NH−CH(NH2)−,−C(O)−NH−C(NH)−NH−,NH−CH(NH2)−C(O)−又は−NH−C(NH)−NH−C(O)−を表し;
Z1は、−O−又は−NH−を表し;
R1は、−OH又は−NH2を表し;
nは、1〜4の整数を表し;
mは、1〜6の整数を表し;及び、
pは、1〜6の整数を表す。]
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−である。)
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−である。)
式中、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−であり;またR2は、本明細書中に定義された通りである。
特定のアザシクロオクチニル残基には、窒素原子を介してX2と結合する1−アザシクロオクチン−1−イル基が含まれ、例えばX1は、以下から選択される式で示される。
好ましくは、X2は−O−である。
X3に関して、好ましくは、C1〜C6アルキレン基は直鎖アルキレンをいう。
好適実施態様では、X3は−CH2−CH2−O−又は単結合である。
或いはまた、X3は−(CH2−O)p−である;また、pは、1,2,3,4,5又は6である。特定の実施態様では、X3は−CH2−O−(すなわち、pは1である)である。
特定の実施態様では、nは3又は4である。
好適実施態様では、nは4である。
のいずれかの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。
X1は、
(式中、
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−であり;
R2は、水素,ハロゲン,C1〜C4アルキル基,CF3,CN,C1〜C4アルコキシ基,−O−CF3,C2〜C5アルカノイルオキシ基,C1〜C4アルキルアミノカルボニルオキシ基又はC1〜C4アルキルチオ基を表す);
X2は、−CH2−,−O−,−S−,−NH−,−C(O)−,−OC(O)−,−C(O)O−,−NH−C(O)−又は−C(O)−NH−を表し;
X3は、C1〜C6アルキレン基,−(CH2−CH2−O)m−又は単結合を表し;
X4は、−NH−,−C(O)−NH−,−NH−C(O)−,−NH−CH(NH2)−,−CH(NH2)−NH−,−NH−C(NH)−NH−,−C(O)−NH−CH(NH2)−,−C(O)−NH−C(NH)−NH−,NH−CH(NH2)−C(O)−又は−NH−C(NH)−NH−C(O)−を表し;
X5は、水素、C1〜C6アルキル基、C1〜C6アルコキシ−C1〜C2アルキル基、C2〜C7アルカノイルオキシ−C1〜C2アルキル基又はC2〜C7アルカノイルスルファニル−C1〜C2アルキル基を表し;
R1は、−OH又は−NH2を表し;
nは、1〜4の整数を表し;及び、
mは、1〜6の整数を表す。]
X1は、
(式中、
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−であり;
R2は、水素,ハロゲン,C1〜C4アルキル基,CF3,CN,C1〜C4アルコキシ基,−O−CF3,C2〜C5アルカノイルオキシ基,C1〜C4アルキルアミノカルボニルオキシ基又はC1〜C4アルキルチオ基を表す);
X2は、>CH−もしくは>N−を表すか(式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して3員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH<,−NH−CH<もしくは−CH2−N<を表すか(式中、2つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して4員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH2−CH<,−NH−CH2−CH<,−CH2−NH−CH<,−CH2−CH2−N<,
X3は、C1〜C6アルキレン基,−(CH2−CH2−O)m−,−(CH2−O)p又は単結合を表し;
X4は、−NH−,−C(O)−NH−,−NH−C(O)−,−NH−CH(NH2)−,−CH(NH2)−NH−,−NH−C(NH)−NH−,−C(O)−NH−CH(NH2)−,−C(O)−NH−C(NH)−NH−,NH−CH(NH2)−C(O)−又は−NH−C(NH)−NH−C(O)−を表し;
X5は、水素、C1〜C6アルキル基、C1〜C6アルコキシ−C1〜C2アルキル基、C2〜C7アルカノイルオキシ−C1〜C2アルキル基又はC2〜C7アルカノイルスルファニル−C1〜C2アルキル基を表し;
R1は、−OH又は−NH2を表し;
nは、1〜4の整数を表し;
mは、1〜6の整数を表し;及び、
pは、1〜6の整数を表す。]
a)以下の(i)〜(iii)を含む翻訳システムを提供する工程;
(i)アミノアシルtRNA合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド;
(ii)本発明の化合物又は塩;
(iii)セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するtRNA、又は、前記tRNAをコードするポリヌクレオチド;及び、
(iv)目的のポリペプチドをコードし、1つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
(ここで、アミノアシルtRNA合成酵素(i)は、化合物又は塩(ii)を用いてtRNA(iii)を特異的にアシル化することができる);
b)ポリヌクレオチド(iv)を翻訳させる工程;並びに、
c)任意に、得られたポリペプチドを回収する工程。
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARAL 60
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MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARAL 60
RHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLE 120
NTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMS 180
APVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERE 240
NYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM 300
LAPNLANYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLE 360
SIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVFGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA 420
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL 454
(i)アミノアシルtRNA合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド;
(ii)本明細書中に記載されるtRNA、又は、それをコードするポリヌクレオチド
一般的な材料と方法
N−ε−((シクロオクト−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル)−L−リジンは、スキーム1に概説するように製造することができる。
化合物6(3.12g,25.1mmol)とTEA(4.20ml,30.2mmol,1.2eq)をTHF(0.2M,126ml)に溶解し、−10℃で1時間かけて、クロロギ酸4−ニトロフェニル(15.20g,75.4mmol,3.0eq)とTHF(0.7M,36ml)の攪拌溶液に液滴で添加した。反応混合物をRT(室温)まで温め、オーバーナイトで攪拌した。次に、cHex(100ml)を添加し、THFを減圧下で除去した。反応混合物を濾過した後に、FC(cHex:EtOAc 9:1)から黄色油として7(6.03g,20.9mmol,83%)を得た。
化合物8(1.24g,3.13mmol)を70%ギ酸のCHCl3溶液(0.2M,16ml)に溶解し、RT(室温)で36時間攪拌した。DMF(0.2M,16ml)を添加し、減圧下で全ての揮発性成分を除去した。残留物を0.1M HCl(100ml)中に溶解し、凍結乾燥によって、純粋な1のHCl塩(1.00g,3.01mmol,96%)を黄色固体として得た。
化合物4(3.12g,11.6mmol)及び無水エタン−1,2−ジオール(13.0ml,23.3mmol,20.0eq)を無水アセトン(0.6M,19ml)に溶解した。遮光下で、無水AgClO4(7.24g,34.9mmol,3.0eq)を少量ずつ加え、RT(室温)で1時間攪拌した。EtOAc(100ml)を添加し、濾過した後、1M HCl(100ml)を加え、EtOAcを用いて水層を抽出した(50ml×3)。合成した有機層を1M HCl/H2O/飽和NaCl溶液で洗浄し(各100ml)、Na2SO4上で乾燥した。減圧下で溶媒をエバポレートし、化合物9(1.42g,5.86mmol,49%)を黄色油として得、さらに精製することなく使用した。
a LiAlH4,THF,0℃〜RT,オーバーナイト;
b 安息香酸メチル,ジエチルエーテル,シクロヘキサン,254nm照射,RT,6h;
c クロロギ酸4−ニトロフェニル,NEt3(TEA),THF,−10℃〜RT,オーバーナイト;
d Boc−L−Lys−OH,NEt3(TEA),DMF,−10℃〜RT,オーバーナイト;
e:70%ギ酸 CHCl3溶液,RT,オーバーナイト。
(工程(e)では、70%ギ酸の代わりに60%のギ酸を使用できる。)
トランス−シクロオクト−4エノール(1.00g,7.92mmol,1.0eq.)及びDIEA(3.07g,4.14ml,23.8mmol,3.0eq.)を無水THF(0.3 M,26 ml)に溶解した。得られた透明溶液を、0℃、アルゴン下で、透明なクロロギ酸4−ニトロフェニル(4.79g,23.8mmol,3.0eq.)の無水THF(0.3M,26ml)溶液に2時間かけて液滴で添加した。反応混合物をRT(室温)まで温め、オーバーナイトで攪拌した。EtOAc(100ml)を添加し、不溶成分を珪藻土(セライト(商標))で濾過した。次に、濾液をH2O(50ml),1.0MHCl(50ml)及び飽和NaCl溶液(50ml)で洗浄した。続いて残りの有機相をNa2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(Macherey−Nagel silica gel 60,0.04−0.063mm,230−400mesh;cHex:EtOAc 19:1v/v)に通してシリカゲルで精製した。化合物14(1.678g,5.78mmol,73%)を白色固体として得た。
Rf(cHex:EtOAc 4:1v/v)=0.80.
1H−NMR(CDCl3)δ=8.29−8.24(m,2H),7.39−7.34(m,2H),5.67−5.57(m,1H),5.55−5.45(m,1H),4.48−4.42(m,1H),2.47−2.33(m,3H),2.22−2.07(m,2H),2.05−1.85(m,3H),1.81−1.67(m,2H)ppm.
1H−NMR(DMSO−d6)δ=8.31−8.26(m,2H),7.55−7.50(m,2H),5.66−5.57(m,1H),5.51−5.41(m,1H),4.38−4.32(m,1H),2.36−2.24(m,3H),2.13−2.02(m,2H),1.96−1.86(m,2H),1.85−1.76(m,1H),1.73−1.58(m,2H)ppm.
13C−NMR(CDCl3)δ=155.7,152.0,145.3,134.9,133.0,125.3,121.8,86.4,40.7,38.3,34.1,32.4,31.1ppm.
13C−NMR(DMSO−d6)δ=155.9,151.9,145.5,135.4,133.1,125.8,123.1,86.2,40.5,38.0,34.0,32.4,31.1ppm.
1H−NMR(CDCl3)δ=8.33−8.27(m,2H),7.42−7.38(m,2H),5.69−5.54(m,2H),5.03−4.97(m,1H),2.50−2.27(m,4H),2.23−2.16(m,1H),1.96−1.85(m,2H),1.82−1.71(m,1H),1.67−1.58(m,1H),1.39−1.30(m,1H)ppm.
13C−NMR(CDCl3)δ=155.7,152.0,145.3,135.5,131.5,125.3,121.9,76.0,40.6,34.1,32.1,29.8,28.0ppm.
HR MS(FAB+)m/z:C15H18NO5[M+H]+の理論値(calculated):292.1185,測定値(measured):292.1151.
Fmoc−L−Lys−OH(0.69g,1.87mmol,1.2eq.)を、アルゴン下で、DIEA(0.24g,0.33ml,1.87mmol,1.2eq.)及び無水DMSO(0.2M,8ml)中に懸濁した。この白色懸濁液に、RT(室温)、アルゴン下で、化合物14(0.45g,1.56mmol,1.0eq.)の無水DMSO(0.2M,8ml)透明溶液を2時間かけて液滴で添加した。反応混合物をさらに4時間、RTで攪拌した。H2O(50ml)とEtOAc(150ml)を添加し、濃HClを用いて水層のpHを1〜3に調整した。相が分離し、次いで水層をEtOAc(50ml×2)で抽出した。合成した有機層を飽和NaCl溶液で洗浄し(50ml×2)、Na2SO4上で乾燥した。全ての揮発性成分を減圧下でエバポレートし、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(Macherey−Nagel silica gel 60,0.04−0.063mm,230−400 mesh;DCM:MeOH 95:5v/v)で精製して、白色固体として化合物15(0.69g,1.32mmol,85%)を得た。二重結合の形がトランス配座からシス配座となる異性化を導く可能性がある酸性条件を避けるために、AcOHは全く精製に使用しなかった。
Rf(DCM:MeOH:AcOH 96:2:2v/v/v)=0.16.
1H−NMR(DMSO−d6)δ=7.87(d,3J(H,H)=7.4Hz,2H),7.70(d,3J(H,H)=7.3Hz,2H),7.40(t,3J(H,H)=7.4Hz,2H),7.31(t,3J(H,H)=7.4Hz,2H),6.92(t,3J(H,H)=4.4Hz,1H),5.58−5.47(m,1H),5.44−5.34(m,1H),4.33−4.12(m,4H),3.86−3.73(m,1H),2.96−2.82(m,2H),2.28−2.15(m,3H),1.90−1.76(m,4H),1.69−1.42(m,5H),1.37−1.18ppm(m,4H).
13C−NMR(DMSO−d6)δ=156.4,156.2,144.4,144.3,141.2,135.4,133.0,128.1,127.5,125.8,120.6,79.3,65.9,47.2,41.2,40.9,40.5,38.7,34.2,32.6,31.4,31.0,29.7,23.3ppm.
化合物15(0.30g,0.58mmol,1.0eq.)を20%ピペリジンのDMF(50mM,12ml)溶液に溶解し、RT(室温)で1時間攪拌した。全ての揮発性成分を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(Macherey−Nagel silica gel 60,0.04−0.063mm,230−400mesh;アセトン:MeOH:H2O 65:25:10v/v/v)に通してシリカゲルで精製し、化合物13(0.14g,0.46mmol,80%)を白色固体として得た。
Rf(acetone:MeOH:H2O 65:25:10v/v/v)=0.53.
1H−NMR(CD3OD)δ=5.65−5.54(m,1H),5.51−5.41(m,1H),4.38−4.21(m,1H),3.52(dd,3J(H,H)=7.0,5.2Hz,1H),3.11−3.02(m,2H),2.37−2.25(m,3H),2.01−1.65(m,8H),1.63−1.37(m,5H)ppm.
13C−NMR(CD3OD)δ=173.1,157.4,134.7,132.3,80.2,54.7,40.8,39.9,38.2,33.8,32.1,30.7,30.6,29.2,22.1ppm.
HR MS(ESI)m/z:C15H27N2O4[M+H]+の理論値(calculated):299.19653,測定値(measured):299.19656.
5−ノルボルネン−2−オール(5.00g,45.4mmol,1.0eq.)の無水トルエン/THF(1:1v/v,1.0M,45ml)溶液を、0℃、アルゴン下で、20%ホスゲンのトルエン溶液(8.98g,90.8mmol,2.0eq.;47.8mlの20%ホスゲンのトルエン溶液)に1時間かけて液滴で添加した。反応混合物をRT(室温)まで温め、さらに3時間攪拌した。次いで、全ての揮発性成分を減圧下で除去し、残留物を高真空で30分間乾燥し、次の工程で直接使用した。茶色の残留物を無水THF(3.5M,13ml)中に溶解し、Boc−L−Lys−OH(14.5g,59.0mmol,1.3eq.)の1.0M NaOH/THF(2:1v/v,0.3M,151ml)溶液に0℃で、液滴で添加した。添加後、反応混合物をRT(室温)まで温め、さらに12時間攪拌した。EtOAc(100ml)を加え、水層を濃HClを用いてpH<4まで酸性化した。相が分離し、次いで水層をEtOAc(70ml×3)で抽出した。合成した有機層を飽和NaCl溶液(80ml)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥した。全ての揮発性成分を減圧下でエバポレートした。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(Macherey−Nagel silica gel 60, 0.04−0.063mm,230−400mesh;DCM:MeOH:AcOH 96:3:1v/v/v;トルエンと共蒸発(co−evaporation))で精製し、茶色固体として、エキソ体/エンド体の比が3:7(1H−NMRで測定)の化合物18(16.9g,44.3mmol,97%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ=6.34−6.31(m,0.7H),6.25−6.20(m,0.3H),5.99−5.94(m,1H),5.29−5.21(m,2H),4.37−4.24(m,1H),3.22−2.99(m,3H),2.89−2.80(m,1H),2.15−2.08(m,0.7H),1.91−1.66(m,3.3H),1.61−1.37(m,14.3H),1.33−1.23(m,1H),0.99−0.88ppm(m,0.7H).
HR MS(ESI)m/z:C23H42N3O6[M+C4H11N+H]+の理論値(calculated):456.30681,測定値(measured):456.30678.
化合物18(11.6g,30.4mmol,1.0eq.)を60%ギ酸のCHCl3溶液(6:4v/v,0.2M,152ml)に溶解し、RT(室温)で24時間、攪拌した。DMF(0.2M,152ml)を添加し、全ての揮発性成分を減圧下で除去した。残留物を50mM HCl中に溶解し、凍結乾燥した。エキソ体/エンド体の比が3:7(1H−NMRで測定)の純粋な化合物1のHCl塩(9.14g,28.7mmol,94%)を黄色固体として得た。
1H−NMR(DMSO−d6)δ=8.47−8.37(m,2H),7.12−7.04(m,0.3H),6.96−6.89(m,0.7H),6.29(dd,3J(H,H)=5.4,2.9Hz,0.7H),6.23(dd,3J(H,H)=5.5,2.7Hz,0.3H),5.97(dd,3J(H,H)=5.5,3.2Hz,0.3H),5.91(dd,3J(H,H)=5.4,2.6Hz,0.7H),5.12−5.01(m,0.7H),4.72−4.63(m,0.3H),3.84−3.76(m,1H),3.04−2.98(m,0.7H),2.94−2.86(m,2H),2.81−2.71(m,1.3H),2.29−2.25(m,0.3H),2.05−1.98(m,0.7H),1.79−1.24(m,8H),0.91−0.71ppm(m,1H)
13C−NMR(DMSO−d6)δ=171.4,156.7,156.6*,141.3*,138.6,133.2*,132.3,74.4,72.7*,52.2,47.6,47.5*,46.3*,46.0,42.2,40.5*,34.7,34.5,33.7*,30.0,29.3,22.0ppm(*=エキソ異性体のシグナル).
HR MS(ESI)m/z:C14H23N2O4[M+H]+の理論値(calculated):283.16523,測定値(measured):283.16517.
5−ノルボルネン−2−メタノール(4.17g,33.6mmol,1.0eq.)を、0°C、アルゴン下で、トリホスゲン(9.96g,33.6mmol,1.0eq.)の無水THF(0.5M,67ml)の溶液に、2時間かけて液滴で添加し、さらに0℃で6時間攪拌した。反応混合物をRT(室温)まで温め、濾過した。次いで、全ての揮発性成分を減圧下で除去し、残留物を高真空で1時間乾燥し、透明な油として中間生成物を得、さらに精製を行うことなく次の工程で使用した。この残留物を無水THF(3.5M,10ml)中に溶解し、0℃で、ゆっくりと、Boc−L−Lys−OH(9.93g,40.3mmol,1.2eq.)の1.0M NaOH/THF(2:1v/v,0.3M,112ml)溶液に加えた。添加後、反応混合物をRT(室温)まで温め、さらに14時間攪拌した。EtOAc(100ml)を加え、水層を濃HClを用いてpH<4まで酸性化した。相が分離し、次いで水層をEtOAc(70ml×3)で抽出した。合成した有機層を飽和NaCl溶液(100ml)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥した。全ての揮発性成分を減圧下でエバポレートした。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(Macherey−Nagel silica gel 60,0.04−0.063mm,230−400mesh;DCM/MeOH/AcOH 96:3:1v/v/v,トルエンと共蒸発(co−evaporation))で精製し、黄色固体として、エキソ体/エンド体の比が2:3(1H−NMRで測定)の化合物19(12.8g,32.3mmol,96%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ=6.14(dd,3J(H,H)=4.9,2.7Hz,0.6H),6.11−6.06(m,0.8H),5.94(dd,3J(H,H)=5.4,2.6Hz,0.6H),5.52−5.46(m,0.6H),5.30−5.23(m,0.4H),4.34−4.24(m,1.4H),4.19−4.07(m,1H),3.99−3.80(m,1H),3.69−3.57(m,0.6H),3.23−3.10(m,3H),2.86(s,0.6H),2.84−2.78(m,1H),2.70(s,0.4H),1.92−1.65(m,6H),1.61−1.10(m,12H),1.19−1.11(m,0.4H),0.58−0.50(m,0.6H)ppm.
13C−NMR(DMSO−d6)δ=179.5,161.5,161.5,160.8,142.5,142.4,141.4,141.4,83.2,72.2,71.6,58.7,54.1,49.8,48.6,48.4,46.9,46.3,43.4,43.1,38.8,35.6,34.2,33.9,33.4,28.1ppm.
HR MS(ESI)m/z:C20H33N2O6[M+H]+の理論値(calculated):397.23331,測定値(measured):397.23405;C20H32N2NaO6[M+Na]+の理論値:419.21526,測定値(measured):419.21607;C20H32KN2O6[M+K]+の理論値:435.18920,測定値(measured):435.19006;C40H65N4O12[2M+H]+の理論値:793.45935,測定値(measured):793.46014.
化合物19(1.82g,4.60mmol,1.0eq.)を60%ギ酸のCHCl3溶液(6:4v/v,0.2M,23ml)で溶解し、RT(室温)で、24時間、攪拌した。DMF(0.2M,23ml)を添加し、全ての揮発性成分を減圧下で除去した。残留物を50mM HCl中に溶解し、凍結乾燥し、白色固体として、エキソ体/エンド体の比が2:3(1H−NMRで測定)の化合物17のHCl塩(1.46g,4.37mmol,95%)を得た。
1H−NMR(DMSO−d6)δ=7.11(t,3J(H,H)=5.4Hz,0.4H),7.06(t,3J(H,H)=5.4Hz,0.6H),6.15(dd,3J(H,H)=5.6,3.0Hz,0.6H),6.10−6.05(m,0.8H),5.91(dd,3J(H,H)=5.6,2.8Hz,0.6H),4.02−3.95(m,0.4H),3.86−3.79(m,0.4H),3.69−3.62(m,0.6H),3.58−3.40(m,2.6H),2.92(q,3J(H,H)=5.2Hz,2H),2.81−2.74(m,1.6H),2.64(s,0.4H),2.33−2.24(m,0.6H),1.80−1.53(m,3.4H),1.40−1.26(m,3.4H),1.24−1.18(m,1.4H),1.15−1.11(m,0.6H),0.45(ddd,3J(H,H)=11.5,4.1,2.5Hz,0.6H)ppm.
13C−NMR(DMSO−d6)δ=171.3,156.8,156.7*,137.7,137.2*,136.6*,132.6,68.0*,67.5,53.4,49.4,45.1,43.9,43.7*,42.2,41.6*,38.6*,38.4,30.6,29.5,29.1,28.9*,22.4ppm(*=エキソ異性体のシグナル).
HR MS(ESI)m/z:C15H25N2O4[M+H]+の理論値:297.18088,測定値(measured):297.18102.
実施例A:大腸菌におけるシクロオクチニル残基を含むGFPの発現
大腸菌のコドンで最適化した野生型ピロリシルtRNA合成酵素(pylRSWT)遺伝子とそれに対応するM.MaizeのtRNA(tRNApyl)(Mr Gene,レーゲンスブルク,ドイツから購入)を用いて、Young他(J Mol Biol.2010;395:361)が記載するpEVOLプラスミドシステムにおいて、M. jannaschiiのtRNA合成酵素とtRNAの2つのコード領域を置換し、プラスミドpEVOL tRNApyl/pylRSWTを作製した。さらに、アミノ酸置換Y306AとY384F含む変異型ピロリシルtRNA合成酵素をコードするプラスミドpEVOL tRNApv7pylRSw(pylRSAF)を作製した。この二重変異体について、標準的な部位特異的変異誘発を2回実施し、コドン最適化遺伝子にY306A及びY384Fを導入した。次に野生型(wt)に関しては、この遺伝子の2つのコピーをpEvolvプラスミドにクローニングし、変異型プラスミドpEVOL tRNApyl/pylRSAFを生産した。
標的タンパクGFPTAGの発現のため、C−末端 6−Hisペプチド配列を持ちN末側がFLAGタグ化され、許容部位の39にアンバー終止コドン(TAG)を含むGFPを含むpBADプラスミド(Invitrogen,カールズバッド,USA)を準備した。大腸菌Top10細胞にGFPTAG発現ベクターとpEVOL tRNApyl/pylRSWT又はpEVOL tRNApyl/pylRSAFのいずれかを共形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコール存在下において37℃で培養した。典型的に、0.5mlの一夜培養液を使用して、振盪フラスコ中の50mlのTerrific Broth(TB)培地に接種した。培養物は、通常、37℃で1〜2時間以内にOD600で0.2〜0.3に増殖した。その後、化合物1もしくは2(保存溶液:0.1M NaOH中に80mM)又は0.1M等量のNaOH(コントロール実験用)を最終濃度が1mMとなるように添加した。さらに、培養物をOD600で0.4〜0.6となるように増殖させた。次に、最終濃度0.02%(w/v)となるようにアラビノースを添加して発現を誘導した。37℃で4〜6時間振盪した後、遠心分離によって集菌した。沈殿物を1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を含む4×リン酸緩衝食塩水(4×PBS pH8.0)溶液で再懸濁し、細胞を超音波処理によって溶解した。溶解液を14,000gで1時間遠心し、上清を約50μlのNi−NTAビーズ(Qiagen,デュッセルドルフ,ドイツ)と共にインキュベートした。10mMのイミダゾールを含む4×PBSを用いてビーズを洗浄し、500mMのイミダゾールを含む緩衝液を用いて溶出した。洗浄及び/又は溶出と記載する場合、6Mの塩酸グアニジウムを含む変性4×PBS緩衝液(pH8)で実施した。より正確に収率を測定するために用いられる大規模な発現法は、それに応じてスケールアップした。
1mMの化合物1の存在下において、tRNApyl/pylRSAFを含む大腸菌でGFPTAG−>1を発現させた。発現誘導の4〜6時間後に、5mlの培養液サンプルを採取した。12mlのPBSで細胞を2回洗浄し、12mlのPBSで再懸濁し、4℃の暗所で1時間インキュベートした後、12mlのPBSでさらに2回洗浄した。その細胞をペレットにし、50μMのアジドクマリン(化合物3:Base Clickより市販されており、Sivakumar他のOrg Lett 2004,6:4603にしたがって合成できる)を含む3mlのPBSで再懸濁し(OD600約2〜3)、37℃の暗所にて振とうしながらインキュベートした。
化合物3との4〜6時間のインキュベーション後、5mlの細胞を採取し、1.5mlのPBSで2回洗浄し、PBSで再懸濁し、4℃で暗所にて1時間インキュベートし、1.5mlのPBSでさらに2回洗浄し、カバーガラスにセットした。1.4NAの油浸対物レンズを装備したライカSP5顕微鏡(Leica,マンハイム,ドイツ)に細胞を取り付けた。400Hzの走査速度と最終画素サイズ120.1nm×120.1nmの2倍のズーム比で1024*1024画素を含むイメージを取得した。DICイメージに加えて、青色ダイオードレーザー装置を用いて405nmの波長でサンプルを励起し、2つのチャンネルで同時に蛍光シグナルを記録した(青色=415〜470nm、緑色=520〜540nm)。青色チャンネルの蛍光はクリックされた化合物3を起源とし、一方、緑色チャンネルの蛍光は405nmの波長でも直接励起され、クリックされた化合物3からGFP発色団へのエネルギー変換が可能なGFPを起源としている。アルゴンイオンレーザー装置を用いてGFPを励起するのみのλ=488nmで励起中に同じ蛍光チャンネルを記録した。相対的な蛍光強度を表2にまとめる。λex=405nmで励起した時、GFPTAG−>1を発現している細胞は、GFP発色団と同様にクリックした化合物3の存在下で示される緑色チャンネルと同時に青色チャンネルの蛍光を示した。それに対して、GFPWTを発現しているコントロール細胞では、λex=405nmの青色チャンネルにおいて、バックグランドの蛍光しか認められず、すなわち、化合物3はこれらの細胞では検出されなかった。アンバー抑制されたGFPTAG−>1に比べてGFPWTは自然に多く発現していることから、緑色チャンネルで認められたGFP蛍光は、GFPTAG−>1発現細胞に比べて、コントロール細胞で強かった。要約すると、GFPTAG−>1を発現する細胞における青色チャンネルの蛍光強度はバックグランドに比べて約2〜3倍高く、in vivoで化合物3とのカップリングが起こっていることが確認された。
GFPを含むシクロオクチニルと化合物3のカップリングは、SDS−PAGEによる細胞抽出物中の蛍光を解析することによって確認した。GFPTAG−>1又はGFPWTをそれぞれ発現している大腸菌培養液に化合物3を添加後、0,15,30,60,120,180,360及び540分後に少量のサンプルを採取し、PBSで総量を1.5mlに希釈し、1.5mlのPBSで2回洗浄し、全細胞溶解物の解析のためにSDSポリアクリルアミドゲルにロードした。市販されているゲル撮影装置(Alpha Innotech,CA)で、励起波長を365nmとし、臭化エチジウムフィルターを用いて蛍光を検出することによって、ゲルの蛍光を解析した(図3a)。化合物3で標識されたGFPTAG−>1は、既に15分後に認められ、実際にGFPTAG−>1の標識がされたことを確認した。
アンバーコドンをコードした部位に化合物1を導入しているmCherry(mCherryTAG−>1)又は野生型のmCherry(mCherryWT)を発現した大腸菌培養液を用いて実施例B.1/B.2と同様の実験を実施した。一晩発現を誘導した後、前記培養液を5ml採取し、12mlのPBSで2回洗浄し、12mlのPBSで再懸濁し、4℃の暗所にて1時間インキュベートし、12mlのPBSでさらに2回洗浄した。細胞をペレットにし、50μMのアジドクマリンを含む3mlのPBSで再懸濁(OD600約2〜3)し、37℃の暗所にて振とうしながらインキュベートした。3〜4時間後、細胞を採取し、1.5mlのPBSで2回洗浄し、1.5mlのPBSで再懸濁し、4℃の暗所にて1時間インキュベートし、細胞をカバーガラスにセットする前に1.5mlのPBSでさらに2回洗浄した。次に、1.4NAの油浸対物レンズを装備したライカSP5顕微鏡(Leica,マンハイム,ドイツ)に取り付けた。400Hzの走査速度と最終画素サイズ160.5nm×160.5nmの2倍のズーム比で512*512画素を含むイメージを取得した。DICイメージに加えて、青色ダイオードレーザー装置を用いて405nmの波長でサンプルを励起し、一方、2つのチャンネルで同時に蛍光シグナルを記録した(青色/緑色=420〜520nm、赤色=590〜690nm)。青色/緑色チャンネルの蛍光はクリックされたクマリンを起源とし、一方、mCherryからの赤色チャンネルの蛍光はみられなかった。DPSSレーザー装置を用いてmCherryを励起するのみのλex=561nmで励起中に同じ蛍光チャンネルを記録した。コントロール実験として、同じイメージング手順をmCherryWTを発現している細胞で繰り返した。このコンストラクトでは、合成酵素とtRNAは化合物1の認識において未だ活性があるが、mCherryWTは化合物1を導入するアンバーコドンを含んでいない。したがって、mCherryWTを発現しているコントロール細胞では、バックグランドの蛍光のみが青色/緑色チャンネルでみられ、すなわち、化合物3はこれらの細胞では検出されなかった。mCherryWTはアンバー抑制されたmCherryTAG−>1に比べて、自然により多く発現していることから、赤色チャンネルでみられたmCherryの蛍光はmCherryTAG−>1を発現している細胞に比べて、コントロール細胞で強かった。
この目的のために、実施例Aで述べたようにGFPTAG−>1を発現させ、精製した。4×PBS(pH8.0)で溶解した1mMのGFPTAG−>1溶液を10mMのAtto647N アジド溶液(Atto−Tec GmbH,ジーゲン,ドイツ)と共に37℃で12時間インキュベートした。その混合物をNi−NTAビーズ上でインキュベートし、タンパク質から非特異的な結合色素を除去するために、低変性バッファー(2M 尿素)で洗浄し、4×PBS バッファー(pH8.0)で溶出した。標準のUV/Visスペクトロメトリー及び報告されたGFP、変性GFP(変性条件下で測定した場合)及びAtto647Nの吸光率を用いて測定された標識効率は、通常、約50%であった。
生成したGFPTAG−>1,Atto647N(Atto647N アジドで標識された化合物1を含むGFPTAG)を50pMの濃度に希釈し、以前に報告されている測定スキーム(Lemke et al.,J Am Chem Soc 2009,131:13610)と同様に自由拡散分子の1分子型スペクトロメトリーで解析した。簡単に言うと、その溶液を1.2NA 60×水浸対物レンズを備えたオリンパスI×81顕微鏡(ハンブルク,ドイツ)の中心に置かれた特注の共焦点顕微鏡に取り付けた。2つのレーザーダイオード(LDH485及び660,Picoquant,ベルリン,ドイツ)からの発光を56MHzのマスターパルス周期で偏光し、サンプルに焦点を当てた。単一で、自由拡散のGFPTAG−>1,Atto647Nからのバースト状(burst wise)蛍光発光は、100μmのピンホールを用いて空間的にフィルター処理し、次に、スペクトルに蛍光ドナーチャンネル(D)とアクセプターチャンネル(A)にフィルター処理した(発光フィルター525/50,700/75,干渉フィルター500/660及び560(AHF,チュービンゲン,ドイツ)を使用)。単一光子は緑色チャンネルにおいてPicoquantのMPD、赤色チャンネルにおいてAPD(PerkinElmer,ボードルイ,カナダ)を用いて検出した。Hydraharp(Picoquant)を用いてシグナルをカウントし、1ms bin幅にシグナルストリームをビニングし、1分子バースト当たり30カウントの閾値を適用した後、ルーチンのパルスインターリーブ励起解析(Mueller et al.,Biophys J 2005,89:3508)を実施した。このようにして、個々のGFPTAG−>1,Atto647N分子から生じる発光バーストを化学量論(S)に基づき、DからAへのエネルギー転移(EFRET)の発生について解析した。
UAA13,16又は17を導入したGFPTAGすなわち、GFPTAG−>13,GFPTAG−>16及びGFPTAG−>17を下記以外はGFPTAG−>1とGFPTAG−>2で記載したように作製した(A.1参照)。大腸菌培養液がOD600で0.2〜0.3に達した時、化合物1又は2の代わりにそれぞれ化合物13、16もしくは17(0.1M NaOH中の80mM保存液)又は等量の0.1M NaOH(陰性コントロール実験)を最終濃度が1mMになるように添加した。GFPTAG−>13は以下の製造者プロトコル(BIO−RAD,ミュンヘン,ドイツ)に従い、Niビーズの代わりにMacro−Prep HICサポートを用いてGFPTAG−>13を精製した。
許容部位38にアンバー終止コドンとC末端にHisタグ(MBPTAG)を有するマルトース結合タンパク(MBP)をGPFTAGに相似のUAA存在下での大腸菌による発現のために使用した。タンパク質発現、溶解、精製はA.1とD.1で述べたように実施した。
GFPTAG−>1,GFPTAG−>13,GFPTAG−>16及びGFPTAG−>17を実施例AとDで記載されているように大腸菌で発現し、TAMRA−アジド(Az)又はTAMRA−テトラジン(Tet)のいずれかで標識した(いずれも50μMの濃度で37℃で12時間)。脂肪族のアルキンが銅(I)触媒アジドアルキン環状付加を実施するだけで、菌株が促進するアジドアルキン反応を実施できない陰性コントロールとしてUAA プロパルギルリジンを発現したGFPTAGを使用した。大腸菌が発現したタンパク質をSDS−PAGEで分離し、クーマシー染色(図7b)と蛍光スキャンで可視化した(図7a)。高い位置のGFPバンドの蛍光によって標識の成功が確認された。GFPTAG−>1,GFPTAG−>13,GFPTAG−>16及びGFPTAG−>17はそれぞれTAMRA−テトラジンでうまく標識された。シクロオクチニル残基を含むタンパク質のみ、すなわち、GFPTAG−>1のみがTAMRA−アジドで標識された。
化合物1又は17の存在下においてMBPTAGを発現した大腸菌を別々に培養し、PBSで4回洗浄した。2つの大腸菌培養液を1:1(OD600約2)で混合し、50μMのTAMRA−アジドと共に37℃で4時間培養した。次に、大腸菌をPBSで1回洗浄し、10μMのクマリン−テトラジンと共に37℃で4時間インキュベートを続けた。コントロールとして、MBPTAG−>1を発現する大腸菌とMBPTAG−>17を発現する大腸菌をそれぞれ別々に、TAMRA−アジド又はクマリン−テトラジンで標識した。標識後、過剰な色素を除くために、全ての培養液を5%のDMSOを含むPBSで5回洗浄した。結果の画像は緑(クマリン−テトラジンで標識されたMBPTAG−>17)と赤(TAMRA−アジドで標識されたMBPTAG−>1)の蛍光細胞で示した。TAMRA−アジドで処理されたMBPTAG−>17は蛍光を示さなかったが、クマリン−テトラジンで標識されたMBPTAG−>1は緑の蛍光細胞を示した。
実施例AとDで記載されているように導入された化合物1,13,16又は17を有するGFPTAGを大腸菌で発現させた。大腸菌の溶解物は吸光度に基づき最終的に約500nMのGFP濃度に調整した。5μMの色素(TAMRA−テトラジン又はTAMRA−アジド)を添加し、蛍光スペクトル(励起波長450nm,蛍光波長470〜650nm)を記録した。GFPTAGの成功した標識は、タンパク質に結合した時のGFP発色団からTAMURAまでのFRETによってモニターした。図8においてGFPTAG−>13で模範的に示されているように、個々のスペクトルにおいて、これは時間が経つにつれて(暗いところから明るい色のグラフ)、GFP蛍光(約505nm)の減少及び同時のTAMURA蛍光(約575nm)の増加によって可視化された。
tRNApylとピロリジン合成酵素pylRSの両方を発現する単一の発現プラスミドを、プラスミドpEVOL tRNApyl/pylRSWT又はpEVOL tRNApyl/pylRSAFに由来する合成遺伝子を用いて哺乳動物UAA発現プラスミドpSWAN(Liu et al.,Nat Methods 2007,4:239)のtRNAと合成酵素と置換することによって生産した。これにより、哺乳動物細胞の同時導入を用いたプラスミドpEVOL tRNApyl/pylRSWT又はpEVOL tRNApyl/pylRSAFが生産された。
UAA1,13,16又は17とRSWT又はRSAFの存在下でのUAA濃度依存性のGFP発現は、以下の自動化された顕微鏡手順を用いて解析した。
AcF=p−アセチルフェニルアラニン
AcOH=酢酸
Boc−L−Lys−OH=N−α−tert−ブチルオキシカルボニル−L−リジン
cHex=シクロヘキサン
DBU=1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデ−7−セン
DCM=ジクロロメタン
DMF=ジメチルホルムアミド
DMSO=ジメチルスルホキシド
EtOH=エタノール
EtOAc=酢酸エチル
FC=フラッシュクロマトグラフィー
FRET=蛍光共鳴エネルギー移動
MeOH= メタノール
GFP=緑色蛍光タンパク質
GFPWT=野生型GFP
GFPTAG=許容部位39にアンバー終止コドン(TAG)を含む配列によってコードされたGFP
GFPTAG−>1=アンバーコドンをコードした部位に化合物1が導入されたGFPTAG
IGFP=GFPの平均強度
MBP=マルトース結合タンパク
MBPTAG=許容部位38にアンバー終止コドン、C末端にHisタグ(MBPTAG)を有する配列によってコードされたMBP
MBPTAG−>1=アンバーコドンをコードした部位に化合物1が導入されたMBPTAG
mCherryWT=野生型mCherry
mCherryTAG−>1=アンバーコドンをコードした部位に化合物1が導入されたmCherry
NLS=核局在配列
OD600=600nmの吸光度
PBS=リン酸緩衝溶液
PMSF=フッ化フェニルメチルスルホニル
RT=室温
SD=標準誤差
SDS−PAGE=ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
smFRET=FRETの1分子観察
TAMRA=テトラメチルローダミン
TB=TB培地(Terrific Broth)
TEA=トリエチルアミン
THF=テトラヒドロフラン
TLC=薄層クロマトグラフィー
UAA=非天然型アミノ酸
Claims (37)
- 式Iの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩:
[式中、
X1は、
を表し、
(式中、
Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6は、互いに独立して−CH2−,−NH−,−S−又は−O−を表すが、Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の少なくとも4つは−CH2−であり;
R2は、独立して水素,ハロゲン,C1〜C4アルキル基,CF3,CN,C1〜C4アルコキシ基,−O−CF3,C2〜C5アルカノイルオキシ基,C1〜C4アルキルアミノカルボニルオキシ基又はC1〜C4アルキルチオ基を表す);
X2は、−CH2−,−O−,−S−,−NH−,−C(O)−,−OC(O)−,−C(O)O−,−NH−C(O)−もしくは−C(O)−NH−を表すか;又は、
X2は、>CH−もしくは>N−を表すか(式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して3員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH<,−NH−CH<もしくは−CH2−N<を表すか(式中、2つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して4員環を形成する);又は、
X2は、−CH2−CH2−CH<,−NH−CH2−CH<,−CH2−NH−CH<,−CH2−CH2−N<,
を表し(式中、3つの炭素原子もしくは2つの炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して5員環を形成する);
X3は、C1〜C6アルキレン基,−(CH2−CH2−O)m−,−(CH2−O)p又は単結合を表し;
X4は、−NH−,−C(O)−NH−,−NH−C(O)−,−NH−CH(NH2)−,−CH(NH2)−NH−,−NH−C(NH)−NH−,−C(O)−NH−CH(NH2)−,−C(O)−NH−C(NH)−NH−,NH−CH(NH2)−C(O)−又は−NH−C(NH)−NH−C(O)−を表し;
X5は、水素、C1〜C6アルキル基、C1〜C6アルコキシ−C1〜C2アルキル基、C2〜C7アルカノイルオキシ−C1〜C2アルキル基又はC2〜C7アルカノイルスルファニル−C1〜C2アルキル基を表し;
R1は、−OH又は−NH2を表し;
aは、0、1、2、3、4又は5を表し;
nは、1〜4の整数を表し;
mは、1〜6の整数を表し;及び、
pは、1〜6の整数を表す。] - R2が、水素である請求項1記載の化合物又は塩。
- R2が、独立してハロゲンである請求項1又は2記載の化合物又は塩。
- R2が、フッ素である請求項3記載の化合物又は塩。
- [R2 ] a が、1つの炭素環原子に結合した2つのフッ素原子である請求項4記載の化合物又は塩。
- X1が、以下の式で表される請求項1〜5のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R2 及びaは請求項1〜5で定義されたとおりである。) - X1が、以下の式で表される請求項1〜5のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R2 及びaは請求項1〜5で定義されたとおりである。) - X1が、以下の式で表される請求項1〜5のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R2 及びaは請求項1〜5で定義されたとおりである。) - X1が、以下の式で表される請求項1〜5のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R2 及びaは請求項1〜5で定義されたとおりである。) - Y1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の1つが−NH−であり、同時にY1,Y2,Y3,Y4,Y5,Y6の残りの5つが−CH2−であり、かつ、R2 及びaが請求項1〜5で定義されたとおりである、請求項1〜5のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- X1が、以下から選択される式で表され、かつ、R2 及びaが請求項1〜5で定義されたとおりである、請求項1〜4のいずれか1項記載の化合物又は塩:
- X1が、非置換のシクロオクチニル基である請求項1記載の化合物又は塩。
- X1が、1又は2のハロゲン原子で置換されたシクロオクチニル基である請求項1記載の化合物又は塩。
- ハロゲン原子が、フッ素原子である請求項13記載の化合物又は塩。
- X1が、非置換のトランス−シクロオクテニル基である請求項1記載の化合物又は塩。
- X2が、−O−である請求項1〜15のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- X3が、−CH2−CH2−O−又は単結合である請求項1〜16のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- 構造要素−X2−X3−が、主鎖に1〜6つの原子を含む請求項1〜17のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- X4が、−NH−,−C(O)−NH−,−NH−CH(NH2)−,−NH−C(NH)−NH−,−C(O)−NH−CH(NH2)−又は−C(O)−NH−C(NH)−NH−である請求項1〜18のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- X4が、−C(O)−NH−である請求項1〜19のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- nが3又は4である請求項1〜20のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- 構造要素−X2−X3−X4−(CH2)n−が、主鎖に5〜12個の原子を含み、例えば6,7,8,9,10又は11個の原子を主鎖に含む請求項1〜21のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- X5が、水素、C1〜C6アルコキシメチル、C1〜C6アルコキシエチ−1−イル、C2〜C7アルカノイルオキシメチル又はC2〜C7アルカノイルスルファニルエチルである請求項1〜22のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- X5が、水素である請求項1〜23のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- R1を持つ不斉炭素原子に関して、S配置である請求項1〜24のいずれか1項記載の化合物又は塩。
- −(CH2)n−CHR1−C(O)O−X5が以下の式で表される請求項1〜25のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R1とX5は請求項1〜25で定義されたとおりである。) - 式Ia,Ib,Ic及びIdのいずれかの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項1〜26のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R1,R2,X5 ,a及びY1〜Y6は、請求項1〜26で定義されたとおりである。) - 以下のいずれかの式で表される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項1記載の化合物又は塩:
- 以下の式で表される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項1記載の化合物又は塩:
- 式Ieの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項1〜7、10〜14及び23〜26のいずれか1項記載の化合物又は塩:
(式中、R1,R2,X5 ,a及びY1〜Y6は本明細書中に定義された通りであり、X2は、>CH−もしくは>N−を表すか(式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して3員環を形成する);又は、X2は、−CH2−CH<,−NH−CH<もしくは−CH2−N<を表すか(式中、2つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して4員環を形成する);又は、X2は、−CH2−CH2−CH<,−NH−CH2−CH<,−CH2−NH−CH<,−CH2−CH2−N<,
を表す(式中、3つの炭素原子もしくは2つの炭素原子と窒素原子は、隣接するX1の2つの環原子と互いに結合して5員環を形成する)。 - 以下の式で表される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項1項記載の化合物又は塩:
- 以下の工程を含む、1つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有する目的のポリペプチドの生産方法:
a)以下の(i)〜(iii)を含む翻訳システムを提供する工程;
(i)アミノアシルtRNA合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド;
(ii)請求項1〜31のいずれか1項記載の化合物又は塩;
(iii)セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するtRNA、又は、前記tRNAをコードするポリヌクレオチド;及び、
(iv)目的のポリペプチドをコードし、1つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
(ここで、アミノアシルtRNA合成酵素(i)は、化合物又は塩(ii)を用いてtRNA(iii)を特異的にアシル化することができる);
b)ポリヌクレオチド(iv)を翻訳させて、それにより目的のポリペプチドのセレクターコドンによってコードされた位置に化合物(ii)を導入する工程。 - 前記翻訳システムが、前記アミノアシルtRNA合成酵素を発現する細胞である請求項32記載の方法。
- 前記アミノアシルtRNA合成酵素が、ピロリシルtRNA合成酵素ある請求項32又は33記載の方法。
- ピロリシルtRNA合成酵素が、配列番号1又は2に記載アミノ酸配列を含む請求項34記載の方法。
- 1つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチドを生産するための請求項1〜31のいずれか1項記載の化合物の使用。
- 請求項1〜31のいずれか1項記載の化合物又は塩を含む、1つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチドを生産するためのキット。
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