WO2023167333A1 - がん細胞の蛍光イメージング技術 - Google Patents

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WO2023167333A1
WO2023167333A1 PCT/JP2023/008187 JP2023008187W WO2023167333A1 WO 2023167333 A1 WO2023167333 A1 WO 2023167333A1 JP 2023008187 W JP2023008187 W JP 2023008187W WO 2023167333 A1 WO2023167333 A1 WO 2023167333A1
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WO
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carbon atoms
alkyl group
hydrogen atom
general formula
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PCT/JP2023/008187
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泰照 浦野
真子 神谷
廉 伊藤
恭平 藤田
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国立大学法人 東京大学
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
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    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
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    • C09B67/006—Preparation of organic pigments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to a novel fluorescent imaging method for cancer cells or tissues, and a fluorescent probe used to visualize novel cancer cells or cancer tissues. More specifically, the present invention relates to a method for fluorescently imaging cancer cells or cancer tissues expressing LAT1 using the Click reaction, and fluorescent probes used in the method.
  • LAT1 Large amino acid transporter 1
  • LAT1 is one of the isoforms of transporter LAT that drives sodium-independently. It counter-transports amino acids and amino acid derivatives such as L-DOPA into and out of cells.
  • LAT1 transports substrates by forming a dimer with the single transmembrane protein 4F2hc on the cell membrane.
  • LAT1 in normal tissues is restricted to local tissues that require an intermittent supply of amino acids, such as neurons, glial cells, activated T cells, bone marrow, testis, placental barrier, blood-brain barrier, and many normal tissues.
  • amino acids such as neurons, glial cells, activated T cells, bone marrow, testis, placental barrier, blood-brain barrier, and many normal tissues.
  • LAT2 is mainly responsible for membrane transport of large neutral amino acids in tissues.
  • LAT1 is highly expressed in tumor tissues, and due to its increased expression in a wide range of cancer types and cancer-specific expression distribution, it has recently attracted attention as a new cancer biomarker. ing. Lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, brain cancer, esophageal cancer, stomach cancer, bile duct cancer, liver cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, skin cancer .
  • enhancement of LAT1 expression has been confirmed at the tissue level derived from human patients (Non-Patent Documents 1 and 2), especially non-small cell lung cancer, brain tumor, prostate cancer In cancer and breast cancer, a group with high LAT1 expression has a poor prognosis, and it has been suggested that the malignancy of cancer and the expression of LAT1 are related. In this way, LAT1 has been found to be closely related to cancer ecology, and has become a target for basic research aimed at elucidating cancer
  • Non-Patent Documents 3 and 4 Fluorescence Imaging has attracted attention as a technique for realizing simple and highly sensitive cancer diagnosis, especially intraoperative cancer diagnosis.
  • LAT1 has been verified for its usefulness as a cancer marker and is attracting attention as a drug discovery target, there are almost no reports on fluorescence imaging techniques that visualize cancer tissues via LAT1.
  • a fluorescence imaging method that can be used with high sensitivity and safety can be applied to cancer detection, it is expected to become an epoch-making medical technology that can diagnose a wide range of cancer types during surgery. Few fluorescent substrates have been developed that are incorporated into cancer tissue via
  • the purpose of the present invention is to provide a method for fluorescent imaging of cancer cells or tissues expressing LAT1, and a fluorescent probe used in the method.
  • the present inventors proceeded with studies to develop a cancer imaging fluorescent probe that utilizes uptake by LAT1, and found that nitrobenzoxadiazole ( NBD) have been found to be promising fluorescent probes (pending PCT/JP2021/006413 by the present inventors). It was suggested that these fluorescent probes are promising compounds that accumulate in cells with a substrate of NBD or its analogues and fluorescence activation occurs due to prolonged fluorescence lifetime. Conversion (structural expansion) is not easy.
  • NBD nitrobenzoxadiazole
  • a method for visualizing cancer cells or tissues comprising: (a) introducing a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof into a cell or tissue; (b) a step of introducing a compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof into a cell or tissue; and (c) a compound represented by general formula (I) or a salt thereof and general formula (II)
  • a method for visualizing cancer cells or tissues comprising: (a) introducing a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof into a cell or tissue; (b) a step of introducing a compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof into a cell or tissue; and (c) a compound represented by general formula (I) or a salt thereof and general formula (II)
  • Any of the steps (a) and (b) may be performed first.
  • R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms:
  • L is alkylene (provided that —CH 2 — at the A-side terminal of the alkylene group may be substituted with —NH—), arylene, or an arbitrary combination of alkylene and arylene. selected from the group consisting of;
  • A represents a linker;
  • D represents a dienophile group, The dienophile group is selected from;
  • R if present, is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and when R is 2 or more, may be the same or different; * represents a binding site with A.
  • B is a single bond or a linking group; represents a fluorophore;
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aromatic ring, a substituted or unsubstituted pyridine ring, or a substituted or unsubstituted pyrimidine ring.
  • the method of [1] or [2], which is selected from [4] The linking group of B is an alkylene group (provided that one or more —CH 2 — in the alkylene group may be substituted with —O—, —S—, —NH—, or —CO—.
  • R 3 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring;
  • R 4 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carboxyl group;
  • m is an integer of 0 to 3, and when m is 2 or more, each R 3 may be the same or different;
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 );
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t
  • R 20 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring; m' is an integer of 0 to 3, and when m' is 2 or more, each R 20 may be the same or different; R 21 and R 22 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 ); R 23 and R 24 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 ) and: X is an oxygen atom or SiR 9 R 10 , wherein
  • a fluorescent probe used for visualizing cancer cells or tissues comprising a compound represented by formula (II) or a salt thereof, The fluorescent probe that emits or enhances fluorescence by reacting the compound or its salt with the compound represented by the following general formula (I) or its salt in cancer cells or tissues.
  • B is a single bond or a linking group; represents a fluorophore
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aromatic ring, a substituted or unsubstituted pyridine ring, or a substituted or unsubstituted pyrimidine ring.
  • R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms:
  • L is alkylene (provided that —CH 2 — at the A-side terminal of the alkylene group may be substituted with —NH—), arylene, or an arbitrary combination of alkylene and arylene.
  • A represents a linker
  • D represents a dienophile group
  • the dienophile group is selected from; (In formulas (1) to (5), R, if present, is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and when R is 2 or more, may be the same or different; * represents a binding site with A. ))
  • a kit for detecting cancer cells or tissues comprising a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof, and a compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof.
  • R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms:
  • L is alkylene (provided that —CH 2 — at the A-side terminal of the alkylene group may be substituted with —NH—), arylene, or an arbitrary combination of alkylene and arylene. selected from the group consisting of;
  • A represents a linker;
  • D represents a dienophile group, The dienophile group is selected from;
  • R if present, is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and when R is 2 or more, may be the same or different; * represents a binding site with A.
  • B is a single bond or a linking group; represents a fluorophore;
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, a substituted or unsubstituted aromatic ring, a substituted or unsubstituted pyridine ring, or a substituted or unsubstituted pyrimidine ring.
  • the present invention it is possible to provide a method for fluorescently imaging cancer cells or tissues expressing LAT1. Since the visualization method of the present invention can use various fluorophores, the optical properties can be made longer wavelength, which can reduce the effect of autofluorescence, and furthermore, the effect on the tissue can be reduced. Can reduce damage. Moreover, the present invention can provide a fluorescent probe used in the method.
  • a test protocol using JPH203, a selective inhibitor of LAT1, using BCN-pAP and 5Tz-TMR is shown.
  • the results of imaging using JPH203, a selective inhibitor of LAT1, using BCN-pAP and 5Tz-TMR are shown.
  • a protocol for imaging studies in HBSS of A549 cells supplemented with 5Tz-TMR after pre-incubation with BCN-pAP is shown.
  • the results of imaging in HBSS of A549 cells supplemented with 5Tz-TMR after pre-incubation with BCN-pAP are shown.
  • Example 2 a test protocol for examining the intracellular localization of the diene dye 5Tz-TMR is shown.
  • FIG. 2 shows the results of examining the intracellular localization of the diene dye 5Tz-TMR in Example 2.
  • FIG. 3 shows the test protocol of Example 3.
  • FIG. 3 shows the imaging test results of Example 3.
  • FIG. The results of fluorescence activation evaluation using 5Tz-TMR, BCN-pAP, BCN-AA, TCO-K, and BCN-K and reactivity evaluation by UPLC-MS are summarized.
  • a protocol for an imaging test in A549 cells using 5Tz-TMR and each dienophile-introduced amino acid is shown.
  • the results of an imaging test in A549 cells using 5Tz-TMR and each dienophile-introduced amino acid are shown.
  • FIG. 4 shows the results of examination of the dienophile concentration and the LAT1 inhibitor concentration in the pair of TCO-K and 5Tz-TMR.
  • Fig. 2 shows the evaluation results of intracellular retention when TCO-K and 5Tz-TMR were applied to A549 cells. The results of applying TCO-K and 5Tz-TMR to cell types with different LAT1 expression levels and performing cell imaging are shown.
  • alkyl may be straight chain, branched chain, cyclic, or an aliphatic hydrocarbon group consisting of a combination thereof.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group is not particularly limited, but for example, 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 ), 1 to 10 carbon atoms (C 1-10 ), ) and 1 to 20 carbon atoms (C 1-20 ).
  • the number of carbon atoms is specified, it means “alkyl” having the number of carbon atoms within the specified range.
  • C 1-8 alkyl includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neo-pentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, n-octyl and the like are included.
  • an alkyl group may have one or more optional substituents.
  • substituents include, but are not limited to, alkoxy groups, halogen atoms, amino groups, mono- or di-substituted amino groups, substituted silyl groups, acyl, and the like.
  • alkyl group When an alkyl group has more than one substituent, they may be the same or different.
  • alkyl moieties of other substituents containing alkyl moieties eg, alkoxy groups, arylalkyl groups, etc.
  • halogen atom may be fluorine, chlorine, bromine or iodine, preferably fluorine, chlorine or bromine.
  • substituents include, but are not limited to, alkyl groups, alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, halogen atoms, sulfo groups, amino groups, alkoxycarbonyl groups, and oxo groups. These substituents may further have a substituent. Examples of such groups include, but are not limited to, halogenated alkyl groups, dialkylamino groups, and the like.
  • Visualization method of the present invention is a method for visualizing cancer cells or tissues, (a) introducing a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof into a cell or tissue; (b) a step of introducing a compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof into a cell or tissue; and (c) a compound represented by general formula (I) or a salt thereof and general formula (II) By observing or measuring the fluorescence emitted or enhanced by the reaction of the compound represented by or a salt thereof in cancer cells or tissues, The order of performing the steps (a) and (b) is the method in which any step may be performed first (hereinafter also referred to as the "visualization method of the present invention").
  • the visualization method of the present invention makes it possible to establish a new cancer imaging method targeting LAT1 by using the strain-enhanced inverse electron demand Diels-Alder reaction (SPEIDAC).
  • the visualization method of the present invention includes a dienophile-introduced amino acid (a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof) and a diene-fluorophore (a compound represented by the general formula (II) or A strategy is used in which the salt) is met in cancer cells and a click reaction occurs.
  • FIG. 1 shows a schematic of cancer imaging via LAT1 using SPIEDAC (R in FIG. 1 selects the appropriate structure).
  • LAT1 can efficiently bind to LAT1 even in an in vivo environment where natural amino acids coexist. It is expected that the incorporated dienophile-amino acids can be designed.
  • SPEIDAC allows the design of diene-fluorophores to produce fluorophores with high fluorescence quantum yields, allowing for more flexible structural evolution, and LAT1-mediated cancer fluorescence that overcomes the aforementioned challenges.
  • An imaging method can be established.
  • R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the alkyl group is preferably a methyl group.
  • L is alkylene (provided that —CH 2 — at the A-side terminal of the alkylene group may be substituted with —NH—), arylene, or any combination of alkylene and arylene is a divalent group selected from the group consisting of groups formed by bonding to
  • Alkylene is a divalent group consisting of straight-chain or branched saturated hydrocarbons, for example methylene, 1-methylmethylene, 1,1-dimethylmethylene, ethylene, 1-methylethylene, 1-ethylethylene , 1,1-dimethylethylene, 1,2-dimethylethylene, 1,1-diethylethylene, 1,2-diethylethylene, 1-ethyl-2-methylethylene, trimethylene, 1-methyltrimethylene, 2-methyltrimethylene methylene, 1,1-dimethyltrimethylene, 1,2-dimethyltrimethylene, 2,2-dimethyltrimethylene, 1-ethyltrimethylene, 2-ethyltrimethylene, 1,1-diethyltrimethylene, 1,2- Diethyltrimethylene, 2,2-diethyltrimethylene, 2-ethyl-2-methyltrimethylene, tetramethylene, 1-methyltetramethylene, 2-methyltetramethylene, 1,1-dimethyltetramethylene, 1,2-dimethyl tetramethylene
  • Arylene is a monocyclic or condensed polycyclic aromatic hydrocarbon divalent group containing one or more heteroatoms (e.g., oxygen, nitrogen, or sulfur atoms) as ring-constituting atoms. It may be an aromatic heterocycle. Whether the arylene is a single ring or a fused ring, it can be attached at all possible positions.
  • Non-limiting examples of monocyclic aryl include a phenylene group (Ph) and the like.
  • Non-limiting examples of fused polycyclic arylenes include naphthylene and the like.
  • L is selected from: -(CR a R b ) n -, -Ar-, * - Ar- (CR a R b ) m -, * - (CR a R b ) s -Ar-, * - (CR a R b ) s - Ar-(CR a R b ) m -, * - NH-(CR a R b ) n-1 -, * - NH-(CR a R b ) s-1 -Ar-, * - NH-(CR a R b ) s-1 -Ar-(CR a R b ) m -
  • Ar represents arylene
  • R a and R b are each independently at each occurrence independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • n is an integer of 1 to 8
  • m is an integer of 1 to 5
  • s is an integer of 1
  • L is selected from: -(CH 2 ) n1 -, -Ph-, * -Ph-(CH 2 ) m1 -, * -(CH 2 ) s1 -Ph-, * -(CH 2 ) s1 -Ph-(CH 2 ) m1 - , * -NH-(CH 2 ) n1-1 -, * -NH-(CH 2 ) s1-1 -Ar-, * -NH-(CH 2 ) s1-1 -Ar-(CH 2 ) m1
  • Ph represents a phenylene group
  • n1 is an integer of 1 to 8
  • m1 is an integer of 1 to 5
  • s1 is an integer of 1 to 8
  • * indicates the side bonding to A .
  • L corresponds to the side chain site of the amino acid that is the substrate of LAT1
  • a group obtained by removing one hydrogen atom from the terminal group of the side chain of the amino acid that is the substrate target of LAT1 for example, the substrate target of LAT1
  • a methylene group ( --CH.sub.2-- ) is preferred, but it is not limited to this and can be selected according to the type of amino acid.
  • L is preferably * -Bz-CH 2 - (Bz represents a benzene ring) and * -CH 2 -Bz-CH 2 -.
  • L is preferably * -NH-(CH 2 ) 4 -.
  • L is selected from: -CH 2 -, * -Bz-CH 2 -, -(CH 2 ) 4 -, * -CH 2 -Bz-CH 2 -, * -NH-(CH 2 ) 4 -
  • Bz represents a benzene ring
  • * represents the side that bonds to A.
  • A represents a linker.
  • a linker is selected from the group consisting of an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, an amide group, a carbamate group, and a group formed by optionally bonding two or more groups selected from these groups. be.
  • D represents a dienophile group.
  • the dienophile group of D can be represented by the following general formula (A) or (B).
  • R if present, is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and when there are two or more R, they may be the same or different. * indicates the binding site with A.
  • the dienophile groups of D are preferably selected from:
  • R if present, is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and when there are two or more R, they may be the same or different.
  • * represents a binding site with A.
  • dienophile groups of formulas (3), (4), (5) and (1) are preferred, and dienophile groups of formulas (3), (4) and (5) are particularly preferred.
  • the dienophile groups of formulas (3) and (5) are more preferred.
  • Non-limiting examples of the compound represented by general formula (I) or a salt thereof that can be used in the visualization method of the present invention are shown below. is not limited to
  • the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof has a diene-fluorophore structure and exhibits a high fluorescence intensity increase before and after SPIEDAC with a dienophile. It is a diene-introduced dye and is represented below.
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkyl group having an amino group (-(CH 2 ) x -NH 2 (x is an integer of 1 to 6)), a substituted or unsubstituted aromatic ring, substituted or unsubstituted pyridine ring, substituted or unsubstituted pyrimidine ring.
  • R 1a is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkyl group having an amino group (-(CH 2 ) y -NH 2 (y is an integer of 1 to 3) ), carboxyl groups.
  • * represents a site that binds to tetrazine.
  • R 2 is preferably a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkyl group having an amino group (—(CH 2 ) x —NH 2 (x is an integer of 1 to 6), or It is a benzene ring substituted with an alkyl group (—(CH 2 ) y —NH 2 (y is an integer of 1 to 3)) or a carboxyl group.
  • B is a single bond or a linking group. If B is a single bond, the tetrazine will bind directly to the fluorophore.
  • the linking group of B is an alkylene group (provided that one or more —CH 2 — in the alkylene group may be substituted with —O—, —S—, —NH—, or —CO—), alkenylene groups (e.g., vinylene groups, propenylene groups, etc.), arylene (including heteroarylene), cycloalkylene, alkoxyl groups, polyethylene glycol chains, amide groups, and optionally two or more groups selected from these groups is selected from the group consisting of groups formed in combination;
  • arylene and heteroarylene are preferably benzene ring, pyridine ring and pyrimidine ring.
  • the alkylene group, alkenylene group, arylene (including heteroarylene), cycloalkylene, and alkoxyl group may have a substituent (for example, an alkyl group having 1 or more carbon atoms).
  • B is preferably a single bond, a pyridine ring, or a pyrimidine ring.
  • the fluorophore that can be used in the present invention is a fluorophore that exhibits a high fluorescence intensity increase before and after SPIEDAC with the dienophile of the compound of general formula (I), and is not particularly limited as long as it has such characteristics. can be used.
  • the fluorophore is represented by the following formula (6).
  • R 3 if present, represent the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • monovalent substituents include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and carboxyl groups.
  • n is an integer of 0 to 3, and when m is 2 or more, each R3 may be the same or different.
  • R 4 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxyl group having 1 to 6 carbon atoms or a carboxyl group.
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 ).
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 );
  • X is an oxygen atom or SiR9R10 .
  • R 9 and R 10 are each independently an alkyl or aryl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group represented by R 9 and R 10 may contain one or more of halogen atom, carboxy group, sulfonyl group, hydroxyl group, amino group, alkoxy group, etc.
  • R 9 and R 10 Alkyl groups may be halogenated alkyl groups, hydroxyalkyl groups, carboxyalkyl groups, and the like.
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring has one or more ring-constituting heteroatoms.
  • a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom may be included.
  • a phenyl group is preferred as the aryl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring.
  • substituents for example, one or more of halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like may be present.
  • Y and Z are a combination of (OR d , O) or (NR 11 R 12 , N + R 13 R 14 ).
  • Rd is a hydrogen atom, an acyl group (eg, an acetyl group) or an enzyme recognition site.
  • the enzyme recognition site is selected from saccharides, partial structures of saccharides, saccharides with self-cleavable linkers, amino acids with self-cleavable linkers, or peptides.
  • the saccharide partial structure of Rd refers to a structure corresponding to the remaining partial structure after removing one hydroxyl group from the saccharide.
  • Sugars include ⁇ -D-glucose, ⁇ -D-galactose, ⁇ -L-galactose, ⁇ -D-xylose, ⁇ -D-mannose, ⁇ -D-fucose, ⁇ -L-fucose, ⁇ -L- fucose, ⁇ -D-arabinose, ⁇ -L-arabinose, ⁇ -DN-acetylglucosamine, ⁇ -DN-acetylgalactosamine and the like, preferably ⁇ -D-galactose.
  • a self-cleavable linker means a linker that is spontaneously cleaved and degraded, and examples thereof include carbamate, urea, para-aminobenzyloxy group, ester group (-CO-O-, -O-CO-) and the like. be done.
  • R 11 and R 12 are each independently a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 13 and R 14 are each independently a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • at least one of R 11 to R 12 is —CO—R′ (R′ is a partial structure of an amino acid), a saccharide, a partial structure of a saccharide, a saccharide having a self-cleavage linker, a self-cleavage It may be an enzymatic labeling moiety selected from amino acids or peptides with a type of linker.
  • amino acid can be any compound as long as it has both an amino group and a carboxyl group, including natural and non-natural compounds. It may be a neutral amino acid, a basic amino acid, or an acidic amino acid. In addition to amino acids that themselves function as transmitters such as neurotransmitters, physiologically active peptides (dipeptides, tripeptides, tetrapeptides, (including oligopeptides) and proteins that are constituents of polypeptide compounds, such as ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, and ⁇ -amino acids. As the amino acid, it is preferable to use an optically active amino acid. For example, for ⁇ -amino acids, either D- or L-amino acids may be used, but it may be preferable to select optically active amino acids that function in vivo.
  • amino acid residue refers to a structure corresponding to a partial structure remaining after removing the hydroxyl group from the carboxyl group of an amino acid.
  • Amino acid residues include ⁇ -amino acid residues, ⁇ -amino acid residues, and ⁇ -amino acid residues.
  • Preferred amino acid residues include the ⁇ -glutamyl group of the GGT substrate and the dipeptide consisting of the dipeptide (amino acid-proline) of the DPP4 substrate.
  • peptide refers to a structure in which two or more amino acids are linked by peptide bonds.
  • the carboxyl group of the side chain of the amino acid is -
  • a structure in which a carbonyl group is formed by bonding with NH 2 to become a part of an amino acid is exemplified.
  • amino acid partial structure of R' is represented by any of the following formulas.
  • Rla is flanked by natural amino acids (glycine, alanine, leucine, isoleucine, valine, lysine, cysteine, threonine, arginine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, serine, histidine, phenylalanine, methionine, tryptophan, tyrosine, proline) It is selected from the group consisting of chain-constituting groups, groups constituting side chains of unnatural amino acids (citrulline, norvaline, etc.), and substituted or unsubstituted alkyl groups.
  • R2a is on the side of natural amino acids (glycine, alanine, leucine, isoleucine, valine, lysine, cysteine, threonine, arginine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, serine, histidine, phenylalanine, methionine, tryptophan, tyrosine, proline) It is selected from the group consisting of chain-constituting groups, groups constituting side chains of unnatural amino acids (citrulline, norvaline, etc.), and substituted or unsubstituted alkyl groups.
  • * represents the location where B is bonded.
  • the fluorophore is represented by formula (7) below.
  • R 15 to R 18 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 19 represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • monovalent substituents include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and carboxyl groups.
  • s is an integer of 0 to 4, and when s is 2 or more, each R 19 may be the same or different.
  • the fluorophore is represented by formula (8) below.
  • R 20 if present, represent the same or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • monovalent substituents include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and carboxyl groups.
  • n' is an integer of 0 to 3, and when m' is 2 or more, each R 20 may be the same or different.
  • R 21 and R 22 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 ).
  • R 23 and R 24 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or —(CH 2 ) t —N(CH 2 COOR c ) 2 (t is 1 to 3 is an integer and R c is —CH 2 —O—CO—CH 3 ).
  • —N(CH 2 COOR c ) 2 is introduced into R 21 to R 24 , and the four carboxy groups thereof are acetoxymethyl-esterified (commonly known as AM) to impart cell membrane permeability,
  • AM acetoxymethyl-esterified
  • the AM group is hydrolyzed by intracellular esterase in the cell, a carboxy group is generated and becomes impermeable to the cell membrane, so that intracellular retention can be acquired. Furthermore, since it is distributed throughout the cell after hydrolysis, clearer imaging becomes possible.
  • X is an oxygen atom or SiR9R10 .
  • R 9 and R 10 are each independently an alkyl or aryl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alkyl group represented by R 9 and R 10 may contain one or more of halogen atom, carboxy group, sulfonyl group, hydroxyl group, amino group, alkoxy group, etc.
  • R 9 and R 10 Alkyl groups may be halogenated alkyl groups, hydroxyalkyl groups, carboxyalkyl groups, and the like.
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring has one or more ring-constituting heteroatoms.
  • a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom may be included.
  • a phenyl group is preferred as the aryl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring. As substituents, for example, one or more of halogen atoms, carboxyl groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, etc. may be present.
  • Y' and Z' are a combination of (OR d , OR e ) or (NR 11 R 12 , N + R 13 R 14 ).
  • R d and R e are each independently a hydrogen atom, an acyl group (eg, an acetyl group), or an enzymatic labeling moiety.
  • the enzyme labeling site is selected from saccharides, partial structures of saccharides, saccharides with self-cleavable linkers, amino acids with self-cleavable linkers, or peptides.
  • the saccharides, partial structures of saccharides, saccharides having self-cleavage linkers, amino acids or peptides having self-cleavage linkers are as described in detail in formula (6).
  • R 11 and R 12 are each independently a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 13 and R 14 are each independently a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 11 to R 12 is —CO—R′ (R′ is a partial structure of an amino acid), a saccharide, a partial structure of a saccharide, a saccharide having a self-cleavage linker, a self-cleavage It may be an enzymatic labeling moiety selected from amino acids or peptides with a type of linker.
  • R′ is a partial structure of an amino acid
  • the partial structure of the amino acid of R' is as described in detail in formula (6), and the fluorophore of formula (8) can also have the same structure as described in formula (6).
  • Y' and Z' are a combination of (NR 11 R 12 , N + R 13 R 14 ), and at least one of R 11 to R 12 is -CO-R'(R' is a partial structure of an amino acid; ), saccharides, partial structures of saccharides, saccharides with self-cleavable linkers, amino acids with self-cleavable linkers, or peptides, one of R 21 to R 24 is —CH 2 F There may be.
  • At least one of R 11 to R 12 an enzyme recognition site, is partially cleaved by a cancer cell-specific enzymatic activity to act as a leaving group that leaves the benzene ring, and as a result, A quinone methide is formed. Once quinone methide is formed, it reacts with intracellular nucleophiles such as proteins and is labeled, allowing it to remain in cancer cells.
  • Non-limiting examples of the compound represented by general formula (II) or a salt thereof that can be used in the visualization method of the present invention are shown below. is not limited to
  • the compounds represented by general formulas (I) and (II) can exist as acid addition salts or base addition salts.
  • Acid addition salts include, for example, mineral salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, or methanesulfonates, p-toluenesulfonates, oxalates, citrates, tartrates, trifluoroacetates and the like.
  • base addition salts include metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts and magnesium salts, ammonium salts, and organic amine salts such as triethylamine salts. . In addition to these, it may form a salt with an amino acid such as glycine.
  • the compound represented by formula (I) or a salt thereof may exist as a hydrate or solvate, and these substances can also be used in the present invention.
  • the compounds represented by general formulas (I) and (II) may have one or more asymmetric carbon atoms depending on the type of substituent.
  • stereoisomers such as optically active isomers based on the asymmetric carbon of , and diastereoisomers based on two or more asymmetric carbons, arbitrary mixtures and racemates of stereoisomers can also be used.
  • Introduction of the compound represented by the general formula (I) and the compound represented by the general formula (II) into cells or tissues is performed by separately adding these compounds in advance to an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, Alternatively, dissolving in a mixture of a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, and an aqueous medium, and adding these solutions to an appropriate buffer containing cells and tissues.
  • aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution
  • a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, and an aqueous medium
  • the fluorescent probe containing the compound of general formula (II) or a salt thereof may be used in the form of a composition in combination with appropriate additives. For example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers, pH adjusters and the
  • the step of introducing the compound represented by general formula (I) into a cell or tissue and the step of introducing the compound represented by general formula (II) into a cell or tissue may be performed together; may be performed first, but it is desirable not to administer both compounds at the same time as a mixture, as the Click reaction may occur prior to cellular uptake.
  • the compound represented by general formula (I) and the compound represented by general formula (II) are preferably introduced into cells or tissues in order, and either step may be carried out first.
  • pre-incubation of a compound represented by general formula (I) e.g., pre-incubation in HBSS for 30 minutes
  • washout ⁇ subsequent addition of fluorescent probe containing compound of general formula (II) or a salt thereof may be performed in the order of
  • pre-incubation of the fluorescent probe containing the compound of general formula (II) or a salt thereof for example, pre-incubation in HBSS
  • washout ⁇ addition of the compound of general formula (I) or a salt thereof afterwards, You can go in order.
  • step (a) is performed prior to step (b).
  • the time for pre-incubating the compound represented by general formula (I) or a salt thereof and the time for incubation with the addition of a fluorescent probe containing the compound of general formula (II) or a salt thereof are appropriately determined depending on the type of these compounds.
  • the incubation time is preferably about 5 to 15 minutes, and the preincubation time is preferably about 15 minutes or longer.
  • the concentration at which the compound represented by general formula (I) or a salt thereof, or the compound represented by general formula (II) or a salt thereof is added to cells or tissues is appropriately determined according to the type of cells to be measured, measurement conditions, etc. be able to.
  • the compound represented by general formula (I) or a salt thereof reacts with the compound represented by general formula (II) or a salt thereof in cancer cells or tissues. , observing or measuring the emitted or enhanced fluorescence.
  • the reaction between the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof and the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof is the distortion of the tetrazine and the dienophile compound, which is schematically described below. It utilizes the accelerated inverse electron demand Diels-Alder reaction (SPIEDAC). represents a dienophile compound.
  • SPIEDAC accelerated inverse electron demand Diels-Alder reaction
  • the fluorescence is quenched or attenuated because the tetrazine is bound to the fluorophore. Fluorescence from the fluorophore is emitted or enhanced by reaction with the dienophile group of the salt.
  • the compound represented by general formula (I) or a salt thereof is a substrate for LAT1, and thus is preferably selectively taken up by cancer cells or tissues.
  • the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof is taken up into cells, and both meet and react in cancer cells or tissues, thereby emitting fluorescence. Enhanced.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof reacts with the compound represented by the general formula (II) or a salt thereof in cancer cells or tissues to form the following general formula (IIIa ) or (IIIb) or a salt thereof is produced.
  • the dienophile group is selected from formulas (1)-(5) above, wherein the dienophile group moiety after reaction with the tetrazine moiety is represented by formulas (1)-(5) ) in which the double bond portion is a single bond and the triple bond portion is a double bond.
  • one aspect of the visualization method of the present invention is that a compound represented by general formula (I) or a salt thereof reacts with a compound represented by general formula (II) or a salt thereof in cancer cells or tissues. to produce a compound represented by general formula (IIIa) or (IIIb) or a salt thereof.
  • a compound represented by general formula (IIIa) or (IIIb) or a salt thereof As described above, depending on whether the dienophile group represented by the general formula (A) or the dienophile group represented by the general formula (B) is used as D, either of the general formulas (IIIa) and (IIIb) A compound is produced.
  • Another aspect of the visualization method of the present invention is that the compound represented by general formula (I) or a salt thereof and the compound represented by general formula (II) or a salt thereof are present in cancer cells or tissues.
  • Types of cancer cells or cancer tissues targeted by the visualization method of the present invention include lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, brain tumor, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, and bile duct. cancer, liver cancer, pancreatic cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, skin cancer, and thyroid cancer cells or tissues.
  • cancer tissue means any tissue that contains cancer cells.
  • tissue should be interpreted in the broadest sense, including a part or the whole of an organ, and should not be interpreted restrictively in any way.
  • As the cancer tissue a tissue that highly expresses LAT1 is preferable.
  • the visualization method of the present invention further includes observing fluorescence responses using fluorescence imaging means.
  • a fluorometer having a wide measurement wavelength can be used, but the fluorescence response can also be visualized using fluorescence imaging means capable of displaying a two-dimensional image.
  • fluorescence imaging By using the means of fluorescence imaging, the fluorescence response can be visualized in two dimensions, so that cancer cells or tissues can be visualized instantaneously.
  • a device known in the art can be used as the fluorescence imaging device.
  • it is also possible to detect the reaction between the sample to be measured and the fluorescent probe by means of a change in the ultraviolet-visible absorption spectrum (for example, a change in absorbance at a specific absorption wavelength).
  • Another embodiment of the present invention is a method for detecting cancer, comprising the steps of (a) applying a compound of general formula (I) or a salt thereof to a clinical specimen of a subject, (b) A step of applying a fluorescent probe containing the compound of II) or a salt thereof to a clinical specimen of a subject, and (c) a compound represented by general formula (II) or a salt thereof and a compound represented by general formula (I) Or a salt thereof reacts in a clinical sample, and includes the step of observing or measuring the fluorescence emitted or enhanced, and the order of performing the steps (a) and (b) is which step precedes (hereinafter also referred to as "the detection method of the present invention").
  • step (a) is preferably performed prior to step (b).
  • each solution of the compound and the fluorescent probe can be locally sprayed onto the clinical sample. can be done by
  • the detection method of the present invention can further include observing the fluorescence response using the fluorescence imaging means described above.
  • one aspect of the detection method of the present invention is that the compound represented by general formula (I) or a salt thereof and the compound represented by general formula (II) or a salt thereof are cancer cells or A step of producing a compound represented by general formula (IIIa) or (IIIb) or a salt thereof by reacting in the tissue.
  • another aspect of the detection method of the present invention is that the compound represented by general formula (I) or a salt thereof and the compound represented by general formula (II) or a salt thereof are cancer cells in a clinical specimen. Or, by reacting in tissue, the compound represented by general formula (IIIa) or (IIIb) or a salt thereof is produced, and the fluorescence emitted or enhanced from the compound is observed or measured.
  • Fluorescent Probe Another aspect of the present invention is a fluorescent probe used for visualizing cancer cells or tissues containing a compound represented by the general formula (II) or a salt thereof, wherein the compound or a salt thereof and a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof is a fluorescent probe that emits or enhances fluorescence by reacting in cancer cells or tissues (hereinafter referred to as "the (Also called "fluorescent probe").
  • R 1 , L, A and D in general formula (I) are the same as described in detail in the visualization method of the present invention.
  • the method of using the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, and it can be used in the same manner as conventionally known fluorescent probes.
  • the compound of general formula (II) is added to an aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or a mixture of a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethylsulfoxide and dimethylformamide and an aqueous medium.
  • the salt may be dissolved, the solution may be added to an appropriate buffer containing cells or tissues, and the fluorescence spectrum may be measured.
  • the fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with suitable additives.
  • the concentration of the compound of general formula (II) in the fluorescent probe of the present invention can be determined appropriately according to the type of cells to be measured, the measurement conditions, and the like.
  • Another embodiment of the present invention includes a fluorescent probe containing a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof, and a compound represented by the following general formula (II) or a salt thereof, A kit for detecting cancer cells or tissues.
  • R 1 , L, A and D in general formula (I) are the same as described in detail in the visualization method of the present invention.
  • the fluorescent probe of the present invention and the compound of general formula (I) are usually prepared as solutions. It can also be provided as a composition and dissolved in distilled water for injection or an appropriate buffer before use.
  • kit may contain other reagents and the like as necessary.
  • additives such as dissolution aids, pH adjusters, buffers, tonicity agents, and the like can be used, and the amount of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the kit of the present invention can be used to diagnose cancer.
  • a compound represented by the following general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a compound represented by the following general formula (II) or a medicament thereof It is a diagnostic agent for cancer (hereinafter also referred to as "diagnostic agent of the present invention") including a combination with a functionally acceptable salt.
  • R 1 , L, A and D in general formula (I) are the same as described in detail in the visualization method of the present invention.
  • the diagnostic agent of the present invention comprises a compound represented by general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a compound represented by general formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof. are not included in a mixture, but are included separately.
  • the diagnostic agent of the present invention is a compound represented by general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and general formula (II ) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used by separately applying or administering to cancer cells or tissues or clinical specimens.
  • Either the compound represented by general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof or the compound represented by general formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is first applied to cancer cells or tissues Alternatively, it may be applied or administered to a clinical specimen, but preferably the compound represented by general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is applied or administered first.
  • the diagnostic agent of the present invention includes not only the compound represented by general formula (I) and the compound represented by general formula (II), but also salts, solvates or hydrates thereof.
  • the salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and examples thereof include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • base addition salts include alkaline earth metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts and magnesium salts, ammonium salts, or organic amine salts such as triethylamine salts, piperidine salts and morpholine salts.
  • Acid addition salts include, for example, mineral salts such as hydrochlorides, hydrobromides, sulfates, nitrates, and phosphates; Organic acid salts such as tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, cinnamic acid, lactic acid, glycolic acid, glucuronic acid, ascorbic acid, nicotinic acid, salicylic acid can be mentioned.
  • Examples of amino acid salts include glycine salts, aspartates, glutamates, and the like.
  • the type of solvent that forms the solvate is not particularly limited, but solvents such as ethanol, acetone, and isopropanol can be exemplified.
  • the compound represented by general formula (I) and the compound represented by general formula (II) are usually prepared as solutions. It is provided as a composition in an appropriate form such as a tablet or a liquid, and can be applied by dissolving in distilled water for injection or an appropriate buffer at the time of use.
  • Types of cancer targeted by the diagnostic agent of the present invention include lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, breast cancer, bladder cancer, brain tumor, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, bile duct cancer, and liver cancer. , pancreatic cancer, head and neck cancer, renal cancer, leukemia, skin cancer, and thyroid cancer cells or tissues.
  • the diagnostic agent of the present invention can be used both in vivo and in vitro, but is preferably used for cancer cells or tissues or clinical specimens in vitro during surgery.
  • the compounds of the present invention can exist as acid addition salts or base addition salts.
  • Acid addition salts include, for example, mineral salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, or methanesulfonates, p-toluenesulfonates, oxalates, citrates, tartrates, trifluoroacetates and the like.
  • base addition salts include metal salts such as sodium salts, potassium salts, calcium salts and magnesium salts, ammonium salts, and organic amine salts such as triethylamine salts. . In addition to these, it may form a salt with an amino acid such as glycine.
  • the compounds of the present invention or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances can also be used in the present invention.
  • BCN bicyclo[6.1.0]nonine
  • DCM dichloromethane
  • DIEA N,N-diisopropylethylamine
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • DMF N,N-dimethylformamide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • ESI electrospray ionization
  • FBS Fetal Bovine Serum HBSS: Hank's Balanced Salt Solution
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • HRMS High Resolution Mass Spectrometry
  • MeOH Methanol
  • MeCN Acetonitrile MPLC: Medium Pressure Liquid Chromatography
  • MS Mass Spectrometry NMR: Nuclear Magnetic Resonance O/N: Overnight
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • PS Penicillin-Streptomycin ROI: Region of Interest
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium
  • RT-qPCR Quantitative Reverse Transcription PCR method r.
  • Apparatus used JEOL JNM-LA400 was used to acquire NMR spectra, and 1 H-NMR was measured at 400 MHz. MS spectra were measured using a JEOL JMS-T100LC AccuToF (ESI).
  • Reverse-phase HPLC purification was performed using an HPLC system consisting of Inertsil ODS-3 10 mm ⁇ 250 mm (GL Sciences Inc.) as a column, a pump (PU-2080, JASCO), and a detector (MD-2015, JASCO).
  • A H 2 O containing 0.1% TFA (v /v) for acidic HPLC, H 2 O containing 0.1% TEAA for neutral HPLC
  • mobile phase B (20% H 2 O and 0.1% for acidic HPLC).
  • UPLC-MS analysis was performed by ACQUITY equipped with a reversed-phase column (ODS, 1.7 ⁇ m, 2.1 mm ⁇ 50 mm, Waters) equipped with a UV-VIS detector (205015017, Waters) and a QDa mass spectrometer system (176003208, Waters).
  • MS spectra were measured using a MicroTOF (Bruker, ESI-TOF).
  • Reverse-phase HPLC purification was performed using Inertsil ODS-3 20 mm x 250 mm (GL Sciences Inc.) or Inertsustain C18 4.6 mm x 150 mm (GL Sciences Inc.) as columns, pumps (PU-2080 or PU-2087, JASCO) and a detector (MD-2010, JASCO), mobile phase A (H 2 O containing 0.1% TFA (v/v) and 1% acetonitrile) and mobile phase B (0.1% TFA (v/v) and 1% acetonitrile) were used.
  • Fluorescence spectra were obtained using a F7100 (Hitachi). The slit width at the time of spectrum measurement was set to 5 nm for both excitation and fluorescence, and the photomultiplier voltage was set to 400V. Fluorescence spectra were measured at an excitation wavelength of 480 nm (5Tz-2COOH-RG, 5Tz-TG) or 540 nm (5Tz-TMR), and the solvent used was PBS (Gibco, pH 7.4, containing 1% or less DMSO). there was. In the single wavelength measurement using 5Tz-TMR, an excitation wavelength of 556 nm and a detection wavelength of 580 nm were used, and PBS (pH 7.4, containing 0.2% DMSO) was used as the solvent.
  • Cell culture A549 cells and HT-29 cells were cultured in 5% CO 2 environment using DMEM (Gibco) containing 10% FBS (biowest) and 1% PS (Gibco).
  • H460 cells, SHIN3 cells, and SKOV3 cells were cultured in 5% CO 2 environment using RPMI (Gibco) containing 10% FBS (biowest) and 1% PS (Gibco).
  • HBSS containing diene dyes (5Tz-TMR, 5Tz-TG: 1 ⁇ M) or dienophile amino acid (BCN-pAP: 50 ⁇ M) (containing 1% or less DMSO) was added, and confocal
  • the cells were set on a stage of a microscope (TCS SP8, Leica) kept at 37° C., and changes in intracellular fluorescence intensity over time were observed.
  • TCS SP8, Leica Leica
  • BCH 5 mM
  • JPH203 5 ⁇ M
  • the confocal microscope settings are as follows.
  • Objective lens 40x objective lens (HC PL APO 40x/1.30 OIL, Leica), excitation wavelength: 405 nm (HoechestTM 33342), 476 nm (Calcein-AM), 488 nm (5Tz-TG), 561 nm (5Tz- TMR), 594 nm (CellTrackerTM Red CMTPX), detection wavelength: 420-480 nm (HoechestTM 33342), 490-520 nm (Calcein-AM), 500-550 nm (5Tz-TG), 610-660 nm (5Tz -TMR, CellTrackerTM Red CMTPX)
  • Tz-Introduced Dye A549 cells were seeded at 4.0 ⁇ 10 4 cells/well in an 8-well chamber (ibidi) and cultured for 1-2 days. After removing the medium and washing once with PBS (wako), PBS was added and the plate was set on the microscope stage. After imaging the autofluorescence of the cells, diene dyes (5Tz-TMR, 5Tz-2COOH-RG, 5Tz-TG: 1 ⁇ M) were added. After incubation for 10 minutes, images were taken, and images were taken again after washing twice with PBS. The confocal microscope settings are as follows.
  • Objective lens 63x objective lens (HC PL APO CS2 63x/1.40 OIL, Leica), excitation wavelength 488nm (5Tz-2COOH-RG, 5Tz-TG), 561nm (5Tz-TMR), detection wavelength: 526-600nm ( 5Tz-2COOH-RG, 5Tz-TG), 610-660 nm (5Tz-TMR)
  • Tz-TMR Tz-TMR A549 cells were seeded at 4.0 ⁇ 10 4 cells/well in an 8-well chamber (ibidi) and cultured for 3 days. The medium was removed, washed once with HBSS, and pre-incubated with HBSS containing 1 ⁇ M 5Tz-TMR for 60 minutes.
  • HBSS solution was removed and fresh organelle staining reagents (ER-Tracker (trademark) Blue-White DPX: 5 ⁇ M, LysoTracker (trademark) Green DND-26: 1 ⁇ M, MitoTracker (trademark) Deep Red FM: 0.5 ⁇ M, all Invitrogen) containing HBSS was added, and the cells were observed under a confocal microscope at 37°C. Acquired co-stained images were evaluated for localization with ImageJ Fiji.
  • the confocal microscope settings are as follows.
  • Objective lens 64x objective lens (HC PL APO 64x/1.40 OIL, Leica), excitation wavelength: 405 nm (ER-TrackerTM Blue-White DPX), 488 nm (LysoTrackerTM Green DND-26), 561 nm (5Tz-TMR), 631 nm (MitoTrackerTM Deep Red FM), detection wavelength: 415-490 nm (ER-TrackerTM Blue-White DPX), 00-520 nm (LysoTrackerTM Green DND-26), 600-660 nm (5Tz-TMR), 640-660 nm (MitoTrackerTM Deep Red FM)
  • A549 cells were preincubated with TCO-K solution, incubated with 5Tz-TMR solution for 30 minutes, and then removed from the HBSS solution on the stage of a confocal microscope. After washing twice and replacing with fresh HBSS, intracellular fluorescence intensity was observed for 30 minutes. After 30 minutes, the same washing/substitution operation was performed again, and the intracellular fluorescence intensity was observed again for 30 minutes.
  • Human GAPDH sense strand 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'
  • Human GAPDH antisense strand 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′
  • Human LAT1 (SLC7A5) antisense strand 5'-AAGAGCCTGGAGGATGTGAA-3'
  • the freeze-dried white powder was dissolved in dehydrated DMF (1.0 mL), piperidine (100 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Disappearance of the raw material and production of the desired product were confirmed by UPLC-MS, and stirring was stopped. Purification by neutral HPLC followed by acidic HPLC followed by lyophilization gave BCN-pAP as a white solid (1.85 mg, 15% yield). In addition, just before freeze-drying, the pH was adjusted to 7 or more with aqueous ammonia in order to prevent decomposition of the compound.
  • the freeze-dried white powder was dissolved in dehydrated DMF (1.0 mL), piperidine (100 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 40 minutes. Disappearance of the raw material and production of the desired product were confirmed by UPLC-MS, and stirring was stopped. Purification by neutral HPLC followed by acidic HPLC followed by lyophilization gave BCN-AA as a white solid (1.85 mg, 24% yield). In addition, just before freeze-drying, the pH was adjusted to 7 or more with aqueous ammonia in order to prevent decomposition of the compound.
  • This material was dissolved in a TFA solution (1 mL) containing 10% water, stirred at room temperature, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • An acetonitrile/Et 2 O mixed solution (1:1) was added to the crude product, and the insoluble matter was collected by suction filtration to obtain the target product 4 as a red solid (101 mg, yield 37%).
  • the product was identified as the desired product with reference to reference 3.
  • Compound 5 was synthesized with reference to Reference 4.
  • Compound 5 (7.2 mg, 0.021 mmol), (4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)methanamine (5.8 mg, 0.031 mmol), O-(N-succinimidyl) -N,N,N,N-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TSTU, 9.4 mg, 0.031 mmol), DIEA (10.6 ⁇ L, 0.062 mmol), DMF (8 mL) were stirred at room temperature for 12 hours. .
  • references 1 A. Wieczorek, P. Werther, J. Euchner, R. Wombacher, Green- to far-red-emitting fluorogenic tetrazine probes - synthetic access and no-wash protein imaging inside living cells, Chem. Sci. 8, 1506-1510 ( 2017). 2. CK Spahn, M. Glaesmann, JB Grimm, AX Ayala, LD Lavis, M. Heilemann, A toolbox for multiplexed super-resolution imaging of the E. coli nucleoid and membrane using novel PAINT labels, Sci. Rep. 8, 14768 (2018 ). 3. C. Grang, L. Bin, T. Ying, W.
  • Example 1 Using the compound synthesized above, it was confirmed whether the reaction proceeded in vitro and whether activation of the pigment by SPIEDAC also occurred in cells.
  • the Click reaction kinetics of BCN-pAP, BCN-AA and diene dyes were evaluated in PBS(-) with a fluorometer.
  • FIG. 2 shows the results of examining the reactivity of the three dyes synthesized in Synthesis Examples 1 to 3 with various dienophiles.
  • the measurement conditions are as follows. Slit: 5 nm, 5 nm photomultiplier voltage 400 V, Ex. 480 nm (5Tz-2COOH-RG, 5Tz-TG), 540nm (5Tz-TMR) Note that 0 min of the spectrum represents the time before addition of the dienophile, and basically the time change of the fluorescence spectrum for 20 min was obtained every 2 min.
  • the reaction of TCO was completed within approximately 10 minutes for both dyes.
  • BCN is not as fast as TCO, but it can be seen that the reaction proceeds on the minute scale.
  • the reaction rate tends to increase as the tetrazine is electron-deficient and has less steric hindrance, and as the dienophile, the greater the strain on the alkene/alkyne side, the higher the reaction rate. seen.
  • FIG. 4 shows a simplified experimental protocol and imaging images of A549 cells to which 5Tz-TMR, 5Tz-2COOH-RG and 5Tz-TG were added.
  • the autofluorescence is low at the observation wavelength of 5Tz-TMR, and the fluorescence intensity inside and outside the cells after the addition of the dye and after washing is high. was considered to be accumulated in cells.
  • 5Tz-2COOH-RG the intracellular fluorescence intensity hardly changed before and after addition of the dye, suggesting low cell membrane permeability.
  • 5Tz-TG was taken up by cells, it was considered that its retention in cells was low because the fluorescence intensity decreased after washing out. Therefore, first, 5Tz-TMR was selected as a diene dye having cell membrane permeability and intracellular retention, and further examined.
  • FIG. 5b shows the results of an imaging test (using BCH as a LAT inhibitor) in HBSS of A549 cells supplemented with BCN-pAP after preincubation with 5Tz-TMR. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • the intracellular fluorescence intensity increased over time only under the BCN-pAP(+)BCH(-) condition, indicating that BCN-pAP was incorporated into A549 cells via LAT. It was suggested that
  • FIG. 6a shows the test protocol
  • FIG. 6b shows the results of imaging in HBSS of A549 cells supplemented with BCN-pAP after pre-incubation with 5Tz-TMR. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • the difference in fluorescence intensity between the presence and absence of inhibitors appears to be low, but the intracellular fluorescence intensity decreases when BCH (2nd row) and JPH203 (3rd row) are added. It was suggested that BCN-pAP becomes a substrate of LAT1 and is incorporated into A549.
  • FIG. 7a is the result of imaging in HBSS of A549 cells supplemented with 5Tz-TMR after pre-incubation with BCN-pAP. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • 8b is a co-stained image of 5Tz-TMR and ER, Lyso, and MitoTracker. 2D intensity histogram is Analyze after developing each channel with ImageJ Fiji ->Colocalization-> Colocalization threshold. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 9a is an imaging result of A549 cells to which 5Tz-TG was added after pre-incubation with BCN-pAP.
  • FIG. 9b is an imaging result of A549 cells to which 5Tz-TG was added after pre-incubation with BCN-pAP.
  • BCN-K uses exo BCN
  • BCN-pAP uses endo BCN
  • Both BCN-K and TCO-K were purchased and used on the market.
  • These dienophile-introduced amino acids were evaluated for reactivity with 5Tz-TMR using a fluorometer and UPLC-MS.
  • FIG. 10 shows the results of BCN-pAP and BCN-AA together.
  • FIG. 10(a) shows the structure of the studied dienophile-introduced amino acid
  • FIG. 10(b) shows the reaction rate comparison between 5Tz-TMR and each dienophile-introduced amino acid (dienophile added for 300 sec, excitation at 556 nm, observation at 580 nm).
  • TCO-K, BCN-K, BCN-pAP, BCN-AA, and control without dienophile-introduced amino acids are in order from the condition that showed a high fluorescence value after 5000 seconds.
  • FIG. 10(c) shows the evaluation of fluorescence recovery by reaction of 5Tz-TMR with BCN-K (excitation at 556 nm).
  • FIG. 10(d) shows the results of analysis of reaction products of 5Tz-TMR and each dienophile-introduced amino acid by UPLC-MS.
  • TCO-K in which TCO is introduced as a dienophile, the reaction progresses more rapidly than in a compound in which BCN is introduced as a dienophile, and even when applied to cells, a more rapid increase in fluorescence is expected compared to a compound in which BCN is introduced. (Fig. 10(b)).
  • BCN-K and TCO-K were applied to A549 cells to assess whether these dienophile-introduced amino acids were taken up via LAT1.
  • the results of imaging with A549 cells using BCN-pAP and BCN-AA obtained in Example 1, and the test protocol for the above TCO-K and BCN-K are shown in FIG. 11b. Shown are fluorescence images of A549 cells 10 minutes after addition of 5Tz-TMR (1 ⁇ M) after pre-incubation with dienophiles (100 ⁇ M) developed in HBSS for 30 minutes.
  • the LAT1 substrate ability of the dienophile-introduced amino acid was evaluated from the difference in intracellular fluorescence intensity between the presence and absence of the LAT1-specific inhibitor JPH203 (5 ⁇ M). (ex.: 556 nm, em.: 610-660 nm) Scale bar is 50 ⁇ m. Control indicates the state of the dienophile-introduced amino acid (-).
  • TCO-K the intracellular fluorescence intensity 10 minutes after the addition of 5Tz-TMR was even higher than that of BCN-pAP, and this intracellular fluorescence was suppressed by the addition of the LAT1-specific inhibitor JPH203. It was suggested that TCO-K was taken up into cells via LAT1.
  • Example 5 Examination of optimization of imaging conditions for 5Tz-TMR and TCO-K (1) Investigation of pre-incubation time and incubation time Next, we searched for the optimal imaging conditions for the combination of 5Tz-TMR and TCO-K, which was suggested to most efficiently cause intracellular SPIEDAC via LAT1. Ta. Ultimately, in this study, which is aimed at applications such as cancer diagnosis, it is important to obtain high intracellular fluorescence intensity in a short experimental time. The pre-incubation/incubation time was changed, and the optimization of the imaging conditions was examined. A simplified experimental protocol and results are shown in FIG.
  • the intracellular fluorescence intensity was higher in the order of pre-incubation with TCO-K ⁇ incubation with 5Tz-TMR.
  • the intracellular fluorescence intensity and its contrast tended to decrease 15 minutes after the addition of the dye, suggesting the influence of the adduct flowing out of the cell. (It seemed that there was no effect of fading from confirmation of another field of view, etc.). Therefore, it was revealed that the optimum incubation time is about 5 to 15 minutes and the pre-incubation time is about 15 minutes or longer.
  • FIG. 12a shows the test protocol and imaging images under each condition (the left figure shows the case where 5Tz-TMR is added first, and the right figure shows the case where TCO-K is added first).
  • FIG. 12b shows the results of quantifying the intracellular fluorescence intensity under each condition. ROIs were defined manually from the calcein-AM fluorescence signal. All scale bars are 50 ⁇ m.
  • FIG. 13 shows the results of examining the dienophile concentration and the LAT1 inhibitor concentration in the pair of TCO-K and 5Tz-TMR. The pre-incubation time for TCO-K was 30 minutes.
  • FIG. 13a is an imaging image after 10 minutes of incubation. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 13b shows the results of quantifying the intracellular fluorescence intensity under each condition. ROIs were manually defined from the calcein-AM fluorescence signal using ImageJ Fiji and the average signal intensity of all ROIs was graphed.
  • FIG. 14 shows the evaluation results of intracellular retention when TCO-K and 5Tz-TMR were applied to A549 cells.
  • FIG. 14(a) is an imaging image after addition of 5Tz-TMR after TCO-K preincubation for 30 minutes, and washing out was performed twice every 30 minutes to replace HBSS(-) in the external solution.
  • FIG. 14(b) shows changes over time in intracellular fluorescence intensity. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • TCO-K and 5Tz-TMR click reaction pairs which were found to be taken up via LAT1 in A549, were injected into cells according to the expression profile of LAT1.
  • TCO-K and 5Tz-TMR were applied to cell types with different LAT1 expression levels, and cell imaging was performed. The results are shown in FIG. FIG. 15(a) shows the results of fluorescence imaging of various cell lines treated with TCO-K and 5Tz-TMR. Scale bar is 50 ⁇ m.
  • (b) of FIG. 15 is the result of quantifying the intracellular fluorescence intensity of each panel of (a).
  • (d) of FIG. 15 shows the result of plotting the correlation between (b) and (c) for each cell line. As a result, there was a rough correlation between the LAT1 mRNA level and the intracellular fluorescence intensity, suggesting that TCO-K causes SPIEDAC in the cell depending on the LAT1 expression level.

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Abstract

【解決課題】　ＬＡＴ１を発現するがん細胞又は組織を蛍光イメージングする方法を提供すること。 【解決手段】　がん細胞又は組織を可視化する方法であって、 （ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、 （ｂ）一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブを細胞又は組織に導入する工程、及び （ｃ）一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩と一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、 （ａ）の工程と（ｂ）の工程を行う順序は、いずれかの工程を先に行ってもよい、該方法。

Description

がん細胞の蛍光イメージング技術
　本発明は、新規ながん細胞又は組織の蛍光イメージング法、及び、新規ながん細胞又はがん組織を可視化するために用いられる蛍光プローブに関わる。より詳しくは、Ｃｌｉｃｋ反応を利用してＬＡＴ１を発現するがん細胞又はがん組織を蛍光イメージングする方法、及び、当該方法に用いられる蛍光プローブに関わる。
　ＬＡＴ１（Large amino acid transporter 1）は、ナトリウム非依存的に駆動するトランスポーターＬＡＴのアイソフォームの一つであり、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒといった大型側鎖を持った中性アミノ酸や、Ｌ－ＤＯＰＡなどのアミノ酸誘導体を細胞内外に対向輸送する。近年、結晶構造解析よりタンパク質の立体構造が明らかとなり、ＬＡＴ１は細胞膜上において膜一回貫通タンパク質４Ｆ２ｈｃとダイマーを形成することで基質輸送を行っている。
　正常組織におけるＬＡＴ１の発現は、神経細胞、グリア細胞、活性化Ｔ細胞、骨髄、精巣、胎盤関門、血液脳関門など、アミノ酸の断続的な供給が必要である局所組織に限定され、多くの正常組織における大型中性アミノ酸の膜輸送は、ＬＡＴのアイソフォームの一つであるＬＡＴ２が主に担っている。
　また、ＬＡＴ１は腫瘍組織において高発現していることが報告されており、その広範ながん種における発現亢進と、がん特異的な発現分布から、近年新たながんのバイオマーカーとして注目されている。肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんなど、非常に多くのがん種において、ヒト患者由来の組織レベルでＬＡＴ１発現の亢進は確認されており（非特許文献１、２）、特に非小細胞性肺がん、脳腫瘍、前立腺がん、乳がんにおいては、ＬＡＴ１の高発現群は予後不良であり、がんの悪性度とＬＡＴ１の発現が関連することが示唆されている。
　このように、ＬＡＴ１は、がんの生態との密接な関連が明らかとなってきており、がんの生態の解明を目指す基礎研究の対象となるとともに、がんに対する新たな創薬標的として注目を集めている。
　一方で、近年、簡便かつ高感度ながんの診断、特にがんの術中診断を実現する手法として、蛍光イメージング法が注目を集めている（非特許文献３、４）。しかしながら、ＬＡＴ１はがんマーカーとしての有用性が多く検証され、創薬標的として注目されているものの、ＬＡＴ１を介してがん組織を可視化するような蛍光イメージング技術はほとんど報告がない。
　また、高い感度および安全性で利用できる蛍光イメージング法をがんの検出に適用できれば、広範ながん種を術中で診断可能な画期的な医療技術となる事が期待されるが、ＬＡＴ１を介してがん組織に取り込まれる蛍光基質の開発はほとんど行われていない。
Hafliger, P. & Charles, R. P. The l-type amino acid transporter LAT1-an emerging target in cancer. Int. J. Mol. Sci. 20, 1-14 (2019). Wang, Q. & Holst, J. L-type amino acid transport and cancer: targeting the mTORC1 pathway to inhibit neoplasia. Am. J. Cancer Res. 5, 4 (2015). Ueo, H. et al. Rapid intraoperative visualization of breast lesions with γ-glutamyl hydroxymethyl rhodamine green. Sci. Rep. 5, 12080 (2015). Onoyama, H. et al. Rapid and sensitive detection of early esophageal squamous cell carcinoma with fluorescence probe targeting dipeptidylpeptidase IV. Sci. Rep. 6, 1-10 (2016).
　本発明は、ＬＡＴ１を発現するがん細胞又は組織を蛍光イメージングする方法、及び、当該方法に用いられる蛍光プローブを提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＬＡＴ１による取り込みを利用したがんイメージング蛍光プローブを開発するべく検討を進めたところ、ＬＡＴ１基質構造を導入した蛍光小分子を利用する手法を用いて、ニトロベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）の誘導体及び類似体が有望な蛍光プローブであることを見出した（本発明者らによる係属中のＰＣＴ／ＪＰ２０２１／００６４１３）。これら蛍光プローブは、ＮＢＤ又はその類似体の基質により細胞内への蓄積・蛍光寿命の長寿命化による蛍光ａｃｔｉｖａｔｉｏｎが起こる有望な化合物であることが示唆されたものの、ＮＢＤ等以外の蛍光団への変換（構造展開）が容易ではない。
　そこで、より柔軟な構造展開が可能となるＬＡＴ１を利用したイメージング手法として、新たに銅フリーＣｌｉｃｋ反応を利用した手法を利用できるのではないかと着想した。
　本発明者らは、それらＣｌｉｃｋ反応の中でもテトラジンとトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）やビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）の反応に代表される歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応（Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ　Ｉｎｖｅｒｓｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｍａｎｄ　Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ　Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＳＰＩＥＤＡＣ）を利用して、ＬＡＴ１を標的とした新たながんイメージング法を確立できるのではないかと考え、鋭意検討した結果、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
［１］ がん細胞又は組織を可視化する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、
（ｂ）以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、及び
（ｃ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
（ａ）の工程と（ｂ）の工程を行う順序は、いずれの工程を先に行ってもよい、該方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
（式中、
Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基であり：
Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択され；
Ａは、リンカーを表し；
Ｄは、ジエノフィル基を表し、
当該ジエノフィル基は、以下から選択される；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
（式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよく；
＊は、Ａとの結合箇所を表す。））
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
（式中、
Ｂは、単結合又は連結基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
は、蛍光団を表し；
Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。）
［２］Ｌが以下から選択される、［１］に記載の方法。
－（ＣＲａＲｂ）ｎ－、－Ａｒ－、＊－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、＊－（ＣＲａＲｂ）ｓ－Ａｒ－、＊－（ＣＲａＲｂ）ｓ－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｎ－１－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｓ－１－Ａｒ－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｓ－１－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－（Ａｒはアリーレンを表し、Ｒａ及びＲｂは、各々独立に、各出現において独立に、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、ｎは１～８の整数であり、ｍは１～５の整数であり、ｓは１～８の整数であり、＊は、Ａと結合する側を示す。）
［３］Ａのリンカーは、炭素数１～６のアルキレン基、アミド基、カルバメート基、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］Ｂの連結基は、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アルケニレン基、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記蛍光団は、以下の式（６）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
（式中、
Ｒ３は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
Ｒ４は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基又はカルボキシル基であり；
ｍは、０～３の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ３は同じであっても異なっていてもよく；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ９Ｒ１０であり、
ここで、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基であり；
Ｙ及びＺは、（ＯＲｄ、Ｏ）又は（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み
合わせであり、
ここで、Ｒｄは、水素原子、アシル基、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであり、
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
ここで、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つは、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであってもよく；
＊は、Ｂと結合する箇所を表す。）
［６］前記蛍光団は、以下の式（７）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
（式中、
Ｒ１５～Ｒ１８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基を示し；
Ｒ１９は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
ｓは、０～４の整数であり、ｓが２以上の場合は、各々のＲ１９は同じであっても異なっていてもよく；
＊は、Ｂと結合する箇所を表す。）
［７］前記蛍光団は、以下の式（８）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
（式中、
Ｒ２０は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
ｍ’は、０～３の整数であり、ｍ’が２以上の場合は、各々のＲ２０は同じであっても異なっていてもよく；
Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
Ｒ２３及びＲ２４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり：
Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ９Ｒ１０であり、
ここで、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基であり；
Ｙ’及びＺ’は、（ＯＲｄ、ＯＲｅ）又は（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４
）の組み合わせであり、
ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、水素原子、アシル基、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであり、
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
ここで、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つは、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであってもよく、
Ｙ’及びＺ’が、（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み合わせであり、
Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つが、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドである場合は、Ｒ２１～Ｒ２４の１つは、－ＣＨ２Ｆであってもよく；
＊は、Ｂと結合する箇所を表す。）
［８］一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む、がん細胞又は組織を可視化するために用いられる蛍光プローブであって、
当該化合物又はその塩と以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とはがん細胞又は組織内で反応することにより、蛍光が発せられる又は増強される、該蛍光プローブ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
（式中、
Ｂは、単結合又は連結基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
は、蛍光団を表し；
Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
（式中、
Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基であり：
Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択され；
Ａは、リンカーを表し；
Ｄは、ジエノフィル基を表し、
当該ジエノフィル基は、以下から選択される；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
（式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよく；
＊は、Ａとの結合箇所を表す。））
［９］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、及び
　以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む、がん細胞又は組織の検出用キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
（式中、
Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基であり：
Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択され；
Ａは、リンカーを表し；
Ｄは、ジエノフィル基を表し、
当該ジエノフィル基は、以下から選択される；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
（式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～6のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよく；
＊は、Ａとの結合箇所を表す。））
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
（式中、
Ｂは、単結合又は連結基であり；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
は、蛍光団を表し； 
Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。）
［１０］以下の式で表される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
を提供するものである。
　本発明により、ＬＡＴ１を発現するがん細胞又は組織を蛍光イメージングする方法を提供することができる。本発明の可視化方法は、種々の蛍光団を使用することができるため、光学特性を長波長にすることが可能であり、これにより自家蛍光の影響を低減することができ、更に、組織へのダメージを減らすことができる。
　また、本発明により当該方法に用いられる蛍光プローブを提供することができる。
ＳＰＩＥＤＡＣを利用したＬＡＴ１を介するがんイメージングの概略図である。 合成例１～３で合成した３種類の色素と種々のジエノフィルの反応性を調べた結果を示す。 各ジエン色素と合成したジエノフィル－アミノ酸のＵＰＬＣ－ＭＳによる反応性評価の結果を示す。 ５Ｔｚ－ＴＭＲ、５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧを添加したＡ５４９細胞のイメージングの結果を示す。 実施例２におけるＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＭＲを用いたイメージング試験のプロトコルを示す。 実施例２におけるＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＭＲを用いたイメージング試験の結果を示す。 ＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＭＲを用い、ＬＡＴ１の選択的な阻害剤であるＪＰＨ２０３を用いた試験プロトコルを示す。 ＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＭＲを用い、ＬＡＴ１の選択的な阻害剤であるＪＰＨ２０３を用いたイメージングの結果を示す。 ＢＣＮ－ｐＡＰをプレインキュベーション後、５Ｔｚ－ＴＭＲを添加したＡ５４９細胞のＨＢＳＳ中でのイメージング試験のプロトコルを示す。 ＢＣＮ－ｐＡＰをプレインキュベーション後、５Ｔｚ－ＴＭＲを添加したＡ５４９細胞のＨＢＳＳ中でのイメージングの結果を示す。 実施例２において、ジエン色素５Ｔｚ－ＴＭＲの細胞内局在を調べた試験プロトコルを示す。 実施例２において、ジエン色素５Ｔｚ－ＴＭＲの細胞内局在を調べた結果を示す。 実施例３の試験プロトコルを示す。 実施例３のイメージング試験結果を示す。 ５Ｔｚ－ＴＭＲと、ＢＣＮ－ｐＡＰ、ＢＣＮ－ＡＡ、ＴＣＯ－Ｋ、ＢＣＮ－Ｋを用いた蛍光のａｃｔｉｖａｔｉｏｎ評価とＵＰＬＣ－ＭＳによる反応性評価の結果まとめて示す。 ５Ｔｚ－ＴＭＲと各ジエノフィル導入アミノ酸を用いたＡ５４９細胞でのイメージング試験のプロトコロを示す。 ５Ｔｚ－ＴＭＲと各ジエノフィル導入アミノ酸を用いたＡ５４９細胞でのイメージング試験の結果を示す。 ５Ｔｚ－ＴＭＲとＴＣＯ－Ｋの組み合わせについてのプレインキュベーション時間とインキュベーション時間の検討結果を示す。 ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲのペアにおけるジエノフィル濃度とＬＡＴ１阻害剤濃度の検討結果を示す。 ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲをＡ５４９細胞に適用した際の細胞内滞留性の評価結果を示す。 ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲをＬＡＴ１発現レベルの異なる細胞種に適用し、細胞イメージングを行った結果を示す。
発明の実施の形態
　本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個（Ｃ１～６）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
　本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。
置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
１．本発明の可視化方法
　本発明の１つの実施態様は、がん細胞又は組織を可視化する方法であって、
（ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、
（ｂ）以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、及び
（ｃ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
（ａ）の工程と（ｂ）の工程を行う順序は、いずれの工程を先に行ってもよい、該方法である（以下「本発明の可視化方法」とも言う）。
　本発明の可視化方法は、歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応（ＳＰＥＩＤＡＣ）を利用して、ＬＡＴ１を標的とした新たながんイメージング法を確立することを可能とするものである。具体的には、本発明の可視化方法は、ジエノフィルを導入したアミノ酸（一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩）と、ジエン－蛍光団（一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩）をがん細胞内で出会わせてクリック反応させる戦略を用いる。図１に、ＳＰＩＥＤＡＣを利用したＬＡＴ１を介するがんイメージングの概略図を示す（図１中のＲは適切な構造を選択する）。理論に拘束されることを目的とするものではないが、このような戦略をとることにより、分子サイズや構造を最適化することで、天然アミノ酸が共存する生体内環境下でもＬＡＴ１に効率的に取り込まれるジエノフィル－アミノ酸を設計することができると期待できる。また、ＳＰＥＩＤＡＣにより高い蛍光量子収率を有する蛍光団を生成するようジエン－蛍光団を設計することができ、より柔軟な構造展開が可能となり、前述の課題を克服したＬＡＴ１を介したがん蛍光イメージング法が確立することが可能となる。
　また、本発明の可視化方法においては、式（６）～（８）で例示するような種々の蛍光団を使用することができるため、光学特性を長波長にすることが可能であり、これにより自家蛍光の影響を低減することができ、更に、組織へのダメージを減らすことができる。
　以下で本発明の可視化方法について詳述する。
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、ＬＡＴ１の基質となるジエノフィル－アミノ酸であり、以下で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基である。アルキル基としては、好ましくは、メチル基である。
　一般式（Ｉ）において、Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択される二価の基である。
　アルキレンは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、メチレン、１－メチルメチレン、１，１－ジメチルメチレン、エチレン、１－メチルエチレン、１－エチルエチレン、１，１－ジメチルエチレン、１，２－ジメチルエチレン、１，１－ジエチルエチレン、１，２－ジエチルエチレン、１－エチル－２－メチルエチレン、トリメチレン、１－メチルトリメチレン、２－メチルトリメチレン、１，１－ジメチルトリメチレン、１，２－ジメチルトリメチレン、２，２－ジメチルトリメチレン、１－エチルトリメチレン、２－エチルトリメチレン、１，１－ジエチルトリメチレン、１，２－ジエチルトリメチレン、２，２－ジエチルトリメチレン、２－エチル－２－メチルトリメチレン、テトラメチレン、１－メチルテトラメチレン、２－メチルテトラメチレン、１，１－ジメチルテトラメチレン、１，２－ジメチルテトラメチレン、２，２－ジメチルテトラメチレン、２，２－ジ－ｎ－プロピルトリメチレン等が挙げられる。
　アリーレンは、単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素からなる二価の基であり、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。アリーレンが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニレン基（Ｐｈ）等が挙げられる。縮合多環式のアリーレンの非限定的な例としては、ナフチレン等が挙げられる。
　本発明の１つの好ましい態様において、Ｌは以下から選択される。
－（ＣＲａＲｂ）ｎ－、－Ａｒ－、＊－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、＊－（ＣＲａＲｂ）ｓ－Ａｒ－、＊－（ＣＲａＲｂ）ｓ－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｎ－１－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｓ－１－Ａｒ－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｓ－１－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－
　ここで、Ａｒはアリーレンを表し、Ｒａ及びＲｂは、各々独立に、各出現において独立に、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、ｎは１～８の整数であり、ｍは１～５の整数であり、ｓは１～８の整数であり、＊は、Ａと結合する側を示す。
　また、本発明の１つの好ましい態様において、Ｌは以下から選択される。
－（ＣＨ２）ｎ１－、－Ｐｈ－、＊－Ｐｈ－（ＣＨ２）ｍ１－、＊－（ＣＨ２）ｓ１－Ｐｈ－、＊－（ＣＨ２）ｓ１－Ｐｈ－（ＣＨ２）ｍ１－、＊－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ１－１－、＊－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ１－１－Ａｒ－、＊－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ１－１－Ａｒ－（ＣＨ２）ｍ１
　ここで、Ｐｈはフェニレン基を表し、ｎ１は１～８の整数であり、ｍ１は１～５の整数であり、ｓ１は１～８の整数であり、＊は、Ａと結合する側を示す。
　Ｌは、ＬＡＴ１の基質となるアミノ酸の側鎖部位に対応することから、ＬＡＴ１の基質ターゲットとなるアミノ酸の側鎖の末端の基から水素原子を１つ取り除いた基（例えば、ＬＡＴ１の基質ターゲットのアミノ酸がアラニンであれば、メチレン基（－ＣＨ２－））が好ましいが、これに限られずに、アミノ酸の種類に応じて選択することができる。
　例えば、ＬＡＴ１の基質ターゲットのアミノ酸がフェニルアラニンであれば、Ｌとして、＊－Ｂｚ－ＣＨ２－（Ｂｚはベンゼン環を表す）及び＊－ＣＨ２－Ｂｚ－ＣＨ２－が好ましい。
　また、ＬＡＴ１の基質ターゲットのアミノ酸がリジンであれば、Ｌとして、＊－ＮＨ－（ＣＨ２）４－が好ましい。
　本発明のより好ましい態様において、Ｌは、以下から選択される。
－ＣＨ２－、＊－Ｂｚ－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）４－、＊－ＣＨ２－Ｂｚ－ＣＨ２－、＊－ＮＨ－（ＣＨ２）４－
　ここで、Ｂｚは、ベンゼン環を表し、＊は、Ａと結合する側を表す。
　一般式（Ｉ）において、Ａは、リンカーを表す。
　Ａのリンカーは、炭素数１～６のアルキレン基、アミド基、カルバメート基、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。
　一般式（Ｉ）において、Ｄは、ジエノフィル基を表す。ここで、Ｄのジエノフィル基は、以下の一般式（Ａ）又は（Ｂ）で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　一般式（Ａ）、（Ｂ）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよい。＊はＡとの結合箇所を示す。
　Ｄのジエノフィル基は、好ましくは、以下から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよい。
　＊は、Ａとの結合箇所を表す。
　ＳＰＥＩＤＡＣの反応性の点からは、式（３）、（４）、（５）、（１）のジエノフィル基が好ましく、式（３）、（４）、（５）のジエノフィル基が特に好ましく、式（３）、（５）のジエノフィル基が更に好ましい。
　本発明の可視化方法に用いることができる一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の非限定的例を以下に示すが、本発明の可視化方法に用いる一般式（Ｉ）の化合物がこれらに限定されるわけではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩
　一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は、ジエン－蛍光団の構造を有し、ジエノフィルとのＳＰＩＥＤＡＣ前後で高い蛍光強度上昇を示すジエン導入色素であり、以下で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
　Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、アミノ基を有するアルキル基（－（ＣＨ２）ｘ－ＮＨ２（ｘは、１～６の整数））、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。
　ここで、置換基を有する芳香環、置換基を有するピリジン環、置換基を有するピリミジン環は、以下の式で表すことができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　（ａ）～（ｃ）の式において、Ｒ１ａは、炭素数１～４のアルキル基、アミノ基を有するアルキル基（－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ２（ｙは、１～３の整数））、カルボキシル基から選択される。
　＊は、テトラジンと結合する箇所を表す。
　Ｒ２は、好ましくは、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、アミノ基を有するアルキル基（－（ＣＨ２）ｘ－ＮＨ２（ｘは、１～６の整数）、アミノ基を有するアルキル基（－（ＣＨ２）ｙ－ＮＨ２（ｙは、１～３の整数））又はカルボキシル基で置換されているベンゼン環である。
　一般式（ＩＩ）において、Ｂは、単結合又は連結基である。Ｂが単結合の場合は、テトラジンは蛍光団に直接結合する。
　Ｂの連結基は、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アルケニレン基（例えば、ビニレン基、プロペニレン基等）、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される。
　ここで、アリーレン及びヘテロアリーレンとしては、ベンゼン環、ピリジン環、ピリミジン環が好ましい。
　また、アルキレン基、アルケニレン基、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基は、置換基（例えば、炭素数１からのアルキル基）を有していてもよい。
　Ｂは、好ましくは、単結合、ピリジン環、ピリミジン環である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
は、蛍光団を表す。
　本発明で使用できる蛍光団は、一般式（Ｉ）の化合物のジエノフィルとのＳＰＩＥＤＡＣ前後で高い蛍光強度上昇を示す蛍光団であり、このような特性を有する蛍光団であれば特に限定されずに使用することができる。
　本発明の１つの態様において、蛍光団は、以下の式（６）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　式（６）において、Ｒ３は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。一価の置換基としては、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基、カルボキシル基等が挙げられる。
　ｍは、０～３の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ３は同じであっても異なっていてもよい。
　Ｒ４は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基又はカルボキシル基である。
　Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）である。
　Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
　Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ９Ｒ１０である。
　Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基である。Ｒ９及びＲ１０が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ９及びＲ１０が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
　Ｒ９又はＲ１０がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　Ｙ及びＺは、（ＯＲｄ、Ｏ）又は（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み合わせである。
　Ｒｄは、水素原子、アシル基（例えば、アセチル基）又は酵素認識部位である。酵素認識部位は、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドから選択される。
　Ｒｄの糖類の部分構造は、糖類から１つの水酸基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。糖類の部分構造は、Ｒｄが結合しているＯと一緒になって、糖類、糖類の一部を構成している。
　糖類としては、β－Ｄ－グルコース、β－Ｄ－ガラクトース、β－Ｌ－ガラクトース、β－Ｄ－キシロース、α－Ｄ－マンノース、β－Ｄ－フコース、α－Ｌ－フコース、β－Ｌ－フコース、β－Ｄ－アラビノース、β－Ｌ－アラビノース、β－Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミン、β－Ｄ－Ｎ－アセチルガラクトサミン等が挙げられ、好ましくは、β－Ｄ－ガラクトースである。
　自己開裂型のリンカーとは、自発的に切断・分解されるリンカーを意味し、例えば、カルバメート、ウレア、パラアミノベンジルオキシ基、エステル基（－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－）等が挙げられる。
　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。
　Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。
　ここで、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つは、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドから選択される酵素標識部位であってもよい。
　Ｒ’のアミノ酸の部分構造とは、Ｒ’が結合しているＣ＝Ｏと一緒になって、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸の一部を構成していることを意味する。
　本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及び非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはＤ－又はＬ－アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。
　アミノ酸残基には、αアミノ酸の残基、βアミノ酸の残基、γアミノ酸の残基が含まれる。好ましいアミノ酸残基としては、ＧＧＴ基質のγ―グルタミル基やＤＰＰ４基質のジペプチド（アミノ酸－プロリン）からなるジペプチドなどが挙げられる。
　本明細書において、「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合でつながった構造をいう。
　Ｒ’が結合しているＣ＝Ｏと一緒になって、アミノ酸の一部を構成している場合としては、例えば、上記したγ－グルタミル基のように、アミノ酸の側鎖のカルボキシル基が－ＮＨ２と結合してカルボニル基となりアミノ酸の一部となっている構造が挙げられる。
　本発明の１つの態様において、Ｒ’のアミノ酸の部分構造は、以下のいずれかの式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
＊は、Ｃ＝Ｏと結合する部位を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
　Ｒ１ａは、天然アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）の側鎖を構成する基、非天然アミノ酸（シトルリン、ノルバリンなど）の側鎖を構成する基、置換又は無置換のアルキル基からなる群から選択される。
　＊は、Ｃ＝Ｏと結合する部位を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　Ｒ２ａは、天然アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、リジン、システイン、トレオニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、セリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、プロリン）の側鎖を構成する基、非天然アミノ酸（シトルリン、ノルバリンなど）の側鎖を構成する基、置換又は無置換のアルキル基からなる群から選択される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
は、アミノ基、Ｎアセチル化等されたアミノ基、１つまたは複数のアミノ酸がペプチド結合により連なった構造を表す。
　＊は、Ｃ＝Ｏと結合する部位を表す。
　式（６）において、＊は、Ｂと結合する箇所を表す。
　本発明のもう１つの態様において、蛍光団は、以下の式（７）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
　式（７）において、Ｒ１５～Ｒ１８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基を示す。
　Ｒ１９は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。一価の置換基としては、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基、カルボキシル基等が挙げられる。
　ｓは、０～４の整数であり、ｓが２以上の場合は、各々のＲ１９は同じであっても異なっていてもよい。
　＊は、Ｂと結合する箇所を表す。
　本発明のもう１つの態様は、蛍光団は、以下の式（８）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　式（８）において、Ｒ２０は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表す。一価の置換基としては、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基、カルボキシル基等が挙げられる。
　ｍ’は、０～３の整数であり、ｍ’が２以上の場合は、各々のＲ２０は同じであっても異なっていてもよい。
　Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）である。
　Ｒ２３及びＲ２４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）である。
　ここで、Ｒ２１～Ｒ２４に－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２を導入し、その４か所のカルボキシ基をアセトキシメチルエステル化 (通称ＡＭ化)することで、細胞膜透過性を付与し、細胞内でＡＭ基が細胞内エステラーゼによる加水分解を受けるとカルボキシ基が生じ細胞膜不透過性となる事で細胞内滞留性を獲得することができる。さらに、加水分解後には細胞内全体に分布する為、より明瞭なイメージングが可能になる。
　Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ９Ｒ１０である。
　ここで、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基である。Ｒ９及びＲ１０が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ９及びＲ１０が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
　Ｒ９又はＲ１０がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　Ｙ’及びＺ’は、（ＯＲｄ、ＯＲｅ）又は（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み合わせである。
　Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、水素原子、アシル基（例えば、アセチル基）又は酵素標識部位である。酵素標識部位は、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドから選択される。
　糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドについては、式（６）で詳述した通りである。
　Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。
　Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基である。
　ここで、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つは、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドから選択される酵素標識部位であってもよい。
　Ｒ’のアミノ酸の部分構造については、式（６）で詳述した通りであり、式（８）の蛍光団についても式（６）で説明したのと同様の構造を有することができる。
　Ｙ’及びＺ’が、（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み合わせであり、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つが、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドである場合は、Ｒ２１～Ｒ２４の１つは、－ＣＨ２Ｆであってもよい。
　Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つである酵素認識部位ががん細胞特異的な酵素活性によってその一部が切断されることにより、ベンゼン環から脱離する脱離基として作用し、その結果、キノンメチドが形成される。キノンメチドが形成されると、蛋白質などの細胞内求核種と反応してラベル化されることで、がん細胞内に滞留することが可能である。
　＊は、Ｂと結合する箇所を表す。
　本発明の可視化方法に用いることができる一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩の非限定的例を以下に示すが、本発明の可視化方法に用いる一般式（ＩＩ）の化合物がこれらに限定されるわけではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
　一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
　一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、本発明においては、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体なども用いることができる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物と一般式（ＩＩ）で表される化合物の細胞又は組織への導入は、これら化合物を、予め、別々に、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこれらの溶液を添加することにより行うことができる。
　また、一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブは、適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物を細胞又は組織へ導入する工程と、一般式（ＩＩ）で表される化合物を細胞又は組織へ導入する工程は、一緒に行ってもよく、いずれか一方を先に行ってもよいが、細胞に取り込まれる前にＣｌｉｃｋ反応を起こしてしまう可能性があるため、両化合物を混合物として同時に投与しないのが望ましい。一般式（Ｉ）で表される化合物と一般式（ＩＩ）で表される化合物の細胞又は組織への導入は順番に行うのが好ましく、その順序はいずれの工程を先に行ってもよい。
　例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物をプレインキュベーション（例えば、３０分間ＨＢＳＳ中でプレインキュベーション）→洗浄（washout）→一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを後から添加、の順序で行ってもよい。
　また、一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブをプレインキュベーション（例えば、ＨＢＳＳ中でプレインキュベーション）→洗浄（washout）→一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を後から添加、の順序で行ってもよい。
　ただし、一般式（Ｉ）で表される化合物を先に細胞又は組織へ導入する方が、一般に、高い細胞内蛍光強度を示す傾向があることから好ましい。特に、一般式（Ｉ）で表される化合物がトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）系の場合は、一般式（Ｉ）で表される化合物をプレインキュベーションし、その後、一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを添加する順序で行う方が高い細胞内蛍光強度を示すことから好ましい。
　即ち、本発明の可視化方法の好ましい側面においては、（ａ）の工程が（ｂ）の工程より先に行われる。
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩をプレインキュベーションする時間や、一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを添加してインキュベーションする時間は、これら化合物の種類等によって適宜定めることができるが、例えば、ＴＣＯ－Ｋをプレインキュベーション→５Ｔｚ－ＴＭＲをインキュベーションの順番で行う場合は、インキュベーション時間は５－１５分程度、プレインキュベーション時間は１５分以上程度が好ましい。
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を細胞又は組織に添加する濃度は、測定する細胞等の種類や測定条件等に応じて適切に定めることができる。
　本発明の可視化方法は、（ｃ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む。
　ここで、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩との反応は、以下で模式的に記載する、テトラジンとジエノフィル化合物との歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）を利用するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
は、ジエノフィル化合物を表す。
　なお、上記の反応式ではジエノフィル化合物として二重結合を有するもの（上記した一般式（Ａ）で表されるタイプ）についての反応を示したが、ジエノフィル化合物として三重結合を有するもの（上記した一般式（Ｂ）で表されるタイプ）を用いた場合についても、基本的には同様に反応は進行する。
　一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は、蛍光団にテトラジンが結合しているため、蛍光が消光又は減弱しているが、テトラジン部分が一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩のジエノフィル基と反応することにより、蛍光団由来の蛍光が発せられるか、あるいは増強される。
　理論に拘束されることを意図するものではないが、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、ＬＡＴ１の基質となることから、好ましくは、がん細胞又は組織に選択的に取り込まれ、また、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩は細胞内に取り込まれ、両者はがん細胞又は組織で出会って反応し、これにより、蛍光が発せられるか、あるいは、蛍光が増強される。
　ここで、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、以下の一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される化合物又はその塩が生成すると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　ここで、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩において、Ｄが上記の一般式（Ａ）で表される場合（二重結合を有するタイプ）の場合は、一般式（ＩＩＩａ）で表される化合物又はその塩が生成し、Ｄが上記の一般式（Ｂ）で表される場合（三重結合を有するタイプ）の場合は、一般式（ＩＩＩｂ）で表される化合物又はその塩が生成すると考えられる。
　一般式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）において、Ｒ１、Ｌ、Ａは、一般式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ２、Ｂ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
は、一般式（ＩＩ）で定義した通りであり、Ｒは、一般式（Ａ）で定義した通りである。
　本発明の可視化方法の好ましい態様において、ジエノフィル基は、上記した式（１）～（５）から選択され、この場合、テトラジン部分と反応した後のジエノフィル基部分は、式（１）～（５）で二重結合部分が単結合に、三重結合部分が二重結合なった以下で表される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　即ち、本発明の可視化方法の１つの側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される化合物又はその塩を生成する工程を含む。上記した通り、Ｄとして一般式（Ａ）で表されるジエノフィル基を用いるか、一般式（Ｂ）で表されるジエノフィル基を用いるかにより、一般式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）のいずれかの化合物が生成する。
　また、本発明の可視化方法のもう１つの側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される化合物又はその塩を生成し、当該化合物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む。
　本発明の可視化方法の対象となるがん細胞又はがん組織の種類として、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんの細胞又は組織が挙げられる。
　本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。
　「組織」の用語は臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。がん組織としてはＬＡＴ１を高発現している組織が好ましい。
　本発明の可視化方法は、さらに蛍光イメージング手段を用いて蛍光応答を観測することを含む。蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、がん細胞又は組織を瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。なお、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記測定対象試料と蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
　本発明のもう１つの実施態様は、がんを検知する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を被検体の臨床検体に適用する工程、（ｂ）一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を含む蛍光プローブを被検体の臨床検体に適用する工程、及び（ｃ）一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩と一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とが臨床検体で反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、（ａ）の工程と（ｂ）の工程を行う順序は、いずれの工程を先に行ってもよい、該方法である（以下「本発明の検知方法」とも言う）。
　本発明の検知方法においては、好ましくは、（ａ）の工程が（ｂ）の工程より先に行われる。
　（ａ）及び（ｂ）の工程で、夫々、式（Ｉ）の化合物及び蛍光プローブを臨床検体に適用するには、例えば、化合物、蛍光プローブの各溶液を局所的に臨床検体にスプレーすることによって行うことができる。
　本発明の検知方法は、さらに上記した蛍光イメージング手段を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。
　また、本発明の検知方法の１つの側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とが臨床検体中のがん細胞又は組織内で反応することにより、一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される化合物又はその塩を生成する工程を含む。
　また、本発明の検知方法のもう１つの側面は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とが臨床検体中のがん細胞又は組織内で反応することにより、一般式（ＩＩＩａ）又は（ＩＩＩｂ）で表される化合物又はその塩を生成し、当該化合物から発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含む。
２．蛍光プローブ
　本発明のもう１つの態様は、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む、がん細胞又は組織を可視化するために用いられる蛍光プローブであって、当該化合物又はその塩と以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とはがん細胞又は組織内で反応することにより、蛍光が発せられる又は増強される、該蛍光プローブである（以下「本発明の蛍光プローブ」とも言う）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
　一般式（ＩＩ）におけるＢ、Ｒ２、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
は、本発明の可視化方法で詳述したのと同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
　一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｌ、Ａ、及びＤは、本発明の可視化方法で詳述したのと同様である。
　本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに一般式（ＩＩ）の化合物又はその塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
　また、本発明の蛍光プローブ中の一般式（ＩＩ）の化合物の濃度は、測定する細胞等の種類や測定条件等に応じて適切に定めることができる。
　本発明のもう１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、及び以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブを含む、がん細胞又は組織の検出用キットである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
　一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｌ、Ａ、及びＤは、本発明の可視化方法で詳述したのと同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　一般式（ＩＩ）におけるＢ、Ｒ２、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
は、本発明の可視化方法で詳述したのと同様である。
　当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブ及び一般式（Ｉ）の化合物は溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
　また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
　本発明のキットは、がんを診断するために使用することができる。
　また、本発明のもう１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩、及び以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩との組み合わせを含む、がんの診断薬である（以下「本発明の診断薬」とも言う）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｌ、Ａ、及びＤは、本発明の可視化方法で詳述したのと同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　一般式（ＩＩ）におけるＢ、Ｒ２、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
は、本発明の可視化方法で詳述したのと同様である。
　本発明の診断薬は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩及び、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩を、これらを混合して含むものではなく、これらを別々に含むものである。本発明の診断薬は、上記した本発明の可視化方法や本発明の検知方法を行う場合に、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩を、夫々、別々に、がん細胞又は組織、あるいは、臨床検体に適用又は投与することにより使用される。
　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩、一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩のいずれを先に、がん細胞又は組織、あるいは、臨床検体に適用又は投与してもよいが、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその医薬的に許容可能な塩を先に適用又は投与するのが好ましい。
　本発明の診断薬は、一般式（Ｉ）で表される化合物、及び一般式（ＩＩ）で表される化合物のみならず、これらの塩又はそれらの溶媒和物若しくは水和物を含むものであってもよい。塩としては、医薬的に許容される塩であれば特に限定されないが、例えば、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などを例示することができる。
　溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　本発明の診断薬において、通常、一般式（Ｉ）の化合物、一般式（ＩＩ）で表される化合物は溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
　本発明の診断薬の対象となるがんの種類として、肺がん、前立腺がん、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳腫瘍、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、肝がん、膵がん、頭頚部がん、腎がん、白血病、皮膚がん、甲状腺がんの細胞又は組織が挙げられる。
　本発明の診断薬は、生体内、生体外のいずれでも使用することができるが、手術中に生体外において、がん細胞又は組織、あるいは、臨床検体に使用することが好ましい。
３．本発明の化合物
　本発明のもう１つの実施態様は、以下の式で表される化合物又はその塩である（以下「本発明の化合物」とも言う）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　本発明の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、トリフルオロ酢酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
　本発明の化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、本発明の化合物を製造することができる。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．略語の説明
ＢＣＮ：ビシクロ［６．１．０］ノニン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ：ダルベッコの改良イーグル培地
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化　
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＨＢＳＳ：ハンクの平衡塩類溶液
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＭＳ：高分解能質量分析
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭＰＬＣ：中圧液体クロマトグラフィー
ＭＳ：質量分析
ＮＭＲ：核磁気共鳴
Ｏ／Ｎ：一晩
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水　
ＰＳ：ペニシリン－ストレプトマイシン
ＲＯＩ：関心領域
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所培地
ＲＴ－ｑＰＣＲ：定量的逆転写ＰＣＲ法
ｒ．ｔ．：室温　
Ｓ／Ｎ：シグナル／ノイズ
ＳＰＩＥＤＡＣ：歪み促進逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ環化付加
ＴＥＡＡ：トリエチルアミンアセテート
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸　
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＭＲ：テトラメチルローダミン
Ｔｚ：テトラジン
ＵＰＬＣ－ＭＳ：超高性能液体クロマトグラフィー質量分析
ＵＶ－ＶＩＳ：紫外－可視
原料と一般手順
　試薬と溶媒は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ、東京化成工業、和光純薬、関東化学、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、入手可能な最高グレードのものを追加精製せずに使用した。
　反応は、ＴＬＣ（ＴＬＣ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ）またはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ－ＭＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ．）によってモニターした。
利用機器
　ＮＭＲスペクトルの取得にはＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＬＡ４００を利用し、１Ｈ－ＮＭＲは４００ＭＨｚで測定した。
　ＭＳスペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ ＡｃｃｕＴｏＦ（ＥＳＩ）を用いて測定した。
　逆相ＨＰＬＣ精製は、カラムとしてＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３　１０mm×２５０ｍｍ (ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）、ポンプ（ＰＵ－２０８０，ＪＡＳＣＯ）、検出器（ＭＤ－２０１５，ＪＡＳＣＯ）から成るＨＰＬＣシステムを用いて、移動相Ａ（酸性ＨＰＬＣでは０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）含有Ｈ２Ｏ、中性ＨＰＬＣでは０．１％ＴＥＡＡ含有Ｈ２Ｏ）と移動相Ｂ（酸性ＨＰＬＣでは２０％Ｈ２Ｏと０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）含有アセトニトリル、中性ＨＰＬＣでは２０％Ｈ２Ｏと０．１％ＴＥＡＡ（ｖ／ｖ）含有アセトニトリル）を使用した。また、化合物の精製操作には、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８ ３０ｇ（Ｂｉｏｔａｇｅ）から構成されている逆相フラッシュクロマトグラフィー　ＩｓｏｌｅｒａＴＭ　Ｏｎｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ）と、シリカゲルカラム（シリカゲル４０μｍ、山善）を用いた順相フラッシュクロマトグラフィー（ＥＰＣＬＣ ＡＩ－５８０Ｓ、山善)も利用した。
　ＵＰＬＣ－ＭＳ分析は、逆相カラム（ＯＤＳ，１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）にＵＶ－ＶＩＳ検出器（２０５０１５０１７、Ｗａｔｅｒｓ）とＱＤａ質量分析計システム（１７６００３２０８、Ｗａｔｅｒｓ）を搭載したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ－ＭＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｉｎｃ．）を用いて、移動相Ａ　（酸性条件では１０ｍＭギ酸含有Ｈ２Ｏ、中性条件では１０ｍＭギ酸アンモニウム含有Ｈ２Ｏ）と移動相Ｂ（酸性条件では２０％Ｈ２Ｏと１０ｍＭギ酸含有アセトニトリル、中性条件では２０％Ｈ２Ｏと１０ｍＭギ酸アンモニウム含有アセトニトリル）を使用して流速０．８ｍＬ／ｍｉｎで行った。
　化合物４、５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧの合成については、ＮＭＲスペクトルの取得にはAVANCE III 400 Nanobay (Bruker)を利用し、１Ｈ－ＮＭＲは４００ＭＨｚで測定した。
　ＭＳスペクトルは、MicroTOF (Bruker, ESI-TOF)を用いて測定した。
　逆相ＨＰＬＣ精製は、カラムとしてInertsil ODS-3 20 mm x 250 mm(ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）、またはInertsustain C18 4.6 mm x 150 mm(ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）、ポンプ（ＰＵ－２０８０、またはPU-2087，ＪＡＳＣＯ）、検出器（MD-2010，ＪＡＳＣＯ）から成るＨＰＬＣシステムを用いて、移動相Ａ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）と１％アセトニトリル含有Ｈ２Ｏ）と移動相Ｂ（０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）と１％Ｈ２Ｏ含有アセトニトリル）を使用した。また、化合物の精製操作には、シリカゲルカラム（シリカゲル４０μｍ、山善）を用いた順相フラッシュクロマトグラフィー（YFLC AI-580、山善)も利用した。
分光光度計によるＳＰＩＥＤＡＣ活性化の測定
　蛍光スペクトルは、Ｆ７１００（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて取得した。スペクトル測定時のスリット幅は励起・蛍光ともに５ｎｍ、ホトマル電圧は４００Ｖとした。蛍光スペクトルは、励起波長は４８０ｎｍ（５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧ）または５４０ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）で測定し、溶媒はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ｐＨ７．４、１％以下のＤＭＳＯを含む）を用いた。また、５Ｔｚ－ＴＭＲを用いた単波長測定では、励起波長５５６ｎｍ、検出波長５８０ｎｍを利用し、溶媒はＰＢＳ（ｐＨ７．４、０．２％のＤＭＳＯを含む）を用いた。
ＵＰＬＣでのＳＰＩＥＤＡＣの反応追跡
　ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解したＴｚ色素５０μＭか１００μＭに対して、１０当量のジエノフィル－アミノ酸を添加して１時間室温でインキュベーション前後のＵＰＬＣ－ＭＳチャートを測定した。移動相は、５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ及び５Ｔｚ－ＴＧについては中性条件、５Ｔｚ－ＴＭＲについては酸性条件でグラジエントをかけて測定した。
細胞培養
　Ａ５４９細胞、ＨＴ－２９細胞は１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｗｅｓｔ）、１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、５％ＣＯ２環境下で培養した。また、Ｈ４６０細胞、ＳＨＩＮ３細胞、ＳＫＯＶ３細胞は、１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｗｅｓｔ）、１％ＰＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、５％ＣＯ２環境下で培養した。
共焦点顕微鏡によるジエノフィル導入アミノ酸とＴｚ導入色素を用いた蛍光イメージングの一般手順
　Ａ５４９細胞を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで８－ｗｅｌｌ　ｃｈａｍｂｅｒ（ｉｂｉｄｉ）に撒き、１－２日培養した。培地を除去し、ＨＢＳＳ（ｗａｋｏ）　で１回洗浄後、ジエン色素（５Ｔｚ－ＴＭＲ：１μＭ）またはジエノフィルアミノ酸　（ＢＣＮ－ｐＡＰ、ＢＣＮ－ＡＡ：５０μＭまたは１００μＭ、ＴＣＯ－Ｋ、ＢＣＮ－Ｋ：１００μＭ）とＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（商標） ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを含むＨＢＳＳ（１％以下ＤＭＳＯ含有）でプレインキュベーションした。ＨＢＳＳ溶液を除去し、ＨＢＳＳで１回洗浄後にジエン色素（５Ｔｚ－ＴＭＲ、５Ｔｚ－ＴＧ：１μＭ）またはジエノフィルアミノ酸（ＢＣＮ－ｐＡＰ：５０μＭ）を含むＨＢＳＳ（１％以下ＤＭＳＯ含有）を加え、共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ８、Ｌｅｉｃａ）の３７℃に保温したステージにセットし、細胞内蛍光強度の経時変化を観察した。ＬＡＴ１の基質能を調べる際は、ジエノフィル導入アミノ酸のインキュベーション時に同時にＢＣＨ（５ｍＭ）またはＪＰＨ２０３（５μＭ）を添加した。また、詳細な実験手順については各図のプロトコルに記載した。
共焦点顕微鏡の設定は以下の通り。
　対物レンズ：４０ｘ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｌｅｎｓ（ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ４０ｘ／１．３０ ＯＩＬ、Ｌｅｉｃａ）、励起波長：４０５ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（商標） ３３３４２）、４７６ｎｍ（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）、４８８ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＧ）、５６１ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）、５９４ｎｍ（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標） Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ）、検出波長：４２０－４８０ｎｍ（Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（商標） ３３３４２）、４９０－５２０ｎｍ（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）、５００－５５０ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＧ）、６１０－６６０ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸ）
Ｔz導入色素の細胞内挙動の評価
　Ａ５４９細胞を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで８－ｗｅｌｌ　ｃｈａｍｂｅｒ（ｉｂｉｄｉ）に撒き、１－２日培養した。培地を除去し、ＰＢＳ（ｗａｋｏ）で１回洗浄後、ＰＢＳを添加し、顕微鏡のステージにセットした。細胞の自家蛍光を撮像後、ジエン色素（５Ｔｚ－ＴＭＲ、５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧ：１μＭ）を添加した。１０分間インキュベート後撮像し、ＰＢＳで２回洗浄後に再度撮像した。
共焦点顕微鏡の設定は以下の通り。
　対物レンズ：６３ｘ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｌｅｎｓ（ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ＣＳ２　６３ｘ／１．４０ ＯＩＬ、Ｌｅｉｃａ）、励起波長　４８８ｎｍ（５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧ）、５６１ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）、検出波長：５２６－６００ｎｍ（５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧ）、６１０－６６０ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）
Ｔz－ＴＭＲの細胞内局在評価
　Ａ５４９細胞を４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで８－ｗｅｌｌ　ｃｈａｍｂｅｒ（ｉｂｉｄｉ）に撒き、３日培養した。培地を除去し、ＨＢＳＳで１回洗浄後、１μＭ ５Ｔｚ－ＴＭＲを含むＨＢＳＳで６０分間プレインキュベーションした。ＨＢＳＳ溶液を除去し、新たにオルガネラ染色試薬（ＥＲ－Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ ＤＰＸ：５μＭ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６：１μＭ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ：０．５μＭ、いずれもｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＨＢＳＳを添加し、共焦点顕微鏡で３７℃保温下で細胞を観察した。取得した共染色画像について、ＩｍａｇｅＪ　Ｆｉｊｉで局在を評価した。共焦点顕微鏡の設定は以下の通り。
　対物レンズ：６４ｘ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓ（ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ６４ｘ／１．４０ ＯＩＬ、Ｌｅｉｃａ）、励起波長：４０５ｎｍ（ＥＲ－Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ ＤＰＸ）、４８８ｎｍ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６）、５６１ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）、６３１ｎｍ（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ）、検出波長：４１５－４９０ｎｍ（ＥＲ－Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ－Ｗｈｉｔｅ ＤＰＸ）、００－５２０ｎｍ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＤＮＤ－２６）、６００－６６０ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）、６４０－６６０ｎｍ（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭ）
細胞内滞留性評価
　上述の細胞イメージングの一般手順に従って、Ａ５４９細胞をＴＣＯ－Ｋ溶液でプレインキュベーション、５Ｔｚ－ＴＭＲ溶液で３０分間インキュベーション後に、共焦点顕微鏡のステージ上でＨＢＳＳ溶液を除去し、ＨＢＳＳで２回洗浄して新鮮なＨＢＳＳに置換後、３０分間細胞内蛍光強度を観察した。３０分後に再度同じ洗浄・置換操作を行い、再度３０分間細胞内蛍光強度を観察した。
ＲＴ-ｑＰＣＲ
　ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ （ＳＣＱ-401, ＴＯＹＯＢＯ） と ＲＮＡ-ｄｉｒｅｃｔＴＭ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＲＴ-201, ＴＯＹＯＢＯ） を用いて、細胞の溶解、逆転写、ｑＰＣＲをメーカーの説明書に従って実施した。定量的リアルタイムＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ 480 Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用い、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ΔΔＣｔ法により実施した（ｎ＝３）。
ヒトＧＡＰＤＨセンス鎖：5‘- ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ -3’
ヒトＧＡＰＤＨアンチセンス鎖：5‘- ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ-3’
ヒトＬＡＴ1（ＳＬＣ7Ａ5）センス鎖：5‘- ＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＴＡＣＴＴＣ -3’
ヒトＬＡＴ1 （ＳＬＣ7Ａ5） アンチセンス鎖：5‘- ＡＡＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡ -3’
細胞内蛍光強度の定量解析
　細胞内蛍光強度の定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊ Ｆｉｊｉで行った。図１１ｂ、図１２、図１３、図１５については、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭの染色増より、細胞の存在する領域について手動でＲＯＩを設定し（図１１ｂ、図１３、図１５：ｎ＝１０、図１２：ｎ＝５）、ＲＯＩ内の平均蛍光強度を各条件について平均化した。図９ｂについては、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸの染色像からＲＯＩを自動で設定後（ｎ＝７２：ＪＰＨ２０３（－）、ｎ＝２８：ＪＰＨ２０３（＋））、各ＲＯＩの平均蛍光強度を平均化した。図１４については、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭの染色像から画像内の細胞の存在する領域を全てＲＯＩとして取得し、このＲＯＩについて５Ｔｚ－ＴＭＲの蛍光強度を定量後、全ＲＯＩ面積あたりの平均蛍光強度を画像ごとに取得した。
［合成実施例１］
（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－（（（（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）フェニル）プロパン酸（化合物Ａ：ＢＣＮ－ｐＡＰ）の合成
　以下の反応スキームにより、化合物Ａ（ＢＣＮ－ｐＡＰ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチルスクシンイミジルカーボネート（１０．０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）とＦｍｏｃ－４－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン（１３．８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（１２０μＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（１１．８μＬ、０．０６８ｍｍｏｌ）を添加し、室温で９．５時間攪拌した。ＵＰＬＣ－ＭＳで原料の消失と目的物の生成を確認し、攪拌を停止した。酸性ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥後の白色粉末を脱水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解させ、ピペリジン（１００μＬ）を添加し、室温で３０分攪拌した。ＵＰＬＣ－ＭＳで原料の消失と目的物の生成を確認し、攪拌を停止した。中性ＨＰＬＣと続く酸性ＨＰＬＣで精製後に凍結乾燥し、ＢＣＮ－ｐＡＰの白色固体を得た（１．８５ｍｇ、収率１５％）。なお、凍結乾燥の直前には化合物の分解を防ぐため、アンモニア水でｐＨを７以上に調整した。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ7.42 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.23 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.11 (dd, J = 7.8, 5.0 Hz, 1H), 3.22-3.25 (m, 1H), 3.04 (dd, J = 14.6, 8.2 Hz, 1H), 2.13-2.28 (m, 6H), 1.58-1.67 (m, 2H), 1.39-1.47 (m, 1H), 0.94-0.98 (m, 2H). HRMS (ESI+): Calcd. For [M+Na]+ , 379.16338, Found, 379.16308 (-0.30 mDa)
［合成実施例２］
（Ｓ）－２－アミノ－３－（（（（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物Ｂ：ＢＣＮ－ＡＡ）の合成
　以下の反応スキームにより、化合物Ｂ（ＢＣＮ－ＡＡ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチルスクシンイミジルカーボネート（７．００ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）とＮ－α－Ｆｍｏｃ－Ｌ－２，３－ジアミノプロパン酸（８．９７ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ（９０．４μＬ）に溶解させ、ＤＩＥＡ（９．４７μＬ、０．０５４ｍｍｏｌ）を添加し、室温で終夜攪拌した。ＵＰＬＣ－ＭＳで原料の消失と目的物の生成を確認し、攪拌を停止した。酸性ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥後の白色粉末を脱水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解させ、ピペリジン（１００μＬ）を添加し、室温で４０分攪拌した。ＵＰＬＣ－ＭＳで原料の消失と目的物の生成を確認し、攪拌を停止した。中性ＨＰＬＣと続く酸性ＨＰＬＣで精製後に凍結乾燥し、ＢＣＮ－ＡＡの白色固体を得た（１．８５ｍｇ、収率２４％）。なお、凍結乾燥の直前には化合物の分解を防ぐため、アンモニア水でｐＨを７以上に調整した。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ 4.16-4.18 (d, J = 8.2Hz, 2H), 4.03 (dd, J = 6.2, 3.9 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 15.1, 3.7 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 15.1, 6.4 Hz, 1H), 2.12-2.27 (m, 5H), 1.57-1.59 (m, 2H), 1.21-1.39 (m, 2H), 0.90-0.95 (m, 2H). HRMS (ESI+): Calcd. For [M+Na]+ , 303.13208, Found, 303.13310 (+1.03 mDa)
［合成例１］
（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタノール（１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　参考文献１を参考に合成した。４－（ヒドロキシメチル）ベンゾニトリル（３０６ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ）、Ｎｉ（ＯＴｆ）２（１６５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（１．２０ｍＬ、２３．１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下０℃で攪拌し、ヒドラジン一水和物（５．２０ｍＬ、１０７ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。６０℃に加熱して終夜攪拌後、室温にして精製水（４．０ｍＬ）に溶解させたＮａＮＯ２（８０５ｍｇ、１１．７ｍｍｏｌ）を滴下し、５分間攪拌した。４Ｍ　ＨＣｌ水溶液を慎重に加え、ｐＨを約１とした。ジクロロメタンで４回抽出後、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を減圧留去した。粗生成物を順相フラッシュクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル）で精製し、乾燥後に化合物１のピンク色固体を得た（１３０ｍｇ、収率２８％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.56-8.59 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.58 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.83 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 3.09 (s, 3H)
４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンズアルデヒド（２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
　参考文献１を参考に合成した。Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎ　Ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ　（３５５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気・氷冷下で化合物１（１１９　ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン溶液（６ｍＬ）を滴下して加えた。室温で１時間攪拌後、ＴＬＣ（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル）で原料の消失を確認し、攪拌を停止した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加えｐＨを９以上とし、続いて飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液を加え室温で３０分間攪拌した。ジクロロメタンで３回抽出後、飽和食塩水で洗浄、Ｎａ２ＳＯ４で脱水・溶媒を減圧留去し、乾燥後に目的物２のピンク色固体を得た（１１３ｍｇ、収率９６％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.15 (s, 1H), 8.78 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 3.14 (s, 3H)
Ｎ－（６－（ジメチルアミノ）－９－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－イリデン）－Ｎ－メチルメタンアミニウム（５Ｔｚ－ＴＭＲ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　化合物２（２９．４ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ｐ－トルエンスルホン酸一水和物（７．０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、３－（ジメチルアミノ）フェノール（４８．９ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下酢酸（１０ｍＬ）を加え、７０℃で終夜攪拌した。ＴＬＣ（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル）で原料の消失を確認し、ｐ－クロラニル（１９．８ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン溶液（１２ｍＬ）を加えた。室温で４時間攪拌後、減圧留去し逆相フラッシュクロマトグラフィー（０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ：０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル）で粗精製後、酸性ＨＰＬＣで精製した。凍結乾燥後、５Ｔｚ－ＴＭＲの紫色固体を得た（４．４ｍｇ、収率６．７％）。参考文献１を参考に１Ｈ－ＮＭＲを帰属した。
1H-NMR (400 MHz, CD3CN) δ 8.76 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 7.00 (dd, J = 9.6, 2.3 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 3.25 (s, 12H), 3.05 (s, 3H). HRMS (ESI+): Calcd. for [M+Na]+ , 437.20898, Found, 437.20432 (-4.67 mDa).
６－アミノ－９－（２，４－ジカルボキシフェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－イミニウム（４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
　化合物３は、参考文献２を参考に合成した。化合物３（４０２ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、キサントホス（１３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＢｏｃＮＨ２（２５３ｍｇ、２．１６ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（５８６ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）、１，４－ジオキサン（４０ｍＬ）をアルゴン雰囲気下１００℃で終夜攪拌した。反応液を室温にし、セライトでろ過後、溶媒を減圧留去した。粗生成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、オレンジ色油状物質を得た。この物質を１０％の水を含むＴＦＡ溶液（１ｍＬ）に溶解させ、室温で攪拌後、溶媒を減圧留去した。粗生成物にアセトニトリル／Ｅｔ２Ｏ混合溶液（１：１）を加え、不溶解物を吸引濾取し、目的物４の赤色固体を得た（１０１ｍｇ、収率３７％）。生成物は参考文献３を参考に目的物と同定した。
［合成例２］
９－（４－（（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）カルバモイル）－２－カルボキシフェニル）－６－アミノ－３Ｈ－キサンテン－３－イミニウム（５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　化合物４（１９．０ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン（１４．２　ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）、Ｏ－（Ｎ－Ｓスミシイミジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、２２．８ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２５．８μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（５ｍＬ）を室温で１２時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、酸性ＨＰＬＣで精製した（Ａ／Ｂ＝９０／１０　ｔｏ　１０／９０　ｉｎ　３０ｍｉｎ、移動相Ａ：１％アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：１％　Ｈ２Ｏ含有アセトニトリル）。凍結乾燥後、５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧのオレンジ色固体を得た（７．８ｍｇ、収率２８％）。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 10.23 (s, 1H), 9.40 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 8.75 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.52 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.23 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.72 (m, 4H), 4.70 (d, J = 5.2 Hz, 2H). HRMS (ESI +): Calcd. for [M+H]+, 544.17278, found, 544.17717 (+4.39 mDa).
［合成例３］
Ｎ－（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）ベンジル）－４－（６－ヒドロキシ－３－オキソ－３Ｈ－キサンテン－９－イル）－３－メチルベンズアミド（５Ｔｚ－ＴＧ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
　化合物５は、参考文献４を参考に合成した。化合物５（７．２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）、（４－（１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）メタンアミン（５．８ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）、Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、９．４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１０．６μＬ、０．０６２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（８ｍＬ）を室温で１２時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、酸性ＨＰＬＣで精製した（Ａ／Ｂ＝９０／１０　ｔｏ　１０／９０　ｉｎ　３０　ｍｉｎ、移動相Ａ：１％アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡ含有Ｈ２Ｏ、移動相Ｂ：１％Ｈ２Ｏ含有アセトニトリル）。凍結乾燥後、５Ｔｚ－ＴＧのオレンジ色固体を得た（３．４ｍｇ、収率３２％）。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 10.24 (s, 1H), 8.51 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.96 (s, 1H), 7.90 (dd, J = 1.6 Hz, 8.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 1.6 Hz, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 6.95 (dd, J = 2.4 Hz, 9.2 Hz, 2H), 4.69 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 2.04 (s, 3H). HRMS (ESI +) Calcd. for [M+H]+, 516.16718 ; found, 516.16562 (-1.55 mDa).
参考文献
１．A. Wieczorek, P. Werther, J. Euchner, R. Wombacher, Green- to far-red-emitting fluorogenic tetrazine probes - synthetic access and no-wash protein imaging inside living cells, Chem. Sci. 8, 1506-1510 (2017).
２．C.K. Spahn, M. Glaesmann, J.B. Grimm, A.X. Ayala, L.D. Lavis, M. Heilemann, A toolbox for multiplexed super-resolution imaging of the E. coli nucleoid and membrane using novel PAINT labels, Sci. Rep. 8, 14768 (2018).
３．C. Grang, L. Bin, T. Ying, W. Ya, A Rapid and Eco-friendly Synthesis of 5(6)-Carboxy-Rhodamine 110 Isomers, Iran, J. Chem. Chem. Eng. 29, 73-76 (2010).
４．T. Mineno, T. Ueno, Y. Urano, H. Kojima, T. Nagano, Creation of superior carboxyfluorescein dyes by blocking donor-excited photoinduced electron transfer, Org. Lett. 8, 5963-5966 (2006).
［実施例１］
　上記で合成した化合物を用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで反応が進行するか、細胞内でもＳＰＩＥＤＡＣによる色素のａｃｔｉｖａｔｉｏｎが起こるかを確認した。
　まず、ＢＣＮ－ｐＡＰとＢＣＮ－ＡＡとジエン色素のＣｌｉｃｋ反応速度をＰＢＳ（－）中、蛍光計で評価した。また、５Ｔｚ－ＲＧ、５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧについては以下に示す参考化合物である市販のジエノフィルとの反応性も併せて評価した。結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
　図２は、合成例１～３で合成した３種類の色素と種々のジエノフィルの反応性を調べた結果である。測定条件は以下の通りである。スリッド：５nｍ、５nｍ　ホトマル電圧４００Ｖ、Ｅｘ．４８０ｎｍ（５Ｔｚ－２ＣＯＯＨ－ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧ）、５４０ｎｍ（５Ｔｚ－ＴＭＲ）　
　なお、スペクトルの０ｍｉｎはジエノフィル添加前を表し、基本的には２ｍｉｎごと２０ｍｉｎ間の蛍光スペクトルの時間変化を取得した。
　図２から、いずれの色素においても、ＴＣＯは大体１０分以内に反応が完了した。ＢＣＮはＴＣＯほど速くはないが、分スケールで反応が進行することが分かる。
　また、合成実施例で合成した本発明の化合物であるジエノフィル－アミノ酸について見ると、いずれの色素においても反応は分スケールで進行した。
　なお、ＳＰＩＥＤＡＣにおいてはテトラジンが電子不足で立体障害が少ないほど、またジエノフィルとしてはアルケン・アルキン側の歪みが大きいほど反応速度は大きくなる傾向が知られるが、今回検討した化合物についても同様の傾向が見られた。
　次に、蛍光計で観測された蛍光のａｃｔｉｖａｔｉｏｎが、添加したジエンとジエノフィルによるＳＰＩＥＤＡＣによるものなのか確認する為、ＵＰＬＣ－ＭＳを用いて反応生成物の解析を行った（図３）。
　この結果、いずれのジエン色素においてもジエン色素のシグナルの減少とＳＰＩＥＤＡＣにより生成すると想定される構造の化合物と同一のＭ／Ｚシグナルを確認し、反応性の差異はあるが、目的のＳＰＩＥＤＡＣが問題なく進行していることが示唆された。
［実施例２］
培養細胞での検討
（１）Ｃｌｉｃｋ反応前の色素の細胞内への取り込みの確認
　Ｔｚを導入した色素は蛍光が消光されているものの、蛍光顕微鏡を用いれば細胞内への集積・局在などは確認できると考え、Ｔｚ導入色素を細胞に添加し蛍光イメージングを行った（図４）。図４に、簡略化した実験プロトコルと、５Ｔｚ－ＴＭＲ、５Ｔｚ-2ＣＯＯＨ-ＲＧ、５Ｔｚ－ＴＧを添加したＡ５４９細胞のイメージング像を示す。
　色素添加前の自家蛍光を見ると、５Ｔｚ－ＴＭＲの観察波長においては自家蛍光が低く、また、色素添加後および洗浄操作後の、細胞内・細胞外の蛍光強度が高いことから、５Ｔｚ－ＴＭＲは細胞内に集積していると考えられた。５Ｔｚ-2ＣＯＯＨ-ＲＧにおいては、色素添加前後で細胞内蛍光強度はほとんど変化しなかったことから、細胞膜透過性が低いことが示唆された。また、５Ｔｚ－ＴＧは細胞に取り込まれるものの、ｗａｓｈｏｕｔ後に蛍光強度が下がることから細胞内への滞留性は低いと考えられた。そこでまず、５Ｔｚ－ＴＭＲを細胞膜透過性・細胞内滞留性を有するジエン色素として選定し、さらに検討を行った。
（２）ＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＭＲを用いたイメージング
　次に、ＬＡＴ１高発現肺がん由来培養細胞であるＡ５４９細胞にＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＭＲを適用し、ＢＣＮ－ｐＡＰがＬＡＴ１を介して５Ｔｚ－ＴＭＲと細胞内でＳＰＩＥＤＡＣを起こすか確認した。まず５Ｔｚ－ＴＭＲをプレインキュベーション→ｗａｓｈｏｕｔ→ジエノフィル導入アミノ酸を後から添加、の条件でイメージングを行い、ＬＡＴの阻害剤ＢＣＨの有無で細胞内蛍光強度を比較した。
　図５ａに試験のプロトコルを示す。また、図５ｂに、５Ｔｚ－ＴＭＲをプレインキュベーション後、ＢＣＮ－ｐＡＰを添加したＡ５４９細胞のＨＢＳＳ中でのイメージング試験（ＬＡＴ阻害剤としてＢＣＨを利用）の結果を示す。スケールバーは５０μｍである。
　図５ｂに示すように、ＢＣＮ－ｐＡＰ（＋）ＢＣＨ（－）の条件でのみ細胞内蛍光強度が経時的に上昇する様子が見られ、ＢＣＮ－ｐＡＰがＬＡＴを介してＡ５４９細胞に取り込まれていることが示唆された。
　次に、ＬＡＴ１の選択的な阻害剤であるＪＰＨ２０３を用いてイメージングを行った。
　図６ａに試験プロトコルを示し、図６ｂに、５Ｔｚ－ＴＭＲをプレインキュベーション後、ＢＣＮ－ｐＡＰを添加したＡ５４９細胞のＨＢＳＳ中でのイメージングした結果を示す。スケールバーは５０μｍである。
　その結果、図５ｂに比べて阻害剤の有無での蛍光強度差は低いように見えるが、ＢＣＨ（２段目）、ＪＰＨ２０３（３段目）を添加した条件で細胞内蛍光強度は低くなり、ＢＣＮ－ｐＡＰはＬＡＴ１の基質となりＡ５４９に取り込まれていることが示唆された。
（３）ジエノフィル－アミノ酸と色素の添加順序の検討
　マウスでの検討や実際の生体サンプルへの使用を考えた際、アミノ酸側を先に投与し、ＬＡＴ１を介してがんに集積させておいて色素を散布するという順番が使いやすいと考えられる。そこで次に、図５ａ、６ａと添加する順番を逆にし、ジエノフィルアミノ酸（ＢＣＮ－ｐＡＰ）をプレインキュベーション→ｗａｓｈｏｕｔ→５Ｔｚ－ＴＭＲを後から添加・イメージングを行った（図７ａ）。図７ｂは、ＢＣＮ－ｐＡＰをプレインキュベーション後、５Ｔｚ－ＴＭＲを添加したＡ５４９細胞のＨＢＳＳ中でのイメージングの結果である。スケールバーは５０μｍである。
　その結果、図６ｂと同様にＬＡＴの阻害剤を添加しない条件で細胞内蛍光強度が上昇し、色素を後から添加する条件においてもＢＣＮ-ｐＡＰと5Ｔｚ-ＴＭＲがＬＡＴ１によるＢＣＮ－ｐＡＰの取り込み依存的にＡ５４９細胞を可視化できることが示唆された。
（４）ジエン色素５Ｔｚ－ＴＭＲの細胞内局在の検討
　細胞内でＣｌｉｃｋ反応を効率よく惹起する為にはジエンとジエノフィルの局在を揃えることが重要だと考えられる。そこで５Ｔｚ－ＴＭＲについて、その細胞内局在を、各種オルガネラｔｒａｃｋｅｒ　ｄｙｅとの共染色により調べた（図８ａ及び８ｂ）。その結果、プローブ由来の蛍光シグナルの局在はＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒと最もよく一致したため、５Ｔｚ－ＴＭＲはミトコンドリアに集積していると考えられた。ローダミン系色素はミトコンドリアに集積しやすいことが知られているため、合理的な結果だと考えられる。
　図８ａに試験のプロトコルを示す。図８ｂは、５Ｔｚ－ＴＭＲとＥＲ、Ｌｙｓｏ、　ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒの共染色像である。２Ｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｈｉｓｔｇｒａｍはＩｍａｇｅＪ Fijiでそれぞれのｃｈを展開後Ａｎａｌｙｚｅ
－＞　Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ－＞　Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄで解析した。スケールバーは５０μｍである。
［実施例３］
ＢＣＮ－ｐＡＰと５Ｔｚ－ＴＧの検討
　５Ｔｚ－ＴＧを用いて、ＢＣＮ－ｐＡＰとのイメージングを行った。その結果、ＬＡＴ１阻害剤の有無でＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸから定めた細胞のＲＯＩにおいて細胞内蛍光強度に差はついた。
　図９ａに試験プロトコロを示す。図９ｂは、ＢＣＮ－ｐＡＰをプレインキュベーション後、５Ｔｚ－ＴＧを添加したＡ５４９細胞のｉｍａｇｉｎｇ結果である。右図の定量値については、ＩｍａｇｅＪ Ｆｉｊｉ上でＣｅｌｌｔｒａｃｋｅ
ｒ（商標）Ｒｅｄ ＣＭＴＰＸの蛍光が見られた領域をＲＯＩとして設定し、５Ｔｚ－ＴＧのチャンネルについて蛍光強度を定量した。スケールバーは５０μｍである。
［実施例４］
ＢＣＮ－Ｋ、ＴＣＯ－Ｋを用いた検討
　色素骨格として５Ｔｚ－ＴＭＲを用いて、ジエノフィルとしてＢＣＮ、ＴＣＯにＬ－Ｌｙｓｉｎｅを導入した化合物ＢＣＮ－Ｋ、ＴＣＯ－Ｋについて、５Ｔｚ－ＴＭＲとの反応性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した。両化合物の構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
　ここでＢＣＮ－Ｋは、ＢＣＮ－ｐＡＰがｅｎｄｏ体のＢＣＮを用いていたのに対し、ｅｘｏ体を用いている。ＢＣＮ－Ｋ、ＴＣＯ－Ｋはいずれも市販品を購入して用いた。
　これらのジエノフィル導入アミノ酸について、５Ｔｚ－ＴＭＲとの反応性を、蛍光計とＵＰＬＣ―ＭＳを用いて評価した。ＢＣＮ－ｐＡＰとＢＣＮ－ＡＡの結果と併せて、図１０に示す。
　図１０（ａ）は検討したジエノフィル導入アミノ酸の構造、図１０（ｂ）は５Ｔｚ－ＴＭＲと各ジエノフィル導入アミノ酸の反応速度比較を示す（３００ｓｅｃでジエノフィルを添加、５５６ｎｍで励起、５８０ｎｍを観測）。５０００秒経過時点で高い蛍光値を示した条件から順に、ＴＣＯ－Ｋ、ＢＣＮ-Ｋ、ＢＣＮ-ｐＡＰ、ＢＣＮ-ＡＡ、ジエノフィル導入アミノ酸無しのＣｏｎｔｒｏｌである。図１０（ｃ）は、５Ｔｚ－ＴＭＲのＢＣＮ－Ｋとの反応による蛍光回復の評価を示す（５５６ｎｍで励起）。図１０（ｄ）は、ＵＰＬＣ－ＭＳによる５Ｔｚ－ＴＭＲと各ジエノフィル導入アミノ酸の反応生成物の解析の結果を示す。
　ジエノフィルとしてＴＣＯを導入したＴＣＯ－Ｋでは、ジエノフィルとしてＢＣＮを導入した化合物に比べて迅速に反応が進行し、細胞に適用した際にもＢＣＮを導入した化合物に比べより迅速な蛍光上昇が期待された（図１０（ｂ））。
　次に、ＢＣＮ－ＫとＴＣＯ－ＫをＡ５４９細胞に適用し、これらジエノフィル導入アミノ酸がＬＡＴ１を介して取り込まれるか評価した。実施例１で得られたＢＣＮ－ｐＡＰ及びＢＣＮ－ＡＡを用いたＡ５４９細胞でのイメージングの結果と、上記のＴＣＯ－ＫとＢＣＮ－Ｋについて、試験プロトコルを図１１aに示し、結果をまとめて図１１ｂに示す。
　ＨＢＳＳ中で開発したジエノフィル（１００μＭ）を３０分間プレインキュベーションした後に、５Ｔｚ－ＴＭＲ（１μＭ）を添加したＡ５４９細胞の１０分後の蛍光画像を示す。ジエノフィル導入アミノ酸のＬＡＴ１基質能力は、ＬＡＴ１特異的阻害剤ＪＰＨ２０３（５μＭ）の存在下と非存在下での細胞内蛍光強度の違いから評価した。（ｅｘ．：５５６　ｎｍ、ｅｍ．：６１０－６６０ｎｍ）スケールバーは５０μｍである。ｃｏｎｔｒｏｌは、ジエノフィル導入アミノ酸（－）の状態を示す。
　図１１ｂの右図は、左図のイメージング画像の細胞内蛍光強度の定量結果を示す。ＲＯＩは、カルセインＡＭの蛍光シグナルから手動で定めた。エラーバー：Ｓ．Ｄ．（ｎ＝１０）。
　この結果、ＴＣＯ－Ｋにおいては５Ｔｚ－ＴＭＲ添加後１０分後の細胞内蛍光強度はＢＣＮ-ｐＡＰにくらべてさらに高く、またこの細胞内蛍光はＬＡＴ1特異的阻害剤ＪＰＨ２０３の添加により抑制されたため、ＴＣＯ－ＫはＬＡＴ1を介
して細胞内に取り込まれていることが示唆された。
［実施例５］
５Ｔｚ－ＴＭＲとＴＣＯ－Ｋの撮像条件の最適化の検討
（１）プレインキュベーション時間とインキュベーション時間の検討
　次に、ＬＡＴ１を介して最も効率よく細胞内ＳＰＩＥＤＡＣを起こせることが示唆された５Ｔｚ－ＴＭＲとＴＣＯ－Ｋの組み合わせについて、最適なイメージング条件の探索を行った。最終的にがん診断などへの応用を見据えた本研究においては、短い実験時間で高い細胞内蛍光強度を稼げることが重要であり、したがってこれらの観点から、色素とジエノフィル導入アミノ酸の添加順とプレインキュベーション・インキュベーション時間を振り、イメージング条件の最適化を検討した。図１２に簡略化した実験プロトコルと結果を示す。
　この結果、細胞内の蛍光強度は、ＴＣＯ－Ｋのプレインキュベーション→５Ｔｚ－ＴＭＲのインキュベーションの順番の方が高い細胞内蛍光強度を示した。またジエノフィル導入アミノ酸としてＴＣＯ－Ｋを用いた今回の検討においては、色素添加後１５分を過ぎると細胞内蛍光強度やそのコントラストは減少傾向にあり、ａｄｄｕｃｔの細胞外への流出などの影響が示唆された（別視野の確認などから、褪色の影響は無いようであった）。従って、インキュベーション時間は５－１５分程度、プレインキュベーション時間は１５分以上程度が最適であることが明らかとなった。
　図１２のａは試験プロトコルと、各条件でのイメージング像を示す（左図は５Ｔｚ－ＴＭＲを先に添加する場合、右図はＴＣＯ－Ｋを先に添加する場合である）。図１２のｂは、各条件における細胞内蛍光強度を定量化した結果を示す。ＲＯＩはカルセイン－ＡＭの蛍光シグナルから手動で定めた。全てのスケールバーは５０μｍである。
（２）阻害剤とジエノフィルの濃度検討
　次に、ジエノフィルの濃度と阻害剤の濃度を検討した。以下の条件を振り、共焦点顕微鏡で撮像した（図１３）。
・プレインキュベーションの時間：３０分
・プローブ濃度：１μＭ
・ジエノフィル濃度：１００／５００μＭ　
・阻害剤濃度　ＪＰＨ２０３：５／５０μＭ　
　各組合せの中から、最もＳ／Ｎ比がつく条件（色素の有無での細胞内蛍光強度比）と最も阻害剤の有無で蛍光強度差がつく条件を調べた。この結果、プローブ濃度は５００μＭで１００μＭよりコントラストが高くなり、阻害剤濃度は５μＭで十分であることが示唆された。
　図１３は、ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲのペアにおけるジエノフィル濃度とＬＡＴ１阻害剤濃度の検討結果を示す。ＴＣＯ－Ｋのプレインキュベーション時間は３０分間とした。図１３のａは、１０分インキュベーション時のイメージング像である。スケールバーは５０μｍである。図１３ｂは、各条件における細胞内蛍光強度を定量化した結果を示す。ＲＯＩは、ＩｍａｇｅＪ　Ｆｉｊｉを用いてカルセイン－ＡＭの蛍光シグナルから手動で定め、全てのＲＯＩの平均シグナル強度をグラフ化した。
（３）細胞内滞留性の評価
　次に、５Ｔｚ－ＴＭＲとＴＣＯ－Ｋのペアについて、ＴＣＯ－Ｋを３０分プレインキュベーション→５Ｔｚ－ＴＭＲ溶液に置換・３０分イメージング後に外液の洗浄操作を行い、細胞内の蛍光強度が変化するかどうかを追跡した（図１４）。Ａ５４９細胞を用いて、洗浄操作は３０分ごとに２回ずつ行った。
　その結果、ｗａｓｈｏｕｔ後に経時的に細胞内蛍光強度は下がり、細胞からＳＰＩＥＤＡＣの生成物が経時的に漏出していることが示唆された。ただ、既存の細胞内滞留型染色試薬であるCalcein－ＡＭと同様の経時変化で細胞内蛍光高強度は減少しているように見え、細胞膜を積極的に透過して漏出して行くような極端な滞留性の悪さは無いようだった。
　図１４は、ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲをＡ５４９細胞に適用した際の細胞内滞留性の評価結果を示す。図１４（ａ）は、３０分ＴＣＯ－Ｋプレインキュベーション後に５Ｔｚ－ＴＭＲを添加した後のイメージング像であり、３０分ごとに２回ずつｗａｓｈｏｕｔを行い外液のＨＢＳＳ（－）を置換した。図１４（ｂ）は、細胞内蛍光強度の経時変化を示す。スケールバーは５０μｍである。
［実施例６］
ＴＣＯ－Ｋを用いた様々なＣｅｌｌ　ｌｉｎｅへの適用
　Ａ５４９においてＬＡＴ１を介して取り込まれることが明らかとなったＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲのＣｌｉｃｋ反応ペアについて、ＬＡＴ１の発現プロファイルに応じて細胞内への取り込みが変化するかを評価するため、ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲをＬＡＴ１発現レベルの異なる細胞種に適用し、細胞イメージングを行った。結果を図１５に示す。
　図１５の（ａ）は、ＴＣＯ－Ｋと５Ｔｚ－ＴＭＲで処理した種々の細胞株（cell line）の蛍光イメージングの結果を示す。スケールバーは５０μｍである。図１５の（ｂ）は、（ａ）の各々のパネルの細胞内蛍光強度を定量化した結果である。ＲＯＩは、カルセイン－ＡＭ（ｎ＝１０）の蛍光シグナルから手動で定めた。図１５の（ｃ）は、ＧＡＰＤＨ によって正規化された ＬＡＴ１遺伝子の相対的な遺伝子発現を示す。データは、平均±Ｓ．Ｄ（ｎ＝３）である。図１５の（ｄ）は、各細胞株について、（ｂ）と（ｃ）の間の相関をプロットした結果を示す。
　この結果、大まかにＬＡＴ１のｍＲＮＡレベルと細胞内の蛍光強度は相関し、ＴＣＯ－ＫがＬＡＴ１の発現レベルに応じて細胞内でＳＰＩＥＤＡＣを起こしていることが示唆された。

Claims (10)

  1. 　がん細胞又は組織を可視化する方法であって、
    （ａ）以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、
    （ｂ）以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織に導入する工程、及び
    （ｃ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩とががん細胞又は組織内で反応することにより、発せられる又は増強される蛍光を観察又は測定する工程を含み、
    （ａ）の工程と（ｂ）の工程を行う順序は、いずれの工程を先に行ってもよい、該方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基であり：
    Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択され；
    Ａは、リンカーを表し；
    Ｄは、ジエノフィル基を表し、
    当該ジエノフィル基は、以下から選択される；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよく；
    ＊は、Ａとの結合箇所を表す。））
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （式中、
    Ｂは、単結合又は連結基であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    は、蛍光団を表し；
    Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。）
  2. 　Ｌが以下から選択される、請求項１に記載の方法。
    －（ＣＲａＲｂ）ｎ－、－Ａｒ－、＊－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、＊－（ＣＲａＲｂ）ｓ－Ａｒ－、＊－（ＣＲａＲｂ）ｓ－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｎ－１－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｓ－１－Ａｒ－、＊－ＮＨ－（ＣＲａＲｂ）ｓ－１－Ａｒ－（ＣＲａＲｂ）ｍ－（Ａｒはアリーレンを表し、Ｒａ及びＲｂは、各々独立に、各出現において独立に、水素原子又は炭素数１～３のアルキル基であり、ｎは１～８の整数であり、ｍは１～５の整数であり、ｓは１～８の整数であり、＊は、Ａと結合する側を示す。）
  3. 　Ａのリンカーは、炭素数１～６のアルキレン基、アミド基、カルバメート基、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　Ｂの連結基は、アルキレン基（但し、アルキレン基の１以上の－ＣＨ２－は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯ－で置換されていてもよい。）、アルケニレン基、アリーレン（ヘテロアリーレンを含む）、シクロアルキレン、アルコキシル基、ポリエチレングリコール鎖、アミド基、及び、これらの基から選択される２種以上の基が任意に結合して構成される基からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記蛍光団は、以下の式（６）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （式中、
    Ｒ３は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
    Ｒ４は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のアルコキシル基又はカルボキシル基であり；
    ｍは、０～３の整数であり、ｍが２以上の場合は、各々のＲ３は同じであっても異なっていてもよく；
    Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
    Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ９Ｒ１０であり、
    ここで、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基であり；
    Ｙ及びＺは、（ＯＲｄ、Ｏ）又は（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み
    合わせであり、
    ここで、Ｒｄは、水素原子、アシル基、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであり、
    Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
    Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
    ここで、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つは、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであってもよく；
    ＊は、Ｂと結合する箇所を表す。）
  6. 　前記蛍光団は、以下の式（７）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    （式中、
    Ｒ１５～Ｒ１８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基を示し；
    Ｒ１９は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
    ｓは、０～４の整数であり、ｓが２以上の場合は、各々のＲ１９は同じであっても異なっていてもよく；
    ＊は、Ｂと結合する箇所を表す。）
  7. 　前記蛍光団は、以下の式（８）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （式中、
    Ｒ２０は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を表し；
    ｍ’は、０～３の整数であり、ｍ’が２以上の場合は、各々のＲ２０は同じであっても異なっていてもよく；
    Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり；
    Ｒ２３及びＲ２４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は－（ＣＨ２）ｔ－Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＲｃ）２（ｔは、１～３の整数であり、Ｒｃは、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ３である）であり：
    Ｘは、酸素原子又はＳｉＲ９Ｒ１０であり、
    ここで、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリー
    基であり；
    Ｙ’及びＺ’は、（ＯＲｄ、ＯＲｅ）又は（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４
    ）の組み合わせであり、
    ここで、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立に、水素原子、アシル基、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであり、
    Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
    Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個の置換または無置換のアルキル基であり、
    ここで、Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つは、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドであってもよく、
    Ｙ’及びＺ’が、（ＮＲ１１Ｒ１２、Ｎ+Ｒ１３Ｒ１４）の組み合わせであり、
    Ｒ１１～Ｒ１２の少なくとも１つが、－ＣＯ－Ｒ’（Ｒ’は、アミノ酸の部分構造である）、糖類、糖類の部分構造、自己開裂型のリンカーを有する糖類、自己開裂型のリンカーを有するアミノ酸類又はペプチドである場合は、Ｒ２１～Ｒ２４の１つは、－ＣＨ２Ｆであってもよく；
    ＊は、Ｂと結合する箇所を表す。）
  8. 　一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む、がん細胞又は組織を可視化するために用いられる蛍光プローブであって、
    当該化合物又はその塩と以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とはがん細胞又は組織内で反応することにより、蛍光が発せられる又は増強される、該蛍光プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    （式中、
    Ｂは、単結合又は連結基であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    は、蛍光団を表し；
    Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
    （式中、
    Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基であり：
    Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択され；
    Ａは、リンカーを表し；
    Ｄは、ジエノフィル基を表し、
    当該ジエノフィル基は、以下から選択される；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
    （式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～６のアルキル基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよく；
    ＊は、Ａとの結合箇所を表す。））
  9. 　以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩、及び
    　以下の一般式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を含む、がん細胞又は組織の検出用キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
    （式中、
    Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基であり：
    Ｌは、アルキレン（但し、アルキレン基のＡ側の末端の－ＣＨ２－は、－ＮＨ－で置換されていてもよい。）、アリーレン、及び、アルキレンとアリーレンが任意に結合して構成される基からなる群から選択され；
    Ａは、リンカーを表し；
    Ｄは、ジエノフィル基を表し、
    当該ジエノフィル基は、以下から選択される；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
    （式（１）～（５）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～6のアルキル
    基であり、Ｒが２以上ある場合は、同一であっても異なっていてもよく；
    ＊は、Ａとの結合箇所を表す。））
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
    （式中、
    Ｂは、単結合又は連結基であり；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
    は、蛍光団を表し；
    Ｒ２は、水素原子、炭素数１～４のアルキル基、置換又は無置換の芳香環、置換又は無置換のピリジン環、置換又は無置換のピリミジン環である。）
  10. 　以下の式で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014511371A (ja) * 2011-02-03 2014-05-15 エー エム ベー エル シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含む非天然型アミノ酸及びその使用
WO2021119268A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 The General Hospital Corporation Methods for cell imaging
WO2021177060A1 (ja) * 2020-03-03 2021-09-10 国立大学法人 東京大学 Ｌｔａ１基質となる蛍光プローブ
WO2022077052A1 (en) * 2020-10-12 2022-04-21 The University Of Sydney Probe compounds for mitochondial membrane imaging

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014511371A (ja) * 2011-02-03 2014-05-15 エー エム ベー エル シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含む非天然型アミノ酸及びその使用
WO2021119268A1 (en) * 2019-12-11 2021-06-17 The General Hospital Corporation Methods for cell imaging
WO2021177060A1 (ja) * 2020-03-03 2021-09-10 国立大学法人 東京大学 Ｌｔａ１基質となる蛍光プローブ
WO2022077052A1 (en) * 2020-10-12 2022-04-21 The University Of Sydney Probe compounds for mitochondial membrane imaging

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDRÉ A. NEVES, HENNING STÖCKMANN, YELENA A. WAINMAN, JOE C-H. KUO, SARAH FAWCETT, FINIAN J. LEEPER, KEVIN M. BRINDLE: "Imaging Cell Surface Glycosylation in Vivo Using "Double Click" Chemistry", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 24, no. 6, 19 June 2013 (2013-06-19), pages 934 - 941, XP055122985, ISSN: 10431802, DOI: 10.1021/bc300621n *
ANONYMOUS: "Amino Acid Uptake Assay Kit Amino Acid Uptake Assay Kit ", FUJIFILM WAKO PURE CHEMICAL CORPORATION, 12 October 2021 (2021-10-12), XP093087569, Retrieved from the Internet <URL:https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/category/docs/02205_pamphlet.pdf> [retrieved on 20231002] *
COLE, Christian M. Fluorescent Live-Cell Imaging of Metabolically Incorporated Unnatural Cyclopropene-Mannosamine Derivatives. ChemBioChem. 04 January 2013, vol. 14, no. 2, pages 205-208 *
HAOXING WU; JUN YANG; JOLITA ŠEČKUTĖ; NEAL K. DEVARAJ: "In Situ Synthesis of Alkenyl Tetrazines for Highly Fluorogenic Bioorthogonal Live‐Cell Imaging Probes", ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, VERLAG CHEMIE, HOBOKEN, USA, vol. 53, no. 23, 24 April 2014 (2014-04-24), Hoboken, USA, pages 5805 - 5809, XP072067959, ISSN: 1433-7851, DOI: 10.1002/anie.201400135 *
HE ZHIYONG, ISHIZUKA TAKUMI, HISHIKAWA YOSHITAKA, XU YAN: "Click chemistry for fluorescence imaging via combination of a BODIPY-based ‘turn-on’ probe and a norbornene glucosamine", CHEMICAL COMMUNICATIONS, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, UK, vol. 58, no. 89, 8 November 2022 (2022-11-08), UK , pages 12479 - 12482, XP093087570, ISSN: 1359-7345, DOI: 10.1039/D2CC05359D *
JURAJ GALETA; RASTISLAV DZIJAK; JAN OBOŘIL; MARTIN DRAČÍNSKÝ; MILAN VRABEL: "A Systematic Study of Coumarin–Tetrazine Light‐Up Probes for Bioorthogonal Fluorescence Imaging", CHEMISTRY - A EUROPEAN JOURNAL, JOHN WILEY & SONS, INC, DE, vol. 26, no. 44, 14 July 2020 (2020-07-14), DE, pages 9945 - 9953, XP071881052, ISSN: 0947-6539, DOI: 10.1002/chem.202001290 *
LEBRAUD HONORINE, NOBLE RICHARD A., PHILLIPS NICOLE, HEAM KEISHA, CASTRO JUAN, ZHAO YAN, NEWELL DAVID R., LUNEC JOHN, WEDGE STEPHE: "Highly Potent Clickable Probe for Cellular Imaging of MDM2 and Assessing Dynamic Responses to MDM2-p53 Inhibition", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 29, no. 6, 20 June 2018 (2018-06-20), US , pages 2100 - 2106, XP093087565, ISSN: 1043-1802, DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.8b00315 *
MATSUURA MINAMI.: "Development of temperature-responsive fluorescent probes and drug carriers targeting amino acid transporters", THE DOCTORAL THESIS OF THE GRADUATE SCHOOL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES AT KEIO UNIVERSITY., 1 January 2018 (2018-01-01), XP093087567, Retrieved from the Internet <URL:https://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/download.php/KO80001001-20185039-0004.pdf?file_id=141002> [retrieved on 20231002] *
REN ITO, MAKO KAMIYA, YASUTERU URANO: "27P-am004S Development of LAT1 fluorescent substrate for cancer fluorescence imaging", ABSTRACTS OF ANNUAL MEETING OF PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN (CD-ROM), PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, JP, vol. 140, 1 March 2020 (2020-03-01) - 28 March 2020 (2020-03-28), JP , XP009549250, ISSN: 0918-9823 *
REN ITO, MAKO KAMIYA, YASUTERU URANO: "ROMBUNNO.27PO3-pm2-15S Development of fluorescence imaging technology for LAT1-expressing cancer cells using Click reaction", PROCEEDINGS OF THE 142ND ANNUAL MEETING OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, JP, vol. 142, 1 March 2022 (2022-03-01) - 28 March 2022 (2022-03-28), JP, pages ROMBUNNO.27PO3 - pm2, XP009549252 *
REN ITO, MAKO KAMIYA, YASUTERU URANO: "ROMBUNNO.28V06-am06S Development of fluorescent LAT1 substrates for cancer imaging", PROCEEDINGS OF THE 141ST ANNUAL MEETING OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN; MARCH 26-29, 2021, PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN, JP, vol. 141, 1 March 2021 (2021-03-01) - 29 March 2021 (2021-03-29), JP, pages ROMBUNNO.28V06 - am06S, XP009549251 *
YANG, Jun. Live-Cell Imaging of Cyclopropene Tags with Fluorogenic Tetrazine Cycloadditions. Angewandte Chemie, International Edition. 13 June 2012, vol. 51, no. 30, pages 7476-7479 *

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