JP2014511371A - シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含む非天然型アミノ酸及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含み、式Ｉで表される非天然型アミノ酸又はその酸もしくは塩基付加塩に関する。また本発明は、前記非天然型アミノ酸の使用、並びに、１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含むポリペプチドを生産するためのキット及び方法に関する。これらのポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ反応によって、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、ジアゾカルボニル又は１，２，４，５−テトラジン基を含む化合物との共有結合により修飾できる。
【化１】

Description

本発明は、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含む非天然型アミノ酸（ＵＡＡ）及びその使用、キット並びに１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含むポリペプチドの生産方法に関する。これらのポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ反応によって、アジド、ニトリルオキシド、ニトロン、ジアゾカルボニル又は１，２，４，５−テトラジン基を含む化合物との共有結合により修飾できる。

人工的に作製された蛍光標識タグによって生体試料中の生体分子を可視化する技能は、現在のバイオテクノロジー、細胞生理学及び生命科学において重要なツールとなっている。比較的大きな自家蛍光タンパクと結合した融合タンパクをコードすることは、現在、最も広く応用されている技術である。一般的に、合成色素は自家蛍光タンパクに比べて良好な光物理的性質を示すので、Ｈａｌｏ−やＳＮＡＰ−タグ等の遺伝学的にコードされるユニークなタグを基に、代替戦略が開発されている。それらのタグは高い特異性を示すが、サイズはまだかなり大きい。複数のヒスチジン又は複数のシステインモチーフ等の小さなタグは、より小さな蛍光色素分子を認識するために使用できるが、それらの基本的な認識因子は天然のアミノ酸側鎖から作られるので、細胞内の環境ではそれらはしばしば特異性の問題を抱えている。そのような欠点は、温和な生理的条件下において非天然型部分の結合に依存する生体直交型化学を利用することによって克服できる。

生理的温度の下、十分に官能基を有する生物環境において効率的に進められる強力な化学反応は、直鎖アジドとアルキン間の銅（Ｉ）触媒Ｈｕｉｓｇｅｎ型［３＋２］環化付加反応、又は、トランス−シクロオクテン又はノルボルネン等の歪みを有するジエノフィルと１，２，４，５−テトラジンとの逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ［４＋２］環化付加反応であり、両者ともクリックケミストリーである（非特許文献１；非特許文献２）。しかしながら、より確立されている［３＋２］環化付加反応では、細菌や哺乳類細胞に対して毒性のある銅触媒が必要とされ、このタイプのクリックケミストリーの生物学的適合性を強力に低下させている。基質として環歪みを有するアルキンを利用する場合は、細胞毒性のある触媒を必要としないでクリック反応が容易に進行することを示したＢｅｒｔｏｚｚｉとその共同研究者によってこの欠点が克服された（非特許文献３）。銅を使用しないクリックケミストリーは、生体分子の標識において、利用が次第に増加した。ｉｎ ｖｉｖｏで酵素的に結合したアジド部分を含む糖質とタンパク質をラベルするために、シクロオクチニル基を含む蛍光色素が使用され（非特許文献４）、そしてアジド蛍光体を用いたアルキン−／シクロアルキン修飾ホスファチジン酸の標識が非特許文献５に記載されている。ｉｎ ｖｉｖｏでの分子標識の変法であるＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ［４＋２］環化付加反応は、トランス−シクロオクテニル基又はノルボルネニル基等の歪みを有するジエノフィル基と、例えば蛍光色素分子等の小分子プローブと融合した１，２，４，５−テトラジンとの反応を必要とする（非特許文献６；非特許文献２；非特許文献７）。触媒は必要としない。

直交性のアミノアシルｔＲＮＡ／合成酵素ペアを用いて蛍光非天然型アミノ酸を遺伝的に直接コードすることによるタンパク質の翻訳修飾は、特異性に優れ、標的タンパク質での配置が自由であり、もしあったとしても構造変化は最少である。最初にＳｕｍｍｅｒｅｒ他によって、このアプローチはうまく応用され（非特許文献８）、彼らは大腸菌由来のロイシルｔＲＮＡ／合成酵素ペアを、ＵＡＡダンシルアラニンを酵母で遺伝学的にコードするように発展させた。アンバー終止コドンＴＡＧに対応して、ダンシルアラニンは宿主の翻訳機構によって容易に導入された。一方、このアプローチは、いくつかの小さい色素と対象となる他の部分を遺伝学的にコードするために使用される。例えば、人工的に作製されたＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのチロシルｔＲＮＡ^ｔｙｒ／合成酵素、大腸菌のロイシルｔＲＮＡ^ｌｅｕ／合成酵素、そしてＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｉｚｅ及びＭ．ｂａｒｋｅｒｉのピロリシンｔＲＮＡ^ｐｙｌ／合成酵素ペアは、ポリペプチド中のアジド部分を遺伝学的にコードするために使用された（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２）。しかしながら、新しいアミノアシルｔＲＮＡ／合成酵素ペアを発展させる必要性と翻訳機構によって課せられる潜在的なサイズ制限のために、増幅された光物理的性質を有するより大きい色素及びその他のかさ高い部分は未だコード化されていない。

Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００１，４０：２００４ Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：７０１３ Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００４，１２６：１５０４６ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１０，１０７：１８２１ Ｎｅｅｆ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：１４９８ Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２００８，１９：２２９７ Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２０１０，４９：２８６９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３：９７８５ Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００２，１２４：９０２６ Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３， ３０１：９６４ Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００９，１３１：８７２０ Ｙａｎａｇｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８，１５：１１８７

多大な努力にもかかわらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の部位特異的な標識を容易にするための戦略について、まだ高い要求がある。したがって、本発明の目的は、翻訳的にポリペプチド鎖に導入できるアミノ酸又はその類似体を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏで、結果として生じるポリペプチドを標識することを可能とすることである。

本発明は式Ｉの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩に関する。

［式中、
Ｘ^１は、

を表し、
（式中、
Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；
Ｒ^２は、水素，ハロゲン，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基，ＣＦ_３，ＣＮ，Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基，−Ｏ−ＣＦ_３，Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基を表す）；
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−もしくは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を表すか；又は、
Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表し（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）；
Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基，−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−，−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ又は単結合を表し；
Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｘ^５は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニル−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基を表し；
Ｒ^１は、−ＯＨ又は−ＮＨ_２を表し；
ｎは、１〜４の整数を表し；
ｍは、１〜６の整数を表し；及び、
ｐは、１〜６の整数を表す。］

本発明の化合物又は塩は、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに翻訳的に導入できる。

すなわち、また本発明は１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有する目的のポリペプチドの生産方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む翻訳システムを提供する工程；
（ｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）本発明の化合物又は塩；
（ｉｉｉ）セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、又は、前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び、
（ｉｖ）目的のポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
（ここで、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）は、化合物又は塩（ｉｉ）を用いてｔＲＮＡ（ｉｉｉ）を特異的にアシル化することができる）；
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）を翻訳させて、それにより目的のポリペプチドのセレクターコドンによってコードされた位置に化合物（ｉｉ）を導入する工程；並びに、
ｃ）任意に、得られたポリペプチドを回収する工程。

すなわち、本発明は式ＩＩの残基を１つ以上含むポリペプチドに関する。

［式中、
Ｘ^１は、

を表し、
（式中、
Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；
Ｒ^２は、水素，ハロゲン，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基，ＣＦ_３，ＣＮ，Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基，−Ｏ−ＣＦ_３，Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基を表す）；
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−もしくは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を表すか；又は、
Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表し（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）；
Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基，−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−，−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ又は単結合を表し；
Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｚ^１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し；
Ｒ^１は、−ＯＨ又は−ＮＨ_２を表し；
ｎは、１〜４の整数を表し；
ｍは、１〜６の整数を表し；及び、
ｐは、１〜６の整数を表す。］

さらに本発明は、１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチド（目的のポリペプチド）を生産するキットに関する。該キットは、本発明の化合物又は塩を含み、任意に、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、本明細書中に記載のｔＲＮＡ、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド等のポリペプチドを生産する１つ以上の手段、及び／又は、前記目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを翻訳するさらなる手段を含む。

トランス−シクロオクテニル基と同様に、ノルボルネニル基は逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加反応において１，２，４，５−テトラジンと反応することが知られている（非特許文献６）。したがって、本発明はまた、ノルボルネニル基を含む非天然型アミノ酸、その使用、キット及び１つ以上のノルボルネニル基を含むポリペプチドの生産方法に関し、本明細書中でトランス−シクロオクテニル基に関して開示されるものは類似の方法でノルボルネニル基にも適用される。

ＧＦＰ^ＴＡＧを発現する大腸菌培養液の蛍光画像（ａ）、及び、タンパク質を発現させた大腸菌から精製したＨｉｓタグのついたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、クーマシー染色したゲル中のＧＦＰ^ＴＡＧのバンド（ｂ）を示す。ＧＦＰ^ＴＡＧは、ＮａＯＨ（“−”）、化合物１（“＋１”）又は化合物２（“＋２”）を添加した培地中において、野生型（ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ＲＳ^ＷＴ）又は変異型（ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ＲＳ^ＡＦ）のピロリジルｔＲＮＡ／ピロリジルｔＲＮＡ合成酵素ペアの存在下で発現した。マーカータンパク質のサイズはｋＤａで示す。 図１ｂのクーマシー染色ゲルを全体サイズで示す。 実施例Ｂに記載された大腸菌培養液の全細胞溶解物の解析を示す。ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}とＧＦＰ^ＷＴを発現する培養液に蛍光性アジドクマリン（化合物３）を添加した後、指定された時点で少量のサンプルを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動後、３６５ｎｍの励起波長で臭化エチジウムフィルタのセットを用いて蛍光を検出することにより、ゲルの蛍光画像（ａ）を得た。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離されたタンパク質は、クーマシー染色によって可視化された（ｂ）。ＧＦＰの泳動後の高さを矢印で示す。マーカータンパク質のサイズはｋＤａで示す。 図５に示された生データに基づいた、自由拡散したＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１，Ａｔｔｏ６４７Ｎ}単一分子のｓｍＦＲＥＴデータの２Ｄヒストグラム（Ｓ ｖｓ．Ｅ_ＦＲＥＴ）を示す。 図４に示されたデータに対応する自由拡散したＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１，Ａｔｔｏ６４７Ｎ}単一分子の生データトレース（１ミリ秒の時間分解能でのビニング）を示す。緑色チャンネルにおいて検出された蛍光バースト（ドナーＤ）は、直接励起したＧＦＰ発色団に由来し（そして、Ａへのエネルギー移動は殆んどないか、全くない）、また赤チャンネル（アクセプターＡ）におけるバーストは、Ａｔｔｏ６４７Ｎ色素への共鳴エネルギー移動に起因する。 ＲＳ^ＷＴ（ａ）又はＲＳ^ＡＦ（ｂ）をコードするプラスミドを用いて同時導入した大腸菌で得られるＧＦＰ^ＴＡＧの精製後に、ＵＡＡ１、１３、１６又は１７それぞれの非存在下（“−”）及び存在下（“＋”）においてＧＦＰ^ＴＡＧを発現しているマイクロ遠心チューブ中の大腸菌懸濁液の蛍光画像と、対応するクーマシー染色ポリアクリルアミドゲルとを示す。 実施例Ｄに記載の大腸菌によって生産されたタンパク質の解析を示す。ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}（＋１），ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}（＋１３），ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１６}（＋１６），ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１７}（＋１７）又はＧＦＰ^ＴＡＧとプロパルギルリシン（陰性コントロール）発現している培養液をＴＡＭＲＡ−アジド（Ａｚ）又はＴＡＭＲＡ−テトラジン（Ｔｅｔ）で処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。電気泳動の後、ゲルの蛍光画像（ａ）得た。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離されたタンパク質をクーマシー染色により可視化した（ｂ）。 ＴＡＭＲＡ−テトラジンで標識している間にＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}を発現した大腸菌で観察されたＧＦＰからＴＡＭＵＲＡへのＦＲＥＴの増加を示す。蛍光スペクトル（励起波長４５０ｎｍ，蛍光波長４７０〜６５０ｎｍ）を経時的に記録した（濃色のグラフから淡色のグラフへ）。

本発明の化合物及び塩は、ポリペプチド鎖に翻訳的に導入できる非天然型アミノ酸である。

用語「非天然型アミノ酸」は２０の必須アミノ酸のひとつではなく又はセレノシステインではないアミノ酸をいう。またこの用語は、アミノ酸類似体、例えばアミノ基がヒドロキシル基に置換されたものについても言及する。

本発明の化合物又は塩は、不斉中心を有し、異なる空間的配置で、又は、異なる互変異性体として存在できる。シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチドを生産するために、鏡像異性体混合物、特にラセミ体、ジアステレオマー混合物及び互変異性体混合物を使用できる。或いはまた、本発明の化合物又は塩のそれぞれの本質的に純粋な鏡像体、ジアステレオマー及び互変異性体もその目的に使用できる。

上記の定義で述べた有機部分の変数は（用語「アルキル基」と同様に）個々の基の員の個々の列挙のための集合的な用語である。いずれの場合も接頭部Ｃ_ｎ〜ｍは、該基中の炭素原子の可能性のある数を示す。

用語「ハロゲン」は、いずれの場合も、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素基、特にフッ素基を意味する。

Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基は、１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。例としては、メチル基や、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基等のＣ_２〜Ｃ_４アルキル基、またペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基及び１−エチル−２−メチルプロピル基を挙げることができる。

Ｃ_１〜Ｃ_４アルキレン基は、１〜４の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキレン基である。例としては、メチレン基及び１，２−エチレン基を挙げることができる。さらなる例は１，３−プロピレン基である。

Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基は、１〜６の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキレン基である。例としては、メチレン基、エチレン基、１，２−エチレン基、１，３−プロピレン基、イソプロピレン基、１，４−ブチレン基及び１，５−ペンチレン基を挙げることができる。

Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ基は、式Ｒ−Ｏ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。

Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシ基は、式Ｒ−（ＣＯ）−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。

Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルアミノカルボニルオキシ基は、式Ｒ−ＮＨ−（ＣＯ）−○−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。

Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基は、式Ｒ−Ｓ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜４の、好ましくは１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。

Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニル基は、式Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。

用語「シクロオクチニル類似基」は、環構造中に８つの炭素原子と１つの三重結合を有する不飽和の環式脂肪族基を意味し、１又は２の炭素原子は、酸素、硫黄及び／又は窒素原子と置換されていてもよい。特に、用語「シクロオクチニル類似基」は下記式の基を意味する：

（式中、
Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−である。）

用語「シクロオクチニル基」は、上で定義するようにシクロオクチニル類似基を意味し、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は全て−ＣＨ_２−である。特に、用語「シクロオクチニル基」は下記式の基を意味する：

用語「トランス−シクロオクテニル類似基」は、環構造中８つの炭素原子と１つのトランス型の二重結合を有する不飽和の環式脂肪族基を意味し、１又は２の炭素原子は、酸素、硫黄及び／又は窒素原子と置換されていてもよい。特に、用語「トランス−シクロオクテニル類似基」は下記式の基を意味する：

（式中、
Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−である。）

用語「トランス−シクロオクテニル基」は、上で定義するようにトランス−シクロオクチニル類似基を意味し、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は全て−ＣＨ_２−である。特に、用語「トランス−シクロオクチニル基」は下記式の基を意味する：

特に記載がない限り、用語「置換される」は、基が、１、２又は３個、特に１又は２個の置換基、特に、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基、ＣＮ、ＣＦ_３、−Ｏ−ＣＦ_３、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基、Ｃ_２〜Ｃ_４アルカノイルオキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基及びＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基から成る群から選択される置換基で置換されることを意味する。

ポリペプチド鎖に翻訳的に導入される化合物の可能性に関しては、変数Ｘ^１，Ｘ^２，Ｘ^３，Ｘ^４，Ｘ^５，Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６，ｎ，ｍ，ｐ，Ｒ^１及びＲ^２は、好ましくは、単独で又は組み合せて選ばれたとき、式Ｉ又は本明細書中に開示されたその他の式の非天然型アミノ酸の特定の実施態様を表す以下の意味を有する。

Ｘ^１は、

を表し、
式中、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；またＲ^２は、本明細書中に定義された通りである。

１つの実施態様では、Ｘ^１は下記式のシクロオクチニル類似基である。

（式中、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６及びＲ^２は本明細書中に定義された通りである。）

別の実施態様では、Ｘ^１は下記式のトランス−シクロオクテニル類似基である。

（式中、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６及びＲ^２は本明細書中に定義された通りである。）

シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基であるＸ^１基は、三重結合又は二重結合のα−、β−又はγ位の環原子によってＸ^２に結合できる。Ｘ^２が隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３、４又は５員環を形成する場合、Ｘ^１基は、Ｙ^１とＹ^２、Ｙ^２とＹ^３、Ｙ^３とＹ^４、Ｙ^４とＹ^５又はＹ^５とＹ^６を介してしてＸ^２に結合できる。Ｘ^２がＸ^１のＹ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の１つ又は２つと結合するＣ−又はＮ−であるのが簡単で好ましい（それにより、−ＣＨ_２−又は−ＮＨ−は、それぞれ＞ＣＨ又は＞Ｎ−となる）。

特定の実施態様では、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基は、三重結合又は二重結合のα位の環原子によってＸ^２に結合する（すなわち、Ｙ^１又はＹ^６を介して）。Ｘ^２が隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３、４又は５員環を形成する場合、特定の実施態様では、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基がＹ^３及びＹ^４を介してＸ^２に結合する。

シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基は、非置換（すなわち、Ｒ^２は水素である）であっても、１以上のＲ^２基で置換されていてもよい。したがって、１以上の置換基Ｒ^２があってもよい。特に、置換基Ｒ^２は５つまで存在できる。好ましくは、１、２又は３つの置換基Ｒ^２が存在する。その結果、式（Ｉ）は以下のように示すことができる：

（式中、ａは、ゼロ、１、２、３、４又は５を表す。）

複数のＲ^２基が存在する場合、これらは同じ基であっても異なる基であってもよく、また２つのＲ^２基は、同じ原子又は異なる原子と結合していてもよい。例えば、Ｒ^２は１つの炭素環原子に結合した２つのフッ素原子であってもよい。

Ｒ^２は、水素、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基、ＣＦ_３、ＣＮ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基、−Ｏ−ＣＦ_３、Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基である。

特定の実施態様では、Ｒ^２はハロゲンであり、好ましくはフッ素である。

さらなる特定の実施態様では、Ｘ^１はシクロオクチニル類似基であり、またＲ^２はハロゲン、好ましくはフッ素である。

Ｘ^１がシクロオクチニル類似基であり、Ｒ^２がハロゲン（例えば、フッ素）である場合、Ｒ^２が三重結合に隣接する環原子に結合するのが特に好ましい。

さらなる特定の実施態様では、Ｒ^２はＣ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基である。

特定の実施態様では、Ｘ^１はシクロオクチニル基である（Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は全て−ＣＨ_２−である）。すなわち、Ｘ^１は下記式で示される。

（式中、Ｒ^２は本明細書中に定義された通りである。）

これらの置換又は非置換のシクロオクチニル基は、三重結合のα、β又はγ位の環原子によって、Ｘ^２に結合できる。特定の実施態様では、Ｘ^１は下記式で示される。

（式中、Ｒ^２は本明細書中に定義された通りである。）

別の特定の実施態様では、Ｘ^１はアザシクロオクチニル基であり、すなわち、Ｘ^１は下記式で示される。

（式中、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の１つは−ＮＨ−であり、同時に、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の残りの５つは−ＣＨ_２−であり、またＲ^２は本明細書中に定義された通りである。）
特定のアザシクロオクチニル残基には、窒素原子を介してＸ^２と結合する１−アザシクロオクチン−１−イル基が含まれ、例えばＸ^１は、以下から選択される式で示される。

（式中、Ｒ^２は本明細書中に定義された通りである。）

１つの特定の実施態様では、Ｘ^１は非置換のシクロオクチニルである。

別の特定の実施態様では、Ｘ^１は１又は２つのハロゲン原子、例えばフッ素原子で置換されたシクロオクチニル基であり、三重結合に隣接する環原子で結合している。

別の特定の実施態様では、Ｘ^１はトランス−シクロオクテニル基であり、すなわち、Ｘ^１は下記式で示される。

（式中、Ｒ^２は本明細書中に定義された通りである。）

これらの置換又は非置換のトランス−シクロオクテニル基は、二重結合のα、β又はγ位の環原子によって、Ｘ^２に結合できる。特定の実施態様では、Ｘ^１は下記式で示される。

（式中、Ｒ^２は本明細書中に定義された通りである。）

Ｘ^２は、−ＣＨ_２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨＣ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
好ましくは、Ｘ^２は−Ｏ−である。

或いはまた、Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表す（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）。例えば、Ｘ^１−Ｘ^２−は下記式で示される。

（式中、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^５，Ｙ^６，Ｘ^２及びＲ^２は本明細書中に定義された通りであり、Ｙ^３及びＹ^４は、互いに独立して＞ＣＨ−又は＞Ｎ−から選択され、好ましくは、Ｙ^３及びＹ^４は両者ともに＞ＣＨ−である。）このようなビシクロ［６．１．０］ノニニル、ビシクロ［６．２．０］デシニル及びビシクロ［６．３．０］ウンデシニル類似基は、本発明の置換又は非置換のシクロオクチニル類似基を含むと考えられる。

Ｘ^２が隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３、４又は５員環を形成する場合、特定の実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−は下記式で示される。

（式中、Ｒ^２及びＸ^２は本明細書中に定義された通りである。）ビシクロ［６．１．０］ノニニル基（すなわち、Ｘ^２は＞ＣＨ−である）は、本発明の特定の実施態様を示す。

別の実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−は下記式で示される。

（式中、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^５，Ｙ^６，Ｘ^２及びＲ^２は本明細書中に定義された通りであり、Ｙ^３及びＹ^４は、互いに独立して＞ＣＨ−又は＞Ｎ−から選択され、好ましくは、Ｙ^３及びＹ^４は両者ともに＞ＣＨ−である。）このようなビシクロ［６．１．０］−トランス−ノネニル、ビシクロ［６．２．０］−トランス−デセニル及びビシクロ［６．３．０］−トランス−ウンデセニル類似基は、本発明の置換又は非置換のトランス−シクロオクチニル類似基を含むと考えられる。

Ｘ^２が隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３、４又は５員環を形成する場合、特定の実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−は下記式で示される。

（式中、Ｒ^２及びＸ^２は本明細書中に定義された通りである。）ビシクロ［６．１．０］−トランス−ノネニル基（すなわち、Ｘ^２は＞ＣＨ−である）は、本発明の特定の実施態様を示す。

Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン、−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−又は単結合である；またｍは、１，２，３，４，５又は６である。
Ｘ^３に関して、好ましくは、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基は直鎖アルキレンをいう。
好適実施態様では、Ｘ^３は−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−又は単結合である。
或いはまた、Ｘ^３は−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ−である；また、ｐは、１，２，３，４，５又は６である。特定の実施態様では、Ｘ^３は−ＣＨ_２−Ｏ−（すなわち、ｐは１である）である。

特定の実施態様では、構造要素−Ｘ^２−Ｘ^３−は、主鎖に１〜６つの原子を含み、例えば１，２，３又は４つの原子を主鎖に含む。

特定の実施態様では、−Ｘ^２−Ｘ^３−は−Ｏ−又は−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−である。Ｘ^２が隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３、４又は５員環を形成する場合、さらなる特定の実施態様では、Ｘ^３が−ＣＨ_２−Ｏ−である。

さらなる特定の実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−はＸ^１−Ｏ−又はＸ^１−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−であり（式中、Ｘ^１は、本明細書中に定義された通りである）、好ましくは非置換のシクロオクチニル基又は非置換のトランス−シクロオクテニル基である。

さらなる特定の実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−は、Ｘ^１−Ｘ^２−ＣＨ_２−Ｏ−であり（式中、Ｘ^１は、本明細書中に定義された通りである）、好ましくは非置換のシクロオクチニル基であり、またＸ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表す（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）。

Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である。

特に、Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−である。

好適実施態様では、Ｘ^４は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。

ｎは、１〜４の整数を表す。
特定の実施態様では、ｎは３又は４である。
好適実施態様では、ｎは４である。

特定の実施態様では、−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_ｎ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_ｎ−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−である（式中、ｎは好ましくは３又は４である）。

好適実施態様では、−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｎ−である（式中、ｎは好ましくは３又は４である）。

さらなる特定の実施態様では、−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は、−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_３−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_４−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_３−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（ＣＨ_２）_４−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−である。

好適実施態様では、−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−である。

本発明の特定の一形態では、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−は、カルバミン酸基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を含む（例えば、Ｘ^２は−Ｏ−，Ｘ^３は結合及びＸ^４は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、又は、Ｘ^３は−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−もしくは−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ−及びＸ^４は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である）。

特定の実施態様では、構造要素−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は、主鎖に５〜１２個の原子を含み、例えば６，７，８，９，１０又は１１個の原子を主鎖に含む。

特定の実施態様では、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。

さらなる特定の実施態様では、−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−は−Ｘ^２−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。［式中、Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表す（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）。］

好適実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は、Ｘ^１−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−，Ｘ^１−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−又はＸ^１−Ｏ−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−である（式中、Ｘ^１は本明細書中に定義された通りであり、好ましくは、非置換のシクロオクチニル基又は非置換のトランス−シクロオクテニル基である）。

さらなる特定の実施態様では、Ｘ^１−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−は、Ｘ^１−Ｘ^２−ＣＨ_２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ_２）_４−である。［式中、Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表す（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）。］

Ｘ^５は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニル−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基である。

特定の実施態様では、Ｘ^５は水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシメチル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシエチ−１−イル（特に、１−（Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ）エチ−１−イル）、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシメチル又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニルエチルである。

好適実施態様では、Ｘ^５は水素である。

Ｒ^１を持つ不斉炭素原子に関して、本発明の化合物は（カーン・インゴルド・プレローグ順位則に基づいて）Ｓ又はＲ配置とすることができるが、Ｓ配置が好ましい。

好適実施態様では、−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨＲ^１−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ^５は下記式で示される。

（式中、Ｒ^１とＸ^５は本明細書中に定義された通りであり、Ｘ^５は、特に水素である。）

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、式Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ及びＩｄ
のいずれかの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。

（式中、Ｒ^１，Ｒ^２ _，Ｘ^５及びＹ^１〜Ｙ^６は本明細書中に定義された通りである。）

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、式Ｉａ又はＩｂの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である（式中、Ｒ^１，Ｘ^５及びＹ^１〜Ｙ^６は本明細書中に定義された通りであり、Ｒ^２は水素又はハロゲン、特にフッ素である）。

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、

で示される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、下記式の化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、式Ｉｅの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。

（式中、Ｒ^１，Ｒ^２ _，Ｘ^５及びＹ^１〜Ｙ^６は本明細書中に定義された通りであり、Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表す（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）。

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、下記式の化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。

さらなる特定の実施態様では、本発明の化合物又は塩は、下記式の化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である。

したがって、１つの実施態様では、本発明の化合物は式Ｉで示される。

［式中、
Ｘ^１は、

を表し、
（式中、
Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；
Ｒ^２は、水素，ハロゲン，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基，ＣＦ_３，ＣＮ，Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基，−Ｏ−ＣＦ_３，Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基を表す）；
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を表し；
Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基，−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−又は単結合を表し；
Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｘ^５は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニル−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基を表し；
Ｒ^１は、−ＯＨ又は−ＮＨ_２を表し；
ｎは、１〜４の整数を表し；及び、
ｍは、１〜６の整数を表す。］

したがって、別の実施態様では、本発明の化合物は式Ｉで示される。

［式中、
Ｘ^１は、

を表し、
（式中、
Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；
Ｒ^２は、水素，ハロゲン，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基，ＣＦ_３，ＣＮ，Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基，−Ｏ−ＣＦ_３，Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基を表す）；
Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、
Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，

を表し（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）；
Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基，−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−，−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ又は単結合を表し；
Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を表し；
Ｘ^５は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニル−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基を表し；
Ｒ^１は、−ＯＨ又は−ＮＨ_２を表し；
ｎは、１〜４の整数を表し；
ｍは、１〜６の整数を表し；及び、
ｐは、１〜６の整数を表す。］

本発明の化合物の酸又は塩基付加塩は、特に生理的に許容された酸又は塩基を有する付加塩である。生理的に許容された酸付加塩は、適切な有機又は無機の酸で本発明の化合物の原形を処理することで形成できる。酸性プロトンを含む本発明の化合物は、適切な有機又は無機の塩基で処理することによって、その非毒性金属塩又はアミン付加塩の形に変えることができる。また本発明の化合物と塩には、その水和物や溶媒を添加した形、例えば水和物やアルコラート等が含まれる。

生理的に許容された酸又は塩基とは、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を用いたポリペプチドの生産に用いられる翻訳システムに使用することができるもの、例えば実質的に生存細胞に非毒性であるというものである。

本発明の化合物又は塩（Ｘ^５は水素以外である）が、翻訳システムにおいてポリペプチドの生産に使用される場合、ポリペプチドに導入される前に、翻訳システムの中でＸ^５は原位置で（ｉｎ ｓｉｔｕ）例えば酵素的に取り除かれると考えられる。したがって、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が認識し処理する形に本発明の化合物又は塩を変えるという翻訳システムの働きに適合できるように、Ｘ^５は便宜的に選択される。

本発明の化合物及び塩は、当技術分野で周知の方法と類似の方法で製造できる。式（Ｉ）の化合物の適切な製造方法は、本明細書で引用した様々な刊行物に見られ、その全てが全体として本明細書に参照により組み込まれる。いくつかの方法が本明細書中に概説されている。

ビシクロ［６．１．０］ノニニル基を含む本発明の化合物は、Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ他の方法（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１０，４９：９４２２）に準じて合成できる９−ヒドロキシメチルビシクロ［６．１．０］ノニン等の前駆体から製造できる。

本発明の化合物と塩は、１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を含むポリペプチドの生産に使用できる。本発明は、該ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの生産方法を提供する。特に、本発明の化合物又は塩は、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに翻訳的に導入できる。

すなわち、また本発明は１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有する目的のポリペプチドの生産方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む翻訳システムを提供する工程；
（ｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）本発明の化合物又は塩；
（ｉｉｉ）セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、又は、前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び、
（ｉｖ）目的のポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
（ここで、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）は、化合物又は塩（ｉｉ）を用いてｔＲＮＡ（ｉｉｉ）を特異的にアシル化することができる）；
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）を翻訳させる工程；並びに、
ｃ）任意に、得られたポリペプチドを回収する工程。

ノルボルネニル基は、トランス−シクロオクテニル基と類似した方法で１，２，４，５−テトラジンと反応する。したがって、本明細書においてトランス−シクロオクテニル基に関して記載されるものは、類似の方法でノルボルネニル基に適用される。したがって、さらなる実施態様では、Ｘ^１はノルボルネン−２−イル又はノルボルネン−７−イルであり、特にノルボルネン−２−イルである。

用語「翻訳システム」は、伸長しているポリペプチド鎖（タンパク質）に、自然界のアミノ酸を導入するために必要な構成要素に言及する。翻訳システムの構成要素には、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、合成酵素、ｍＲＮＡ等を含むことができる。

翻訳システムは、ｉｎ ｖｉｖｏの翻訳システムでも、ｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳システムでもよい。

ｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳システムは、無細胞翻訳システムでもよい。無細胞翻訳システムは、例えば細胞抽出液の形などで、ｍＲＮＡの翻訳に必要なタンパク因子を得た後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの反応を再構成することにより、所望のタンパク質を合成するシステムである。タンパク質合成のための該無細胞システムとその使用は当技術分野で公知である。例としては、大腸菌の抽出物、麦芽抽出物、ウサギ網状赤血球溶解物を挙げることができる（Ｓｐｉｒｉｎ ａｎｄ Ｓｗａｒｔｚ，Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ，２００８）。

好ましくは、本発明の方法で使用される翻訳システムは、ｉｎ ｖｉｖｏの翻訳システムである。ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳システムは、例えば、原核細胞又は真核細胞等の細胞とすることができる。その細胞は、細菌性細胞（例えば、大腸菌）；酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の真菌細胞；植物細胞又は昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）等の動物細胞とすることができる。ポリペプチドの発現に使用される真核細胞は、単一細胞でもよいし、多細胞組織の一部でもよい。

特定の実施態様では、その翻訳システムは大腸菌の細胞である。

さらなる特定の実施態様では、その翻訳システムは、哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞である。

本発明のポリペプチドの生産に有用な翻訳システムには、特に、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；本発明の化合物又は塩；セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、又は、前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；本発明のポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドが含まれる。

例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｔＲＮＡ及び本発明のポリペプチドは、当技術分野において公知の形質導入／形質転換によって細胞に導入できる。

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）は、アミノ酸又はアミノ酸類似体を用いてｔＲＮＡをアシル化することができる酵素である。本発明の方法で使用されるＲＳは、本発明の非天然型アミノ酸を用いてｔＲＮＡを便宜的にアシル化することができる。

本発明の方法では、ｔＲＮＡアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｔＲＮＡ／ＲＳ）ペアを便宜的に利用する。好ましくは、本発明の方法で使用されるｔＲＮＡ／ＲＳペアは、翻訳システムにおいて直交性を有している。

本明細書中で使用される用語「直交性」は、対象となる翻訳システム（細胞等）に、低下した効率で使用される分子［例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交系アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）］を示す。「直交性」は、不能又は低下した効率を示し、対象の翻訳システムの内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又は内因性のｔＲＮＡの働きに対し、直交性ｔＲＮＡ又は直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素では、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率又は例えば１％未満の効率となる。

例えば、内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素による内因性のｔＲＮＡのアシル化と比較すると、対象となる翻訳システムにおいて、直交性ｔＲＮＡは、低下した又はゼロの効率で、対象の翻訳システムの内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化される。別の例では、内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素による内因性のｔＲＮＡのアシル化と比較すると、対象となる翻訳システムにおいて、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、低下した又はゼロの効率で、内因性のｔＲＮＡをアシル化する。

好ましくは、本発明の方法で使用される直交性ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、以下の性質を有する：Ｏ−ｔＲＮＡは、本発明の非天然型アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによって選択的にアシル化される。加えて、直交ペアは、対象の翻訳システムで機能する（例えば、その翻訳システムは本発明の非天然型アミノ酸をポリペプチド鎖に導入するために、Ｏ−ｔＲＮＡをアシル化した非天然型アミノ酸を使用する）。取り込みは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ内で部位特異的に行われる（例えば、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバー終止コドン等のセレクターコドンを認識する）。

用語「選択的にアシル化する」とは、対象の翻訳システムの内因性のｔＲＮＡ又はアミノ酸と比較して、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸でアシル化する効率が、例えば、約５０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、約９９％以上の効率であることを示す。そして、非天然型アミノ酸は、伸長するポリペプチドに高い忠実度で取り込まれる（例えば、所定のセレクターコドンに対して約７５％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約８０％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約９０％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約９５％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約９５％以上の効率で、もしくは、所定のセレクターコドンに対して約９９％以上の効率で、又は、それ以上の効率で）。

用語「セレクターコドン」は翻訳過程においてＯ−ｔＲＮＡによって認識され、内因性のｔＲＮＡでは認識されないコドンを示す。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、ポリペプチド内のこの部位で、そのアミノ酸、例えば、非天然型アミノ酸を導入する。セレクターコドンには、例えば、終止コドン等のナンセンスコドン、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン；４塩基又はそれ以上の塩基コドン；天然型又は非天然型塩基対由来のコドン等が含まれる。また、所定のシステムでは、セレクターコドンは天然型の３塩基コドンのひとつを含むこともでき（すなわち、天然型トリプレット）、そこでは内因性システムは、前記天然型トリプレットを使用しない（例えば、天然型トリプレットを認識するｔＲＮＡが欠損しているシステム、又は、天然型トリプレットがレアコドンであるシステム）。

アンチコドンは、対応するコドンの逆の相補配列を有する。

Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば、抑制性ｔＲＮＡ等）及びＯ−ＲＳで構成されている。

抑制性ｔＲＮＡは、所定の翻訳システムにおいて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変えるｔＲＮＡである。抑制性ｔＲＮＡは、例えば、終止コドン、４塩基コドン又はレアコドンを読むことができる。

Ｏ−ｔＲＮＡは、内因性の合成酵素ではアシル化されず、また本明細書に記載するようにセレクターコドンを解読することができる。Ｏ−ＲＳは、例えば、拡張アンチコドンループを用いてＯ−ｔＲＮＡを認識し、選択的に非天然型アミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡをアシル化する。

本発明の方法で使用されるｔＲＮＡとＲＳは、天然由来でもよいし、様々な組織から自然発生したｔＲＮＡ及び／又はＲＳの変異に由来してもよい。様々な実施態様では、１つ以上の組織からｔＲＮＡとＲＳが得られる。別の実施態様では、そのｔＲＮＡは最初の組織から自然発生又は変異して自然発生したｔＲＮＡから得られ、そのＲＳは、２番目の組織から自然発生又は変異して自然発生したＲＳから得られる。

適切なｔＲＮＡ／ＲＳペアは、例えば、ライブラリのスクリーニング結果に基づき、変異型ｔＲＮＡとＲＳのライブラリから選択できる。或いはまた、適切なｔＲＮＡ／ＲＳペアは、発生源種から翻訳システムに導入される異種のｔＲＮＡ／合成酵素ペアであってもよい。好ましくは、翻訳システムとして使用される細胞は、前記発生源種と異なる。

ｔＲＮＡ／ＲＳペアを発展させた方法は、例えば、ＷＯ０２／０８５９２３とＷＯ０２／０６０７５に記載されている。

好ましくは、ＲＳは、本発明の非天然型アミノ酸を用いてｔＲＮＡをアシル化できるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐｙｌＲＳ）である。

本発明の方法で使用されるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、野生型又は遺伝子工学的に作られたｐｙｌＲＳであってもよい。野生型ｐｙｌＲＳの例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｉｚｅ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｂｕｒｔｏｎｉｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ及びＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ等の古細菌及び真正細菌のｐｙｌＲＳが含まれるが、これには限定されない。

遺伝子工学的につくられたｐｙｌＲＳは、例えば、ノイマン他（Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４：２３２，２００８）、柳沢他（Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００８，１５：１１８７）及びＥＰ２１９２１８５Ａ１に記載されている。

特定の実施態様では、本発明のポリペプチドの生産に使用されるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、Ｍ．ｍａｉｚｅの野生型のピロリシルｔＲＮＡ合成酵素である。

特定の実施態様では、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に記載の野生型のＭ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列又はその機能的断片を含む。

配列番号：１：
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARAL 60
RHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLE 120
NTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMS 180
APVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERE 240
NYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM 300
LAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLE 360
SIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA 420
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL 454

別の特定の実施態様では、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、１つ以上のアミノ酸改変を含むＭ．ｍａｉｚｅのピロリシルｔＲＮＡ合成酵素であり、好ましくは、アミノ酸置換Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆから選択される。

特定の実施態様では、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に記載の変異型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列又はその機能的断片を含む。

配列番号：２：
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARAL 60
RHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLE 120
NTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMS 180
APVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERE 240
NYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM 300
LAPNLANYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLE 360
SIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVFGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA 420
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL 454

本明細書中に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、いずれも本発明の化合物を用いたアシル化に使用される。

好適実施態様では、野生型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、

の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。

さらなる好適実施態様では、野生型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。

別の好適実施態様では、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、

の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。

さらなる好適実施態様では、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。

さらなる好適実施態様では、野生型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素又はアミノ酸置換Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｉｚｅピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。

ｐｙｌＲＳ（ｔＲＮＡ^ｐｙｌ）と組み合わせて用いられるｔＲＮＡは、野生型のｔＲＮＡであっても、遺伝子工学的につくられたｔＲＮＡであってもよい。野生型ｔＲＮＡ^ｐｙｌの例には、上記のようにピロリシル残基の翻訳導入を促進する古細菌と真正細菌のｔＲＮＡが含まれるが、これには限定されない。

本発明の方法で利用されるセレクターコドンは、使用される翻訳システムのタンパク質合成機構の遺伝子のコドンの枠組みを広げる。例えば、セレクターコドンには、ユニークな３塩基コドン、終止コドン（例えば、アンバーコドン、オパールコドン）等のナンセンスコドン、非天然型コドン、４塩基以上のコドン等が含まれる。多くのセレクターコドンは、所望のポリペプチド（目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドに導入できる（例えば、１以上、２以上、３以上等）。

６４の遺伝子コドンは、２０のアミノ酸と３つの終止コドンをコードする。翻訳の終了にはひとつの終止コドンだけが必要なので、原理的に他の２つの終止コドンはタンパク質を構成しない（ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸をコードするために使用できる。アンバー終止コドン（ＵＡＧ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの生合成システムや、アフリカツメガエル卵母細胞中での非天然型アミノ酸の導入に使用するのに成功している。３つの終止コドンのうち、ＵＡＧは少なくとも大腸菌において終止コドンとして使用される。いくつかの大腸菌の株は、ＵＡＧを認識し、天然型アミノ酸を挿入する天然型の抑制性ｔＲＮＡを含む。さらに、これらのアンバー抑制性ｔＲＮＡは従来のタンパク質の突然変異誘発に使用されている。

１つの実施態様では、この方法には、本発明の化合物を導入するための終止コドンであるセレクターコドンの使用が含まれる。例えば、終止コドン（好ましくはアンバー終止コドン）を認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、本発明の化合物を用いて、Ｏ−ＲＳによってアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは自然界のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、対象とする部位に終止コドン（例えば、アンバー終止コドン）を導入するために、従来の部位特定的変異誘発が使用できる。翻訳システムにおいてＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び変異遺伝子を組み合わせたとき、アンバー終止コドンに対応して非天然型アミノ酸が特異的な部位で導入され、非天然型アミノ酸類似体（すなわち、本発明の化合物）を含むポリペプチドが与えられる。

ｉｎ ｖｉｖｏでの本発明の化合物の導入は、大腸菌又はＨｅＬａ細胞等の宿主の大きな混乱なく行うことができる。例えば、アンバー終止コドンの抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば、アンバー抑制性ｔＲＮＡ）と終結因子１（ＲＦ１）（アンバー終止コドンに結合し、伸長しているペプチドのリボゾームからの遊離を開始させる因子）間の競合に依存しているので、その抑制効率は、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば、抑制性ｔＲＮＡ）の発現レベルを上昇させること、又は、ＲＦ１欠損株を用いることのどちらかによって調節できる。

特定の実施態様では、本発明の方法で使用されるｔＲＮＡ^ｐｙｌは、アンバー終止コドンに対するＣＵＡアンチコドンを含む。

本発明の化合物をコードするための有用な他のセレクターコドンはレアコドンである。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質合成反応においてアルギニン濃度が低下しているときには、レアアルギニンコドン（ＡＧＧ）は、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるアラニン（Ａｌａ）の挿入に有効であることが証明されている。この場合、合成ｔＲＮＡは、大腸菌中に少数種として存在する自然界のｔＲＮＡ^Ａｒｇと競合する。いくつかの生物は、全てのトリプレットコドンを使用するわけではない。例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓの割り当てられていないコドンであるＡＧＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物中ではアミノ酸の挿入に利用されている。したがって、本発明の方法で利用される翻訳システムによって使用されないトリプレットコドンは、いずれもセレクターコドンとして機能することができる。

この翻訳システムは、リボゾームが本発明のポリペプチドを形成できる条件で、適切な時間維持される。目的のポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むｍＲＮＡはリボゾームに結合する。そして、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡと結合するコドンにコードされた位置で、アミノ酸が段階的に結合することによって、ポリペプチドが形成される。このようにして、本発明の化合物はセレクターコドンにコードされた位置で目的のポリペプチドの中に導入される

翻訳システムによる目的のポリペプチドの翻訳は、当技術分野で周知の手順で実施できる。効率的な翻訳を促進するために、翻訳システムの構成要素は組み合わせることができる。翻訳システムとして使用される細胞は適切に培養され、目的のポリペプチドを生産するために、適切な発現培地中で、適切な時間、適切な条件下で維持される。アラビノース、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）又はテトラサイクリン等、目的のポリペプチド遺伝子の転写を可能にする化合物を添加して、発現を誘導することが必要であろう。

翻訳後に本発明のポリペプチドを翻訳システムから任意に回収できる。この目的ために、当業者に使用されている当業者に公知の手順により、本発明のポリペプチドを回収、精製し、部分的に又は十分に均質にすることができる。当技術分野において周知の標準的な手順としては、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を挙げることができる。正しく折りたたまれた成熟タンパク質の作製では、必要に応じてタンパク質リフォールディングステップを使用することができる。高純度が望まれる精製最終工程では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の好適な方法を使用することができる。本発明の非天然型アミノ酸又はポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬（すなわち、ポリペプチドのアフィニティー精製用）として使用することができる。

様々な、精製／タンパク質折りたたみ法が当技術分野において周知であり、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）及びそれらに引用された参考文献に示されたものが挙げられる。

すでに述べたように、ポリペプチドは合成、発現及び／又は精製後に、関連するポリペプチドの所望の構造とは異なる構造を有する可能性があることを当業者は認識している。例えば、原核生物のシステムによって生産されたポリペプチドは、しばしばカオトロピック試薬に曝露することによって最適化され、適切に折りたたまれる。例えば、大腸菌の溶解物から精製する間に、発現したポリペプチドは任意に変性され、復元される。これは、例えば、塩酸グアニジン等のカオトロピック試薬中でタンパク質を可溶化することにより達成される。一般的に、発現したポリペプチドを変性、還元し、次に、ポリペプチドを好ましい構造に再び折りたたむことが時折望まれる。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、及び／又は、シャペロニンを対象の翻訳産物に加えることができる。タンパク質の還元、変性及び復元の方法は、当業者に周知である。例えば、酸化グルタチオンやＬ−アルギニンを含むレドックス緩衝液中でポリペプチドはリフォールディングすることができる。

また、本発明は、本発明の方法で生産されたポリペプチドを提供する。本発明の該ポリペプチドは、翻訳システムを用いる方法によって生産できる。

したがって、また本発明は、式ＩＩの１つ以上の残基を含むポリペプチドに関する。

（式中、Ｘ^１，Ｘ^２，Ｘ^３，Ｘ^４及びｎは本明細書中に定義された通りであり、Ｚ^１は−Ｏ−又は−ＮＨ−である。）

本発明のポリペプチドのシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基は、無金属クリック反応によって対象分子の共有結合を促進する。

該反応には、アジド、酸化ニトリル、ニトロン及びジアゾカルボニル試薬を用いたシクロオクチニル類似基の環付加が含まれる（Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１０，１３３：９４９；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００４，１２６：１５０４６）。対応するオキシムの直接酸化によって簡便に酸化ニトリルを製造できる。便宜的に、この酸化と、得られた酸化ニトリルと本発明のポリペプチドのシクロオクチニル類似基との環付加は、ワンポット法として実施される。したがって、１つ以上のシクロオクチニル類似基を有するポリペプチドに結合する適切な対象分子は、１つ以上のアジド、酸化ニトリル、オキシム、ニトロン又はジアゾアルボキシル基を有するであろう。

逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加反応による１，２，４，５−テトラジン基を含む化合物とトランス−シクロオクテニル基との効率的な反応が報告されている（Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：７０１３）。したがって、１つ以上のトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチドに結合する適切な対象分子は、１つ以上の１，２，４，５−テトラジン基を有するであろう。

本発明のポリペプチドに結合できる対象分子としては、検出可能な標識、薬物、毒物、リンカー、ペプチド、多くの特異的結合ペア、エピトープタグ等を挙げることができるが、これには限定されない。

本発明のポリペプチドに結合できる検出可能な標識には、蛍光色素分子（例えば、自家蛍光分子、又は、試薬との接触で蛍光を放出できる分子）、スピン標識又はＦＲＥＴ研究のため（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドの構造の研究のため）の発色団、放射性標識（例えば、^１１１Ｉｎ，^１２５Ｉ，^１３１Ｉ，^２１２Ｂ，^９０Ｙ，^１８６Ｒｈ等）、ビオチン（例えば、ビオチンとアビジンの反応で検出される）、精製タグ（ビオチン以外）等が含まれる。また検出可能な標識には、抗体の結合（例えば、検出可能に標識された抗体の結合）によって、又は、サンドイッチタイプのアッセイを使った結合抗体の検出によって、検出できるペプチド又はポリペプチドが含まれる。

本発明のポリペプチドに結合できる薬物には、細胞傷害性の化合物（例えば、癌の化学療法化合物）、抗ウイルス化合物、生体応答物質（例えば、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキン等）、微小管作用物質、ホルモン調節物質、ステロイド化合物等が含まれるが、これには限定されない。

本発明のポリペプチドに結合できる特異的結合パートナーには、リセプター／リガンドペアのメンバー、抗体／抗原ペアのメンバー、レクチン／糖質ペアのメンバー、酵素／基質ペアのメンバー、ビオチン／アビジンペアのメンバー、ビオチン／ストレプトアビジンペアのメンバー、ジゴキシン／アンチジゴキシンペアのメンバー等が含まれるが、これには限定されない。

前記対象分子は、結合を促進するために、本発明のポリペプチドと接触する。多くの場合、この接触は生理的条件下、すなわち、生存細胞と互換性のある条件下で実施される。シクロオクチニル類似基とアジド又はシクロオクチニル類似基と酸化ニトリル基の反応はそれぞれ選択的であり、水性環境と互換性がある。上記対象分子の、本発明のポリペプチドのシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基への結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われてもよい。そのため、その生産に使用される発現システムの一部として、本発明のポリペプチドを精製又は供給できる。或いはまた、その反応は前記対象分子と本発明のポリペプチドが発現される細胞との接触によってｉｎ ｖｉｔｒｏで行われてもよい。前記細胞中で、ポリペプチドは、細胞表面上、細胞膜中、又は、細胞内に存在するであろう。

任意に、標識、リン酸化及び／又は糖化された本発明のポリペプチドは、アッセイ用成分として（例えば、バイオアッセイにおける化合物の検出用；治療、予防もしくは化粧用）又は抗体生産用の免疫原として使用できる。そのような目的のために、ポリペプチドは精製された形で利用されてもよいし、その生産のために用いられる発現システムの一部として提供されてもよい。

本発明の化合物及び塩は、１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を用いてポリペプチドを生産するためのキットの一部であってもよい。

したがって、さらに本発明は１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチド（目的のポリペプチド）を生産するためのキットに関する。該キットには、本発明の化合物又は塩、及び、任意にポリペプチドを生産するための１以上の手段が含まれる。該手段は以下を含むが、これには限定されない：
（ｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）本明細書中に記載されるｔＲＮＡ、又は、それをコードするポリヌクレオチド

例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡは共に、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の１つ以上の発現ベクターと対応するｔＲＮＡの形で提供されてもよい。

また、該キットには、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えばＧＦＰの発現ベクターが含まれ、前記レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にはアンバー終止コドンが含まれる。該レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリヌクレオチドの発現を確認するための陽性コントロールとして機能できる。

さらに、該キットには、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの翻訳の手段、例えば、大腸菌細胞、ＨｅＬａ細胞、大腸菌抽出物、麦芽抽出物又はウサギの網状赤血球溶解物等の翻訳システム及びその取扱説明書が含まれる。

［製造実施例］
一般的な材料と方法

特に記載のない限り、化学合成用の材料は、最高純度の市販製品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｉｇｍａ，Ｆｌｕｋａ，Ａｃｒｏｓ，Ｉｒｉｓ）を入手し、さらに精製することなく用いた。無水溶媒（Ｄｒｙ ｓｏｌｖｅｎｔ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａｃｒｏｓ及びＦｌｕｋａから購入し、モレキュラーシーブ上で保管し、供給して使用した。抽出及びクロマトグラフィーに用いられる溶媒は、Ｆｌｕｋａ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｅｒｃｋ及びＢＤＨ Ｐｒｏｌａｂｏ（ＶＷＲ）から購入した。フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）は、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０（６３〜２００メッシュ）を用いて実施され、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、アルミニウムで支持され、事前にシリカゲルゲルでコートされたプレート（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ａｌｕｇｒａｍ Ｓｉｌ Ｇ／ＵＶ_２５４及びＭｅｒｃｋ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ＷＦ_２５４ｓ）上で、移動相としてｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ又はＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ混合液を用いて実施した。スポットは、２５４ｎｍもしくは３６６ｎｍのＵＶハンドランプ、又は、Ａ）アニスアルデヒド染色液（８５ｍｌ ＥｔＯＨ，１０ｍｌ ＡｃＯＨ，５ｍｌ濃Ｈ_２ＳＯ_４，０．５ｍｌアニスアルデヒド）、Ｂ）ＫＭｎＯ_４染色液（３．０ｇＫＭｎＯ_４，２０ｇＫ_２ＣＯ_３／３００ｍｌ ５％ＮａＯＨ水溶液）もしくはＣ）ニンヒドリン染色液（２５０ｍｌ ＥｔＯＨ，１．５ｍｌ ＡｃＯＨ，０．５ｇニンヒドリン）のいずれかを用いた染色とその後の熱処理によって検出した。

ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａＳｈｉｅｌｄＴＭ Ａｄｖａｎｃｅ ４００（４００ＭＨｚ，^１Ｈ；１００ＭＨｚ，^１３Ｃ）スペクトロメータを用いて記録し、内部標準として残留非重水素化溶媒を用いて校正した。高分解能（ＨＲ）マススペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡｐｅｘＱｅ ｈｙｂｒｉｄ ９．４Ｔ ＦＴ−ＩＣＲマススペクトルメータでエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ法を用いてハイデルベルク大学で記録した。生産物はＮＭＲ（^１Ｈ，^１３Ｃ）及びＨＲ ＭＳによって特性化した。

実施例１：Ｎ−ε−（（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン
Ｎ−ε−（（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジンは、スキーム１に概説するように製造することができる。

スキーム１：シクロオクチンリジン誘導体１の合成［試薬と条件：ａ）ＴＥＡ，ＴＨＦ，−１０℃〜ＲＴ，８３％；ｂ） Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ，ＴＥＡ，ＤＭＦ，０℃〜ＲＴ，９１％；ｃ）ギ酸，ＣＨＣｌ_３，ＲＴ，９６％］

化合物６：シクロオクト−２−イン−１−オールは、Ｒｅｅｓｅ及びＳｈａｗ（Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ １９７０，１１４２）に準じて合成された。

ａ）シクロオクト−２−イン−１−イル ４−ニトロフェニルカーボネート（７）
化合物６（３．１２ｇ，２５．１ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（４．２０ｍｌ，３０．２ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をＴＨＦ（０．２Ｍ，１２６ｍｌ）に溶解し、−１０℃で１時間かけて、クロロギ酸４−ニトロフェニル（１５．２０ｇ，７５．４ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）とＴＨＦ（０．７Ｍ，３６ｍｌ）の攪拌溶液に液滴で添加した。反応混合物をＲＴ（室温）まで温め、オーバーナイトで攪拌した。次に、ｃＨｅｘ（１００ｍｌ）を添加し、ＴＨＦを減圧下で除去した。反応混合物を濾過した後に、ＦＣ（ｃＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ９：１）から黄色油として７（６．０３ｇ，２０．９ｍｍｏｌ，８３％）を得た。

Ｒ_ｆ（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡＣ ４：１）＝０．７０．

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝８．２８（ｄｔ，^３Ｊ＝９．３０，^３Ｊ＝２．７２，２Ｈ，ＣＨ^{ａｒｏｍａｔｉｃ}），７．４０（ｄｔ，^３Ｊ＝９．３０，^３Ｊ＝２．７２，２Ｈ，ＣＨ^{ａｒｏｍａｔｉｃ}），５．３０−５．３５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），２．１０−２．３８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．９２−１．９９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．７４−１．８８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．５９−１．６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ｂ）Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（８）

化合物７（０．９３ｇ，３．２１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２Ｍ，１６ｍｌ）に溶解し、０℃で１時間かけて、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１．０３ｇ，４．１８ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）とＴＥＡ（１．３５ｍｌ，９．６４ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）のＤＭＦ（０．５Ｍ，６ｍｌ）攪拌溶液に液滴で添加した。反応混合物をＲＴ（室温）でオーバーナイトで攪拌した。減圧下のエバポレーションにより全ての揮発性成分を除去した後、残留物をＨ_２Ｏ（１００ｍｌ）とＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）中に溶解した。水相を濃ＨＣｌで酸化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×５０ｍｌ）。合成した有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４の上で乾燥した。溶媒を減圧下でエバポレートし、粗生成物をＦＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９７：２：１）で精製し、非常に高粘度の黄色油として８（１．１７ｇ，２．９４ｍｍｏｌ，９１％）を得た。

Ｒ_ｆ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９７：２：１）＝０．４５．

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ ＝ ５．２６−５．３２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），５．１９−５．２５（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．８０−４．８６（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．２４−４．３４（ｍ，１Ｈ，α−ＣＨ^Ｌｙｓ），３．１６（ｑ，^３Ｊ＝６．３２，２Ｈ，ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２．１０−２．３１（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．６３−２．０４（ｍ，９Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），１．４９−１．５７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），１．４５（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１７６．５（Ｃ（Ｏ）Ｏ_２），１５６．１（Ｃ^Ｌｙｓ），１５４．７（Ｃ^Ｂｏｃ），１０１．６，９１．２（２×Ｃ^ｒｉｎｇ），８０．１（Ｃ（ＣＨ_３）_３ ^Ｂｏｃ），６７．１（ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），５３．３（α−ＣＨ^Ｌｙｓ），４１．９（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），４０．５（ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），３４．２（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），３１．９（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２９．７（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２９．３（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２８．５（３×ＣＨ_３ ^Ｂｏｃ），２６．２（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２２．４（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２０．７（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ｃ）Ｎ−ε−（（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（１）
化合物８（１．２４ｇ，３．１３ｍｍｏｌ）を７０％ギ酸のＣＨＣｌ_３溶液（０．２Ｍ，１６ｍｌ）に溶解し、ＲＴ（室温）で３６時間攪拌した。ＤＭＦ（０．２Ｍ，１６ｍｌ）を添加し、減圧下で全ての揮発性成分を除去した。残留物を０．１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍｌ）中に溶解し、凍結乾燥によって、純粋な１のＨＣｌ塩（１．００ｇ，３．０１ｍｍｏｌ，９６％）を黄色固体として得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ ＝ ７．４３−７．７９（ｍ，２Ｈ，α−ＮＨ_２），７．１８（ｔ，^３Ｊ＝５．７２，１Ｈ，ε−ＮＨ），５．０９−５．１３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），３．０５（ｔ，^３Ｊ ＝ ５．７２，１Ｈ，α−ＣＨ^Ｌｙｓ），２．９０（ｑ，^３Ｊ＝５．８７，２Ｈ，ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２．００−２．２６（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．７７−１．９１（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．６３−１．７１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．４１−１．５９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），１．２３−１．３７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１７０．８（Ｃ（Ｏ）Ｏ_２），１５５．７（Ｃ^Ｌｙｓ），１０１．２，９２．４（２×Ｃ^ｒｉｎｇ），６６．０（ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），５４．４（α−ＣＨ^Ｌｙｓ），４２．１（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），４０．６（ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），３４．３（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），３１．１（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２９．７（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２９．５（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２６．３（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２２．８（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２０．４（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ＨＲ−ＥＳＩ ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：２９７．１８０８８，［Ｍ＋Ｈ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：２９７．１８０８３；［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：３１９．１６２８３，［Ｍ＋Ｎａ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：３１９．１６２８２；［Ｍ＋Ｋ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：３３５．１３６７７，［Ｍ＋Ｋ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：３３５．１３６７９．

化合物１の合成の別の方法では、化合物８を６０％ギ酸のＣＨＣｌ_３溶液で溶解した。それ以外は、上記のように反応を行った。

実施例２：Ｎ−ε−（（２−（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン

Ｎ−ε−（（２−（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）カルボニル）−Ｌ−リジンは、スキーム２に概説するように製造することができる。

スキーム２：シクロオクチンリジン誘導体２の合成［試薬と条件：ａ）ＡｇＣｌＯ_４，アセトン，ＲＴ，暗所，４９％；ｂ）ＤＢＵ，ＤＭＳＯ，６０℃，７４％；ｃ）クロロギ酸４−ニトロフェニル，ＴＥＡ，ＴＨＦ，−１０℃〜ＲＴ，６５％；ｄ）Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ，ＴＥＡ，ＤＭＦ，０℃〜ＲＴ，７９％；ｅ）ギ酸，ＣＨＣｌ_３，ＲＴ，９４％］

化合物４：８，８−ジブロモビシクロ［５．１．０］オクタンは、市販のシス−シクロヘプテンを出発物質として、Ｎｅｅｆ及びＳｃｈｕｌｔｚ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２００９，４８：１４９８）の報告のように合成した。

ａ）２−（ブロモシクロオクト−２−エン−１−イルオキシ）エタノール（９）
化合物４（３．１２ｇ，１１．６ｍｍｏｌ）及び無水エタン−１，２−ジオール（１３．０ｍｌ，２３．３ｍｍｏｌ，２０．０ｅｑ）を無水アセトン（０．６Ｍ，１９ｍｌ）に溶解した。遮光下で、無水ＡｇＣｌＯ_４（７．２４ｇ，３４．９ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）を少量ずつ加え、ＲＴ（室温）で１時間攪拌した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）を添加し、濾過した後、１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍｌ）を加え、ＥｔＯＡｃを用いて水層を抽出した（５０ｍｌ×３）。合成した有機層を１Ｍ ＨＣｌ／Ｈ_２Ｏ／飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し（各１００ｍｌ）、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。減圧下で溶媒をエバポレートし、化合物９（１．４２ｇ，５．８６ｍｍｏｌ，４９％）を黄色油として得、さらに精製することなく使用した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝６．２０（ｄｄ，^３Ｊ＝１１．７３，^３Ｊ＝４．０９，１Ｈ，ＣＨ^{ｖｉｎｙｌ}），３．９１（ｄｄ，^３Ｊ＝１０．２２，^３Ｊ＝５．０９，１Ｈ，ＣＨ^{ａｌｌｙｌ}），３．７８（ｔ，^３Ｊ ＝ ４．５１，２Ｈ，ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），３．６１−３．６６（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．４４−３．４９（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），２．２７−２．３４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．８４−２．０６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．６７−１．７６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．４３−１．５５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．２３−１．３４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１３２．８（ＣＢｒ），１３１．７（ＣＨ^{ｖｉｎｙｌ}），８５．０（ＣＨ^{ａｌｌｙｌ}），６９．９，６１．９（２×ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），３９．６，３６．５，３３．３，２８．１，２６．３（５×ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ＨＲ−ＥＳＩ ＭＳ：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：２７１．０３０４１，［Ｍ＋Ｎａ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：２７１．０３０４６；［Ｍ＋Ｋ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：２８７．００４３５，［Ｍ＋Ｋ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：２８７．００４４３．

ｂ）２−（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）エタノール（１０）

化合物９（３．７６ｇ，１５．１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５Ｍ，３０ｍｌ）に溶解し、６０℃まで加熱した。ＤＢＵ（４．５１ｍｌ，３０．２ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ）を添加し、得られた溶液を１５分間攪拌し、さらにＤＢＵ（１８．０ｍｌ，１２１ｍｍｏｌ，８．０ｅｑ）を添加した。この混合物を６０℃で、オーバーナイトで攪拌し、ＲＴ（室温）まで冷却した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）と水（１００ｍｌ）を添加した。濃ＨＣｌを用いてｐＨ１まで酸性化した後、水相をＥｔＯＡｃで抽出した（５０ｍｌ×３）。合成した有機層を１Ｍ ＨＣｌ／飽和ＮａＣｌ溶液（各１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧下でエバポレートした。ＦＣ（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ ９：１）より化合物１０（１．８９ｇ，１１．２ｍｍｏｌ，７４％）を淡黄色油として得た。

Ｒ_ｆ（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ ４：１）＝０．２４．

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ ＝ ４．２０−４．２４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），３．７２−３．７７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），３．６５−３．７１（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．４４−３．５０（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），２．１０−２．３１（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．９１−２．０３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．７８−１．８９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．５８−１．７４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．４２−１．５１（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１００．５，９２．５（２×Ｃ^ｒｉｎｇ），７２．８（ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），７０．４，６１．９（２×ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），４２．３，３４．３，２９．８，２６．３，２０．７（５×ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ｃ）２−（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）エチル ４−ニトロフェニル カーボネート（１１）

化合物１０（２．６４ｇ，１５．７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（２．６３ｍｌ，１８．８ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をＴＨＦ（０．２Ｍ，７９ｍｌ）に溶解し、−１０℃で１時間かけて、クロロギ酸４−ニトロフェニル（９．４９ｇ，４７．１ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）とＴＨＦ（０．７Ｍ，２２ｍｌ）の攪拌溶液に液滴で添加した。反応混合物をＲＴ（室温）でオーバーナイトで攪拌し、ｃＨｅｘ（１００ｍｌ）を用いて希釈した。次に、ｃＨｅｘ（１００ｍｌ）を添加し、ＴＨＦを減圧下で除去した。反応混合物を濾過した後に、ＦＣ（ｃＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ４：１）から黄色油として化合物１１（３．４２ｇ，１０．３ｍｍｏｌ，６５％）を得た。

Ｒ_ｆ（ｃＨｅｘ／ＥｔＯＡｃ ４：１）＝０．４４．

^１Ｈ−ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３）δ＝８．２８（ｄｔ，３Ｊ＝９．１８，^３Ｊ＝２．１２，２Ｈ，ＣＨ^{ａｒｏｍａｔｉｃ}），７．３９（ｄｔ，^３Ｊ＝９．１８，^３Ｊ＝２．１２，２Ｈ，ＣＨ^{ａｒｏｍａｔｉｃ}），４．４１−４．４７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），４．２５−４．３０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），３．８６−３．９２（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．６３−３．６９（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），２．１１−２．３２（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．９１−２．０５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．７９−１．８９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．６２−１．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．４２−１．５２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１５６．５（Ｃ（Ｏ）Ｏ_２），１５５．６，１５２．５（２×Ｃ^{ａｒｏｍａｔｉｃ}），１２５．３，１２２．３（２×ＣＨ^{ａｒｏｍａｔｉｃ}），１０１．０，９２．１（２×Ｃ^ｒｉｎｇ），７３．０（ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），６８．５，６６．３（２×ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），４２．３，３４．３，２９．７，２６．３，２０．７（５×ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ｄ）Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｎ−ε−（（２−（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（１２）

化合物１１（０．６０ｇ，１．８１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２Ｍ，９ｍｌ）に溶解し、０℃で１時間かけて、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（０．５８ｇ，２．３５ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）とＴＥＡ（０．７６ｍｌ，５．４２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ）のＤＭＦ（０．５Ｍ，４ｍｌ）攪拌溶液に液滴で添加した。反応混合物をＲＴ（室温）でオーバーナイトで攪拌した。減圧下のエバポレーションにより全ての揮発性成分を除去した後、残留物をＨ_２Ｏ（１００ｍｌ）とＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）中に溶解した。水相を濃ＨＣｌで酸化し、ＥｔＯＡｃで抽出した（３×５０ｍｌ）。合成した有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４の上で乾燥した。溶媒を減圧下でエバポレートし、粗生成物をＦＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９７：２：１）で精製し、非常に高粘度の黄色油として１２（０．６３１ｇ，１．４３ｍｍｏｌ，７９％）を得た。

Ｒ_ｆ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９７：２：１）＝０．４１．

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝５．１８−５．２３（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．７９−４．８５（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），４．１６−４．３１（ｍ，４Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}，α−ＣＨ^Ｌｙｓ，ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），３．７４−３．８１（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．５２−３．６０（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．１５−３．２６（ｍ，２Ｈ，ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２．１１−２．３１（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．５１−２．０４（ｍ，１３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），１．４５（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１７５．８（Ｃ（Ｏ）Ｏ_２），１５６．７（Ｃ^Ｌｙｓ），１５５．９（Ｃ^Ｂｏｃ），１００．６，９２．４（２×Ｃ^ｒｉｎｇ），８０．２（Ｃ（ＣＨ_３）_３ ^Ｂｏｃ），７２．７（ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），６７．４，６３．９（２×ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），５３．２（α−ＣＨ^Ｌｙｓ），４２．２（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），４０．５（ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），３４．３（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），３１．８（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２９．８（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２９．３（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２８．３（３×ＣＨ_３ ^Ｂｏｃ），２６．４（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２２．３（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２０．７（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ＨＲ−ＥＳＩ ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：４４１．２５９５３，［Ｍ＋Ｈ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：４４１．２５９８２；［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：４６３．２４１４７，［Ｍ＋Ｎａ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：４６３．２４１７２；［Ｍ＋Ｋ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：４７９．２１５４１，［Ｍ＋Ｋ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：４７９．２１５７０．

ｅ）Ｎ−ε−（（２−（シクロオクト−２−イン−１−イルオキシ）エトキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（２）

化合物１２（２．０８ｇ，４．７１ｍｍｏｌ）を７０％ギ酸のＣＨＣｌ_３溶液（０．２Ｍ，２４ｍｌ）に溶解し、ＲＴ（室温）で３６時間攪拌した。ＤＭＦ（０．２Ｍ， ２４ｍｌ）を添加し、減圧下で全ての揮発性成分を除去した。残留物を０．１Ｍ ＨＣｌ（１００ｍｌ）中に溶解し、凍結乾燥によって、純粋な２のＨＣｌ塩（１．５０ｇ，４．４２ｍｍｏｌ，９４％）を黄色固体として得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝７．３４−７．６５（ｍ，２Ｈ，α−ＮＨ_２），７．１４−７．２３（ｍ，１Ｈ，ε−ＮＨ），４．１７−４．２５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），３．９５−４．０７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），３．４９−３．６０（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．３８−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨＨ’^{ｅｔｈｙｌ}），３．０５（ｔ，^３Ｊ＝６．０３，１Ｈ，α−ＣＨ^Ｌｙｓ），２．９２（ｑ，^３Ｊ＝６．２３，２Ｈ，ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），１．９８−２．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．５９−１．８６（ｍ，５Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），１．４４−１．５７（ｍ，３Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），１．２２−１．３９（ｍ，６Ｈ，ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ，ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ）ｐｐｍ．

^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１７１．２（Ｃ（Ｏ）Ｏ_２），１５６．８（Ｃ^Ｌｙｓ），１００．４，９３．４（２×Ｃ^ｒｉｎｇ），７２．３（ＣＨ^{ｐｒｏｐａｒｇｙｌ}），６７．５，６５．９（２×ＣＨ_２ ^{ｅｔｈｙｌ}），５３．６（α−ＣＨ^Ｌｙｓ），４２．３（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），４０．５（ε−ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），３４．４（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），３０．７（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２９．８（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２９．６（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２６．４（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ），２２．５（ＣＨ_２ ^Ｌｙｓ），２０．５（ＣＨ_２ ^ｒｉｎｇ）ｐｐｍ．

ＨＲ−ＥＳＩＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：３４１．２０７１０，［Ｍ＋Ｈ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：３４１．２０７１６；［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：３６３．１８９１７，［Ｍ＋Ｎａ］^＋実測値（ｆｏｕｎｄ）：３６３．１８９０４．

化合物２の合成の別の方法では、化合物１２を６０％ギ酸のＣＨＣｌ_３溶液で溶解した。それ以外は、上記のように反応を行った。

実施例３：トランス−シクロオクテニル類似基を含む本発明の化合物の合成

合成スキーム３：

反応条件:
ａ ＬｉＡｌＨ_４，ＴＨＦ，０℃〜ＲＴ，オーバーナイト；
ｂ 安息香酸メチル，ジエチルエーテル，シクロヘキサン，２５４ｎｍ照射，ＲＴ，６ｈ；
ｃ クロロギ酸４−ニトロフェニル，ＮＥｔ_３（ＴＥＡ），ＴＨＦ，−１０℃〜ＲＴ，オーバーナイト；
ｄ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ，ＮＥｔ_３（ＴＥＡ），ＤＭＦ，−１０℃〜ＲＴ，オーバーナイト；
ｅ：７０％ギ酸 ＣＨＣｌ_３溶液，ＲＴ，オーバーナイト。
（工程（ｅ）では、７０％ギ酸の代わりに６０％のギ酸を使用できる。）

シクロオクテン誘導体の合成に関する具体的な情報は、Ｒｏｙｚｅｎ他（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ ２００８，１３０：３７６０）及びＨｉｌｌｍｙｅｒ他（Ｍａｃｒｏｍｏｌ １９９５，２８：６３１１）にある。

合成スキーム４：トランス−シクロオクテンリジン誘導体１３の合成［試薬と条件：ｉ）クロロギ酸４−ニトロフェニル，ＤＩＥＡ，ＴＨＦ，０℃〜ＲＴ，７３％；ｉｉ）Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ，ＤＩＥＡ，ＤＭＳＯ，ＲＴ，８５％；ｉｉｉ）２０％ピペリジン ＤＭＦ溶液，ＲＴ，８０％］（Ｚ）−９−オキサビシクロ［６．１．０］ノン−４−エンから開始する合成の５工程後の全収率は３７％であり、１工程あたりの平均収率は８３％であった。

ｉ）化合物１４の合成：
トランス−シクロオクト−４エノール（１．００ｇ，７．９２ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）及びＤＩＥＡ（３．０７ｇ，４．１４ｍｌ，２３．８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）を無水ＴＨＦ（０．３ Ｍ，２６ ｍｌ）に溶解した。得られた透明溶液を、０℃、アルゴン下で、透明なクロロギ酸４−ニトロフェニル（４．７９ｇ，２３．８ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）の無水ＴＨＦ（０．３Ｍ，２６ｍｌ）溶液に２時間かけて液滴で添加した。反応混合物をＲＴ（室温）まで温め、オーバーナイトで攪拌した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）を添加し、不溶成分を珪藻土（セライト（商標））で濾過した。次に、濾液をＨ_２Ｏ（５０ｍｌ），１．０ＭＨＣｌ（５０ｍｌ）及び飽和ＮａＣｌ溶液（５０ｍｌ）で洗浄した。続いて残りの有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４−０．０６３ｍｍ，２３０−４００ｍｅｓｈ；ｃＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ １９：１ｖ／ｖ）に通してシリカゲルで精製した。化合物１４（１．６７８ｇ，５．７８ｍｍｏｌ，７３％）を白色固体として得た。

主要異性体:
Ｒ_ｆ（ｃＨｅｘ：ＥｔＯＡｃ ４：１ｖ／ｖ）＝０．８０．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝８．２９−８．２４（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．３４（ｍ，２Ｈ），５．６７−５．５７（ｍ，１Ｈ），５．５５−５．４５（ｍ，１Ｈ），４．４８−４．４２（ｍ，１Ｈ），２．４７−２．３３（ｍ，３Ｈ），２．２２−２．０７（ｍ，２Ｈ），２．０５−１．８５（ｍ，３Ｈ），１．８１−１．６７（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝８．３１−８．２６（ｍ，２Ｈ），７．５５−７．５０（ｍ，２Ｈ），５．６６−５．５７（ｍ，１Ｈ），５．５１−５．４１（ｍ，１Ｈ），４．３８−４．３２（ｍ，１Ｈ），２．３６−２．２４（ｍ，３Ｈ），２．１３−２．０２（ｍ，２Ｈ），１．９６−１．８６（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．７６（ｍ，１Ｈ），１．７３−１．５８（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１５５．７，１５２．０，１４５．３，１３４．９，１３３．０，１２５．３，１２１．８，８６．４，４０．７，３８．３，３４．１，３２．４，３１．１ｐｐｍ．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１５５．９，１５１．９，１４５．５，１３５．４，１３３．１，１２５．８，１２３．１，８６．２，４０．５，３８．０，３４．０，３２．４，３１．１ｐｐｍ．

微量異性体:
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝８．３３−８．２７（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３８（ｍ，２Ｈ），５．６９−５．５４（ｍ，２Ｈ），５．０３−４．９７（ｍ，１Ｈ），２．５０−２．２７（ｍ，４Ｈ），２．２３−２．１６（ｍ，１Ｈ），１．９６−１．８５（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．７１（ｍ，１Ｈ），１．６７−１．５８（ｍ，１Ｈ），１．３９−１．３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝１５５．７，１５２．０，１４５．３，１３５．５，１３１．５，１２５．３，１２１．９，７６．０，４０．６，３４．１，３２．１，２９．８，２８．０ｐｐｍ．
ＨＲ ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ：Ｃ_１５Ｈ_１８ＮＯ_５［Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：２９２．１１８５，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：２９２．１１５１．

ｉｉ）化合物１５の合成：
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（０．６９ｇ，１．８７ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）を、アルゴン下で、ＤＩＥＡ（０．２４ｇ，０．３３ｍｌ，１．８７ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）及び無水ＤＭＳＯ（０．２Ｍ，８ｍｌ）中に懸濁した。この白色懸濁液に、ＲＴ（室温）、アルゴン下で、化合物１４（０．４５ｇ，１．５６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）の無水ＤＭＳＯ（０．２Ｍ，８ｍｌ）透明溶液を２時間かけて液滴で添加した。反応混合物をさらに４時間、ＲＴで攪拌した。Ｈ_２Ｏ（５０ｍｌ）とＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）を添加し、濃ＨＣｌを用いて水層のｐＨを１〜３に調整した。相が分離し、次いで水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ×２）で抽出した。合成した有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し（５０ｍｌ×２）、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。全ての揮発性成分を減圧下でエバポレートし、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４−０．０６３ｍｍ，２３０−４００ ｍｅｓｈ；ＤＣＭ：ＭｅＯＨ ９５：５ｖ／ｖ）で精製して、白色固体として化合物１５（０．６９ｇ，１．３２ｍｍｏｌ，８５％）を得た。二重結合の形がトランス配座からシス配座となる異性化を導く可能性がある酸性条件を避けるために、ＡｃＯＨは全く精製に使用しなかった。

主要異性体:
Ｒ_ｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ９６：２：２ｖ／ｖ／ｖ）＝０．１６．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝７．８７（ｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７０（ｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｔ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｔ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｔ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），５．５８−５．４７（ｍ，１Ｈ），５．４４−５．３４（ｍ，１Ｈ），４．３３−４．１２（ｍ，４Ｈ），３．８６−３．７３（ｍ，１Ｈ），２．９６−２．８２（ｍ，２Ｈ），２．２８−２．１５（ｍ，３Ｈ），１．９０−１．７６（ｍ，４Ｈ），１．６９−１．４２（ｍ，５Ｈ），１．３７−１．１８ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ）．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１５６．４，１５６．２，１４４．４，１４４．３，１４１．２，１３５．４，１３３．０，１２８．１，１２７．５，１２５．８，１２０．６，７９．３，６５．９，４７．２，４１．２，４０．９，４０．５，３８．７，３４．２，３２．６，３１．４，３１．０，２９．７，２３．３ｐｐｍ．

ｉｉｉ）化合物１３の合成：
化合物１５（０．３０ｇ，０．５８ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を２０％ピペリジンのＤＭＦ（５０ｍＭ，１２ｍｌ）溶液に溶解し、ＲＴ（室温）で１時間攪拌した。全ての揮発性成分を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４−０．０６３ｍｍ，２３０−４００ｍｅｓｈ；アセトン：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ ６５：２５：１０ｖ／ｖ／ｖ）に通してシリカゲルで精製し、化合物１３（０．１４ｇ，０．４６ｍｍｏｌ，８０％）を白色固体として得た。

主要異性体:
Ｒ_ｆ（ａｃｅｔｏｎｅ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ ６５：２５：１０ｖ／ｖ／ｖ）＝０．５３．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ＝５．６５−５．５４（ｍ，１Ｈ），５．５１−５．４１（ｍ，１Ｈ），４．３８−４．２１（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．０，５．２Ｈｚ，１Ｈ），３．１１−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．３７−２．２５（ｍ，３Ｈ），２．０１−１．６５（ｍ，８Ｈ），１．６３−１．３７（ｍ，５Ｈ）ｐｐｍ．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ_３ＯＤ）δ＝１７３．１，１５７．４，１３４．７，１３２．３，８０．２，５４．７，４０．８，３９．９，３８．２，３３．８，３２．１，３０．７，３０．６，２９．２，２２．１ｐｐｍ．
ＨＲ ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ_１５Ｈ_２７Ｎ_２Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：２９９．１９６５３，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：２９９．１９６５６．

実施例４：ノルボルネニル基を含む本発明の化合物の合成

合成スキーム：ノルボルネンリジン誘導体１６（ａ）及び１７（ｂ）［試薬と条件：（ａ）ｉ）ホスゲン，ＴＨＦ，トルエン，０℃〜ＲＴ；ｉｉ）Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ，ＴＨＦ，ＮａＯＨ，９７％（２工程後）；ｉｉｉ）ギ酸，ＣＨＣｌ_３，ＲＴ，９４％．（ｂ）ｉ）トリホスゲン，ＴＨＦ，０℃〜ＲＴ；ｉｉ）Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ，ＴＨＦ，ＮａＯＨ，０°℃〜ＲＴ，９６％（２工程後）；ｉｉｉ）ギ酸，ＣＨＣｌ_３，ＲＴ，９５％］全てのノルボルネン出発物質がエンド体およびエキソ体の混合物として供給されて用いられた。合成のどの時点でもエンド体とエキソ体を分離する試みはされなかった。エキソ体／エンド体の比は^１Ｈ−ＮＭＲで測定され、プロトコルに示されている。

（ａ）ｉ），ｉｉ）化合物１８の合成：
５−ノルボルネン−２−オール（５．００ｇ，４５．４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）の無水トルエン／ＴＨＦ（１：１ｖ／ｖ，１．０Ｍ，４５ｍｌ）溶液を、０℃、アルゴン下で、２０％ホスゲンのトルエン溶液（８．９８ｇ，９０．８ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ．；４７．８ｍｌの２０％ホスゲンのトルエン溶液）に１時間かけて液滴で添加した。反応混合物をＲＴ（室温）まで温め、さらに３時間攪拌した。次いで、全ての揮発性成分を減圧下で除去し、残留物を高真空で３０分間乾燥し、次の工程で直接使用した。茶色の残留物を無水ＴＨＦ（３．５Ｍ，１３ｍｌ）中に溶解し、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１４．５ｇ，５９．０ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ．）の１．０Ｍ ＮａＯＨ／ＴＨＦ（２：１ｖ／ｖ，０．３Ｍ，１５１ｍｌ）溶液に０℃で、液滴で添加した。添加後、反応混合物をＲＴ（室温）まで温め、さらに１２時間攪拌した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）を加え、水層を濃ＨＣｌを用いてｐＨ＜４まで酸性化した。相が分離し、次いで水層をＥｔＯＡｃ（７０ｍｌ×３）で抽出した。合成した有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（８０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。全ての揮発性成分を減圧下でエバポレートした。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０， ０．０４−０．０６３ｍｍ，２３０−４００ｍｅｓｈ；ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ９６：３：１ｖ／ｖ／ｖ；トルエンと共蒸発（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ））で精製し、茶色固体として、エキソ体／エンド体の比が３：７（^１Ｈ−ＮＭＲで測定）の化合物１８（１６．９ｇ，４４．３ｍｍｏｌ，９７％）を得た。

Ｒ_ｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ９０：８：２ｖ／ｖ／ｖ）＝０．４５．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝６．３４−６．３１（ｍ，０．７Ｈ），６．２５−６．２０（ｍ，０．３Ｈ），５．９９−５．９４（ｍ，１Ｈ），５．２９−５．２１（ｍ，２Ｈ），４．３７−４．２４（ｍ，１Ｈ），３．２２−２．９９（ｍ，３Ｈ），２．８９−２．８０（ｍ，１Ｈ），２．１５−２．０８（ｍ，０．７Ｈ），１．９１−１．６６（ｍ，３．３Ｈ），１．６１−１．３７（ｍ，１４．３Ｈ），１．３３−１．２３（ｍ，１Ｈ），０．９９−０．８８ｐｐｍ（ｍ，０．７Ｈ）．
ＨＲ ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ_２３Ｈ_４２Ｎ_３Ｏ_６［Ｍ＋Ｃ４Ｈ１１Ｎ＋Ｈ］^＋の理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：４５６．３０６８１，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：４５６．３０６７８．

（ａ）ｉｉｉ）化合物１６の合成：
化合物１８（１１．６ｇ，３０．４ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を６０％ギ酸のＣＨＣｌ_３溶液（６：４ｖ／ｖ，０．２Ｍ，１５２ｍｌ）に溶解し、ＲＴ（室温）で２４時間、攪拌した。ＤＭＦ（０．２Ｍ，１５２ｍｌ）を添加し、全ての揮発性成分を減圧下で除去した。残留物を５０ｍＭ ＨＣｌ中に溶解し、凍結乾燥した。エキソ体／エンド体の比が３：７（^１Ｈ−ＮＭＲで測定）の純粋な化合物１のＨＣｌ塩（９．１４ｇ，２８．７ｍｍｏｌ，９４％）を黄色固体として得た。

Ｒ_ｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ８７：１０：３ｖ／ｖ／ｖ）＝０．０４．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝８．４７−８．３７（ｍ，２Ｈ），７．１２−７．０４（ｍ，０．３Ｈ），６．９６−６．８９（ｍ，０．７Ｈ），６．２９（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４，２．９Ｈｚ，０．７Ｈ），６．２３（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．５，２．７Ｈｚ，０．３Ｈ），５．９７（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．５，３．２Ｈｚ，０．３Ｈ），５．９１（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４，２．６Ｈｚ，０．７Ｈ），５．１２−５．０１（ｍ，０．７Ｈ），４．７２−４．６３（ｍ，０．３Ｈ），３．８４−３．７６（ｍ，１Ｈ），３．０４−２．９８（ｍ，０．７Ｈ），２．９４−２．８６（ｍ，２Ｈ），２．８１−２．７１（ｍ，１．３Ｈ），２．２９−２．２５（ｍ，０．３Ｈ），２．０５−１．９８（ｍ，０．７Ｈ），１．７９−１．２４（ｍ，８Ｈ），０．９１−０．７１ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１７１．４，１５６．７，１５６．６^＊，１４１．３^＊，１３８．６，１３３．２^＊，１３２．３，７４．４，７２．７^＊，５２．２，４７．６，４７．５^＊，４６．３^＊，４６．０，４２．２，４０．５^＊，３４．７，３４．５，３３．７^＊，３０．０，２９．３，２２．０ｐｐｍ（^＊＝エキソ異性体のシグナル）．
ＨＲ ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ_１４Ｈ_２３Ｎ_２Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：２８３．１６５２３，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：２８３．１６５１７．

（ｂ）ｉ）、ｉｉ）化合物１９の合成：
５−ノルボルネン−２−メタノール（４．１７ｇ，３３．６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を、０°Ｃ、アルゴン下で、トリホスゲン（９．９６ｇ，３３．６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）の無水ＴＨＦ（０．５Ｍ，６７ｍｌ）の溶液に、２時間かけて液滴で添加し、さらに０℃で６時間攪拌した。反応混合物をＲＴ（室温）まで温め、濾過した。次いで、全ての揮発性成分を減圧下で除去し、残留物を高真空で１時間乾燥し、透明な油として中間生成物を得、さらに精製を行うことなく次の工程で使用した。この残留物を無水ＴＨＦ（３．５Ｍ，１０ｍｌ）中に溶解し、０℃で、ゆっくりと、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ（９．９３ｇ，４０．３ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ．）の１．０Ｍ ＮａＯＨ／ＴＨＦ（２：１ｖ／ｖ，０．３Ｍ，１１２ｍｌ）溶液に加えた。添加後、反応混合物をＲＴ（室温）まで温め、さらに１４時間攪拌した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）を加え、水層を濃ＨＣｌを用いてｐＨ＜４まで酸性化した。相が分離し、次いで水層をＥｔＯＡｃ（７０ｍｌ×３）で抽出した。合成した有機層を飽和ＮａＣｌ溶液（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥した。全ての揮発性成分を減圧下でエバポレートした。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０，０．０４−０．０６３ｍｍ，２３０−４００ｍｅｓｈ；ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ ９６：３：１ｖ／ｖ／ｖ，トルエンと共蒸発（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ））で精製し、黄色固体として、エキソ体／エンド体の比が２：３（^１Ｈ−ＮＭＲで測定）の化合物１９（１２．８ｇ，３２．３ｍｍｏｌ，９６％）を得た。

Ｒ_ｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ９０：８：２ｖ／ｖ／ｖ）＝０．４４．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ＝６．１４（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝４．９，２．７Ｈｚ，０．６Ｈ），６．１１−６．０６（ｍ，０．８Ｈ），５．９４（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４，２．６Ｈｚ，０．６Ｈ），５．５２−５．４６（ｍ，０．６Ｈ），５．３０−５．２３（ｍ，０．４Ｈ），４．３４−４．２４（ｍ，１．４Ｈ），４．１９−４．０７（ｍ，１Ｈ），３．９９−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．５７（ｍ，０．６Ｈ），３．２３−３．１０（ｍ，３Ｈ），２．８６（ｓ，０．６Ｈ），２．８４−２．７８（ｍ，１Ｈ），２．７０（ｓ，０．４Ｈ），１．９２−１．６５（ｍ，６Ｈ），１．６１−１．１０（ｍ，１２Ｈ），１．１９−１．１１（ｍ，０．４Ｈ），０．５８−０．５０（ｍ，０．６Ｈ）ｐｐｍ．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１７９．５，１６１．５，１６１．５，１６０．８，１４２．５，１４２．４，１４１．４，１４１．４，８３．２，７２．２，７１．６，５８．７，５４．１，４９．８，４８．６，４８．４，４６．９，４６．３，４３．４，４３．１，３８．８，３５．６，３４．２，３３．９，３３．４，２８．１ｐｐｍ．
ＨＲ ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ_２０Ｈ_３３Ｎ_２Ｏ_６［Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）：３９７．２３３３１，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：３９７．２３４０５；Ｃ_２０Ｈ_３２Ｎ_２ＮａＯ_６［Ｍ＋Ｎａ］^＋の理論値：４１９．２１５２６，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：４１９．２１６０７；Ｃ_２０Ｈ_３２ＫＮ_２Ｏ_６［Ｍ＋Ｋ］^＋の理論値：４３５．１８９２０，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：４３５．１９００６；Ｃ_４０Ｈ_６５Ｎ_４Ｏ_１２［２Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値：７９３．４５９３５，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：７９３．４６０１４．

（ｂ）ｉｉｉ）化合物１７の合成：
化合物１９（１．８２ｇ，４．６０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を６０％ギ酸のＣＨＣｌ_３溶液（６：４ｖ／ｖ，０．２Ｍ，２３ｍｌ）で溶解し、ＲＴ（室温）で、２４時間、攪拌した。ＤＭＦ（０．２Ｍ，２３ｍｌ）を添加し、全ての揮発性成分を減圧下で除去した。残留物を５０ｍＭ ＨＣｌ中に溶解し、凍結乾燥し、白色固体として、エキソ体／エンド体の比が２：３（^１Ｈ−ＮＭＲで測定）の化合物１７のＨＣｌ塩（１．４６ｇ，４．３７ｍｍｏｌ，９５％）を得た。

Ｒ_ｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ ８７：１０：３ｖ／ｖ／ｖ）＝０．０４．
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝７．１１（ｔ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４Ｈｚ，０．４Ｈ），７．０６（ｔ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４Ｈｚ，０．６Ｈ），６．１５（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．６，３．０Ｈｚ，０．６Ｈ），６．１０−６．０５（ｍ，０．８Ｈ），５．９１（ｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．６，２．８Ｈｚ，０．６Ｈ），４．０２−３．９５（ｍ，０．４Ｈ），３．８６−３．７９（ｍ，０．４Ｈ），３．６９−３．６２（ｍ，０．６Ｈ），３．５８−３．４０（ｍ，２．６Ｈ），２．９２（ｑ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），２．８１−２．７４（ｍ，１．６Ｈ），２．６４（ｓ，０．４Ｈ），２．３３−２．２４（ｍ，０．６Ｈ），１．８０−１．５３（ｍ，３．４Ｈ），１．４０−１．２６（ｍ，３．４Ｈ），１．２４−１．１８（ｍ，１．４Ｈ），１．１５−１．１１（ｍ，０．６Ｈ），０．４５（ｄｄｄ，^３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１１．５，４．１，２．５Ｈｚ，０．６Ｈ）ｐｐｍ．
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ＝１７１．３，１５６．８，１５６．７^＊，１３７．７，１３７．２^＊，１３６．６^＊，１３２．６，６８．０^＊，６７．５，５３．４，４９．４，４５．１，４３．９，４３．７^＊，４２．２，４１．６^＊，３８．６^＊，３８．４，３０．６，２９．５，２９．１，２８．９^＊，２２．４ｐｐｍ（^＊＝エキソ異性体のシグナル）．
ＨＲ ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ_１５Ｈ_２５Ｎ_２Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］^＋の理論値：２９７．１８０８８，測定値（ｍｅａｓｕｒｅｄ）：２９７．１８１０２．

［生物学的実施例］
実施例Ａ：大腸菌におけるシクロオクチニル残基を含むＧＦＰの発現

Ａ．１ プラスミドとＤＮＡ構築
大腸菌のコドンで最適化した野生型ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐｙｌＲＳ^ＷＴ）遺伝子とそれに対応するＭ．ＭａｉｚｅのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ^ｐｙｌ）（Ｍｒ Ｇｅｎｅ，レーゲンスブルク，ドイツから購入）を用いて、Ｙｏｕｎｇ他（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１０；３９５：３６１）が記載するｐＥＶＯＬプラスミドシステムにおいて、Ｍ． ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡの２つのコード領域を置換し、プラスミドｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＷＴを作製した。さらに、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆ含む変異型ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素をコードするプラスミドｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡｐｖ７ｐｙｌＲＳｗ（ｐｙｌＲＳＡＦ）を作製した。この二重変異体について、標準的な部位特異的変異誘発を２回実施し、コドン最適化遺伝子にＹ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆを導入した。次に野生型（ｗｔ）に関しては、この遺伝子の２つのコピーをｐＥｖｏｌｖプラスミドにクローニングし、変異型プラスミドｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＡＦを生産した。

Ａ．２ 蛋白質の発現と精製
標的タンパクＧＦＰ^ＴＡＧの発現のため、Ｃ−末端 ６−Ｈｉｓペプチド配列を持ちＮ末側がＦＬＡＧタグ化され、許容部位の３９にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を含むＧＦＰを含むｐＢＡＤプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＵＳＡ）を準備した。大腸菌Ｔｏｐ１０細胞にＧＦＰ^ＴＡＧ発現ベクターとｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＷＴ又はｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＡＦのいずれかを共形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコール存在下において３７℃で培養した。典型的に、０．５ｍｌの一夜培養液を使用して、振盪フラスコ中の５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に接種した。培養物は、通常、３７℃で１〜２時間以内にＯＤ_６００で０．２〜０．３に増殖した。その後、化合物１もしくは２（保存溶液：０．１Ｍ ＮａＯＨ中に８０ｍＭ）又は０．１Ｍ等量のＮａＯＨ（コントロール実験用）を最終濃度が１ｍＭとなるように添加した。さらに、培養物をＯＤ_６００で０．４〜０．６となるように増殖させた。次に、最終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）となるようにアラビノースを添加して発現を誘導した。３７℃で４〜６時間振盪した後、遠心分離によって集菌した。沈殿物を１ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）を含む４×リン酸緩衝食塩水（４×ＰＢＳ ｐＨ８．０）溶液で再懸濁し、細胞を超音波処理によって溶解した。溶解液を１４，０００ｇで１時間遠心し、上清を約５０μｌのＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，デュッセルドルフ，ドイツ）と共にインキュベートした。１０ｍＭのイミダゾールを含む４×ＰＢＳを用いてビーズを洗浄し、５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液を用いて溶出した。洗浄及び／又は溶出と記載する場合、６Ｍの塩酸グアニジウムを含む変性４×ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８）で実施した。より正確に収率を測定するために用いられる大規模な発現法は、それに応じてスケールアップした。

ＧＦＰ^ＴＡＧタンパクの発現は、陰性コントロールと比べて、化合物１と２それぞれの存在下で認められた（図１）。ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＡＦの発現ベクターを形質導入した細胞でのＧＦＰ^ＴＡＧ発現はｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＷＴの発現ベクターを形質導入した細胞に比べて高かった（１リットル培養液当たりのＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}（化合物１を含むＧＦＰ^ＴＡＧ）の絶対収率が約１０ｍｇ）。図１ｂに示されたクーマシー染色ゲルのバンドをトリプシンとキモトリプシンで切断、消化し、得られたペプチドをマススペクトルによって解析した（Ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ；Ｍａｓｃｏｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）。この解析によってＧＦＰ^ＴＡＧへの化合物１又は２の部位特異的な導入がそれぞれ確認された。

実施例Ｂ：生存大腸菌細胞中のＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}の蛍光標識

Ｂ．１ 蛍光アジドクマリンによるＧＦＰを含むシクロオクチニル基のｉｎ ｖｉｖｏ標識
１ｍＭの化合物１の存在下において、ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＡＦを含む大腸菌でＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}を発現させた。発現誘導の４〜６時間後に、５ｍｌの培養液サンプルを採取した。１２ｍｌのＰＢＳで細胞を２回洗浄し、１２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、４℃の暗所で１時間インキュベートした後、１２ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄した。その細胞をペレットにし、５０μＭのアジドクマリン（化合物３：Ｂａｓｅ Ｃｌｉｃｋより市販されており、Ｓｉｖａｋｕｍａｒ他のＯｒｇ Ｌｅｔｔ ２００４，６：４６０３にしたがって合成できる）を含む３ｍｌのＰＢＳで再懸濁し（ＯＤ_６００約２〜３）、３７℃の暗所にて振とうしながらインキュベートした。

ＧＦＰ^ＷＴを発現している細胞を用いて、同様の画像解析の手順を繰り返すことによってコントロール実験を実施した。このコンストラクトでは、合成酵素とｔＲＮＡは化合物１の認識においてはまだ活性があるが、ＧＦＰ^ＷＴは化合物１を導入するアンバー終止コドンを含まない。

Ｂ．２ 蛍光顕微鏡を用いた標識ＧＦＰの解析
化合物３との４〜６時間のインキュベーション後、５ｍｌの細胞を採取し、１．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁し、４℃で暗所にて１時間インキュベートし、１．５ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄し、カバーガラスにセットした。１．４ＮＡの油浸対物レンズを装備したライカＳＰ５顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，マンハイム，ドイツ）に細胞を取り付けた。４００Ｈｚの走査速度と最終画素サイズ１２０．１ｎｍ×１２０．１ｎｍの２倍のズーム比で１０２４^＊１０２４画素を含むイメージを取得した。ＤＩＣイメージに加えて、青色ダイオードレーザー装置を用いて４０５ｎｍの波長でサンプルを励起し、２つのチャンネルで同時に蛍光シグナルを記録した（青色＝４１５〜４７０ｎｍ、緑色＝５２０〜５４０ｎｍ）。青色チャンネルの蛍光はクリックされた化合物３を起源とし、一方、緑色チャンネルの蛍光は４０５ｎｍの波長でも直接励起され、クリックされた化合物３からＧＦＰ発色団へのエネルギー変換が可能なＧＦＰを起源としている。アルゴンイオンレーザー装置を用いてＧＦＰを励起するのみのλ＝４８８ｎｍで励起中に同じ蛍光チャンネルを記録した。相対的な蛍光強度を表２にまとめる。λ_ｅｘ＝４０５ｎｍで励起した時、ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}を発現している細胞は、ＧＦＰ発色団と同様にクリックした化合物３の存在下で示される緑色チャンネルと同時に青色チャンネルの蛍光を示した。それに対して、ＧＦＰ^ＷＴを発現しているコントロール細胞では、λ_ｅｘ＝４０５ｎｍの青色チャンネルにおいて、バックグランドの蛍光しか認められず、すなわち、化合物３はこれらの細胞では検出されなかった。アンバー抑制されたＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}に比べてＧＦＰ^ＷＴは自然に多く発現していることから、緑色チャンネルで認められたＧＦＰ蛍光は、ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}発現細胞に比べて、コントロール細胞で強かった。要約すると、ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}を発現する細胞における青色チャンネルの蛍光強度はバックグランドに比べて約２〜３倍高く、ｉｎ ｖｉｖｏで化合物３とのカップリングが起こっていることが確認された。

Ｂ．３ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる標識ＧＦＰの解析
ＧＦＰを含むシクロオクチニルと化合物３のカップリングは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる細胞抽出物中の蛍光を解析することによって確認した。ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}又はＧＦＰ^ＷＴをそれぞれ発現している大腸菌培養液に化合物３を添加後、０，１５，３０，６０，１２０，１８０，３６０及び５４０分後に少量のサンプルを採取し、ＰＢＳで総量を１．５ｍｌに希釈し、１．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、全細胞溶解物の解析のためにＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。市販されているゲル撮影装置（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，ＣＡ）で、励起波長を３６５ｎｍとし、臭化エチジウムフィルターを用いて蛍光を検出することによって、ゲルの蛍光を解析した（図３ａ）。化合物３で標識されたＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}は、既に１５分後に認められ、実際にＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}の標識がされたことを確認した。

Ｂ．４ 蛍光アジドクマリンによるｍＣｈｅｒｒｙを含むシクロオクチニル基のｉｎ ｖｉｖｏ標識
アンバーコドンをコードした部位に化合物１を導入しているｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈｅｒｒｙ^{ＴＡＧ−＞１}）又は野生型のｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈｅｒｒｙ^ＷＴ）を発現した大腸菌培養液を用いて実施例Ｂ．１／Ｂ．２と同様の実験を実施した。一晩発現を誘導した後、前記培養液を５ｍｌ採取し、１２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１２ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、４℃の暗所にて１時間インキュベートし、１２ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄した。細胞をペレットにし、５０μＭのアジドクマリンを含む３ｍｌのＰＢＳで再懸濁（ＯＤ_６００約２〜３）し、３７℃の暗所にて振とうしながらインキュベートした。３〜４時間後、細胞を採取し、１．５ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳで再懸濁し、４℃の暗所にて１時間インキュベートし、細胞をカバーガラスにセットする前に１．５ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄した。次に、１．４ＮＡの油浸対物レンズを装備したライカＳＰ５顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，マンハイム，ドイツ）に取り付けた。４００Ｈｚの走査速度と最終画素サイズ１６０．５ｎｍ×１６０．５ｎｍの２倍のズーム比で５１２^＊５１２画素を含むイメージを取得した。ＤＩＣイメージに加えて、青色ダイオードレーザー装置を用いて４０５ｎｍの波長でサンプルを励起し、一方、２つのチャンネルで同時に蛍光シグナルを記録した（青色／緑色＝４２０〜５２０ｎｍ、赤色＝５９０〜６９０ｎｍ）。青色／緑色チャンネルの蛍光はクリックされたクマリンを起源とし、一方、ｍＣｈｅｒｒｙからの赤色チャンネルの蛍光はみられなかった。ＤＰＳＳレーザー装置を用いてｍＣｈｅｒｒｙを励起するのみのλ_ｅｘ＝５６１ｎｍで励起中に同じ蛍光チャンネルを記録した。コントロール実験として、同じイメージング手順をｍＣｈｅｒｒｙ^ＷＴを発現している細胞で繰り返した。このコンストラクトでは、合成酵素とｔＲＮＡは化合物１の認識において未だ活性があるが、ｍＣｈｅｒｒｙ^ＷＴは化合物１を導入するアンバーコドンを含んでいない。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ^ＷＴを発現しているコントロール細胞では、バックグランドの蛍光のみが青色／緑色チャンネルでみられ、すなわち、化合物３はこれらの細胞では検出されなかった。ｍＣｈｅｒｒｙ^ＷＴはアンバー抑制されたｍＣｈｅｒｒｙ^{ＴＡＧ−＞１}に比べて、自然により多く発現していることから、赤色チャンネルでみられたｍＣｈｅｒｒｙの蛍光はｍＣｈｅｒｒｙ^{ＴＡＧ−＞１}を発現している細胞に比べて、コントロール細胞で強かった。

実施例Ｃ：ｓｍＦＲＥＴによる蛍光標識されたＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}の解析

Ｃ．１ 蛍光色素を用いたＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}の標識
この目的のために、実施例Ａで述べたようにＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}を発現させ、精製した。４×ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で溶解した１ｍＭのＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}溶液を１０ｍＭのＡｔｔｏ６４７Ｎ アジド溶液（Ａｔｔｏ−Ｔｅｃ ＧｍｂＨ，ジーゲン，ドイツ）と共に３７℃で１２時間インキュベートした。その混合物をＮｉ−ＮＴＡビーズ上でインキュベートし、タンパク質から非特異的な結合色素を除去するために、低変性バッファー（２Ｍ 尿素）で洗浄し、４×ＰＢＳ バッファー（ｐＨ８．０）で溶出した。標準のＵＶ／Ｖｉｓスペクトロメトリー及び報告されたＧＦＰ、変性ＧＦＰ（変性条件下で測定した場合）及びＡｔｔｏ６４７Ｎの吸光率を用いて測定された標識効率は、通常、約５０％であった。

Ｃ．２ 蛍光共鳴エネルギー移動の１分子観察（ｓｍＦＲＥＴ）
生成したＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１，Ａｔｔｏ６４７Ｎ}（Ａｔｔｏ６４７Ｎ アジドで標識された化合物１を含むＧＦＰ^ＴＡＧ）を５０ｐＭの濃度に希釈し、以前に報告されている測定スキーム（Ｌｅｍｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００９，１３１：１３６１０）と同様に自由拡散分子の１分子型スペクトロメトリーで解析した。簡単に言うと、その溶液を１．２ＮＡ ６０×水浸対物レンズを備えたオリンパスＩ×８１顕微鏡（ハンブルク，ドイツ）の中心に置かれた特注の共焦点顕微鏡に取り付けた。２つのレーザーダイオード（ＬＤＨ４８５及び６６０，Ｐｉｃｏｑｕａｎｔ，ベルリン，ドイツ）からの発光を５６ＭＨｚのマスターパルス周期で偏光し、サンプルに焦点を当てた。単一で、自由拡散のＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１，Ａｔｔｏ６４７Ｎ}からのバースト状（ｂｕｒｓｔ ｗｉｓｅ）蛍光発光は、１００μｍのピンホールを用いて空間的にフィルター処理し、次に、スペクトルに蛍光ドナーチャンネル（Ｄ）とアクセプターチャンネル（Ａ）にフィルター処理した（発光フィルター５２５／５０，７００／７５，干渉フィルター５００／６６０及び５６０（ＡＨＦ，チュービンゲン，ドイツ）を使用）。単一光子は緑色チャンネルにおいてＰｉｃｏｑｕａｎｔのＭＰＤ、赤色チャンネルにおいてＡＰＤ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ボードルイ，カナダ）を用いて検出した。Ｈｙｄｒａｈａｒｐ（Ｐｉｃｏｑｕａｎｔ）を用いてシグナルをカウントし、１ｍｓ ｂｉｎ幅にシグナルストリームをビニングし、１分子バースト当たり３０カウントの閾値を適用した後、ルーチンのパルスインターリーブ励起解析（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２００５，８９：３５０８）を実施した。このようにして、個々のＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１，Ａｔｔｏ６４７Ｎ}分子から生じる発光バーストを化学量論（Ｓ）に基づき、ＤからＡへのエネルギー転移（Ｅ_ＦＲＥＴ）の発生について解析した。

蛍光種のスペクトル特性のために、天然のＧＦＰ発色団はドナーとして機能し（Ｄ）、Ａｔｔｏ６４７Ｎはアクセプター色素として機能した（Ａ）。共焦点検出幾何学を用いた１分子解像（上記）では自由拡散ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１，Ａｔｔｏ６４７Ｎ}が観察された（図５）。２つの主要な集団が認められた（図４）。１番目の集団はＳ＝１とＥ_ＦＲＥＴ＝０の中心に位置し、すなわち、ドナー蛍光のみを有していた。この分子種は、ほぼいつも１分子実験で観察され（Ｌｅｍｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００９，１３１：１３６１０参照）、Ａが光物理的に不活性かそれが存在しない場合のこれらの種を起源としている。２番目の集団はＳ＝０．５とＥ_ＦＲＥＴ＝１の中心に位置し、すなわち、エネルギー転移が効率的に起こるのでＡｔｔｏ６４７Ｎで標識されたＧＦＰ分子種と明確に同一である。この２番目の集団で認められる高ＦＲＥＴ効率はＧＦＰの結晶構造と良く一致しており（Ｏｒｍｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６，２７３：１３９２）、３９番目の位置に結合した色素が３０オングストロームのＧＦＰ発色団中に位置していることを示している。ＧＦＰ発色団を壊すために、６Ｍの塩酸グアニジウムでタンパク質を変性し、９５℃で５分間煮沸したときには、ＦＲＥＴシグナルが観察されなかった。

実施例Ｄ：ＵＡＡ１３、１６及び１７を導入したＧＦＰとＭＢＰの大腸菌での発現

Ｄ．１ ＧＦＰ^ＴＡＧ
ＵＡＡ１３，１６又は１７を導入したＧＦＰ^ＴＡＧすなわち、ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}，ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１６}及びＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１７}を下記以外はＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}とＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞２}で記載したように作製した（Ａ．１参照）。大腸菌培養液がＯＤ_６００で０．２〜０．３に達した時、化合物１又は２の代わりにそれぞれ化合物１３、１６もしくは１７（０．１Ｍ ＮａＯＨ中の８０ｍＭ保存液）又は等量の０．１Ｍ ＮａＯＨ（陰性コントロール実験）を最終濃度が１ｍＭになるように添加した。ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}は以下の製造者プロトコル（ＢＩＯ−ＲＡＤ，ミュンヘン，ドイツ）に従い、Ｎｉビーズの代わりにＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＨＩＣサポートを用いてＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}を精製した。

大腸菌細胞のＧＦＰ蛍光を調べ、精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシー染色を行った（図６）。その結果は、ＲＳ^ＡＦによる化合物１，１３，１６及び１７の効率的な導入を示す。化合物１６の存在下で最も発現が高かったＧＦＰ^ＴＡＧではＲＳ^ＷＴによる導入は低かった。

Ｄ．２ ＭＢＰ^ＴＡＧ
許容部位３８にアンバー終止コドンとＣ末端にＨｉｓタグ（ＭＢＰ^ＴＡＧ）を有するマルトース結合タンパク（ＭＢＰ）をＧＰＦ^ＴＡＧに相似のＵＡＡ存在下での大腸菌による発現のために使用した。タンパク質発現、溶解、精製はＡ．１とＤ．１で述べたように実施した。

前記大腸菌から精製したＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１}，ＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１３}，ＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１６}及びＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１７}をＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔエレクトロスプレイタンデム質量分析計（Ｑ−ＴｏＦ，Ｗａｔｅｒｓ）を用いて解析した。表３にまとめた結果はＭＢＰ^ＴＡＧへのそれぞれのＵＡＡの導入を確認する。

実施例Ｅ：導入されたＵＡＡを有するＧＦＰ及びＭＢＰを発現する大腸菌のｉｎ ｖｉｖｏ蛍光標識

Ｅ．１ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたｉｎ ｖｉｖｏ標識されたＧＦＰ^ＴＡＧタンパク質の可視化
ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}，ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}，ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１６}及びＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１７}を実施例ＡとＤで記載されているように大腸菌で発現し、ＴＡＭＲＡ−アジド（Ａｚ）又はＴＡＭＲＡ−テトラジン（Ｔｅｔ）のいずれかで標識した（いずれも５０μＭの濃度で３７℃で１２時間）。脂肪族のアルキンが銅（Ｉ）触媒アジドアルキン環状付加を実施するだけで、菌株が促進するアジドアルキン反応を実施できない陰性コントロールとしてＵＡＡ プロパルギルリジンを発現したＧＦＰ^ＴＡＧを使用した。大腸菌が発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシー染色（図７ｂ）と蛍光スキャンで可視化した（図７ａ）。高い位置のＧＦＰバンドの蛍光によって標識の成功が確認された。ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}，ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}，ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１６}及びＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１７}はそれぞれＴＡＭＲＡ−テトラジンでうまく標識された。シクロオクチニル残基を含むタンパク質のみ、すなわち、ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}のみがＴＡＭＲＡ−アジドで標識された。

Ｅ．２ 蛍光顕微鏡によるｉｎ ｖｉｖｏ標識されたＭＢＰ^ＴＡＧの可視化
化合物１又は１７の存在下においてＭＢＰ^ＴＡＧを発現した大腸菌を別々に培養し、ＰＢＳで４回洗浄した。２つの大腸菌培養液を１：１（ＯＤ_６００約２）で混合し、５０μＭのＴＡＭＲＡ−アジドと共に３７℃で４時間培養した。次に、大腸菌をＰＢＳで１回洗浄し、１０μＭのクマリン−テトラジンと共に３７℃で４時間インキュベートを続けた。コントロールとして、ＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１}を発現する大腸菌とＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１７}を発現する大腸菌をそれぞれ別々に、ＴＡＭＲＡ−アジド又はクマリン−テトラジンで標識した。標識後、過剰な色素を除くために、全ての培養液を５％のＤＭＳＯを含むＰＢＳで５回洗浄した。結果の画像は緑（クマリン−テトラジンで標識されたＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１７}）と赤（ＴＡＭＲＡ−アジドで標識されたＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１}）の蛍光細胞で示した。ＴＡＭＲＡ−アジドで処理されたＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１７}は蛍光を示さなかったが、クマリン−テトラジンで標識されたＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１}は緑の蛍光細胞を示した。

Ｅ．３ ＦＲＥＴによるｉｎ ｖｉｖｏ ＴＡＭＲＡ標識の定量分折
実施例ＡとＤで記載されているように導入された化合物１，１３，１６又は１７を有するＧＦＰ^ＴＡＧを大腸菌で発現させた。大腸菌の溶解物は吸光度に基づき最終的に約５００ｎＭのＧＦＰ濃度に調整した。５μＭの色素（ＴＡＭＲＡ−テトラジン又はＴＡＭＲＡ−アジド）を添加し、蛍光スペクトル（励起波長４５０ｎｍ，蛍光波長４７０〜６５０ｎｍ）を記録した。ＧＦＰ^ＴＡＧの成功した標識は、タンパク質に結合した時のＧＦＰ発色団からＴＡＭＵＲＡまでのＦＲＥＴによってモニターした。図８においてＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}で模範的に示されているように、個々のスペクトルにおいて、これは時間が経つにつれて（暗いところから明るい色のグラフ）、ＧＦＰ蛍光（約５０５ｎｍ）の減少及び同時のＴＡＭＵＲＡ蛍光（約５７５ｎｍ）の増加によって可視化された。

対応する経時評価において、最初のタイムポイント（実質的に反応がまだ進んでいない時点）を用いて直接励起（すなわち、励起光によるＴＡＭＵＲＡの励起）及び漏出（アクセプターへのＧＦＰの蛍光）に対して全てのデータを補正した。ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１３}については、反応が非常に速かったので、別のコントロール実験の漏出と直接励起値を使用した。より遅い反応を観察し、速度定数を抽出するために、導入されたＵＡＡを有する精製ＧＦＰ^ＴＡＧを吸収スペクトルに基づき約１μＭの最終濃度に調整した。５μＭのＴＡＭＲＡ−テトラジンを添加し、蛍光スペクトル（励起波長４５０ｎｍ，蛍光波長４７０〜６５０ｎｍ）を数時間記録した。ＴＡＭＲＡ−アジドと反応する化合物１の場合には、妥当な時間スケールで標識を達成するためにアジドの濃度は５０μＭに増加させた。得られた反応速度は以下にしたがって簡単な単一指数関数モデルを用いて適合させた。

式中、Ａ_０は適合した振幅に対応しており、最初のＧＦＰ濃度に比例している。Ｂは反応液中の色素濃度に対応している。反応速度定数ｋは反応中の定数Ｂの仮定のもとで適合から得られる（過剰な色素のために有効）。３７℃で測定されたおおよその速度定数を表５にまとめる。

実施例Ｆ：ほ乳動物細胞での導入されたＵＡＡ１，１３，１６，及び１７を有するＧＦＰとＭＢＰの発現

Ｆ．１ プラスミドとＤＮＡコンストラクト
ｔＲＮＡ^ｐｙｌとピロリジン合成酵素ｐｙｌＲＳの両方を発現する単一の発現プラスミドを、プラスミドｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＷＴ又はｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＡＦに由来する合成遺伝子を用いて哺乳動物ＵＡＡ発現プラスミドｐＳＷＡＮ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００７，４：２３９）のｔＲＮＡと合成酵素と置換することによって生産した。これにより、哺乳動物細胞の同時導入を用いたプラスミドｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＷＴ又はｐＥＶＯＬ ｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳ^ＡＦが生産された。

哺乳動物のアンバー抑制研究において、ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−^ＴＡＧＧＦＰ融合タンパク質が生成された。核局在化配列（ＮＬＳ）があるため、発現したタンパク質は核に局在した。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、プラスミドがうまく形質導入されたことを示すように核のオレンジの蛍光で可視化した。緑色の蛍光は、適切なｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳプラスミドの同時導入及び融合^ＴＡＧＧＦＰのアンバーコドンの抑制が良好でありＧＦＰ発現が成功していることを示した。

Ｆ．２ ＵＡＡに依存するアンバー抑制を検討するための自動化顕微鏡手順
ＵＡＡ１，１３，１６又は１７とＲＳ^ＷＴ又はＲＳ^ＡＦの存在下でのＵＡＡ濃度依存性のＧＦＰ発現は、以下の自動化された顕微鏡手順を用いて解析した。

ＨｅＬａ Ｋｙｏｔｏ細胞を１０％のＦＢＳと１％のＬ−グルタミンを含む低グルコースＤＭＥＭ培地（１ｇ／ｌ）（Ｓｉｇｍａ，ミュンヘン，ドイツ）で増殖させた。ガラス底の２４穴チャンバーに１ウェル当たり１０〜２０×１０^３個の細胞を播種し、一晩培養した。次の日に、増殖培地を、ＵＡＡ濃度を段階的に増加させて（０，１，１０，１００，２５０，１０００μＭ）加えて新鮮な培地に交換し、ｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬を用いて、以下の製造者プロトコルに従い（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ，イルキルシュ，フランス）、その細胞にＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−^ＴＡＧＧＦＰとそれぞれのｔＲＮＡ^ｐｙｌ／ｐｙｌＲＳペア（ＲＳ^ＷＴ又はＲＳ^ＡＦ）を有するプラスミド（１：１の比率）の同時形質導入を行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１μｇ／ｍｌ，１０分間）で染色し、２％のパラフォルムアルデヒドで固定し（室温で１５分間）、画像解析のためにＰＢＳで保存した。全てのＵＡＡ濃度で、独立して準備した２つの２４穴のチャンバーについて実験を２回繰り返した。

顕微鏡でのイメージングは、３チャンネルにおいて自動化された広視野のＯｌｙｍｐｕｓ ＳｃａｎＲ顕微鏡（ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＵｐｌａｎＡｐｏ ２０ｘ，０．７０ ＮＡ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ Ｒ２ ＣＣＤ ｃａｍｅｒａ）を用いて実施した。全てのウェルについて、２５以上の画像（１３４４×１０２４ピクセル；４３３×３３０μｍ，１２−ｂｉｔ）を取得した（露出時間：３０ｍｓ Ｈｏｅｃｈｓｔ，１００ｍｓ ｍＣｈｅｒｒｙ，１００ｍｓ ＧＦＰ）。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色にはそのシステムの自動焦点オプションを使用した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルを示す細胞においてＧＦＰ蛍光強度の定量化ができるＩｍａｇｅＪ マクロ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を用いて画像を解析した。ヘキスト染色は閾値と選択核に使用した。検出された全ての核について、ｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰの蛍光強度を定量した。ｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＰチャンネルにおける蛍光強度のバックグランドは形質導入しなかったが、ヘキストで染色した細胞が含まれるチャンバーの１つのウェルを用いて測定した。それらのバックグラウンド値には、バックグランドとｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞を区別するために閾値を設定した。全てのウェルについて、ＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙのシグナルが陽性な細胞におけるＧＦＰの平均蛍光強度（Ｉ_ＧＦＰ）をＵＡＡ導入の成功の測定値として調べた。ＧＦＰの蛍光強度は最大で観察されたシグナルに基づき全てのＵＡＡについて別々に標準化した（ＲＳ^ＷＴ又はＲＳ^ＡＦについて）。

標準化したＩ_ＧＦＰデータを表６にまとめる。ＮＬＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ−^ＴＡＧＧＦＰ融合タンパクの発現は、全てのＵＡＡに関して、明確にＵＡＡ濃度依存性が検出された。通常、融合タンパクの発現には、約２５０μＭのＵＡＡが最適であることが示された。

略語
ＡｃＦ＝ｐ−アセチルフェニルアラニン
ＡｃＯＨ＝酢酸
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ＝Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
ｃＨｅｘ＝シクロヘキサン
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデ−７−セン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＦＣ＝フラッシュクロマトグラフィー
ＦＲＥＴ＝蛍光共鳴エネルギー移動
ＭｅＯＨ＝ メタノール
ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質
ＧＦＰ^ＷＴ＝野生型ＧＦＰ
ＧＦＰ^ＴＡＧ＝許容部位３９にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を含む配列によってコードされたＧＦＰ
ＧＦＰ^{ＴＡＧ−＞１}＝アンバーコドンをコードした部位に化合物１が導入されたＧＦＰ^ＴＡＧ
Ｉ_ＧＦＰ＝ＧＦＰの平均強度
ＭＢＰ＝マルトース結合タンパク
ＭＢＰ^ＴＡＧ＝許容部位３８にアンバー終止コドン、Ｃ末端にＨｉｓタグ（ＭＢＰ^ＴＡＧ）を有する配列によってコードされたＭＢＰ
ＭＢＰ^{ＴＡＧ−＞１}＝アンバーコドンをコードした部位に化合物１が導入されたＭＢＰ^ＴＡＧ
ｍＣｈｅｒｒｙ^ＷＴ＝野生型ｍＣｈｅｒｒｙ
ｍＣｈｅｒｒｙ^{ＴＡＧ−＞１}＝アンバーコドンをコードした部位に化合物１が導入されたｍＣｈｅｒｒｙ
ＮＬＳ＝核局在配列
ＯＤ_６００＝６００ｎｍの吸光度
ＰＢＳ＝リン酸緩衝溶液
ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル
ＲＴ＝室温
ＳＤ＝標準誤差
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｓｍＦＲＥＴ＝ＦＲＥＴの１分子観察
ＴＡＭＲＡ＝テトラメチルローダミン
ＴＢ＝ＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＵＡＡ＝非天然型アミノ酸

Claims (38)

1. 式Ｉの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩：
   
   ［式中、
   Ｘ^１は、
   
   を表し、
   （式中、
   Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；
   Ｒ^２は、水素，ハロゲン，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基，ＣＦ_３，ＣＮ，Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基，−Ｏ−ＣＦ_３，Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基を表す）；
   Ｘ^２は、−ＣＨ_２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−もしくは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を表すか；又は、
   Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、
   Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、
   Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，
   
   を表し（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）；
   Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基，−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−，−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ又は単結合を表し；
   Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を表し；
   Ｘ^５は、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル基、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシ−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニル−Ｃ_１〜Ｃ_２アルキル基を表し；
   Ｒ^１は、−ＯＨ又は−ＮＨ_２を表し；
   ｎは、１〜４の整数を表し；
   ｍは、１〜６の整数を表し；及び、
   ｐは、１〜６の整数を表す。］
2. Ｒ^２が、水素である請求項１記載の化合物又は塩。
3. Ｒ^２が、ハロゲンである請求項１又は２記載の化合物又は塩。
4. Ｒ^２が、フッ素である請求項３記載の化合物又は塩。
5. Ｒ^２が、１つの炭素環原子に結合した２つのフッ素原子である請求項４記載の化合物又は塩。
6. Ｘ^１が、以下の式で表される請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物又は塩：
   
   （式中、Ｒ^２は請求項１〜５で定義されたとおりである。）
7. Ｘ^１が、以下の式で表される請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物又は塩：
   
   （式中、Ｒ^２は請求項１〜５で定義されたとおりである。）
8. Ｘ^１が、以下の式で表される請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物又は塩：
   
   （式中、Ｒ^２は請求項１〜５で定義されたとおりである。）
9. Ｘ^１が、以下の式で表される請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物又は塩：
   
   （式中、Ｒ^２は請求項１〜５で定義されたとおりである。）
10. Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の１つが−ＮＨ−であり、同時にＹ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の残りの５つが−ＣＨ_２−であり、かつ、Ｒ^２が請求項１〜５で定義されたとおりである、請求項１〜５のいずれか１項記載の化合物又は塩。
11. Ｘ^１が、以下から選択される式で表され、かつ、Ｒ^２が請求項１〜５で定義されたとおりである、請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又は塩：
    
12. Ｘ^１が、非置換のシクロオクチニル基である請求項１記載の化合物又は塩。
13. Ｘ^１が、１又は２のハロゲン原子で置換されたシクロオクチニル基である請求項１記載の化合物又は塩。
14. ハロゲン原子が、フッ素原子である請求項１３記載の化合物又は塩。
15. Ｘ^１が、非置換のトランス−シクロオクテニル基である請求項１記載の化合物又は塩。
16. Ｘ^２が、−Ｏ−である請求項１〜１５のいずれか１項記載の化合物又は塩。
    
17. Ｘ^３が、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−又は単結合である請求項１〜１６のいずれか１項記載の化合物又は塩。
18. 構造要素−Ｘ^２−Ｘ^３−が、主鎖に１〜６つの原子を含む請求項１〜１７のいずれか１項記載の化合物又は塩。
19. Ｘ^４が、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−である請求項１〜１８のいずれか１項記載の化合物又は塩。
20. Ｘ^４が、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である請求項１〜１９のいずれか１項記載の化合物又は塩。
21. ｎが３又は４である請求項１〜２０のいずれか１項記載の化合物又は塩。
22. 構造要素−Ｘ^２−Ｘ^３−Ｘ^４−（ＣＨ_２）_ｎ−が、主鎖に５〜１２個の原子を含み、例えば６，７，８，９，１０又は１１個の原子を主鎖に含む請求項１〜２１のいずれか１項記載の化合物又は塩。
23. Ｘ^５が、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシメチル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシエチ−１−イル、Ｃ_２〜Ｃ_７アルカノイルオキシメチル又はＣ_２〜Ｃ_７アルカノイルスルファニルエチルである請求項１〜２２のいずれか１項記載の化合物又は塩。
24. Ｘ^５が、水素である請求項１〜２３のいずれか１項記載の化合物又は塩。
25. Ｒ^１を持つ不斉炭素原子に関して、Ｓ配置である請求項１〜２４のいずれか１項記載の化合物又は塩。
26. −（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨＲ^１−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ^５が以下の式で表される請求項１〜２５のいずれか１項記載の化合物又は塩：
    
    （式中、Ｒ^１とＸ^５は請求項１〜２５で定義されたとおりである。）
27. 式Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ及びＩｄのいずれかの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項１〜２６のいずれか１項記載の化合物又は塩：
    
    
    
    
    （式中、Ｒ^１，Ｒ^２ _，Ｘ^５及びＹ^１〜Ｙ^６は、請求項１〜２６で定義されたとおりである。）
28. 以下のいずれかの式で表される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項１項記載の化合物又は塩：
    
29. 以下の式で表される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項１項記載の化合物又は塩：
    
30. 式Ｉｅの化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項１〜７、１０〜１４及び２３〜２６のいずれか１項記載の化合物又は塩：
    
    （式中、Ｒ^１，Ｒ^２ _，Ｘ^５及びＹ^１〜Ｙ^６は本明細書中に定義された通りであり、Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，
    
    を表す（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）。
31. 以下の式で表される化合物又はその酸もしくは塩基付加塩である請求項１項記載の化合物又は塩：
    
32. 以下の工程を含む、１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有する目的のポリペプチドの生産方法：
    ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む翻訳システムを提供する工程；
    （ｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）請求項１〜３１のいずれか１項記載の化合物又は塩；
    （ｉｉｉ）セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、又は、前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び、
    （ｉｖ）目的のポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチド
    （ここで、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）は、化合物又は塩（ｉｉ）を用いてｔＲＮＡ（ｉｉｉ）を特異的にアシル化することができる）；
    ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）を翻訳させて、それにより目的のポリペプチドのセレクターコドンによってコードされた位置に化合物（ｉｉ）を導入する工程。
33. 前記翻訳システムが、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する細胞である請求項３２記載の方法。
34. 前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素ある請求項３２又は３３記載の方法。
35. ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素が、配列番号１又は２に記載アミノ酸配列を含む請求項３４記載の方法。
36. １つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチドを生産するための請求項１〜３１のいずれか１項記載の化合物の使用。
    
37. 式ＩＩの残基を１つ以上含むポリペプチド。
    
    ［式中、
    Ｘ^１は、
    
    を表し、
    （式中、
    Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６は、互いに独立して−ＣＨ_２−，−ＮＨ−，−Ｓ−又は−Ｏ−を表すが、Ｙ^１，Ｙ^２，Ｙ^３，Ｙ^４，Ｙ^５，Ｙ^６の少なくとも４つは−ＣＨ_２−であり；
    Ｒ^２は、水素，ハロゲン，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル基，ＣＦ_３，ＣＮ，Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ基，−Ｏ−ＣＦ_３，Ｃ_２〜Ｃ_５アルカノイルオキシ基，Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルアミノカルボニルオキシ基又はＣ_１〜Ｃ_４アルキルチオ基を表す）；
    Ｘ^２は、−ＣＨ_２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−もしくは−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を表すか；又は、
    Ｘ^２は、＞ＣＨ−もしくは＞Ｎ−を表すか（式中、炭素原子もしくは窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して３員環を形成する）；又は、
    Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ＜もしくは−ＣＨ_２−Ｎ＜を表すか（式中、２つの炭素原子もしくは炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して４員環を形成する）；又は、
    Ｘ^２は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ＜，−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜，
    
    を表し（式中、３つの炭素原子もしくは２つの炭素原子と窒素原子は、隣接するＸ^１の２つの環原子と互いに結合して５員環を形成する）；
    Ｘ^３は、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキレン基，−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−，−（ＣＨ_２−Ｏ）_ｐ又は単結合を表し；
    Ｘ^４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ_２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を表し；
    Ｚ^１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−を表し；
    Ｒ^１は、−ＯＨ又は−ＮＨ_２を表し；
    ｎは、１〜４の整数を表し；
    ｍは、１〜６の整数を表し；及び、
    ｐは、１〜６の整数を表す。］
38. 請求項１〜３１のいずれか１項記載の化合物又は塩を含む、１つ以上のシクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリペプチドを生産するためのキット。