CN103183727B - 一种卷曲霉素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种卷曲霉素的制备方法，具体而言，涉及一种固相合成卷曲霉素的方法，包括：使Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH在有机碱的存在下于溶剂中与树脂反应，生成Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂，经脱保护和偶联步骤得到线性全保护树脂，然后经裂解、成环、脱保护得到所需产物。

Description

一种卷曲霉素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种卷曲霉素的制备方法，具体而言，涉及一种固相合成卷曲霉素的方法。
背景技术
卷曲霉素是1960年从链霉菌St r.capreolus中分离得到的碱性环状多肽，卷曲霉素包括IA、IB、IIA和IIB等，临床应用的主要是IA和IB，而IIA和IIB属于其副组分。卷曲霉素对结核分支杆菌和部分非结核分支杆菌(如堪萨斯分支杆菌)具有抑菌作用，其最低抑菌浓度(MIC)约为10μg/ml，易达到较高的血浓度，可用于治疗其致病菌对其他低毒性药物有抗性的结核病患者。
目前卷曲霉素主要通过生物合成，该方法不可避免的会产生卷曲霉素IIA或IIB两种副产物，使得分离纯化比较困难。
发明内容
为了选择性地合成卷曲霉素IA或IB，本发明提供了一种固相合成卷曲霉素的方法，包括：
(1)使Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH在有机碱的存在下于溶剂中与树脂反应，生成Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂；
(2)在脱Fmoc保护剂的存在下使Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂脱除Fmoc，然后使其在偶联剂体系的存在下于溶剂中与Boc-L-Dap(Fmoc)-OH偶联，重复上述脱除Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH，然后使反应混合物在脱Alloc保护剂的存在下于溶剂中反应，之后使其产物在偶联剂体系的存在下与Boc-β-Lys(Boc)-OH偶联，并用脱Fmoc保护剂脱除Fmoc，得到线性全保护肽树脂；
(3)在裂解剂的存在下于溶剂中使线性全保护肽与树脂分离；
(4)在偶联剂体系的存在下于溶剂中使线性全保护肽成环；
(5)在脱保护剂的存在下于溶剂中使成环的全保护肽脱除tBu、Boc和Pbf保护基。
本发明通过固相合成，在特定Dap的氨基上进行β-赖氨酰基化，从而选择性地合成了卷曲霉素IA或IB，避免了IIA和IIB的产生。
具体实施方式
本文中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。
本文中，“适量”表示所修饰的物质的用量对反应而言不是关键的，只要能达到所需目的即可，无需限于一个具体范围，而且还可以一次添加或分多次添加，本领域技术人员可以根据经验结合实际情况进行选择，例如通过检测反应终点来控制用量。
本文中，“适当时间”表示所修饰的时间对反应而言不是关键的，只要能达到所需目的即可，无需限于一个具体范围，本领域技术人员可以根据经验结合实际情况进行选择，例如通过检测反应终点来控制时间。
本文中，如无相反说明，则所述反应在常温常压下进行。
本发明中的宽泛的、优选的、更优选的、和最优选的定义和范围可以相互组合。
本文中出现的缩写所表示的中文含义列举在表1中。
表1.文中的缩写
本发明提供一种固相合成卷曲霉素的方法，包括：
(1)使Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH在有机碱的存在下于溶剂中与树脂反应，生成Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂；
(2)在脱Fmoc保护剂的存在下使Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂脱除Fmoc，然后使其在偶联剂体系的存在下于溶剂中与Boc-L-Dap(Fmoc)-OH偶联，重复上述脱除Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH，然后使反应混合物在脱Alloc保护剂的存在下于溶剂中反应，之后使其产物在偶联剂体系的存在下与Boc-β-Lys(Boc)-OH偶联，并用脱Fmoc保护剂脱除Fmoc，得到线性全保护肽树脂；
(3)在裂解剂的存在下于溶剂中使线性全保护肽与树脂分离；
(4)在偶联剂体系的存在下于溶剂中使线性全保护肽成环；
(5)在脱保护剂的存在下于溶剂中使成环的全保护肽脱除tBu、Boc和Pbf保护基。
步骤(1)：
步骤(1)中所用的树脂可为本领域内常用于此目的的树脂，优选2-CTC树脂；与氨基酸反应前，所述树脂的替代度为0.03-1.8mmol/g，优选0.05-1.5mmol/g，更优选0.08-1.2mmol/g；与氨基酸反应后，所述树脂的替代度为0.03-1.2mmol/g，优选0.05-1mmol/g，更优选0.08-0.85mmol/g；可根据树脂的用量、反应前的替代度以及所需的反应后的替代度来选择Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH的用量，通常为树脂上可与氨基酸偶联的官能团的摩尔数的1-5当量，优选2-4当量，更优选2.5-3.5当量，其中树脂上可与氨基酸偶联的官能团摩尔数为树脂重量与替代度的乘积；步骤1)中所用的有机碱为常用于此目的的有机碱，例如，但不限于，TEA、TMP、DMAP、DIPEA等及其混合物，优选DIPEA或DMAP，其用量通常为树脂上可与氨基酸偶联的官能团的摩尔数的1-5当量，优选2-4当量，更优选2.5-3.5当量；所用的溶剂为常用于此目的的溶剂，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，优选DMF或DCM，通常用溶剂溶胀树脂时，溶剂的用量为1-8ml/g树脂，优选1.5-6ml/g树脂，更优选2-4ml/g树脂，而用溶剂溶解反应物时，溶剂的用量是使反应物的浓度在0.05-1.2mmol/ml、优选0.08-1.0mmol/ml、更优选0.1-0.8mmol/ml范围内的量，然而溶剂的用量并不拘泥于以上范围，适量即可；
在步骤(1)的优选实施方案中，先用适量的溶剂使所述树脂溶胀适当的时间(例如，但不限于，0.1-5小时，优选0.2-3小时，更优选0.3-1.5小时)，然后向Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH的DMF溶液中加入所述有机碱(若使用DIPEA，则优选地在冰水浴冷却下加入DIPEA)，于室温反应一段时间(例如，但不限于，0.5-10小时，优选1-5小时，更优选1.5-3小时)；然后用适量的醇(例如，但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等，优选甲醇，最优选无水甲醇)处理树脂适当时间(例如，但不限于，0.1-5小时，优选0.2-3小时，更优选0.5-3小时)，其中，醇能与树脂中未与氢基酸反应的官能团反应(即封闭)，而且除去醇的过程能使树脂收缩；然后用适量溶剂洗涤数次，并将产物干燥(优选真空干燥)。其中的一个或多个操作可重复一次或多次。优选地通过分光光度法测量替代度。
步骤(2)：
步骤(2)中所用的脱Fmoc保护剂是本领域内常用于此目的的试剂，例如，但不限于，体积浓度为5-90体积％，优选10-70体积％，更优选15-50体积％的哌啶/DMF溶液，其用量不受限制，适量即可，可通过茚三酮检测树脂是否呈阳性来控制(若树脂无色透明，则为阴性，继续添加适当脱Fmoc保护剂，直到树脂呈阳性；若树脂显色，则为阳性，不再加入脱Fmoc保护剂)；基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，参与偶联的游离氨基酸各自的用量为1.5-10当量，优选2-5当量，更优选2.5-4当量；所述偶联剂体系可为A+B+C或A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，C为DIPEA或DIC，优选DIPEA+HOBt+PyBOP或HOBt+DIC体系，其中基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，A或B的用量各自为0.5-5当量，优选1.5-4当量，更优选2-3.5当量，C的用量各自为1-10当量，优选3-8当量，更优选4-7当量；步骤(2)中所用的溶剂与步骤(1)中的相同，优选DMF和/或DCM；所述脱Alloc保护剂为本领域内的常用脱Alloc保护剂，优选四三苯基磷钯/一苯基硅烷体系，其中，基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，四三苯基磷钯的用量为0.1-1当量，优选0.3-0.8当量，更优选0.5-0.7当量，一苯基硅烷的用量为5-15当量，优选6-13当量，更优选8-12当量；
在步骤(2)的优选实施方案中，先用适量DMF将Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂或Fmoc-Ala-CTC树脂溶胀适当时间(例如，但不限于，0.1-2小时，优选0.3-1.5小时，更优选0.5-1小时)，然后用脱Fmoc保护剂处理一段时间(例如处理3-20分钟，优选5-15分钟，最优选单独地分别用适量的脱Fmoc保护剂处理1-3次，每次3-9分钟)，用茚三酮检测反应终点后(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则适当延长反应时间，例如延长0.5-2小时，优选延长0.8-1.5小时)，在偶联剂的体系(若使用DIPEA，则优选地在冰水浴冷却下加入DIPEA)的存在下于溶剂中在10-40℃、优选15-35℃，更优选20-30℃下使其与Boc-L-Dap(Fmoc)-OH反应一段时间(例如，但不限于0.5-5小时，优选1-4小时，更优选1.5-3小时)；重复上述脱除Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH；然后使反应混合物在四三苯基磷钯和一苯基硅烷的存在下于溶剂中、在气体(优选惰性气体，例如，但不限于，氮气)的搅拌下在10-40℃、优选15-35℃，更优选20-30℃下反应0.1-2小时，优选0.2-1.5小时，更优选0.3-1小时；之后用脱Fmoc保护剂脱除Fmoc，再用与步骤(1)相同的方法洗涤和收缩树脂，得到线性全保护肽树脂。
步骤(3)：
步骤(3)中所述裂解剂为有机酸溶液，其中所述有机酸例如可为，但不限于TFE、TFA等，所述有机酸溶液所用的溶剂例如可为步骤(1)中所用的溶剂，优选DCM和/或DMF，所述有机酸在该溶液中的体积浓度为10-40体积％，优选15-35体积％，更优选18-25体积％；其用量为3-20ml/g树脂，优选5-15ml/g树脂，更优选8-12ml/g树脂；步骤(3)优选地在10-40℃、优选15-35℃，更优选20-30℃下进行0.5-5小时，优选1-4小时，更优选1.5-3小时，之后滤掉树脂，将滤液浓缩。
步骤(4)：
在步骤(4)中，所述偶联剂体系与步骤(2)相同，其中优选DIC+HOBt体系；所用偶联剂体系中，所用各组分的用量为线性全保护肽的摩尔数的1.0-3.0当量，优选1.0-2.0当量，更优选1.0-1.5当量；步骤(4)所用溶剂与步骤(1)相同，优选地为DMF，其用量根据线性全保护肽的用量进行选择，将溶液中线性全保护肽的浓度配制成0.005-0.05M，优选0.008-0.03M，更优选0.09-0.02M；步骤(4)优选地先在冰浴下(例如，但不限于，0℃以下)进行0.1-5小时，优选0.3-4小时，更优选0.5-2小时，然后于室温进行12-36小时，优选15-30小时，更优选20-28小时；经常规检测手段(例如HPLC)检测反应结束后，将反应液加入适量冰水中(例如反应液体积的5-15倍，优选8-12倍)，然后过滤收集固体，并将其干燥。
步骤(5)：
在步骤(5)中，使成环的全保护肽脱除tBu、Boc和Pbf保护基的脱保护剂为体积比为85-90∶1-5∶1-5∶1-5的TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT混合物，基于步骤(4)的固体产物重量计，其用量为3-30ml/g固体，优选2-20ml/g固体，更优选5-15ml/g固体；步骤(5)优选地在10-40℃、优选15-35℃，更优选20-30℃下进行0.5-5小时，优选1-4小时，更优选1.5-3小时，然后加入适量的(例如脱保护剂体积的5-15倍，优选8-12倍)不良溶剂(是指在室温和常压下对最终产物的溶解度小于10重量％、优选小于5重量％，更优选小于1重量％的溶剂。例如，但不限于，无水乙醚、甲基叔丁基醚等)，通过常规手段对析出的固体产物进行纯化(例如依次经过离心处理、HPLC分离提纯、冻干)，得到卷曲霉素IA或IB。
实施例
2-CTC树脂购自天津南开和成，％DVB，100～200目。氨基酸均购自吉尔生化。
反应柱购自曙光玻璃仪器厂；离心机DR600购自北京京立离心机有限公司；PT6000HPLC制备系统，购自创新通恒。
实施例1：Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂的合成
称取100g替代度为0.1mmol/g的2-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用300ml DMF溶胀树脂30分钟。将11.5g Fmoc-Ser(tBu)-OH溶解于60ml DMF，冰水浴下加入10.5mL DIPEA后，将该混合液加入上述装有树脂的反应柱中，于室温反应2小时。然后加入8mL无水甲醇封闭1小时，用适量DMF洗涤3次，适量DCM洗3次，再用适量无水甲醇封闭30分钟，通过抽干甲醇使树脂收缩，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.081mmol/g。
实施例2：Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂的合成
称取20g替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用60ml DMF溶胀树脂30分钟。将11.5gFmoc-Ser(tBu)-OH溶解于60ml DMF，冰水浴下加入10.5mL DIPEA后，将该混合液加入上述装有树脂的反应柱中，于室温反应2小时。然后加入8mL无水甲醇封闭1小时，用适量DMF洗涤3次，适量DCM洗3次，再用适量无水甲醇封闭30分钟，通过抽干甲醇使树脂收缩，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.412mmol/g。
实施例3：Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂的合成
称取10g替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用30ml DMF溶胀树脂30分钟。将11.5gFmoc-Ser(tBu)-OH溶解于60ml DMF，冰水浴下加入10.5mL DIPEA后，将该混合液加入上述装有树脂的反应柱中，于室温反应2小时。然后加入8mL无水甲醇封闭1小时，用适量DMF洗涤3次，适量DCM洗3次，再用适量无水甲醇封闭30分钟，通过抽干甲醇使树脂收缩，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.834mmol/g。
实施例4：Fmoc-Ala-CTC树脂的合成
称取100g替代度为0.1mmol/g的2-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用300ml DMF溶胀树脂30分钟。将9.3g Fmoc-Ala-OH溶解于60ml DMF，冰水浴下加入10.5mL DIPEA后，将该混合液加入上述装有树脂的反应柱中，于室温反应2小时。然后加入8mL无水甲醇封闭1小时，用适量DMF洗涤3次，适量DCM洗3次，再用适量无水甲醇封闭30分钟，通过抽干甲醇使树脂收缩，得到Fmoc-Ala-CTC树脂，检测替代度为0.085mmol/g。
实施例5：Fmoc-Ala-CTC树脂的合成
称取20g替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用60ml DMF溶胀树脂30分钟。将9.3gFmoc-Ala-OH溶解于60ml DMF，冰水浴下加入10.5mL DIPEA后，将该混合液加入上述装有树脂的反应柱中，于室温反应2小时。然后加入8mL无水甲醇封闭1小时，用适量DMF洗涤3次，适量DCM洗3次，再用适量无水甲醇封闭30分钟，通过抽干甲醇使树脂收缩，得到Fmoc-Ala-CTC树脂，检测替代度为0.421mmol/g。
实施例6：Fmoc-Ala-CTC树脂的合成
称取10g替代度为1.0mmol/g的2-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用30ml DMF溶胀树脂30分钟。将9.3gFmoc-Ala-OH溶解于60ml DMF，冰水浴下加入10.5mL DIPEA后，将该混合液加入上述装有树脂的反应柱中，于室温反应2小时。然后加入8mL无水甲醇封闭1小时，用适量DMF洗涤3次，适量DCM洗3次，再用适量无水甲醇封闭30分钟，通过抽干甲醇使树脂收缩，得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.845mmol/g。
实施例7：卷曲霉素IA线性全保护肽树脂的制备
称取12.34g替代度为0.081mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用48ml DMF溶胀树脂30分钟，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.279g Boc-L-Dap(Fmoc)-OH、0.426g HOBt和1.561gPyBOP溶解于20ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.939g Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于20ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH。然后将0.289g四三苯基磷钯和1.24ml一苯基硅烷溶解于20ml DCM，加入到反应柱中，氮气搅拌下于室温反应0.5小时，用适量DCM洗涤树脂3次，适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。
将1.039g Boc-β-Lys(Boc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于20ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，脱除完毕后用适量DMF洗涤树脂6次，再用适量DCM洗涤树脂3次，然后用适量甲醇收缩树脂，干燥，得到13.6g卷曲霉素IA线性全保护肽树脂。
实施例8：卷曲霉素IA线性全保护肽树脂的制备
称取2.43g替代度为0.412mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用8ml DMF溶胀树脂30分钟，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.279g Boc-L-Dap(Fmoc)-OH、0.426g HOBt和1.561gPyBOP溶解于8ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.939g Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于8ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH。然后将0.289g四三苯基磷钯和1.24ml一苯基硅烷溶解于8ml DCM，加入到反应柱中，氮气搅拌下于室温反应0.5小时，用适量DCM洗涤树脂3次，适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。
将1.039g Boc-β-Lys(Boc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于8ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，脱除完毕后用适量DMF洗涤树脂6次，再用适量DCM洗涤树脂3次，然后用适量甲醇收缩树脂，干燥，得到3.7g卷曲霉素IA线性全保护肽树脂。
实施例9：卷曲霉素IA线性全保护肽树脂的制备
称取1.20g替代度为0.834mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用4ml DMF溶胀树脂30分钟，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.279g Boc-L-Dap(Fmoc)-OH、0.426g HOBt和1.561gPyBOP溶解于5ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.939g Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于5ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH。然后将0.289g四三苯基磷钯和1.24ml一苯基硅烷溶解于5ml DCM，加入到反应柱中，氮气搅拌下于室温反应0.5小时，用适量DCM洗涤树脂3次，适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。
将1.039g Boc-β-Lys(Boc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于5ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，脱除完毕后用适量DMF洗涤树脂6次，再用适量DCM洗涤树脂3次，然后用适量甲醇收缩树脂，干燥，得到2.4g卷曲霉素IA线性全保护肽树脂。
实施例10：卷曲霉素IB线性全保护肽树脂的制备
称取11.76g替代度为0.085mmol/g的Fmoc-Ala-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用适量44ml DMF溶胀树脂30分钟，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.279g Boc-L-Dap(Fmoc)-OH、0.426g HOBt和1.561gPyBOP溶解于20ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.939g Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于20ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH。然后将0.289g四三苯基磷钯和1.24ml一苯基硅烷溶解于20ml DCM，加入到反应柱中，氮气搅拌下于室温反应0.5小时，用适量DCM洗涤树脂3次，适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。
将1.039g Boc-β-Lys(Boc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于20ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，脱除完毕后用适量DMF洗涤树脂6次，再用适量DCM洗涤树脂3次，然后用适量甲醇收缩树脂，干燥，得到13.0g卷曲霉素IB线性全保护肽树脂。
实施例11：卷曲霉素IB线性全保护肽树脂的制备
称取2.38g替代度为0.421mmol/g的Fmoc-Ala-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用8ml DMF溶胀树脂30分钟，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.279g Boc-L-Dap(Fmoc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于8ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.939g Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于8ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH。然后将0.289g四三苯基磷钯和1.24ml一苯基硅烷溶解于8ml DCM，加入到反应柱中，氮气搅拌下于室温反应0.5小时，用适量DCM洗涤树脂3次，适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。
将1.039g Boc-β-Lys(Boc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于8ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，脱除完毕后用适量DMF洗涤树脂6次，再用适量DCM洗涤树脂3次，然后用适量甲醇收缩树脂，干燥，得到3.6g卷曲霉素IB线性全保护肽树脂
实施例12：卷曲霉素IB线性全保护肽树脂的制备
称取1.18g替代度为0.845mmol/g的Fmoc-Ala-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用适量DMF洗涤2次，再用4ml DMF溶胀树脂30分钟，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.279g Boc-L-Dap(Fmoc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于5ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，之后用适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。将1.939g Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于5ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
按照同样的方法依次偶联Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH。然后将0.289g四三苯基磷钯和1.24ml一苯基硅烷溶解于5ml DCM，加入到反应柱中，氮气搅拌下于室温反应0.5小时，用适量DCM洗涤树脂3次，适量DMF洗涤树脂6次，借助茚三酮检测树脂呈阳性。
将1.039g Boc-β-Lys(Boc)-OH、0.426g HOBt和1.561g PyBOP溶解于5ml DMF，冰水浴下加入1.05ml DIPEA处理5分钟，将混合液加入到反应柱中，于室温反应2小时，借助茚三酮检测反应终点。
反应结束后，用适量DMF洗涤树脂3次，然后分别用适量20体积％的哌啶/DMF溶液处理树脂5分钟和7分钟以脱除Fmoc，脱除完毕后用适量DMF洗涤树脂6次，再用适量DCM洗涤树脂3次，然后用适量甲醇收缩树脂，干燥，得到2.4g卷曲霉素IB线性全保护肽树脂。
实施例13：卷曲霉素IA线性全保护肽的制备
将实施例7得到的卷曲霉素IA线性全保护肽树脂13.6g加入到250ml单口瓶中，加入135ml20％体积的TFE/DCM溶液，室温搅拌反应2小时，滤掉树脂，滤液真空浓缩，得到1.19g卷曲霉素IA线性全保护肽，纯度94.5％，总收率93.0％。
实施例14：卷曲霉素IA线性全保护肽的制备
将实施例8得到的卷曲霉素IA线性全保护肽树脂3.7g加入到50ml单口瓶中，加入37ml20体积％的TFE/DCM溶液，室温搅拌反应2小时，滤掉树脂，滤液真空浓缩，得到1.18g卷曲霉素IA线性全保护肽，纯度95.8％，总收率92.5％。
实施例15：卷曲霉素IA线性全保护肽的制备
将实施例9得到的卷曲霉素IA线性全保护肽树脂2.4g加入到50ml单口瓶中，加入24ml20体积％的TFE/DCM溶液，室温搅拌反应2小时，滤掉树脂，滤液真空浓缩，得到1.19g卷曲霉素IA线性全保护肽，纯度95.5％，总收率93.0％。
实施例16：卷曲霉素IB线性全保护肽的制备
将实施例10得到的卷曲霉素IB线性全保护肽树脂13.0g加入到250ml单口瓶中，加入130ml20体积％的TFE/DCM溶液，室温搅拌反应2小时，滤掉树脂，滤液真空浓缩，得到1.18g卷曲霉素IB线性全保护肽，纯度95.9％，总收率94.4％。
实施例17：卷曲霉素IB线性全保护肽的制备
将实施例11得到的卷曲霉素IB线性全保护肽树脂3.6g加入到50ml单口瓶中，加入36ml20体积％的TFE/DCM溶液，室温搅拌反应2小时，滤掉树脂，滤液真空浓缩，得到1.17g卷曲霉素IB线性全保护肽，纯度95.4％，总收率93.6％。
实施例18：卷曲霉素IB线性全保护肽的制备
将实施例12得到的卷曲霉素IB线性全保护肽树脂2.4g加入到50ml单口瓶中，加入24ml20体积％的TFE/DCM溶液，室温搅拌反应2小时，滤掉树脂，滤液真空浓缩，得到1.18g卷曲霉素IB线性全保护肽，纯度96.1％，总收率94.4％。
实施例19：卷曲霉素IA的制备
将实施例13得到的卷曲霉素IA线性全保护肽1.19g溶解于93mlDMF中(0.01M)，冰浴条件下加入0.15ml DIC和0.132g HOBt，继续冰浴1小时，室温反应24小时，HPLC检测原料反应完全。将反应液加入到10倍量的冰水中，过滤收集固体，干燥后得到1.04g固体。得到的固体不经过纯化处理直接用10ml TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT＝90∶5∶3∶2(体积比)的混合物溶解后室温搅拌反应2小时，然后加入100ml无水乙醚，通过离心收集析出的固体，再通过制备HPLC分离提纯，将所得馏分冻干后得到0.41g白色粉末状卷曲霉素IA，ESI-MS：[M+H]＝669.71纯度：99.5％，总收率：61％。
实施例20：卷曲霉素IA的制备
将实施例14得到的卷曲霉素IA线性全保护肽1.18g溶解于93mlDMF中(0.01M)，冰浴条件下加入0.15ml DIC和0.132g HOBt，继续冰浴1小时，室温反应24小时，HPLC检测原料反应完全。将反应液加入到10倍量的冰水中，过滤收集固体，干燥后得到1.06g固体。得到的固体不经过纯化处理直接用10ml TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT＝90∶5∶3∶2(体积比)的混合物溶解后室温搅拌反应2小时，然后加入100ml无水乙醚，通过离心收集析出的固体，再通过制备HPLC分离提纯，将所得馏分冻干后得到0.43g白色粉末状卷曲霉素IA，ESI-MS：[M+H]＝669.36纯度：99.8％，总收率：64％。
实施例21：卷曲霉素IA的制备
将实施例15得到的卷曲霉素IA线性全保护肽1.19g溶解于93mlDMF中(0.01M)，冰浴条件下加入0.15ml DIC和0.132g HOBt，继续冰浴1小时，室温反应24小时，HPLC检测原料反应完全。将反应液加入到10倍量的冰水中，过滤收集固体，干燥后得到1.10g固体。得到的固体不经过纯化处理直接用10ml TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT＝88∶5∶5∶2(体积比)的混合物溶解后室温搅拌反应2小时，然后加入100ml无水乙醚，通过离心收集析出的固体，再通过制备HPLC分离提纯，将所得馏分冻干后得到0.39g白色粉末状卷曲霉素IA，ESI-MS：[M+H]＝669.58纯度：99.6％，总收率：58％。
实施例22：卷曲霉素IB的制备
将实施例16得到的卷曲霉素IB线性全保护肽1.18g溶解于94mlDMF中(0.01M)，冰浴条件下加入0.15ml DIC和0.133g HOBt，继续冰浴1小时，室温反应24小时，HPLC检测原料反应完全。将反应液加入到10倍量的冰水中，过滤收集固体，干燥后得到1.02g固体。得到的固体不经过纯化处理直接用10ml TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT＝90∶4∶3∶3(体积比)的混合物溶解后室温搅拌反应2小时，然后加入100ml无水乙醚，通过离心收集析出的固体，再通过制备HPLC分离提纯，将所得馏分冻干后得到0.38g白色粉末状卷曲霉素IB，ESI-MS：[M+H]＝653.35纯度：99.4％，总收率：58％。
实施例23：卷曲霉素IB的制备
将实施例17得到的卷曲霉素IB线性全保护肽1.17g溶解于94mlDMF中(0.01M)，冰浴条件下加入0.15ml DIC和0.133g HOBt，继续冰浴1小时，室温反应24小时，HPLC检测原料反应完全。将反应液加入到10倍量的冰水中，过滤收集固体，干燥后得到1.03g固体。得到的固体不经过纯化处理直接用10ml TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT＝87∶5∶5∶3(体积比)的混合物溶解后室温搅拌反应2小时，然后加入100ml无水乙醚，通过离心收集析出的固体，再通过制备HPLC分离提纯，将所得馏分冻干后得到0.40g白色粉末状卷曲霉素IB，ESI-MS：[M+H]＝653.39纯度：99.6％，总收率：61％。
实施例24：卷曲霉素IB的制备
将实施例18得到的卷曲霉素IB线性全保护肽1.18g溶解于94mlDMF中(0.01M)，冰浴条件下加入0.15ml DIC和0.133g HOBt，继续冰浴1小时，室温反应24小时，HPLC检测原料反应完全。将反应液加入到10倍量的冰水中，过滤收集固体，干燥后得到1.00g固体。得到的固体不经过纯化处理直接用10ml TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT＝90∶5∶3∶2(体积比)的混合物溶解后室温搅拌反应2小时，然后加入100ml无水乙醚，通过离心收集析出的固体，再通过制备HPLC分离提纯，将所得馏分冻干后得到0.39g白色粉末状卷曲霉素IB，ESI-MS：[M+H]＝653.40纯度：99.5％，总收率：60％。

Claims (28)

1.一种固相合成卷曲霉素的方法，包括：
(1)使Fmoc-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Ala-OH在有机碱的存在下于溶剂中与树脂反应，生成Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂；
(2)在脱Fmoc保护剂的存在下使Fmoc-Ser(tBu)-树脂或Fmoc-Ala-树脂脱除Fmoc，然后使其在偶联剂体系的存在下于溶剂中与Boc-L-Dap(Fmoc)-OH偶联，重复上述脱除Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-卷须酶啶(Pbf)-OH、Fmoc-β-酰脲脱氢丙氨酸和Fmoc-Dap(Alloc)-OH，然后使反应混合物在脱Alloc保护剂的存在下于溶剂中反应，之后使其产物在偶联剂体系的存在下与Boc-β-Lys(B0c)-OH偶联，并用脱Fmoc保护剂脱除Fmoc，得到线性全保护肽树脂；
(3)在裂解剂的存在下于溶剂中使线性全保护肽与树脂分离；
(4)在偶联剂体系的存在下于溶剂中使线性全保护肽成环；
(5)在脱保护剂的存在下于溶剂中使成环的全保护肽脱除tBu、Boc和Pbf保护基。
2.权利要求1的方法，其中(1)中所述树脂为2-CTC树脂，氨基酸反应前，所述树脂的替代度为0.03-1.8mmol/g；与氨基酸反应后，所述树脂的替代度为0.03-1.2mmol/g。
3.权利要求2的方法，其中氨基酸反应前，所述树脂的替代度为0.05-1.5mmol/g。
4.权利要求2的方法，其中氨基酸反应前，所述树脂的替代度为0.08-1.2mmol/g。
5.权利要求2的方法，其中与氨基酸反应后，所述树脂的替代度为0.05-1mmol/g。
6.权利要求2的方法，其中与氨基酸反应后，所述树脂的替代度为0.08-0.85mmol/g。
7.权利要求1或2的方法，其中(2)中所述脱Fmoc保护剂是体积浓度为5-90体积％的哌啶/DMF溶液。
8.权利要求7的方法，其中(2)中所述脱Fmoc保护剂是体积浓度为10-70体积％的哌啶/DMF溶液。
9.权利要求7的方法，其中(2)中所述脱Fmoc保护剂是体积浓度为15-50体积％的哌啶/DMF溶液。
10.权利要求1或2的方法，其中(2)中所述脱Alloc保护剂为四三苯基磷钯/一苯基硅烷体系，其中，基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，四三苯基磷钯的用量为0.1-1当量，一苯基硅烷的用量为5-15当量。
11.权利要求10的方法，其中基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，四三苯基磷钯的用量为0.3-0.8当量，一苯基硅烷的用量为6-13当量。
12.权利要求10的方法，其中基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，四三苯基磷钯的用量为0.5-0.7当量，一苯基硅烷的用量为8-12当量。
13.权利要求1或2的方法，其中(5)中所述脱保护剂是体积比为85-90∶1-5∶1-5∶1-5的TFA∶苯甲硫醚∶苯甲醚∶EDT混合物，基于步骤(4)的固体产物重量计，其用量为3-30ml/g固体。
14.权利要求13的方法，其中(5)中所述脱保护剂基于步骤(4)的固体产物重量计，其用量为2-20ml/g固体。
15.权利要求13的方法，其中(5)中所述脱保护剂基于步骤(4)的固体产物重量计，其用量为5-15ml/g固体。
16.权利要求1或2的方法，其中所述偶联剂体系为A+B+C或A+C，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，C为DIPEA或DIC，其中基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，A或B的用量各自为0.5-5当量，C的用量各自为1-10当量。
17.权利要求16的方法，其中所述偶联剂体系为DIPEA+HOBt+PyBOP或HOBt+DIC体系。
18.权利要求16的方法，其中基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，A或B的用量各自为1.5-4当量，C的用量各自为3-8当量。
19.权利要求16的方法，其中基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，A或B的用量各自为2-3.5当量，C的用量各自为4-7当量。
20.权利要求1或2的方法，其中(3)中所述裂解剂为有机酸溶液，其中所述有机酸为TFE或TFA，所述有机酸溶液所用的溶剂为步骤(1)中所用的溶剂，所述有机酸在该溶液中的体积浓度为10-40体积％；其用量为3-20ml/g树脂。
21.权利要求20的方法，其中所述有机酸溶液所用的溶剂为DCM和/或DMF。
22.权利要求20的方法，其中所述有机酸在该溶液中的体积浓度为15-35体积％；其用量为5-15ml/g树脂。
23.权利要求20的方法，其中所述有机酸在该溶液中的体积浓度为18-25体积％；其用量为8-12ml/g树脂。
24.权利要求1或2的方法，其中的反应在气体的搅拌下进行。
25.权利要求24的方法，其中的反应在惰性气体的搅拌下进行。
26.权利要求1或2的方法，其中(1)中所述有机碱为TEA、TMP、DMAP、DIPEA及其混合物。
27.权利要求26的方法，其中(1)中所述有机碱为DIPEA或DMAP。
28.权利要求1或2的方法，其进一步包括采用HPLC对最终产品进行纯化。
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