CN102304167B

CN102304167B - 一种合成含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元的多肽的新方法

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Publication number: CN102304167B
Application number: CN2011102032111A
Authority: CN
Inventors: 张新军; 张文涛
Original assignee: ZHONGKE YAGUANG BIOTECH CO Ltd BEIJING
Current assignee: ZHONGKE YAGUANG BIOTECH CO Ltd BEIJING
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2011-07-20
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-07-20
Also published as: CN102304167A

Abstract

本发明关于一种制备含有天冬氨酸-精氨酸衍生物[Asp-Arg(X)]单元的多肽的新策略，尤其适用于由于精氨酸或精氨酸衍生物在合成过程中会促进天冬酰亚胺副反应的多肽序列，和用这种方法得到的产物。此方法包括一种利用片段缩合法优化多肽合成条件的策略，在这种策略中，多肽序列在Asp-Arg(X)处被分为两段且分别合成，其中包含Asp残基的一段在对酸高度敏感的2-氯三苯甲基氯树脂(CTC树脂)上进行合成，制备得到的全保护片段(氮端以及侧链均被保护)偶联到另一片段的Arg(X)的氨基上从而完成整个序列的合成。切割得到的粗肽通过常规的高效液相色谱法进行纯化，最终得到目标多肽的纯品。此方法有效压制了Arg(X)的碱性胍基侧链对天冬酰亚胺副反应的促进效应，极大提高了此类多肽的合成成功率以及最终产物的纯度。

Description

一种合成含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元的多肽的新方法

技术领域

本发明关于一种在多肽固相合成中制备序列中含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]单元的多肽的新方法，尤其适用于由于精氨酸或精氨酸衍生物的存在导致合成中易发生天冬酰亚胺副反应的多肽序列，和用这种方法得到的产物。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，人类基因的注释与确认已成为生命科学面临的最重要任务之一。而蛋白质是生命活动的功能执行体，人类基因组中绝大部分基因及其功能有待于在蛋白质水平上的揭示与阐述。所以蛋白质组研究已成为21世纪生命科学的焦点之一，它将全景式地揭示生命活动的本质，特别是人体健康与疾病的机制，将直接关系到未来整个生物技术及相关产业的发展空间和市场份额，是国际生物科技的战略制高点。在人类后基因组即蛋白质组学研究中，将需要合成大量的多肽和蛋白质，其市场前景不可低估。

多肽是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的一类化合物，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间，是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。多肽的全合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽全合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。并且，从动物、植物和微生物等生物体中分离提取多肽极受来源的限制，多肽的化学合成则具有更光明的工业化前景。

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从羧基端向氨基端合成。过去的多肽合成是在溶液中进行的，但自从1963年Merrifield发展成功了固相多肽合成方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法无法比拟的优点。其基本原理是：先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链。重复(缩合→洗涤→去保护→洗涤→下一轮缩合)操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。其中α-氨基用Boc(叔丁氧羰基)保护的称为Boc固相合成法，α-氨基用Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的称为Fmoc固相合成法。

天冬酰亚胺的形成是固相合成中最常见的副反应之一，其发生机理是α-酰胺键中的氮原子与侧链β-羧基之间的关环反应。在目前广泛采用的Fmoc/tBu合成策略中这个问题尤其严重，这是因为在合成过程中去除氨基的保护基Fmoc时要频繁使用六氢吡啶(PIPE)，而PIPE是一种仲胺分子，其碱性能促进此副反应的发生。形成的五元环天冬酰亚胺分子在碱性条件下非常容易发生消旋，而且其它亲核试剂也可进攻酰胺键发生开环反应，从而产生多种副反应产物。例如，水分子进攻天冬酰亚胺产生β-天冬氨酸多肽；而PIPE导致的开环反应则产生α-和β-六氢吡啶多肽分子。图1给出了天冬酰亚胺副反应的发生机理以及产生的多种副产物的化学结构。

通常来说，在常规多肽固相合成中天冬酰亚胺产物的形成比例比较低，在优化条件(如去除Fmoc时使用的PIPE溶液中添加1-羟基苯并三唑)中一般都可以制备得到正确的目标多肽。但在合成中我们发现，含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元的多肽分子在合成过程中会遇到很大的困难，得到粗肽的纯度较低，天冬酰亚胺相关的副产物严重干扰反相高效液相色谱的纯化，不能制备出纯度高的目标多肽产物，如采用标准的Fmoc/tBu固相多肽合成法合成多肽1(H-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-[Arg(Me) ₂ ]-Arg-Glu-Arg-Pro-Tyr-OH)时，粗肽质谱图(图2)上除了正确的分子离子峰外，还出现了含量很高的分子量较理论分子量大67D的组分。这种情况有时会非常严重时，得到的是完全错误的产物，如合成多肽2(H-Gly-Asp-[Arg(Me)2]-Gly-Gly-Phe-GlyPro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-Arg-Arg-Glu-Arg-Pro-Tyr-OH)时，得到的粗肽的分子量比理论分子量小18D，质谱图见图3，未出现正确产物的离子峰。这些都是典型的与天冬酰亚胺相关的副产物。

这种现象是由精氨酸的侧链胍基具有的碱性引起的，其与碱性的PIPE分子共同作用极大程度的促进合成过程中在相邻天冬氨酸上发生天冬酰亚胺副反应的可能，从而导致整个合成的彻底失败。这种情况下，就需要一种合成含有这类天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元的有效方法，以最大程度的压制天冬酰亚胺副反应的发生。本发明的一个目的就是针对这类特殊序列提供一种简单可行的合成策略，提高这类多肽分子的合成成功率。本发明的进一步的目的是提高粗品纯度，以提供具有更高纯度(＞95％)的最终多肽产品。

发明内容

本发明关于一种在多肽固相合成中制备含有精氨酸以及精氨酸及衍生物单元的多肽的新方法，尤其适用于由于精氨酸或精氨酸衍生物的存在导致合成过程中易发生天冬酰亚胺副反应的多肽序列，和用这种方法得到的产物。此方法包括一种，在树脂上分别合成以精氨酸以及精氨酸衍生物为分割点的两段序列，而后将此两段序列连接而成制备目标多肽的的策略，在这种方法中，分段合成使得天冬氨酸残基彻底避免了同时接触碱性的精氨酸胍基侧链和PIPE的环境，有效压制了天冬酰胺副反应的产生，提高这类多肽的合成成功率。

此种制备含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]单元的多肽的方法如图4所示，1)其特征在于，该方法依次包括下列步骤：①将多肽序列在Asp-Arg(X)处分为两段，一段以Asp作为羧基端，标记为片段A；另一段以Arg(X)作为氨基端，标记为片段B；片段A在对酸高度敏感的2-氯三苯基氯(CTC)树脂上采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法进行合成，弱酸性条件下切割制备得到全保护的片段，在这种切割条件下，连接在氨基端氨基上的基团以及侧链基团的保护基均不受影响。②采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法合成片段B，采用25体积％六氢吡啶(PIPE)/二甲基甲酰胺(DMF)处理去除Arg(X)的α-氨基的Fmoc保护基。③将片段A的羧基进行活化，与片段B的氨基端氨基进行缩合，从而完成整个序列的合成。④使用三氟乙酸切割条件将肽链从树脂上切割下来，在此酸性条件下氨基酸侧链保护基也均被去除，利用反相高效液相色谱仪对粗肽进行纯化，制备得到目标多肽纯品。2)本方法的特征在于，将多肽序列在Asp-Arg(X)处分为两段分别进行合成。3)本方法的特征在于，片段A在对酸高度敏感的CTC树脂上进行合成以制备全保护的片段。4)本方法的特征在于，多肽序列中的Arg(X)包括但不仅限于精氨酸Arg，单甲基化精氨酸Arg(Me)，双甲基化精氨酸Arg(Me)₂和三甲基化精氨酸Arg(Me)₃。5)本方法的特征在于，合成过程中的Asp的羧基保护基包括但不仅限于叔丁氧基(OtBu)，烯丙氧基(OAll)，苄氧基(OBzl)，甲氧基(OMe)。6)本方法的特征在于，包含天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元，但不仅限于一个天冬氨酸-精氨酸及衍生物单元。

需要指出的是，此方法采用两段序列分别合成的方式，能够大幅提高多肽的合成速度；另外在多肽固相合成中由于某些二级结构的形成会包埋反应位点，导致合成难度增大，而这种片段缩合法能阻止这些二级结构的形成，从而明显降低了合成难度，这也是传统方法所不具备的重要优势。

附图说明

图1是多肽固相合成中天冬酰亚胺副反应的发生机理以及产生的多种副产物的化学结构。

图2是多肽1采用常规固相合成法得到粗品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)图。理论分子量2603D，测得分子量为2603D和2672D，前者对应产物的分子离子峰，后者为天冬酰亚胺副反应产生的PIPE加合物。

图3是多肽2采用常规固相合成法得到粗品的MALDI-TOF质谱图。理论分子量3045D，测得分子量为3026D，对应为天冬酰亚胺副反应产生的脱水产物。

图4是本专利描述的新方法用于制备含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]单元的多肽的流程图。

图5是多肽3采用新方法合成得到的粗品的MALDI-TOF质谱图。理论分子量3272D，测得分子量为3273D，对应为目标多肽的分子离子峰。

图6是多肽3采用新方法制备得到纯品的RP-HPLC检测图。最终的产品纯度达到了95％以上。流动相为水与乙腈的混合体系，检测波长为220nm，浓度1mg/ml。

图7是多肽4采用新方法合成得到的粗品的MALDI-TOF质谱图。理论分子量3272D，测得分子量为3272D，对应为目标多肽的分子离子峰。

图8是多肽4采用新方法制备得到纯品的RP-HPLC检测图。最终的产品纯度达到了98％以上。流动相为水与乙腈的混合体系，检测波长为220nm，浓度1mg/ml。

具体实施方式

将多肽序列在Asp-Arg(X)处分为两段：一段以Asp作为羧基端，标记为片段A；另一段以Arg(X)作为氨基端，标记为片段B。

两个片段的合成均采用手动固相Fmoc/tBu法，从羧基端向氨基端方向合成。25体积％六氢吡啶/DMF浸泡树脂两次以去除氨基的Fmoc保护基使氮基端成为自由氨基，第一次时长8分钟，第二次时长10分钟。而后，用3倍当量氨基酸/1-羟基苯并三唑(HOBt)/N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)与树脂进行接枝引入C端第二个氨基酸残基。如此反复依次连接各个氨基酸残基以完成整条多肽的合成。以上每步反应后都需用二甲基甲酰胺洗涤树脂八次以上，并且都通过Kaiser Test检测来对反应进行控制，若某个氨基酸缩合反应不完全，重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段。

两个片段A和B的合成不同之处在于，其中片段A是在对酸高度敏感的2-氯三苯基氯(CTC)树脂上进行合成，完成本片段的整个序列后，最后一个氨基酸的氨基保护基Fmoc保留在多肽序列中；弱酸性条件1体积％三氟乙酸/二氯乙烷中切割1小时，滤液加入到10倍量石油醚/无水乙醚(1∶1，v/v)中使多肽沉淀析出，离心后干燥，即得到片段A的粗品。在此切割条件下连接在氨基端氨基上的以及所有氨基酸侧链的保护基均不受影响，制备得到的是全保护的片段。片段B的合成完成后不进行切割，使整个片段仍接枝在树脂上；而去除最后末端氨基的Fmoc保护基后，其氨基端以自由氨基形式存在，。

得到的片段A粗品纯度很高，不用进一步的纯化即可直接用于合成。用DIC/HOBt法对其羧基端活化后与在树脂上的片段B发生酰胺化反应，此过程通过Kaiser Test进行监测，若缩合反应不完全，重复缩合一次。反应完成后得到的序列即为目标多肽的全部序列。使用切割试剂(三氟乙酸∶1，2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶苯酚∶水∶三异丙基硅烷＝68.5∶10∶10∶5∶3.5∶1，v/v)将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基(30℃下切割3小时)。滤液加入到10倍量冷的无水乙醚中使多肽沉淀析出，离心去除乙醚。用乙醚洗涤多肽粗品三次，分别离心后干燥。

采用HP1100型(美国安捷伦公司)反相高效液相色谱仪对粗品进行纯化。多肽浓度为5mg/ml，色谱柱型号：Daiso C18(10μm，

50×250mm)。色谱操作条件：流动相A为含0.05体积％三氟乙酸，2体积％乙腈的水溶液，流动相B为90体积％乙腈水溶液，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220nm。收集对应的组分，冻干溶剂后即得蓬松状态的多肽纯品。其化学结构由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行表征，而其纯度则由分析型高效液相色谱仪(KromasilC18-10×250mm，流速：每分钟1毫升，检测波长：220纳米)给出。

本发明也提供了用本发明提供的方法得到的多肽制品。从这些结果可以看到，用这种方法合成序列中含有天冬氨酸-精氨酸及衍生物[Asp-Arg(X)]单元的多肽时，避免了天冬酰亚胺副反应导致的杂质的产生，经RP-HPLC纯化后均得到高纯度的目标多肽分子，无论从收率还是纯品纯度上来说，此方法都是传统多肽合成法不可比拟的。这些例子都是为了说明本专利，而在任何方面都不能理解为对本发明范围的限制。

实施例1

多肽3的序列为Biotin-Gly-Asp-[Arg(Me)₂]-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-Arg-Arg-Glu-Arg-Pro-Tyr-OH。由于Asp-[Arg(Me)₂]单元的存在，使得Asp残基上极其容易发生形成天冬酰胺的副反应，导致采用传统方法不能制备目标多肽分子。在CTC树脂上采用固相合成序列Biotin-Gly-Asp，1体积％三氟乙酸/二氯乙烷中切割1小时，滤液加入到10倍量石油醚/无水乙醚(1∶1，v/v)中使多肽沉淀析出，离心后干燥，即得到Biotin-Gly-Asp(OtBu)-OH的粗品。将此片段与H-[Arg(Me)₂]-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Glu(OtBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Pro-Tyr(tBu)-王树脂进行片段缩合，得到整条目标多肽的序列。切割后得到粗肽产物，经RP-HPLC纯化即得目标多肽纯品。

实施例2

多肽4的序列为Biotin-Gly-Asp-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-[Arg(Me)₂]-ArgGlu-Arg-Pro-Tyr-OH。由于Asp-[Arg(Me)₂]单元的存在，使得Asp残基上极其容易发生形成天冬酰胺的副反应，采用传统方法不能制备目标多肽分子。在CTC树脂上采用固相合成序列Biotin-Gly-Asp-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys-Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Glu-His-Arg-Gln-Asp-OH，1体积％三氟乙酸/二氯乙烷中切割1小时，滤液加入到10倍量石油醚/无水乙醚(1∶1，v/v)中使多肽沉淀析出，离心后干燥，即得到Biotin-Gly-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly-Gly-Phe-Gly-Pro-Gly-Lys(Boc)-Met-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Glu(OtBu)-His(Trt)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-OH的粗品。将此片段与H-[Arg(Me)₂]-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Pro-Tyr(tBu)-王树脂进行片段缩合，完成整条目标多肽的序列合成。切割后得到粗肽产物，经RP-HPLC纯化即得目标多肽纯品。

Claims

1.一种制备含有天冬氨酸-双甲基化精氨酸Asp-Arg(Me)₂单元的多肽的方法，其特征在于，该方法依次包括下列步骤：

a)将多肽序列在Asp-Arg(Me)₂处分为两段，一段以Asp作为羧基端，标记为片段A；另一段以Arg(Me)₂作为氨基端，标记为片段B；片段A在对酸高度敏感的2-氯三苯甲基氯树脂上采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法进行合成，弱酸性条件1体积％三氟乙酸/二氯甲烷下切割制备得到全保护的片段，在这种切割条件下，连接在氨基端氨基上的基团以及侧链基团的保护基均不受影响；

b)采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)法合成片段B，采用25体积％六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液处理去除Arg(Me)₂的α-氨基的Fmoc保护基；

c)将片段A的羧基端羧基进行活化，与片段B的氨基端氨基进行缩合，从而完成整个序列的合成；

d)使用三氟乙酸切割条件将肽链从树脂上切割下来，在此酸性条件下氨基酸侧链保护基也均被去除，利用反相高效液相色谱仪纯化粗肽，制备得到目标多肽的纯品。