CN105218641A

CN105218641A - 一种依非巴特的制备方法

Info

Publication number: CN105218641A
Application number: CN201510754380.2A
Authority: CN
Inventors: 叶仲林
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-11-09
Filing date: 2015-11-09
Publication date: 2016-01-06

Abstract

本发明属于多肽药物合成领域，具体涉及依非巴特的制备方法。本发明方法包括：(1)以保护氨基酸、片段和氨基树脂为原料，采用多肽固相合成法依次偶联得到依非巴特肽树脂X-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-pro-Cys(R₁)-氨基树脂，其中R₁为Trt、Mtt、Mmt或Dmt；X为Mpr(R₂)-Harg，R₂为Mtt、Mmt或Dmt；(2)依非巴特肽树脂加入酸解试剂酸解，得还原型依非巴特粗品；(3)还原型依非巴特粗品氧化，得依非巴特粗品；(4)依非巴特粗品通过C₁₈柱分离纯化，得依非巴特。本发明的优点采用了Fmoc-Cys(R₁)和片段Mpr(R₂)-Harg，既避免了使用高价格的原料Fmoc-Harg(Pbf)-OH，同时使肽树脂酸解条件更为温和，能有效地避免杂质的产生，产品纯度可达99.5%以上，具有产业化前景。

Description

一种依非巴特的制备方法

技术领域

本发明属于药物合成领域，具体涉及一种新的依非巴特的制备方法。

背景技术

依非巴特（Eptifibatide）是人工合成的环状七肽，为糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体(血小板凝血因子Ⅰ受体)拮抗剂，能够阻滞血小板聚集，具有非常强大的抗血小板聚集作用。其肽序结构如下：

依非巴特结构为：

CAS#：148031-34-9；分子式：C₃₅H₄₉N₁₁O₉S₂；分子量：831.96。

依非巴特为糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体(血小板凝血因子Ⅰ受体)拮抗剂。能选择性、可逆性抑制血小板聚集的最终共同通路(血浆凝血因子Ⅰ与GPⅡb/Ⅲa结合)，可逆转因血栓形成而导致的缺血状态该品种由美国CORTherapeutics公司开发，1998年在美国上市，商品名Intergrelin。能够阻滞血小板聚集，具有非常强大的抗血小板聚集作用，用于急性冠脉综合征及经皮冠状动脉介入治疗。

依非巴特的制备方法，国内外已有文献和专利报道，中国专利CN1500805A、CN1858060A、CN102584944A公开了依非巴特的制备方法，其制备方法都采用Fmoc固相合成法，以氨基树脂为开始的载体树脂，依次接入保护氨基酸，所得肽树脂酸解而得还原型依非巴特粗品，再氧化得到依非巴特。中国专利CN1500805A，原料使用了Mpr(Bzl)和Fmoc-Harg(Pbf)-OH，由于Mpr(Bzl)上的基团Bzl酸解条件苛刻，依非巴特肽树脂须采用酸解试剂（TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)，很容易产生杂质，同时Fmoc-Harg(Pbf)-OH价格较贵；中国专利CN1858060A，原料使用了片段Mpr(Trt)-Harg(Boc₂)-OH，但片段Mpr(Trt)-Harg(Boc₂)-OH的制备较繁琐。中国专利CN102584944A原料采用了两个片段Mpr(TrtorAcm)-Harg-OH和Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-OH，工艺复杂。本发明的优点采用了Fmoc-Cys(R₁)和片段Mpr(R₂)-Harg，既避免了使用价格高的Fmoc-Harg(Pbf)-OH，同时使肽树脂酸解条件更为温和，能有效地避免杂质的产生，产品纯度可达99.5%以上，具有产业化前景。

发明内容

本发明旨在提供一种新的依非巴特的制备方法，该制备方法采用了Fmoc-Cys(R₁)和片段Mpr(R₂)-Harg，既避免了使用高价格的原料Fmoc-Harg(Pbf)-OH，同时使肽树脂酸解条件更为温和，能有效地避免杂质的产生，提高产品收率和纯度，有利于规模化生产，具有产业化前景。

本发明依非巴特的制备方法，(1)、以保护氨基酸、片段和氨基树脂为原料，采用多肽固相合成法依次偶联得到肽树脂X-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-pro-Cys(R₁)-氨基树脂，其中R₁为Trt、Mtt、Mmt或Dmt;X为Mpr(R₂)-Harg，R₂为Mtt、Mmt或Dmt；(2)、加入酸解试剂(TFA/TIS/EDT/H₂O)酸解，用乙醚沉淀并收集还原型依非巴特粗品；(3)、将还原型依非巴特粗品氧化，得依非巴特粗品；(4)、将依非巴特粗品通过C₁₈柱分离纯化，获得目标产物依非巴特。

本发明所述的氨基树脂，可选RinkAmide树脂、RinkAmideAM树脂、RinkMBHA树脂和Sieber树脂中的一种，优选为RinkAmideAM树脂。

进一步地，所选氨基树脂取代值为0.4～1.2mmol/g树脂，优选为0.5～1.0mmol/g树脂。

本发明所述的保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc--Trp(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(R₁)-OH；其中R₁为Trt、Mtt、Mmt或Dmt；所述片段为Mpr(R₂)-Harg-OH或其形成的盐；R₂为Mtt、Mmt或Dmt。

其中，片段Mpr(R₂)-Harg-OH结构：

进一步地，片段Mpr(R₂)-Harg-OH对应以下表1中结构：

表1为片段Mpr(R₂)-Harg-OH所对应的结构

进一步地，片段Mpr(R₂)-Harg-OH还包含它所形成的盐，如盐酸盐、碱金属盐、有机胺盐等。

其中，保护Fmoc-Cys(R₁)-OH结构：

进一步地，保护氨基酸Fmoc-Cys(R₁)-OH对应以下表2中结构：

表2保护氨基酸Fmoc-Cys(R₁)-OH所对应的结构

进一步地，本发明所述的保护氨基酸、片段中Mpr(R₂)-Harg-OH有3种结构可选，Fmoc-Cys(R₁)-OH有4种结构可选，保护氨基酸、片段的组合方式有12种。优选的，保护氨基酸、片段为Mpr(Mmt)-Harg-OH.HCl、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH。

本发明所述的偶联合成法具体包含三步反应：(1)、保护氨基酸或片段的活化反应：将保护氨基酸或片段，加溶剂搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入偶联剂，反应0.25～2小时，得保护氨基酸或片段的活化酯溶液。(2)、保护氨基酸或片段与树脂的偶联反应：将保护氨基酸或片段的活化酯溶液加入氨基树脂或前一步反应得到的去Fmoc保护的肽树脂中，室温搅拌偶联反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用溶剂洗涤6次，抽干。(3)、Fmoc基团的脱除反应：加入脱除保护基团Fmoc的试剂的溶液，搅拌反应0.25～1小时，抽干；用溶剂洗涤6次，抽干，得肽树脂。

本发明所述偶联所用的偶联剂为DCC/HOBt、DCC/HOAt、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HBTU/DIPEA、HBTU/NMM、HBTU/TEA、TBTU/DIPEA、TBTU/NMM、TBTU/TEA、HATU/DIPEA、HATU/NMM、HATU/TEA中的一种。优选为DIC/HOBt。

本发明所述的偶联反应，其反应物的摩尔比为氨基树脂：Fmoc-氨基酸或片段=1：1.5-5，优选为1：3。

本发明所述的保护氨基酸或片段的活化反应，其反应物的摩尔比为Fmoc-氨基酸或片段：DIC：HOBt=1：1.05-1.3：1.1～1.5，优选为1：1.05：1.2。反应时间为0.25-2小时，优选为0.5小时。反应溶剂为DMF、DCM、NMP、THF，优选为DMF。

本发明所述的偶联反应，其偶联反应时间为1～8小时，优选为2～3小时。

本发明所述的偶联反应，脱除保护基团Fmoc的试剂为10～30%PIP/DMF（体积百分数）溶液，优选的为20%。用量为每克料树脂5～15ml，优选为每克投料树脂8～12ml。去保护反应时间为10～60分钟，优选为20～35分钟。

本发明所述的偶联反应洗涤溶剂为DMF、DCM，优选为DMF。

本发明所述的依非巴特肽树脂酸解反应具体为：依非巴特肽树脂加入酸解试剂，室温搅拌反应，同时脱去树脂及侧链保护基，过滤、滤洗，滤液和洗液合并，浓缩至少量，加乙醚沉淀，过滤、滤洗、干燥得还原型依非巴特粗品。

还原型依非巴特粗品结构为Mpr-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH₂。

所述依非巴特树脂酸解时采用的酸解试剂为三氟醋酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、1，2-乙二硫醇（EDT）和水(H₂O)混合溶液，其体积比为其体积比为TFA：TIS：EDT：H₂O=90-95：1-3：2-4：2-4。优选的，TFA：TIS：EDT：H₂O=95：1：2：2。

所述依非巴肽特肽树脂酸解所需酸解试剂用量为4～15ml/g肽树脂，优选的，8～12ml/g肽树脂。

非巴肽特肽树脂酸解反应条件为室温搅拌反应1～4小时，优选的，2小时。

本发明所述的将还原型依非巴特粗品氧化得依非巴特粗品，具体为：还原型依非巴特粗品用醋酸溶解，用氧化剂氧化环化，还原型依非巴特结构中Mpr中的巯基（SH）和Cys中的（SH）经氧化形成二硫键（S-S）而得到依非巴特粗品。

氧化所需的溶剂为10～40%醋酸水溶液（体积百分比浓度），优选的，25%。

氧化所需的溶剂的量为0.2～1ml/mg还原型依非巴特，优选的，0.5ml/mg。

氧化剂为O₂、碘、H₂O₂或DMSO中的一种。优选的，氧化剂为碘。

本发明所述的将依非巴特粗品通过C₁₈柱分离纯化得依非巴特纯品，具体方法为：依非巴特粗品，加适量的25%醋酸水溶液搅拌溶解，溶液用0.45μm混合滤膜过滤，得依非巴特粗品溶液，粗品溶液用制备高效液相色谱进行纯化和脱盐，所得溶液浓缩、过滤、冻干得依非巴特纯品。

本发明所述的制备高效液相色谱纯化，其具体为：色谱柱填料为9μm的反相C18，流动相A：0.1%TFA-H₂O，流动相B：0.1%TFA-CH₃CN，色谱柱为100mm×270mm，流速为125ml/min，采用梯度洗脱。取粗品溶液，上样于色谱柱中，启动制备程序进行洗脱，收集、合并合格产品溶液，用旋转蒸发仪、38-40水浴条件下减压浓缩，蒸去大部分乙腈，用0.45μm滤膜过滤，得依非巴特纯化浓缩液，用于制备高效液相色谱进行换盐。

本发明所述的制备高效液相色谱脱盐，其具体为：色谱柱填料为9μm的反相C18，流动相A：1%HOAc-H₂O，流动相B：CH₃CN，色谱柱为100mm×270mm，流速为125ml/min，采用梯度洗脱。取纯化浓缩液，上样于色谱柱中，启动制备程序进行洗脱，收集、合并合格产品溶液，用旋转蒸发仪、38-40水浴条件下减压浓缩，蒸去大部分乙腈，用0.45μm滤膜过滤，得依非巴特醋酸盐浓缩液，用于冻干。

依非巴特醋酸盐浓缩液，冷冻干燥，得产品。

本发明采用了Fmoc-Cys(R₁)和片段Mpr(R₂)-Harg，肽树脂酸解条件更为温和，能有效地避免杂质的产生，产品纯度大于99.5%，单一杂质小于0.15%，有利于规模化生产，具有产业化前景。

具体实施方式

本发明所使用的缩写的含义列于下表3中：

表3本发明所使用的缩写的含义对照表

下述实施例仅为典型范例，通过这些典型范例将有助于进一步说明和理解本发明，但这些典型范例不限制本发明的内容。

实施例1：Mpr(Mmt)-Harg-OH.HCl的合成

200g3-巯基丙酸（Mpr）加2.5LN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，冰水冷却，搅拌下慢慢加入582g4-甲氧基三苯基氯甲烷（Mmt-Cl），加完4-甲氧基三苯基氯甲烷后，再搅拌反应8小时。搅拌下向反应液加5L水，析出固体，固体用水洗5次（每次2L），过滤，再乙酸乙酯洗3次（每次2L），过滤，60℃干燥得611g产品Mpr(Mmt)-OH（收率85.7%）。

600gMpr(Mmt)-OH和201gHOSu加3L四氢呋喃（THF）溶解，冰水冷却，搅拌下慢慢加入327gN,N'-二环己基碳二亚胺（DCC)，自然升至室温，再室温反应15小时。过滤，固体用THF洗3次（每次0.5L），合并滤液和洗液，40℃真空浓缩至少量，加2L乙酸乙酯研磨，析出固体，过滤，固体用乙酸乙酯洗3次（每次2L），过滤，45℃干燥得687g产品Mpr(Mmt)-OSu（收率91.1%）。

321g高精氨酸盐酸盐加（Harg.HCl）加1L水（H₂O）、1L四氢呋喃（THF）溶解，搅拌下加碳酸钠（Na₂CO₃）调PH=8～9，再滴加Mpr(Mmt)-OSu的四氢呋喃溶液[680gMpr(Mmt)-OSu加2L四氢呋喃溶解而成]5小时，滴加过程中同时加碳酸钠（Na₂CO₃）维持反应液PH=8～9，滴加完后，再搅拌反应24小时，反应过程中同时加碳酸钠（Na₂CO₃）维持反应液PH=8～9，反应完全后，过滤，滤液加6NHCl调PH=1-2，45℃蒸去四氢呋喃，析出大量固体，过滤得固体，固体用水洗5次（每次1.5L），过滤，再乙酸乙酯洗5次（每次1.5L），过滤，60℃干燥得620gMpr(Mmt)-Harg-OH.HCl（收率74.1%），纯度为98.5%，MS：585.2(M+1)。

实施例2：Fmoc-Cys(Mmt)-OH的合成

200g半胱氨酸盐酸盐（Cys.HCl）加1.5LN,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，搅拌下慢慢加入392g4-甲氧基三苯基氯甲烷（Mmt-Cl），加完4-甲氧基三苯基氯甲烷后，再室温搅拌反应12小时。搅拌下向反应液加3L水，再用加碳酸钠（Na₂CO₃）调PH=6～7，析出固体，固体用水洗3次（每次1.5L），过滤，再乙酸乙酯洗3次（每次1.5L），过滤，45℃干燥得412g产品Cys(Mmt)（收率82.5%）。

400gCys(Mmt)加1L水（H₂O）、0.5L四氢呋喃（THF）溶解，搅拌下加碳酸钠（Na₂CO₃）调PH=7～9，再加342gFmoc-OSu，搅拌反应12小时，反应过程中同时加碳酸钠（Na₂CO₃）维持反应液PH=7～9，反应完全后，加6N盐酸水溶液调PH=2-3，用乙酸乙酯提取2次（每次1.5L），合并乙酸乙酯提取液，提取液用0.2N盐酸水溶液洗3次（每次0.75L），分液，再用饱和食盐水溶液洗3次（每次0.75L），分液，乙酸乙酯提取液加300g无水硫酸镁（MgSO₄）搅拌干燥20分钟，过滤，用0.5L乙酸乙酯滤洗，合并滤液和洗液，50℃真空浓缩至少量，加2L石油醚研磨，析出固体，过滤，固体用石油醚洗3次（每次1.5L），过滤，45℃干燥得560g产品Fmoc-Cys(Mmt)-OH（收率89.5%），纯度为99.1%，MS：616.2(M+1）。

实施例3：肽树脂1:Cys(Mmt)-Resin的合成

称取184.7gFmoc-Cys(Mmt)-OH、48.6gHOBt，加1600mLDMF搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入48.8mlDIC，反应0.5小时，得保护氨基酸的活化酯溶液，备用。称取代值为0.63mmol/g的RinkAMResin158.7g（100mmol），加入到固相反应器中，加1600mlDMF搅拌溶胀树脂30分钟，抽干，加入20%PIP/DMF溶液（体积比）1600mL搅拌反应0.5小时，抽干，，用DMF洗涤6次，抽干，得脱Fmoc基团的RinkAMResin。将保护氨基酸的活化酯溶液加入脱Fmoc基团的RinkAMResin中，室温搅拌反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用DMF洗涤6次，抽干。加入20%PIP/DMF溶液（体积比）1600mL搅拌反应0.5小时，抽干；用DMF洗涤6次，抽干，得肽树脂1，用于实施例4反应。

实施例4：肽树脂2:Pro-Cys(Mmt)-Resin的合成

称取101.2gFmoc-Pro-OH、48.6gHOBt，加1600mLDMF搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入48.8mlDIC，反应0.5小时，得保护氨基酸的活化酯溶液。将保护氨基酸的活化酯溶液加入肽树脂1中，室温搅拌反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用DMF洗涤6次，抽干。加入20%PIP/DMF溶液（体积比）1600mL搅拌反应0.5小时，抽干；用DMF洗涤6次，抽干，得肽树脂2，用于实施例5反应。

实施例5：肽树脂3:Trp(Boc)-Pro-Cys(Mmt)-Resin的合成

称取158.0gFmoc-Trp(Boc)-OH、48.6gHOBt，加1600mLDMF搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入48.8mlDIC，反应0.5小时，得保护氨基酸的活化酯溶液。将保护氨基酸的活化酯溶液加入肽树脂2中，室温搅拌反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用DMF洗涤6次，抽干。加入20%PIP/DMF溶液（体积比）1600mL搅拌反应0.5小时，抽干；用DMF洗涤6次，抽干，得肽树脂3，用于实施例6反应。

实施例6：肽树脂4:Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Mmt)-Resin的合成

称取123.4gFmoc-Asp(OtBu)-OH、48.6gHOBt，加1600mLDMF搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入48.8mlDIC，反应0.5小时，得保护氨基酸的活化酯溶液。将保护氨基酸的活化酯溶液加入肽树脂3中，室温搅拌反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用DMF洗涤6次，抽干。加入20%PIP/DMF溶液（体积比）1600mL搅拌反应0.5小时，抽干；用DMF洗涤6次，抽干，得肽树脂4，用于实施例7反应。

实施例7：肽树脂5:Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Mmt)-Resin的合成

称取89.2gFmoc-Pro-OH、48.6gHOBt，加1600mLDMF搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入48.8mlDIC，反应0.5小时，得保护氨基酸的活化酯溶液。将保护氨基酸的活化酯溶液加入肽树脂4中，室温搅拌反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用DMF洗涤6次，抽干。加入20%PIP/DMF溶液（体积比）1600mL搅拌反应0.5小时，抽干；用DMF洗涤6次，抽干，得肽树脂5，用于实施例6反应。

实施例8：肽树脂6:Mpr(Mmt)-Harg-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Mmt)-Resin的合成

称取175.5gMpr(Mmt)-Harg.HCl、48.6gHOBt，加1600mLDMF搅拌溶解，在搅拌冰水冷却下加入48.8mlDIC，反应0.5小时，得片段的活化酯溶液。将片段的活化酯溶液加入肽树脂5中，室温搅拌反应，用茚三酮检测反应情况，每隔1小时监测1次，直至完全（茚三酮检测树脂呈无色），反应完全后，用DMF洗涤6次，抽干，再分别用DCM、甲醇洗涤3次，抽干，再干燥至恒重得依非巴特肽树脂288.8g，接肽收率为97.7%。

实施例9：依非巴特肽树脂的酸解得还原型依非巴特粗品

实施例8制得的依非巴特树脂288.8g，加入酸解试剂（TFA：TIS：EDT：H2O=95：1：2：2）2888ml，搅拌室温反应2小时，反应物用砂芯漏斗过滤，并用TFA洗涤树脂3次（每次400ml），过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至400～600g，加3L无水乙醚研磨，析出固体，固体用砂芯漏斗过滤，并用乙醚洗涤固体3次（每次200ml），过滤，得白色粉末状还原型依非巴特粗品79g。

实施例10：依非巴特粗品的制备

实施例9制得的还原型依非巴特粗品79g，加25%醋酸水溶液39.5L溶解，搅拌下滴加碘/乙醇饱和溶液至溶液呈棕红色，再搅拌反应30分钟，滴加Vc溶液至棕红色消失，38-40减压浓缩，用0.45μm混合滤膜过滤，得依非巴特粗品浓缩液820ml。

实施例11：依非巴特的制备

高效液相色谱法纯化：依非巴特粗品浓缩液820ml，加25%醋酸水溶液至1000ml得依非巴特粗品溶液，备用。色谱柱填料为9μm的反相C18，流动相A：0.1%TFA-H2O，流动相B：0.1%TFA-CH₃CN，色谱柱为100mm×270mm，流速为125ml/min，采用梯度洗脱。取依非巴特粗品溶液，分4次上样于色谱柱中，每次250ml，启动制备程序进行洗脱，收集、合并合格产品溶液，用旋转蒸发仪、38～40水浴条件下减压浓缩，蒸去大部分乙腈，用0.45μm滤膜过滤，得依非巴特纯化浓缩液850ml，用于制备高效液相色谱进行换盐。

高效液相色谱法换盐：依非巴特纯化浓缩液850ml，加水至1000ml得依非巴特纯化溶液，备用。色谱柱填料为9μm的反相C18，流动相A：1%HOAc-H²O，流动相B：CH₃CN，色谱柱为100mm×270mm，流速为125ml/min，采用梯度洗脱。取依非巴特纯化溶液，分4次上样于色谱柱中，每次250ml，启动制备程序进行洗脱，收集、合并合格产品溶液，用旋转蒸发仪、38～40水浴条件下减压浓缩，蒸去大部分乙腈，用0.45μm滤膜过滤，得依非巴特醋酸盐浓缩液630ml，用于冻干。

取得依非巴特醋酸盐浓缩液630ml，冷冻干燥，得产品45.8g，总收率为55.1%，纯度99.85%。

Claims

1.一种依非巴特的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：

步骤1：以保护氨基酸、片段和氨基树脂为原料，采用多肽固相合成法依次偶联得到依非巴特肽树脂；

步骤2：肽树脂加入酸解试剂酸解，用乙醚沉淀并收集，得还原型依非巴特粗品；

步骤3：将还原型依非巴特粗品氧化，得依非巴特粗品；

步骤4：将依非巴特粗品通过C₁₈柱分离纯化，获得目标产物依非巴特。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，合成的依非巴特肽树脂具有以下结构：X-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-pro-Cys(R₁)-氨基树脂，其中R₁为Trt、Mtt、Mmt或Dmt;X为Mpr(R₂)-Harg，R₂为Mtt、Mmt或Dmt。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述所述氨基树脂为RinkAmide树脂、RinkAmideAM树脂、RinkMBHA树脂和Sieber树脂中的一种，优选为RinkAmideAM树脂；所述氨基树脂取代值为0.4～1.2mmol/g树脂，优选为0.5～1.0mmol/g树脂。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述氨基树脂取代值为0.4～1.2mmol/g树脂，优选为0.5～1.0mmol/g树脂。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述保护氨基酸为Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc--Trp(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(R₁)-OH；其中R₁为Trt、Mtt、Mmt或Dmt；所述片段为Mpr(R₂)-Harg-OH或其形成的盐；R₂为Mtt、Mmt或Dmt。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1中所述偶联所用的偶联剂为DCC/HOBt、DCC/HOAt、DIC/HOBt、DIC/HOAt、HBTU/DIPEA、HBTU/NMM、HBTU/TEA、TBTU/DIPEA、TBTU/NMM、TBTU/TEA、HATU/DIPEA、HATU/NMM、HATU/TEA中的一种

，优选为DIC/HOBt。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1中偶联Fmoc-氨基酸或片段时，反应物的摩尔比为氨基树脂：Fmoc-氨基酸或片段=1：1.5-5，优选为1：3；所述偶联反应时间为1～8小时，优选为2～3小时。

8.根据权利要求1或7所述方法，其特征在于，步骤1偶联反应后，脱除保护基团Fmoc的试剂为10～30%PIP/DMF溶液（体积百分数），优选为20%；用量为每克肽树脂6～15ml，优选为每克肽树脂8～12ml；去保护反应时间为10～60分钟，优选为20～35分钟。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2中所述依非巴特肽树脂经酸解试剂酸解同时脱去树脂及侧链保护基得还原型依非巴特粗品；所述酸解试剂为TFA、TIS、EDT和H₂O混合溶液，其体积比为TFA：TIS：EDT：H₂O=90-95：1-3：2-4：2-4。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3还原型依非巴特粗品用醋酸溶解，过滤，用氧化剂氧化环化，还原型依非巴特结构中Mpr中的巯基（SH）和Cys中巯基（SH）经氧化形成二硫键S-S而得到依非巴特粗品；所述氧化剂为O₂、碘、H₂O₂或DMSO中的一种。