PT1751176E - Derivados ciclopeptídicos que possuem actividade anti-integrina - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"DERIVADOS CICLOPEPTÍDICOS QUE POSSUEM ACTIVIDADE ANTI-INTEGRINA"

Campo da invenção A presente invenção apresenta como objectos compostos úteis enquanto medicamentos, processos para a sua preparação, composições farmacêuticas que os contêm e a sua utilização para a preparação de medicamentos úteis para a terapia de doenças provocadas por angiogénese anormal.

Antecedentes da invenção

Em pacientes oncológicos, muitas vezes a quimioterapia é a única opção de tratamento para cancros disseminados. Uma abordagem para melhorar a eficácia e reduzir a toxicidade da quimioterapia anti-cancro consiste na administração de fármacos que são dirigidos aos receptores implicados na angiogénese tumoral.

As integrinas estão implicadas na adesão entre uma célula e outra e entre células e a matriz extracelular tanto no processo de angiogénese tumoral como no processo metastático. Em particular, os receptores de integrina ανβ3 e ανβ5 são expressos de uma forma significativa nas células endoteliais dos microvasos tumorais humanos e nas próprias células tumorais. A vascularização tumoral é agora geralmente reconhecida como sendo um alvo promissor para a terapêutica anti-cancro [H. Jin e J. Varner, Br. J. Câncer, 2004, 90 (3) : 561-5] . 2

Nos últimos anos, diversos estudos demonstraram que os derivados ciclopeptidicos que contêm a sequência Arg-Gly-Asp apresentam uma afinidade elevada para os receptores de integrina.

Está a ser investigada a inibição da progressão do tumor e a neoangiogénese utilizando RGD-péptidos cíclicos e alguns estudo apresentaram já resultados promissores.

Por exemplo, foi demonstrado recentemente num carcinoma do cólon, induzido quimicamente, em ratos que o início tardio do tratamento com péptidos bloqueadores de integrina provocou uma inibição do crescimento do tumor e uma redução da carga tumoral, os quais aparentam ser mediados, pelo menos em parte, pela inibição da neoangiogénese (Haier J. et al, Clin Exp Metastasis. 2002; 19(8): 665-72). Assim, a inibição do receptor de integrina ανβ3 parece ser uma boa estratégica terapêutica para o cancro.

Além do mais, estes RGD-péptidos cíclicos também podem possuir aplicações terapêuticas interessantes em doenças cardiovasculares, osteoporose e infecções virais, utilizando integrinas celulares para a sua penetração em células alvo (v.g., VIH) . Tais compostos são úteis para dirigir os fármacos de quimioterapia, em particular os fármacos anti-cancro, contra as células que expressam níveis elevados de receptores e integrina. Deste modo, é possível atingir uma resposta terapêutica eficaz com reduzidos efeitos secundários induzidos pelo agente de quimioterapia.

Haubner R., et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7461 estudaram a influência de alterações conformacionais de pentapéptidos cíclicos que contêm RGD de fórmula estrutural 3 RGD-XX, no perfil de inibição deste último composto em diversos tipos de receptores de integrina. Alterando a natureza dos dois últimos resíduos aminoácidos (isto é, XX), os autores concluíram que a natureza do último resíduo não influenciava o perfil de inibição de todo o composto cíclico. No entanto, não foram apresentados dados referentes a ανβ5·

No documento DE19725368 encontram-se descritos derivados de fórmula estrutural RGD-XX, embora, uma vez que não foram apresentados dados biológicos a propósito de tal derivado nessa patente de invenção, este documento não apresente qualquer informação sobre a influência dos vários resíduos na posição 4 e/ou 5 na estrutura cíclica.

Descrição abreviada da invenção A presente invenção diz respeito a derivados ciclopeptídicos que possuem actividade anti-integrina e, em particular, a péptidos cíclicos que contêm, para além de uma sequência de três aminoácidos que é constante para todos os compostos aqui descritos, dois outros resíduos de aminoácidos naturais ou não naturais, os quais podem ser substituídos no átomo de azoto ou no átomo de Ca com um resíduo com um grupo funcional, ou então na cadeia terminal com um grupo funcional que potencie, de forma inesperada, a sua ligação às integrinas ανβ3 e ανβ5· A presente invenção também diz respeito a processos para a preparação dos referidos compostos, à sua utilização enquanto medicamentos, em particular enquanto inibidores do receptor de integrina, que possuam uma acção útil para o tratamento de doenças, tais como retinopatia, insuficiência renal aguda, osteoporose e metástases, e a composições 4 farmacêuticas que os contêm. Estes compostos, quando devidamente marcados, também são úteis enquanto agentes de diagnóstico para a detecção de massas tumorais pequenas e para episódios de oclusão arterial.

Os fármacos transportados pelos ciclopéptidos de acordo com a presente invenção pertencem à classe de agentes citotóxicos, tais como agentes alquilantes (ciclofosfamidas, nitrosoureias), antimetabolitos (metotrexato, 5-fluorouracilo, citosina arabinosido), produtos naturais (doxorrubicina e análogos estruturais, actinomicina D, bleomicina, alcaloides da vinca, epipodofilotoxinas e mitomicina C).

Para uma descrição exaustiva sobre o desenvolvimento na especialidade de compostos receptores de integrina ανβ3 e ανβ5 e as suas aplicações, veja-se o documento WO 2004/011487, sob o nome da requerente, no qual são apresentadas referências explicitas sobre os antecedentes científicos.

De forma surpreendente, as moléculas resultantes da presente invenção apresentam afinidade para integrinas, a qual é por vezes bastante superior à observada para os ciclopéptidos que pertencem à mesma classe, os quais se encontram descritos na literatura [H. Kessler, et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3033-40].

Assim, a presente invenção proporciona inibidores de integrina do tipo ανβ3 e ανβ5, os quais são muito mais potentes do que os compostos conhecidos.

Assim sendo, constitui o principal objecto da presente invenção os compostos de fórmula estrutural I seguintes; (Fórmula I) c (Ri-Arg-Gly-Asp-R2) 5 em que: o símbolo c designa um composto cíclico; o símbolo Ri representa um aminoácido com fórmula geral: -NX-CY(Z)-C0-; em que o símbolo X representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: H, alquilo(Ci-C6) linear ou ramificado, arilo (C6-Ci0) , benzilo, (CH2)n-COR, (CH2)n-NHR', 4-COR-benzilo, 4-(CH2-NHR')-benziloílo; em que o símbolo n representa um numero intei o símbolo Y representa conjunto constituído por: H, que os símbolos m e m' seleccionados entre 0 e 3; o símbolo Z representa conjunto constituído por: benzilo, 4-COR-benzilo, em número inteiro seleccionado o símbolo R representa conjunto constituído por (CH2CH20) n2-CH2-COOW] 2, NH-CH2 CH2NH) n2-CH2-CH2NHW; em que número inteiro seleccionado o símbolo W representa conjunto constituído por: H o símbolo R' represente conjunto constituído por: (CH2CH20) n2-CH2-NHW, C0-CH2-0 símbolo n2 possui as signifi o símbolo R2 representí conjunto constituído por: E CF3-Phe, D-4-acetilamina-Phe seieccionaao entre i e o; um grupo seleccionado entre o , CHmFm'; em que m + m' =3, em representam números inteiros um grupo seleccionado entre o H, (CH2)ni-NHR', 4-NHR'-(CH2)nl — que o símbolo nl representa um entre 0 e 5; um grupo seleccionado entre o : W, OW, N [CH2-C0-NH-CH2-0- -0- (CH2CH20) n2-CH2-C00W, NW- (CH2-o símbolo n2 representa um entre 1 e 22 e um grupo seleccionado entre o e alquilo (Ci-C3) ; a um grupo seleccionado entre o H, C0-(CH2)n2-COOW, C0-CH2-0-- (CH2CH20)n2-CH2-C00W; em que o cações definidas antes e a um grupo seleccionado entre o )-Phe, D-4-terc-butil-Phe, D-4- r 6 as suas misturas racémicas, os seus enantiómeros individuais, os seus diastereoisómeros individuais e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Como exemplos preferidos de compostos de fórmula estrutural (I) refere-se: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp); c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad) ; c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp); c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO (CH2) 2COOH] ; c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly); c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (0-CH2-CH2) 2-0-CH2-C00H] ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (OCH2CH2) 8-OCH2-COOH] e c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp (CO-CH2- (OCH2-CH2) 3OCH3) ] . A expressão sal farmaceuticamente aceitável pretende designar qualquer sal que não seja tóxico ou que apresente efeitos secundários.

Tais sais são bem conhecidos pelos técnicos farmacológicos e pelos especialistas em tecnologia farmacêutica.

Os compostos de fórmula estrutural I podem ser preparados de acordo com o processo aqui descrito a seguir e exemplificado para os compostos preferidos de acordo com a invenção. Este processo constitui um outro objecto da invenção.

Os compostos de fórmula estrutural I podem ser preparados, após a síntese dos resíduos aminoácidos não naturais, utilizando técnicas convencionais de síntese de péptidos, tal como descrito nos exemplos na parte experimental. A síntese de péptidos pode ser efectuada em fase sólida ou em solução. Depois da preparação do péptido linear protegido adequadamente, este pode ser ciclizado. 7

Os compostos descritos na presente invenção são inibidores de integrina e, por tal motivo, são úteis como medicamentos para o tratamento de cancro, como agentes imagiológicos de diagnóstico e como vectores dirigidos de fármacos (G.C. Tucker, 2003 Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 722-31), em particular para o tratamento de tumores cujas células sobre-expressem integrinas de um modo natural ou induzido, por exemplo, como resultado de radioterapia; em doenças inflamatórias (v.g. artrite reumatóide), em doenças subjacentes a angiogénese anormal, tais como tumores, retinopatia, doenças oculares, insuficiência renal aguda, osteoporose e metástases, doenças cardiovasculares (apoplexia e lesões cardíacas) e restenose após angioplastia coronária transluminal percutânea (J.S. Kerr et al. Drug News Perspect 2001, 14, 143 50). Os compostos aqui descritos também são úteis, quando adequadamente marcados, como agentes de diagnóstico, em particular para a detecção de massas tumorais pequenas e episódios de oclusão arterial. Diversos antagonistas foram marcados com (18)F, (111)In, (99)Tc, (90)Y e diversos isótopos de iodo, para monitorizar a angiogénese induzida em tumores, uma vez que as integrinas estão implicadas na migração de células endoteliais para a formação de novos vasos (R.H. Haubner et al. 2003 Q. J. Nucl. Med. 47 189-99). Os péptidos radiomarcados de elevada afinidade podem ser utilizados como alvos para as integrinas ανβ3 e para mostrar as áreas de lesões vasculares, uma vez que a expressão de ανβ3 é aumentada nas células endoteliais activadas e nas células do músculos liso vasculares após uma lesão vascular. Esta abordagem permite ultrapassar as limitações dos métodos de imagiologia por ressonância magnética e por tomografia axial computorizada, tais como a inexistência de ligandos biologicamente relevantes e agentes de contraste sanguíneos para a imagiologia (F.G. Blankenberg et al. 2002 Am. J. Cardiov. Drugs 2, 357-65).

As composições farmacêuticas contêm pelo menos um composto de fórmula estrutural I como ingrediente activo numa quantidade que produz um efeito terapeuticamente significativo. As composições de acordo com a presente invenção são totalmente convencionais e são obtidas utilizando os métodos normalmente utilizados na prática da indústria farmacêutica. De acordo com a via de administração seleccionada, as composições podem assumir uma forma sólida ou líquida, adequada para a administração por via oral, parentérica ou intravenosa. As composições de acordo com a presente invenção contêm, em conjunto com o ingrediente activo, pelo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. É particularmente útil a utilização de adjuvantes de formulação, tais como, por exemplo, agentes de solubilização, agentes dispersantes, agentes de suspensão e agentes emulsionantes.

Os compostos de fórmula estrutural I também podem ser utilizados em combinação com outros fármacos anti-cancro ou com outros fármacos que possuam actividade antiparasítica ou antiviral, tanto em formas de dosagem separadas como em formas de dosagem singular.

Os medicamentes que constituem um objecto da presente invenção também são utilizados para o tratamento de doenças com parasitas e com adenovírus. A entrada de patogénios nas células tem lugar por penetração directa da membrana de plasma, endocitose mediada por clatrina, endocitose por caveolae , pinocitose ou macropinocitose. Para a 9

macropinocitose é necessário o envolvimento de integrinas (0. Meier et al., 2003, J. Gene Med. 5, 451-62) . A actividade antiparasítica pode ser exercida pela inibição da adesão mediada por integrinas e por meio da mobilização de leucócitos dirigidos pelos receptores de quemoquina, v.g.f para o controlo da inflamação induzida por

Trypanosoma cruzi. Assim, na fase aguda da doença das

Chagas, a indução do processo inflamatório é crucial para o controlo de Trypanosoma cruzi no tecido visado do equilíbrio hospedeiro/parasita (J. Lannes-Vieira, 2003, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 98, 299-304).

Os exemplos seguintes ilustram ainda a invenção.

As abreviaturas utilizadas foram as seguintes:

Aad (ácido aminoadípico);

Amb (aminometilbenzilo);

Amp (aminometilfenilalanina) ;

Boc (terc-butoxicarbonilo); CSA (ácido canfossulfónico); CTH (hidrogenação por transferência catalítica); DBU (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno) ; DCC (diciclo-hexilcarbodiimida); DCM (diclorometano); DEAD (acetilenodicarboxilato de dietilo); DIEA (diisopropiletilamina) ; DMF (dimetilformamida); EMEM (meio essencial mínimo de Eagle com sal de Earle);

Fm (fluorenilmetilo);

Fmoc (9-fluorenilmetil-oxicarbonilo); HOBT (hidroxibenzotriazole); NMP (N-metil-pirrolidona) ;

oNBS (2-nitrobenzenossulfonato); 10 PBS (tampão de fosfato salino);

Pht (ftaloílo);

Pmc (pentametilcromano-6-sulfonilo); SDS (dodecilsulfato de sódio); TBTU (tetrafluoroborato-O-benzotriazol-l-il-tetrametilurónio); TEA (trietilamina);

Teg (éter monometilico de trietilenoglicol) e TFA (ácido trifluoroacético).

Exemplos

Exemplo 1 Síntese de c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp) - ST2581

Colocou-se em suspensão 1,587 mmol de Fmoc-Gly-Res (Res = Sasrin Resin®, Bachem) , sob agitação, em 75 mL de DMF durante 30 minutos, período esse ao fim do gual se adicionou 18 mL de piperidina e se manteve sob agitação durante mais 30 minutos. Filtrou-se a resina, lavou-se com DMF e colocou-se em suspensão em 50 mL de NMP (N-metil-pirrolidona) durante 15 minutos, período esse ao fim do qual se adicionou Fmoc-Arg(Pmc)-OH, HOBT, TBTU e DIEA (3,174 mmol de cada); depois de se agitar durante 2 horas, filtrou-se a suspensão e lavou-se com DMF. Depois de se desproteger com piperidina, repetiu-se a reacção condensação, sucessivamente, com outros aminoácidos, efectuando as operações de acordo com o descrito antes, nomeadamente: Fmoc-Amp(Cbz)-OH, Fmoc-D-Phe-OH e Fmoc-

Asp (OtBu)-OH. Após a última desprotecção do terminal Fmoc-N, libertou-se o pentapéptido linear da resina utilizando 45 mL de TFA a 1% em DCM. Dissolveu-se este material em cerca de 1 1 de CH3CN e adicionou-se 4,761 mmol de HOBT e 11 TBTU e 10 mL de DIEA; manteve-se a solução a agitar durante 30 minutos, evaporou-se o solvente até se obter um pequeno volume e completou-se a precipitação do produto com água.

Dissolveu-se o produto filtrado impuro em tioanisol (50 eq.) e TFA (270 eq.) e manteve-se sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente.

Levou-se a mistura de reacção até à secura, retomou-se o resíduo com uma quantidade mínima de TFA e precipitou-se novamente com um excesso de éter etílico. Por último, purificou-se o produto impuro por RP-HPLC [coluna: 'Alltima C-18', Alltech; fase móvel: 17% de CH3CN em água + 0,1% de TFA] . HPLC analítica: coluna: 'Purosphere STAR', Merck; fase móvel: 15% de CH3CN em água + 0,1% de TFA) : tr = 12,15 minutos.

Massa molecular = 652 Exemplo 2 Síntese de c[Arq-Gly-Asp-D-Phe-Aad) - ST2650

Tratou-se 0, 69 mmol de Fmoc-Gly-Res exactamente conforme descrito no exemplo 1, com a diferença de se ter adicionado, neste caso, o terceiro e quarto aminoácidos sob a forma de dipéptido Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH. Após a desprotecção do éster benzílico com CTH, purificou-se o produto impuro por RP-HPLC preparativa (fase móvel: 55% de CH3CN em água + 0,1% de TFA; tr = 17,29 minutos) e obteve-se 187 mg de péptido desprotegido puro. Dissolveu-se este produto em TFA e, após 1 hora à temperatura ambiente, levou-se a solução à secura. Dissolveu-se novamente o resíduo com uma quantidade mínima de TFA e fez-se 12 precipitar com um excesso de éter etílico. Repetiu-se esta operação até se obter um produto final límpido. RP-HPLC analítica (17% de CH3CN em água + 0,1% de TFA), tr = 12,52 minutos.

Massa molecular = 619

Exemplo 3 Síntese de c(Arq-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp) - ST2700 A uma suspensão de Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH2) -COOH em tolueno anidro, aquecida ao refluxo, adicionou-se 2 eq. de CSA e 20 eq. de paraformaldeído, dividido em 4 porções, em intervalos de 15 minutos. Deixou-se arrefecer a mistura, diluiu-se com 120 mL de tolueno e lavou-se com NaHCC>3 a 5% e com água. Depois de se evaporar o solvente, dissolveu-se o resíduo em 15 mL de CHCI3 + 15 mL de TFA + 700 pL de Et3SiH; e deixou-se a mistura sob agitação no escuro durante 42 horas. Depois de se evaporar o solvente, purificou-se o resíduo por filtração através de gel de sílica. Rendimento total: 90%.

Sintetizou-se o péptido linear em fase sólida, conforme descrito no exemplo 1, inserindo Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH2)-COOH como terceiro aminoácido, preparado tal como descrito antes. Neste caso, as desprotecções de N-Fmoc-terminal sobre a resina foram efectuadas com 30% de diisopropilamina (300 eq.) numa solução de DMF (devido à presença de ftalimida). Após ciclização, dissolveu-se 500 mg do péptido por aquecimento em 10 mL de EtOH absoluto e depois adicionou-se 0,9 mL de uma solução de ΝΗ2-ΝΗ2·Η20 1 M em etanol. Depois de se aquecer ao refluxo durante 2 horas, evaporou-se o solvente e retomou-se o resíduo com 10 mL de DCM + 10 mL de uma solução de Na2C03, sob agitação 13 vigorosa. Depois de se evaporar a fase orgânica, purificou-se o resíduo impuro por RP-HPLC preparativa (fase móvel: 17% de CH3CN em água + 0,1% de TFA) . RP-HPLC analítica (16% de CH3CN em água + 0,1% de TFA), tr = 11,7 minutos.

Massa molecular = 665

Exemplo 4 Síntese de c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CH2) 2COOH] - ST2649

Dissolveu-se 120 mg de ciclopéptido c[Arg(Pmc)-Gly-Asp (OtBu)-D-Phe-Amp]·TFA (preparada tal como descrito no exemplo 1) em 3,6 mL de uma mistura de DCM-DMF a 2:1, em conjunto com uma quantidade estequiométrica de TEA e de anidrido succínico. Decorrida 1 hora, diluiu-se a mistura de reacção com 30 mL de DCM e lavou-se com água. Secou-se a fase orgânica e concentrou-se para se obter um resíduo de 100 mg de hemi-succinato. Desprotegeu-se completamente este produto com TFA e depois submeteu-se a uma primeira purificação, conforme descrito nos exemplos anteriores. Purificou-se novamente por RP-HPLC preparativa (23% de CH3CN em água + 0,1% de TFA). RP-HPLC analítica: (20% de CH3CN em água + 0,1% de TFA), tr = 14,66 minutos.

Massa molecular = 751

Exemplo 5 Síntese de c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly) - ST2701 A uma solução de 1,22 mmol de p-xililenodiamina Boc-monoprotegida em 6 mL de THF adicionou-se 1,83 mmol de TEA e acrescentou-se, gota a gota, uma solução de 1,22 mmol de bromoacetato de benzilo em 2 mL de THF. Manteve-se a 14 mistura a agitar de um dia para o outro, periodo esse ao fim do qual se evaporou o solvente e se purificou o residuo por cromatograf ia em coluna rápida (CHCl3-EtOAc, a 9:1). Obteve-se 0,69 mmol de éster benzilico de N-(4-Boc-NH-CH2-benzil)-glicina.

Dissolveu-se 250 mg de Fmoc-D-Phe-OH em 27 mL de DCM e adicionou-se 40 pL de difosgénio e 230 pL de sym-colidina; decorridos 15 minutos, adicionou-se 190 mg do éster preparado antes, dissolvido em 3 mL de DCM. Decorridas 3 horas, adicionou-se 80 pL de N-Me-piperazina à mistura de reacção e agitou-se durante 10 minutos, periodo esse ao fim do qual se diluiu a mistura com 10 mL de DCM e se efectuou a extracção com água, com HC1 0,5 N, com água, com NaHC03 a 5% e com água. Depois de se evaporar o solvente, purificou-se o residuo por cromatografia rápida através de gel de sílica (DCM-EtOAc, a 9:1). Rendimento: 80%. A 100 mg do produto assim obtido, dissolvido em 6 mL de MeOH, adicionou-se 7 6 pL de AcOH e 42 mg de HCOONH4, arrefeceu-se a mistura até 0°C e adicionou-se 50 mg de Pd a 10%/C. Decorridos 30 minutos, filtrou-se a mistura de reacção através de celite. Levou-se o filtrado à secura e purificou-se numa coluna de cromatografia rápida (CHCI3-MeOH a 9:1). Rendimento: 90%.

Dissolveu-se 190 mg do produto assim obtido em 1,2 mL de TFA e levou-se à secura (desprotecção de Boc) ; dissolveu-se novamente o resíduo em 9 mL de Na2C03 a 10% + 6 mL de dioxano, arrefeceu-se até 0°C e adicionou-se, gota a gota, uma solução de 120 pL de cloreto de benziloxicarbonilo, diluída com 3 mL de dioxano. Depois de se agitar durante 1 hora à temperatura ambiente, evaporou-se sob uma pressão hipobárica até se obter um volume 15 pequeno, depois diluiu-se a mistura com água, ajustou-se o valor de pH para 1 com HC1 e extraiu-se com EtOAc. Após a evaporação do solvente, purificou-se o resíduo por filtração através de gel de sílica (lavando com CHCl3-MeOH a 8:2). Rendimento em dipéptido puro: 82%.

Tratou-se 0, 69 mmol de Fmoc-Gly-Res tal como descrito no exemplo 1. Após a Arg, adicionou-se sequencialmente o dipéptido Fmoc-D-Phe-N (4-Cbz-NH-CH2-benzil)-Gly, preparado antes. Dissolveu-se o produto impuro em tioanisol e TFA e manteve-se sob agitação à temperatura ambiente durante 4,5 horas. Efectuou-se a primeira purificação tal como descrito nos outros exemplos e efectuou-se a purificação final por HPLC preparativa (fase móvel: 16% de CH3CN em água + 0,1% de TFA). RP—HPLC analítica (15% de CH3CN em água + 0,1% de TFA), tr = 7,67 minutos.

Massa molecular = 652

Exemplo 6 Síntese de c [Arq-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (C0-CH2- (0-CH2-CH2) 2-0--CHz-COOH] - ST2661 A uma solução de 200 mg de c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)*TFA (obtida tal como descrito no exemplo 1) em 4 mL de uma mistura a 3:1 de DCM-DMF adicionou-se um excesso substancial de diácido glicólico. Adicionou-se DIEA (3 eq.) e DCC (2 eq.) a essa solução. Manteve-se a mistura a agitar de um dia para o outro, depois diluiu-se com DCM e lavou-se com água. Recuperou-se o produto impuro por evaporação da fase orgânica e purificou-se por cromatografia rápida (fase móvel: CHCl3-MeOH a 7:3 + 1% de AcOH) ; recolheu-se as fracções que continham o produto, lavou-se com água, 16

desidratou-se e levou-se à secura para se obter um resíduo de 157 mg de produto puro. Tratou-se este produto com TFA durante 1,5 horas, limpou-se conforme descrito nos outros exemplos, depois submeteu-se à purificação final por HPLC preparativa (fase móvel: 22% de CH3CN em água + 0,1% de TFA) . RP-HPLC analítica: (23% de CH3CN em água + 0,1% de TFA); tr = 10 minutos.

Massa molecular = 855

Exemplo 7 Síntese de c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp (CO-CH2-(OCH2CH2) 8~OCH2-COOH] - ST2874

Dissolveu-se 150 mg do péptido descrito no exemplo 1 e 110 mg de PEG 600-COOFm (1 eq.) + HOAT (1,5 eq.) + DIEA (2 eq.) em 6 mL de uma mistura de DCM-DMF (a 2:1) e arrefeceu- se a solução até 0°C; adicionou- se 1,5 eq. de DCC e manteve-se a mistura a agitar de um dia para o outro. Depois de se evaporar o solvente, purificou-se o resíduo numa coluna de cromatografia rápida (passo I: CHCl3-MeOH, a 96:4; passo II: CHCÍ3-MeOH, a 90:10) . Para a desprotecção do éster fluorenilmetílico, dissolveu-se 36 mg do éster em 1,8 mL de CHC13, adicionou-se 41 pL (20 eq.) de piperidina e manteve-se em repouso durante 1 noite à temperatura ambiente. Depois de se evaporar o solvente, purificou-se o resíduo impuro por HPLC preparativa (46% de CH3CN em água + 0,1% de TFA) . Dissolveu-se o produto puro assim obtido em TFA e manteve-se em repouso durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois de se reduzir até um volume pequeno, deixou-se precipitar o produto totalmente desprotegido com um excesso de éter etílico. 17 RP-HPLC analítica (26% de CH3CN em água + 0,1% de TFA); tr = 7,89-15,83 minutos.

Massa molecular: 1119.

Exemplo 8 Síntese de c [Arq-Gly-Asp-D-Phe-Amp (CO-CH2- (OCH2CH2) 3-OCH3) ] - ST2597

Este péptido foi sintetizado em fase sólida, conforme descrito no exemplo 1, inserindo Fmoc-Amp(CO-CH2-Teg)-OH como terceiro aminoácidos, o qual foi preparado do seguinte modo: dissolveu-se 570 mg de CH30 (CH2CH20) 3-CH2-COOH, 473 mg de 2,3,4,5-pentafluorofenol (Pfp) e 207 pL de piridina com 11,4 mL de DCM. À solução, arrefecida até 0°C, adicionou-se 637 mg de DCC e manteve-se a mistura de reacção a agitar durante 1,5 horas. Depois, filtrou-se, lavou-se o filtrado com água, com HC1 1 N, com água, com NaHC03 a 5% e com água, levou-se a solução orgânica à secura para se obter 984 mg do éster impuro. A uma suspensão de 500 mg de sal Fmoc-aminometilfenil-alanina*TFA em 15 mL de DCM, adicionou-se 260 pL de TEA, depois acrescentou-se 800 mg do éster activado e manteve-se a mistura a agitar durante 3 horas. Purificou-se o produto impuro por cromatografia rápida, proporcionando o bloco de construção puro.

Purificou-se o péptido cíclico final do modo usual e isolou-se por HPLC preparativa (27% de CH3CN em água + 1% de TFA), tr = 12,7 minutos.

Massa molecular = = 855. 18

Exemplo 9

Resultados biológicos

Ligação aos receptores de inteqrina ανβ3

Diluiu-se o receptor ανβ3 purificado (Chemicon, cat. CC1020) em tampão (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM) até uma concentração de 0,5 pg/mL. Adicionou-se uma aliguota de 100 pL a placas com 96 cavidades e manteve-se a incubar de um dia para o outro a +4°C. Lavou-se as placas uma vez com tampão (Tris 50 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, 1% de albumina do soro de bovino) e depois manteve-se a incubar durante mais 2 horas à temperatura ambiente. Lavou-se as placas duas vezes com o mesmo tampão e manteve-se a incubar durante 3 horas à temperatura ambiente com o ligando radioactivo [ 125I]equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0,05 nM na presença de ligandos competitivos. No final da incubação, lavou-se as cavidades e determinou-se a radioactividade utilizando um contador gama (Packard). Determinou-se a ligação não especifica do ligando na presença de um excesso de equistatina fria (1 pM).

Ligação aos receptores de integrina ανβ5

Diluiu-se o receptor ανβδ purificado (Chemicon, cat. DCC1020) em tampão (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM) até uma concentração de 0,5 pg/mL. Adicionou-se uma aliquota de 100 pL a placas com 96 cavidades e manteve-se a incubar de um dia para o outro a +4°C. Lavou-se as placas uma vez com tampão (Tris 50 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, MnCl2 1 mM, 1% de albumina do soro de bovino) e depois manteve-se a incubar 19 durante mais 2 horas à temperatura ambiente. Lavou-se as placas duas vezes com o mesmo tampão e manteve-se a incubar durante 3 horas à temperatura ambiente com o ligando radioactivo [ 125I]equistatina (Amersham Pharmacia Biotech) 0,15 nM, na presença de ligandos competitivos. No final da incubação, lavou-se as cavidades e determinou-se a radioactividade utilizando um contador gama (Packard). Determinou-se a ligação não específica do ligando na presença de um excesso de equistatina fria (1 μΜ).

Avaliação dos parâmetros CI50 A afinidade dos produtos para os receptores de vitronectina foi expressa em valores CI50 ± DP, isto é, sob a forma da concentração capaz de inibir em 50% a ligação específica radioligando-receptor. O parâmetro CI50 foi elaborado utilizando o programa informático "ALLFIT".

Resultados

Todos os péptidos RGD examinados apresentaram uma afinidade significativa para os receptores de integrina ανβ3 e ανβδ com um valor CI50 da ordem das nanomoles. Em particular, o composto mais activo na inibição da ligação da equistatina às integrinas ανβ3 foi o ST2581 (CI50 = 1,7 nM), seguido pelos produtos ST2661 e ST2700 (CI50 = 4 e 7 nM) , ao passo que o mais activo para os receptores de integrina ανβ5 foi o produto ST2650 (CI50 = 0,17 nM) seguido pelas moléculas ST2661 e ST2700 (CI50 = 0,35 e 0,99 nM, respectivamente).

Embora a função principal das integrinas seja a mediação da adesão celular às proteínas da ECM em espaços intercelulares e membranas basais, também estão involvidas 20 na transdução dos sinais intracelulares que promovem a migração celular, bem como a sobrevivência. As integrinas não possuem actividade enzimática intrínseca mas activam as vias de sinalização fazendo um conglomerado com cinases e com proteínas adaptadores em complexos de adesão focal, após a sua associação com proteínas polivalentes da matriz extracelular (ECM). Por exemplo, a ligação de integrina suprime a apoptose por activação de supressores de apoptose e por inibição da activação de caspase. A integrina também estimula a migração de células por activação de GTpases Rho e Rac (guanosina-trifosfatases) e por ancoragem de ligamentos de actina à membrana. Estas proteínas de adesão promovem a entrada no ciclo celular estimulando a expressão de ciclinas. Assim sendo, a ligação a integrina suporta as cascatas de transdução de sinais que promovem a proliferação, a sobrevivência e a migração celulares. Pelo contrário, a inibição da interacção integrina-ligando em células inibe a migração e a proliferação celulares e induz a apoptose (Jin H. e Varner J. 2004 Br. J. Câncer 90, 561-565) . 21

Quadro 1

Afinidade de péptidos RGD para os receptores de vitronectina ανβ3 e ανβ5 Composto <Χνβ3 <XvPs CI50 ± SD (nM) ST2581 1,7 ± 0,1 3,4 ± 0,1 ST2597 13,5 ± 0,8 2,1 ± 0,07 ST2650 28,6 ± 0,7 0,17 ± 0,01 ST2649 37, 6 ± 0,9 5,1 ± 0, 07 ST2661 4,0 ± 0,1 0,35 ± 0, 09 ST2700 7,2 ± 0,07 0,99 ± 0,005 ST2701 36,7 ± 0,7 2,9 ± 0,1 ST2874 59 ± 0,7 712 ± 8,7 Cilengitida 18, 9 ± 3,1 (2) 0,13 ± 0,009

Ensaio de adesão de células tumorais a vitronectina

Deixou-se desenvolver células de carcinoma do ovário humano A2780 e células de carcinoma da próstata PC3 em RPMI 1640 que continha 10% de soro bovino fetal e sulfato de gentamicina 50 pg/mL. Deixou-se desenvolver células de carcinoma rectal humano A498 em EMEM que continha 10% de soro bovino fetal e sulfato de gentamicina 50 pg/mL. Manteve-se todas as células numa incubadora a 37°C, com humidade saturada e com uma atmosfera de 95% de ar e 5% de C02. A linhagem celular A2780 expressa níveis elevados de integrinas ανβ5, a A498 expressa níveis elevados de integrinas ανβ3 e a PC3 expressa níveis reduzidos de ambas as integrinas.

Para testar a eficácia dos fármacos sobre a adesão celular, manteve-se a incubar cada uma das linhagens 22 celulares, com uma densidade celular adequada (40000-50000 células/cavidade), com concentrações diferentes dos compostos em placas de cultura de tecidos com 96 cavidades revestidas com vitronectina (5 pg/mL) e deixou-se efectuar a ligação durante 3 horas. Decorrido este período, lavou-se as células uma vez com PBS que continha Ca2+ e Mg2+. Fixou-se as células tumorais com 4% de paraformaldeído durante 10 minutos à temperatura ambiente e corou-se com 1% de azul de toluidina durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lavou-se as células tumorais com água bi-destilada, secou-se e solubilizou-se com 1% de SDS. Determinou-se o número de células aderentes recorrendo a um leitor de microplacas (Victor2, EG&G Wallac) a 600 nm.

Determinou-se o valor CI50, enquanto parâmetro para a medição do efeito inibidor das moléculas sobre a adesão de células tumorais a vitronectina, utilizando o programa informático "ALLFIT". Os resultados obtidos com os compostos de ensaio estão agrupados no quadro 2.

Quadro 2

Ensaio de adesao PC3 A498 A2780 CI50, pM CI50, pM CI50, pM 3 horas de 3 horas de 3 horas de tratamento tratamento tratamento ST2581 21,5 ± 4,3 4,3 ± 0,3 3,8 ± 0,3 ST2650 38, 8 ± 8,5 6,5 ± 0,6 5,2 ± 0,2 ST2649 33,7 ± 7,8 34 ± 2,2 9,5 ± 1,9 ST2661 18, 8 ± 4,4 10,7 ±0,4 12,3 ±0,9 ST2700 11, 1 ± 3, 1 2,8 ± 0,1 0,9 ± 0,1 ST2701 22,7 ±5,1 9, 0 ± 0,2 3,2 ± 0,4 23

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pelo requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • DE 19725368 [0010] • WO 2004011487 A [0013]

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • H. Jin; J. Varner. Br. J. Câncer, 2004, vol. 90 (3), 561-5 [0004] • Haier J. et al. Clin Exp Metastasis, 2002, vol. 19(8), 665-72 [0007] • Haubner R. et al. J. Am. Chem. Soc., 1996, vol. 118, 7461 [0009] • H. Kessler et al. J. Med. Chem., 1999, vol. 42, 3033-40 [0014] • G.C. Tucker. Curr. Opin. Investig. Drugs, 2003, vol. 4, 722-31 [0022] • J.S. Kerr et al. Drug News Perspect, 2001, vol. 14, 143 50 [0022] • R.H. Haubner et al. Q. J. Nucl. Med., 2003, vol. 47, 189-99 [0022] • F.G. Blankenberg et al. Am. J. Cardiov. Drugs, 2002, vol. 2, 357-65 [0022] 24 • O. Meier et al. J. Gene Med., 2003, vol. 5, 451-62 [0025] • J. Lannes-Vieira. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2003, vol. 98, 299-304 [0025] • Jin H.; Varner J. Br. J. Câncer, 2004, vol. 90, 561-565 [0055]

Lisboa, 6/05/2010

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptidos cíclicos que satisfazem a fórmula estrutural I: c (Ri-Arg-Gly-Asp-R2) (Fórmula I) em que: o símbolo c designa um composto cíclico; o símbolo Rx representa um aminoácido com fórmula geral: -NX-CY(Z)-C0-; em que o símbolo X representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: H, alquilo (Ci-C6) linear ou ramificado, arilo (C6-Ci0) , benzilo, (CH2)n-COR, (CH2) n-NHR' , 4-COR-benzilo, 4-(CH2-NHR')-benzilo; em que o símbolo n representa um número inteiro seleccionado entre 1 e 5; o símbolo Y representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: H, CHmFm-; em que m + m' =3, em que os símbolos m e m' representam números inteiros seleccionados entre 0 e 3; o símbolo Z representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: H, (CH2) ni-NHR', 4-NHR' - (CH2) ni~ benzilo, 4-COR-benzilo, em que o símbolo ni representa um número inteiro seleccionado entre 0 e 5; o símbolo R representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: W, OW, N[CH2-C0-NH-CH2-0- (CH2CH20) n2-CH2-COOW] 2, NH-CH2-O-(CH2CH2O) n2-CH2-COOW, NW- (CH2-CH2NH) n2_CH2-CH2NHW; em que o símbolo n2 representa um número inteiro seleccionado entre 1 e 22 e o símbolo W representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: H e alquilo(C!-C3) ; o símbolo R' representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: H, C0- (CH2) n2-COOW, CO-CH2- 2 0 (CH2CH20) n2-CH2-NHW, C0-CH2-0-(CH2CH20) n2-CH2-COOW; em que o símbolo n2 possui as significações definidas antes e o símbolo R2 representa um grupo seleccionado entre o conjunto constituído por: D-Phe, D-4-terc-butil-Phe, D-4-CF3-Phe, D-4-acetilamina-Phe; as suas misturas racémicas, os seus enantiómeros individuais, os seus diastereoisómeros individuais e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 seleccionado entre o conjunto constituído por: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp); c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp); c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO (CH2) 2COOH] ; c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly) ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (0-CH2-CH2) 2-0-CH2-C00H] ; c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp- (CO-CH2- (OCH2CH2) 8-OCH2-COOH] .

3. Composto de fórmula estrutural: c [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp (CO-CH2- (OCH2-CH2) 3OCH3) ] ; c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad).

4. Processo para a preparação dos compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, o qual compreende a síntese de um péptido linear e a sua subsequente ciclização.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que a síntese do péptido é efectuada em fase sólida ou em solução. 3

6. Utilização de compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para a preparação de medicamentos.

7. Composições farmacêuticas que contêm pelo menos um composto de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2 ou 3 em mistura pelo menos com um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

8. Composições de acordo com a reivindicação 7 que contêm ainda um fármaco seleccionado entre o conjunto constituído por agentes anti-cancro, anti-parasíticos ou antivirais, quer em formas separadas quer muma forma farmacêutica única.

9. Utilização de compostos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3 para a preparação de um medicamento que exibe actividade inibidora do receptor de integrina.

10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o referido medicamento é útil para o tratamento de doenças que resultam de uma angiogénese anormal.

11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que a referida doença é seleccionado entre o conjunto constituído por tumores que sobre-expressam integrinas de um modo natural ou induzido, estados inflamatórios (v.g., artrite reumatóide), doenças oculares, retinopatia, insuficiência renal aguda, osteoporose, metástases e doenças cardiovasculares (acidente vascular cerebral e lesões cardíacas). 4

12. Utilização dos compostos de acordo com as reivindicações 1 a 3 para a preparação de um medicamento com actividade anti-parasítica por meio da inibição de integrina.

13. Composição que contém um derivado radiomarcado de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2 ou 3.

14. Utilização de um derivado radiomarcado de um composto de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2 ou 3 para a preparação de um agente de diagnóstico.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o referido agente de diagnóstico é utilizado para a detecção de massas tumorais pequenas ou para episódios de oclusão arterial. Lisboa, 6/05/2010