JPS59501319A - コラ−ゲン配向 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コラーゲン配向 技術分野 本発明は、配向したコラーゲン原線維を含むコラーゲン系材料または生体材料移 植組織の製造方法に関する。

背景技術 ２０年以上もコラーゲ゛ンは多種多様な治療および補てつの用途に用いるための 生体材料として研究されてきた。これらの用途の多（のため（・τ、微細に分散 したまたは超微粉砕された懸濁液がコラーゲン含有固体（たとえば動物の皮膚か らのもの）の寸法を機械的に縮小することにより製造されている。これらの懸濁 液を次いで濃、縮しくたとえば濾過により）次いで乾燥させて固体マトリックス を形成させることによりシート（膜）その他の構造物に加工することができた。

コラーゲングルはこの種の方法で加工するのはかなり容易であり、添加物は容易 に加入され、また化学的または紫外線による架橋が可能である。しかし特殊な構 造特性が要求されろ用途、たとえば眼の角膜または健の高度に配列した平行構造 中に存在する層状マ）　ＩＪソックス置換する補てつ用具においては、超微粉砕 されたコラーゲン調製品の特性は不適当である。

コラーゲン構造物を製造するための第２の既矧の方法（これが本発明により改善 された）はコラーゲンモノマーを再構成することよりなる。コラーゲンモノマー の溶液を中性のｐＨおよび中程度のイオン強度で加熱すると、自発的な自己組立 過程が開始し、これにより天然の型のコラーゲン繊維が生成ｊる。このインビト ロ重合過程（ここではゲル化またはフイノリロゲイ・７ス（ｆｉｂｒｉｌｌｏｇ ｅｎｅｓｉｓ）とも呼ぶ）に伴う機構は十分には理解されていないが、２１固の 明瞭に区別できる位相を伴うと思われろ。まず、”誘導（ｌａｇ　）”期が起こ り、この間は浴液の濁度も粘度も認識できるほどには変化しない。次いで”生長 （ｇｒｏｗｔｈ）”期が起こり、これは・容液の濁度の増大および開環な原綴維 構造物の形成により特色づけられる。これらの原線惟は最終的に生長し、大部分 のコラーゲンが高度に配置１ルだ不治性の原１維マトリックス状で存在する多孔 性ゲ′ル構造物となる。

溶液中の特定のコラーゲンのグ′ル化すなわち重合はｐＨの変化によっても誘導 されろ。コラーゲンモノマー溶液の調製、ならひにｐＨおよび温度の変化の組合 わせによるゲル化の誘発。

これ（（続くゲル化したコラーゲンの配向の例は米国特許第２．８３８．３６３ 号および第２，９３５，４１３号各明細書に記載されている。

本発明の目的は、有用な天然の型のコラーゲンマトリックスからなろ有用な高強 度の生体材料を提供することである。

七ツマー溶液から熱により誘導されるフイズリログ′坏シスにより天然の型のコ ラーゲンを製造することも目的とする。

さらに、溶液中のコラーゲンモノマー分子を均一に配向させ、この配向をゲル化 した材料Ｄコラーゲンモノマーで維持するととをも目的とする。

発明の開示 これらの目的に従って、本発明は配向した原線維構造をもつコラーゲン系材料を 製造する方法である。この材料は主としてモノマー状のコラーゲン溶液中に実質 的に層流を導入し、そのフイプリロゲ坏シスを熱により誘発することにより製造 される。

溶液に対流を誘発させるためには、小径チューブを用いることが好ましい。チュ ーブは約Ｌ２０ｍｍ２以下の横断面をもち、正方形または円形であることが好ま しし・。特に好ましい方法は、０６〜３．０　ｍｑ　／　ｍｌ！のコラーゲン溶 液を直径Ｌ２ｍｍ以下の円形の円筒状チューブ内で約２０〜４０°Ｃの温度にお いて熱ゲル化させることよりなる。ゲル化中にチューブの軸線を垂直に配置する ことにより、軸を水平に配置した場合よりもゲル中のコラーダン原勝維の配向が より良好になる。

層流はモノマー溶液を低い流速で加熱チューブ内へ押出すことによっても導入す ることができろ。滞留時間は、溶液がチューブを縦断するのにほぼ必要な時間で 加熱およびフイブリロゲイ、シスが起こるように調整される。

天然の生体高分子でありかつ蛋白質であるコラーゲンは身体組織中の蛋白質の約 ３５％を占め、鍵、皮膚、骨および血管の一次構造を形成する。身体の器官およ び組織の大部分はこの線維性物質により支持され、これは硬組織および軟組織双 方にわたって、しばしば他の物質と組合せて織込まれている。

動物組織から得られる可溶性コラーゲ゛ンを懸濁液中で再構成して線維けのゲル 様物質を形成させ、次いでこれを生体材料としオ用いるために加工することがで きる。インビトロではコラーゲンモノマーの重合を”フィブリロゲ不シス”と呼 ぶ。得られろ物質は生物医学的製品、たとえば人工角膜、血管移植片、４ 鍵移植片および他の多種の補てつ物の製造に用いることができる。

現在のスラリーキャスティングまたは押出しされた（ランダム配向した）コラー ゲン材料は、この種の用途の大部分、τとって弱すぎ、また分解しやすい。従っ てシリコーンまたは樹脂材料から作成された合成支持体が移植組織を補うために 用いられるが、これらは身体の永久的な浸入者として残留する、コラーゲン分子 は、凝集していない状態では三重ヘリックス構造の３本の相互に巻きついた〈プ チド鎖からなる長さ約３０００おける強度その他の特性が改良されると予想され る。コラーゲン原線維を配向させるために幾つかの試みがなされたが、これらの 試みは一般にたとえば機械的伸長または押出しにより、ゲル化または一部ゲル化 した材料に与えられろ物理的な力からなるものであった。これ（で対し本発明は 、凝集していないコラーゲン分子を熱により誘発されたフイブリロゲ不シス過程 までモノマー溶液中に流れを誘発することによって配向させる方法である。配向 は凝集したコラーゲン中で維持され、その結果これらのゲルから加工された材料 の強度が高くなる。

流れは既知の（・がなる手段によってもモノマー浴液中に導入することができる 。能動的手段たとえば羽根車、回転容器、または容積形ポンプを用いることがで きる。本発明においては、コラーゲン分子を配向させる手段がフイプリノゲ坏シ スを誘発する手段を構成することもできる。好ましい方法においては、主として モノマー状のコラーゲンの溶液を入れた伸長した。小径の熱伝導チューブに熱を かける。チューブが外部から適宜な伝熱媒質により加熱されるのに伴って、自然 対流による液体の動きが溶液内に誘発される。たとえば冷コラーゲン溶液を、小 径の石英チューブに入れ、チューブを気体状または液体状の媒質（温時）に浸漬 することにより半径方向に熱をかけると、対流による液体の動きがフイブリノグ ゛イシス過程に付加される。

チューブ軸を垂直に置くと、液体の動きが主として軸方向に起こる対流１セル” が確立する。

コラーゲン分子は溶液流により回転し、その結果柵が液体流の方向に平行した（ たとえば多かれ少なかれ、好ましい細い傾向したチューブ内でチューブの軸に沿 って）分子配向が生じる。

この状態で、粒子に対する液体抗力は最小となる。モノマーの重合が進行するの に伴ってより大きな凝集体がより大きな比率をもち、従って＠液流中で配向する 傾向がいっそう大きくなるであろう。フイブリロゲ不シス法の幾つかの時点でき わめて大きな原線維が製造され、これは生長するコラーゲングルマトリックス中 で固定化される。これが生成した原線維の残留配向を生じることが認められた発 明的な方法である。これを”流れ配向（ｆｌｏｗ　ｏｓｉｅｎｔａｔｉｏｎ）’ 法と呼ぶ。種々の流れ法に関して有用ではあるが、細いチューブ内の対流に関し てこの配向法をより詳細に記述する。

コラーゲンモノマー溶液は当技術分野で一般的なものである。

コラーゲン材料は市販されている。あるいはコラーゲン材料を実験室πおいて下 記に類似の方法で調製することができる。

（１）コラーゲン含有組織を摘出し、 （２）緩衝液で洗浄し。

（３）組、熾をたとえば凍結破壊により分割し、（４）　希望するコラーグ′ン 画分を緩衝化された塩溶液、酵素溶液〔たとえば投プシンまたはプロナーゼ（Ｐ ｒｏｎａｓｅ、登録簡潔）〕または有機酸浴液（たとえば酢駿、クエン酸など） に可溶化し、抽出し、 （５）　コラーゲンを一連の塩沈殿により精製し、（６）必要になるまで酸浴液 中に凍結した状態で保存する。この一時的な溶液を原液と呼ぶ。供給業者から購 入される材料（ま、送付されるとき一般にこの状態にある。使用する時点で、手 持ちのまたは購入した原液につき下記の追加工程を行う。

（７）４℃で希望するｐＨに対し透析し、（８）ゲル化／溶融サイクルによりコ ラーゲン凝集体を除き、次いで冷時遠心して不可逆的凝集体を除去し、（９）　 希望する濃度となし、そして ｊｌＯ）　ｆル化容器に導入し、昇温させてゲル化させろ。

既知のコラーゲン添加物、たとえばエラスチンおよびＧＡＧ（グリコースアミノ グリカン）をゲル化前に溶液に添加するか、あるいは架橋前にゲルに潅流させる ことができる。

フイプリロゲ坏シス 上記のように、希望するイオン強度およびｐＨの透析用緩衝液を用いて原液を希 望する濃度に調整する！次いで得られた溶液を遠心して残存凝集体を除去する。

濃度範囲は厳密なものではなく、若干は使用するコラーゲン型に依存する。実験 室で塩抽出により製造されたラチリチソク（１ａｔｈｙｒｉｔｉｃ　）コラーゲ ン（ＴＨＥ　ＥＴＪＲＯＰＥＡＮ　ＪＯＬＪＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＣＩＩＥｆ ｖｉＩＳＴＲＹ、　Ｖｏ４２５．ＰＰ５５３−５７２（１９７２）中のＢ　、０ ＢＲＩＮＫの論文参照）に関しては０．６−１．５ｍｑ／ｍｅの溶液が最も望ま しい配向を与えることが認められた。酵素法で抽出された市販材料は同様に望ま しく・結果を得るためには約２０〜３．Ｑ　ｍｑ／ｍｅの濃度を必要とする。こ れはこれらコラーゲン分子のテロペプチド（ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）末端領域 が存在しないことによると思われる。ラチリチソクコラーゲン約０．３ｍり／ｍ ｔ（酵素処理されたコラーゲン０．６ｍ９／ｍＵ）以下の溶液は安定性の乏しい ゲルを与える。低濃度ゲルにおける原線維相互作用の低下によっても配向が若干 制限される可能性かある。

溶液のｐＨはゲル化時間に影響を与えるが、原線維の配向には実質的に重大なも のではない。約ｐＩ（６〜８の範囲が好ましい。

フィブリロゲネンスに際しての温度はある程度配回に影響を与えることが認めら れた。ゲル化を実施する際には、コラ−ケン溶液を前記のチューブに約４’Ｃ以 下で入れる。次いでチューブの外しに好ましくは均一に熱をかけて、溶液の温度 を希望する水準に高める。チューブ周囲の水または生気のジャケットが特に望ま しい。加熱によりフィブリロゲネンスが誘発され、チューブ寸法が適切であると 溶液中の対流も誘発される。もちろん対流も熱を急速に溶液全体に分散させるの に役たち、従って溶液はチューブ全体にわたって均一にゲル化すると思われる。

２０〜４０℃の範囲のゲル化温度によって一般に好ましい配向が得られる。内径 約６ｍｍのチューブを用いた場合、浴液温度８ をジャケットの平衡温度の５％以内にまで高めるためｌで約１−６分が必要であ った。２５℃よりも低い温度を用いることもできるが、ゲル化がきわめて緩徐に なる。約３５℃よりも高い温度では、約３５′Ｃ以下の温度を用いて製造した場 合よりも凝集が少ないように思われろ（より分散した、小さな凝集体）。しかし 約４０℃の最高温度までは良好な配向および機械的特注が得られると思われる。

好ましい範囲のいかなる温度を用いても、伸長した小径チューブ内のコラーゲン ゲルを加熱すると内部の対流セルが流動する。厚さの少なくとも４倍の高さをも つ垂直に置かれたチューブの場合５これらの対流セルはその形状が実質的に長円 形であり、その主軸がチューブ軸に実質的に平行であることが認められた。垂直 に配置されたチューブにおいては重力その他の力により対流セルがチューブ軸に 沿って沖長し、従って傾斜の少ないチューブの場合よりも原沫維の配向が良好で あろうと考えられる。垂直方向への傾斜が大ぎいほど対流セルはより伸長し、縦 の配列がより一貫していると考えられろ。水平なチューブの場合、比較的小さな （２および４ｍｍ）のチューブでは縦の配向が一貫しているが、垂直位でゲル化 した材料の場合はど一貫してはいない。より大きなチューブの場合、水平位でケ ゛ル化した材料は配向した原線維を含み、またキャスティングしたフィルムより も良好な強度をもつが、その配向は縦方向に特に−貫してはいない。これは長円 形の対流セルがより少ないためと思われる、水平位でグ′ル化した太径チューブ におけるダルの原線維の配向は、垂直位でグル化した材料の場合よりもキャステ ィングしたフィルムの場合により類似する。

チューブは好ましくは伸長じており、かつ等しくはなくても実質的に同様な１福 および厚さく断面の）をもつ。たとえば幅は好ましくは厚さの２倍以下であり、 一方高さは好ましくは厚さの少なくとも４倍である。正方形または円形の横断面 が好ましく・。単純な横断面および高いアス啄りト比の場合チューブ内の対流セ ルが伸長し、これにより得られるコラーゲンゲルの原線維配向が改良されること が認められた。長方形の横断面は伸長していない多数の並列した対流セルを生じ ろ原因となり、正方形または円形の横断面の場合のように良好にチューブの軸線 に沿ってコラーゲンな一貫して配向させることはできない。

面積的１２０、πｍ２を越える横断面をもつチューブはこれよりも小さなチュー ブはど良好な原線推配向を与えないと思われる。

その理由は明らかでないが、チューブを均一に外部から加熱することにより誘発 されろ対流セルの形状がより伸長していないことによると思われる。異なる直径 をもつ円形チューブによるコラーゲンゲルの性質を比較する実験において、光学 的および機械的測定によれば対流配向効果（水平位の試料よりも優れている）は 内径８朋の垂直に置かれたチューブにおいて最高であることが示された。これよ りも小径または大径のチューブでは改良がより少なかったが、内径１２ｍｍにお いても試料は配向し、スラリーキャスティングされた（配向していない）試料お よび水平位でゲル化したチューブ試料の強度よりも優れていた。

コラーゲンゲル、・まゲル化したのち士イ材料を架橋させ、次い０ でゲルを機械的に容器から取出すことにより取出すことができろ。ゲルを紫外線 によって架橋することができるが、これにより局所的に加熱され、コラーゲンが 変性する可能性がある。従って、適切な試薬を半透過性のゲルに潅流することに より化学的（・二架橋することが好まい・（たとえばグルクルアルデヒド液によ り）。架橋はゲルを乾燥および再水相したのち行うこと゛もできるが、ゲルを強 化するためにはその前に行うことが好ましい。ゲルを適宜な温度に加熱すること により同時に架橋および乾燥することもできる。

本発明に従って流れ配向させろことにより配回させたコラーゲンゲル：・ま実質 的に９０ｗ１０　以上の水を含有する。これから生体材料移植組織を作成するた めには、グルを不可逆収縮点以下に乾燥させなければならない。これは（コラー ゲンの種類および他の加工変数に応じて）水約２　０　ｗ１０以下で起こるか、 通常は水約１　０　ｗ／　ｏ以下で起こる。この不可逆的収縮点以上では、。乾 燥した１ノボンは再水相されてほぼもとの寸法（および強度）になるであろう。

この点以下では、乾燥したＩＪ　、−１４７の伸長はごくわずかであり、再水和 に際して実質的な強度を保持する。

生体材料移植組織、たとえば）健および血管移植片＆よ、次（・で乾燥したコラ ーデ゛ンリボンからこれを再水和し、この再水和されたリボンｌ積層し、織りま たはねじることなどにより希望する形状となし、これらを互いに接着することに よって形作られる。

発明を実施するための最良の形態 例１ 水平および垂直対流配向 コラーゲンゲルを下記により調製した。

（１）切除したラデリチツクラット皮膚を、ＥＤＴＡおよび蛋白領分Ｍ’３　素 掘制剤（たとえばフェニルメチルスルフエニルフルオリド）を含有するトリス緩 衝液中で洗浄し、（２）皮膚を凍結し，小片π破断じ、 （３）洗浄した組織を３倍容積の０１０Ｍ・Ｎａ（Ｊ（）ＩＪス緩衝液中、５０ ミリモル、ｐＨ７．４）で３回抽出し、（４）残存する組織を３倍容積の０．９ 　５Ｍ　−ＮａＧｅ　（　トリス緩衝液中、ｐＨ７．４、５０ミリモル）で３回 抽出し、（５）工程４で得た抽出液を遠心しく１８．０００Ｘ５＋，１時間）、 上清を合わせ、 （６）工程５で得た上ａＬｙ″ＩプールＨＮａ（Ｊ　を添加して最終濃度１７％ にした。沈殿を１８．０００Ｘｇで１時間遠心することにより集めた。デカント シ，上湾を捨てた。沈殿をもとの抽出用譲衝液に再溶解し、沈殿および再溶解を 合計３回繰り返した。

（７）最終沈殿を０．５Ｍ酢酸に再溶解し，−２０℃に凍結保存した。この材料 を以下ラ　リチツクコラーゲン原液と呼ぶ。

上記の原ｉ（０．５Ｍ酢酸中）の一部を４℃で３　２．７　ｍＭ・ＮａＨ２ＰＯ ４　（イオン強度−０１５、希望するｐＨ）３〜４回′（各４ｇ）ｇ対して透析 ｆることにより、フ・イ／リロゲ不シス用の中１生ｐＨ　コラーゲンを調製した 。

透析後、溶液を３０′Ｃで約２５ル３５Ｉ２ により、さらにコラーゲンの精製を行った。次いで得られたコラーゲ′ンゲ′ル を室温で遠心し、上清を捨てた。このコラーゲン−くレットを透析用緩衝液によ りもとの容積の４０％妃までもどし、４°ＣＫ保持して再溶解した。この溶液を 遠心して不溶性凝集体を除去した。

次いでこのコラーゲン溶液を脱気し、内径６ｍｍおよび長さ１００ｍｍをもつ、 円形断面の開口石英ゲルチューブに装填した。

両端には特製のプリコーンゴム裏枠をした。標薄皮下注射用注射針をグルチュー ブの充填およびガス抜きの双方に用いた。上記の操作すべてを４℃の冷蔵室内で 行い、装填したチューブは水浴中に保存、移動させた。

充填したチューブを１度に水浴から空気加熱室に移した。この室は、温風を系内 に循環させることにより一定の温度に加熱さｉｔた。じゃま版でチューブを囲み 、均一な加熱を確保した。

重力ベクトルに対する試料の位置の影響を調べろため、熱グル化操作中試料チュ ーブの軸を垂直または水平に配置した。得られたグ”ルをコラーグ′ンマトリッ クスの形態につき、ならびに（乾燥状態で）機城的強度および光学的特性につき 分析した。

表■にこれらの実験の結果をまとめ、上記により製造したラケリチノクコラーガ ン、およびコラ−タフ社（パロアルト、カリフォルニア州）、製の酵素処理コラ −ダンであるバイトロダン１００　（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ　ｌ　ＯＯ、登録商標） Ｋつき種々の％註を比較スル。すべてのグ゛ルを１％グルタルアルデヒド潅流に より架橋し、チューブから取出した。幾つかの試料は架橋したダルをチューブか ら取出し、非湿潤性のプラスチック支持体上で徐々に風乾することにより脱水さ れた。この乾燥法により製造した薄い不溶性のストリップを乾燥状態であっても 再水和さ几た状態であっても、以下コラーゲンリボンと呼ぶ。

グ′ルの形態は、グル化チューノから取出したのちの湿潤試料（τついて、架橋 したグ゛ル奢エポキシ樹脂マトリックス中に埋め込むことによって保存された。

こ几らの試料の切片は、光学顕微鏡で観察した際、垂直に置かれた試料では軸に 平行な顕著な原線維配向を示した。水平位でグ′ル化した他の試料はよりランダ ムな構造を示したが、フラットキャスティングされた試料よりは多くの場合より 大きな配向を示した。こり・構造の差は脱水試料の光学特性を調べることによっ ても明らかにされ、改良された機械的特性にも現われていた。

試料による平面偏光の旋光を乾燥リボンシておける原線維配向を示すものとして 用いた。試料を光学顕微鏡の直角に配列された偏光フィルター（吸光位置）間π あろ標示付き回転台に乗せ定。第１偏光フイルターに対し４５°に傾けた試料（ Ｉ４５）および平行な試料（工０）それぞれにつき透過光強度を測定した。これ らの強度の比（Ｉ４５／ＩＯ）　Ｃ以下偏光化ＰＬＲと呼ぶ）は試料の光学的異 方性と正比例する。ＰＬＲはフィブリログネシスに際して垂直に置かれたコラ− ダンダルの方が水平に置かれた同様なコラ−タングルによるよりも大きいことが 一貫して認められた。

４ 表■ グル化に際しての試料の配向により （１，５”！？／：ｎｅ）　（３，０ｍｑ／ｒｎｌ　）範囲（ｇ／／ｄｒｍ２） 　１１００−２５００　１５００−２８００偏光比中央［直　３１，３　１８． ０ 範囲　２４．２−４１．７　６．５−２２．０水平チユーブ軸 降伏応力中央値ＵＡ臘２）　９００　１７００範囲１ｇ／ａｍ２）　７００−１ ２００　１．２００−］−９００偏光比中火直　７，０　１０．０ ※　内径６．扉×長さｌ　Ｑ　Ｏ＋ｎｍの石英チューブ中、ｐＨ７，０および３ ０°Ｃにおいて。

リボンの断面積：ラナリチノクコラーｒン、約０．１８８ｍｍ２；バイトロダン １００、約０．１２５ｍｍ　。

引張り試験の前にリボン材料を標準食塩液に少なくとも４時間浸漬することによ り再水和した。再水和に際してとの材料Ｑまその乾燥容積の約１５０％にまて膨 潤した。こｉｔらの方を去Ｇτより製造され、再水相さオｔたコラ−ダンは裂け またＱま全体的破断が生じるまで増大する引張り負荷のもとで柔軟な挙動を示し た。

垂直１立で形成されたグルの原線維の配向は軸方間に高（・機械的特性を与える ことが認められた。標準引張り試験法により１１１定した機械的強度はこれらの グ′ルから加工した再水和コラ−ｆンリボンの場合の方が大きかった（表■参照 ）。

例２ キャスティングされたフィルムの形態 コラーゲン溶液を内径約２５朋の小型の水ジャケット付きビーカー内で溶液深さ １３および６ｍｍにキャスティングした。冷コラーｉン浴液をあらかじめ３０° ＣＫ加熱された循環水ル−プに接続したビーカーに直接ピはットで測り入れた。

この制御されたシステムは、コラーグ′ン原線維形成の科学的研究にしばしば用 いられるガラス板または顕微鏡用フライ１上での普通の熱ゲル化と同等であり、 ランダム原腺維マ）　ＩＪラックス特性を本発明により改造された配向した原線 維マ）　ＩＪノクスの場合と比較するだめのものであった。これらのキャスティ ングされたダルから作成さユた脱水された材料の特注を表■に示す。

３、、ｌＩ６よび６エのダルにみられろわずかに良好な偏光比および機械的特性 は、これらの比較的厚いフィルムには若干の対流配向はあるが試料全体の一方向 性はないことによるものと考えられろ。これらの試料を鏡検用にランダム切断し 、また引張り試験ケ行うことにより、コラ−ダンはいかなろ方向にも優先的に配 列していないことが明らかになった。例１に示した原線維配向の著しい改良に比 べると、これらのキャスティングされたフィルムは熱グル化法により形成された 比較的異方性のマ）　ＩＪラックス特性を表わしていた。

ｌ６ 表■ キャスティングされた脱水フィルムの特注（１，５ｍ？Ａｎｉ）　６　３３０　 １．８バ（）ｏＹンｌ　ｏｏ　ｌ　７００　１．０（３，０Ｉｎ９Ａｌｌ）　３ 　１３００　２．４６　１９００　２．５ ※　引張応力は直径６７７ｍの円筒状デルの一般的収縮に基づく共通収縮因数を 用いて標準化された。

例３ 配向に対するチューブ直径の影響 コラーゲン原線維マトリックスの同時重合および配列に対する容器寸法の影響を 証明するため、下記の実験を考案した。

８７ｍｍの均一な長さおよび２〜１２ｍｍの範囲の各種の内径をもつ円筒形のガ ラスチューブを作成した。ラチリチツクコラーｙン原液を例１の方法と同様な特 性シリコーンゴム裏枠を介して装填した。

チューブを２枚のアクリル製端板間に保持する特殊なホルダーを作成した６６本 のガラスチューブ（２，４，６，８，１０および１２ｍｍ）および１本の石英チ ューブ（対照）よりなる各−組のチューブをあらかじめ装填し、冷蔵室に集め、 移動のため水浴に保存した。次いで各組の試料を３０℃の水浴に移し、熱グル化 を進行させた。

得られたグルおよび乾燥したリボンの構造につき例１に記述した分析を行った。

表■におし・て、垂直位および水平位で処理したグルの機械的および光学的特性 を比較する。引張り試験においては、水平位でグル化した試料がリボンに垂直に 破断する頻回を示した。これは原線維がランダムに、またはリボンの横方向に配 向する頻回を示したためと思われる。垂直位でグル化した試料は一貫して軸方向 に伸びるのこぎりの歯形に破断し、この試料の位置では軸方向のコラーゲン原線 推配向が強められるという結論が支持３ｆｉだ。

表■に示すように、垂直位２よび水平位でグ′ル化した試料間の機械的特性およ び光学的特性の差は内径約８ｍｍのチューブにおいて最大となった。直径１２ｍ ｍの試料では機械的強度が垂直位のグ′ルと水平位のグ“ルとで本質的に等しか った。しかし１２ｍｍの試料の光学的測定によｎば以下のことが示された。すな わち（１）垂直立で形成さ几たグルは軸方向に配列した線維を中程度含有してい たが、（２）水平位で形成されたグ゛ルはよりランダムに配向した構造を含んで いた。実際に、水平位の試料の特定の領域ではコラ−ダン線維が主としてチュー ブ軸に直角に配向しているのが見られた。より大きなチューブはキャスティング されたフィルムと同様によりいっそうランダムな配向を与え、これらのランダム 配向した材料は生体用として不適当であると予想される。

８ 表■ コラーグ′ンマトリックスに対するチューブ直径の影響２　１６３０１２６０　 ２９　１．７　１．１　５５４　９８０　８３０　１８　４．３　３．６　１９ ６　＋２６０　７４０　７０　９．１　１．６　４７０８　１４２０　６８０　 １０９　１１．７　０．９　１２０・）１０　１１００　７２０　５３　２６． ２　８．３　２１６＋２　８３０　８２０　１　８．７　３．４　１５６・シ　 引張応力は直径６韮のグ′ルの一般的収縮に基づく共通状７陥因数を用いて標準 化さ７ｔた。

例４ 押出配向 押出に際して誘発される層流の配回作用を証明するために数種の実験を行った。

一般にコラ−ダンモノマー溶液を可変速度ポンプに乗せたガラス製注射器に装填 した。インラインフィルターおよび押出チューブは注射器と液体の連絡カーあっ た。種々の直径の様々の疎水ｉ生チューブ材料（たとえを了ポリプロピレン、Ｔ ＦＥ　”、＝よびシリコーン）を用（・た。装置シま４”Ｃの冷蔵室内に配置さ れたが押出チューブはモノマーカーチューブを貫流するのニ半ってモノマーの加 熱重合が起こるように加熱浴中に保持さ２ｔた。チューブ内の滞留時間は、はぼ 溶液カーチューブを横断するの（、・Ｃ要する時間内６τフイフリロ〆不シスが 起こるようπ調整さ几た（特にチューブの長さ２よび浴温に応じて）。

各種のチューブＲよび浴温を用いて上記の装置内で数回の実験を行った。３．０ 　ｍ？Ａｌｌのバイトログ′ン１００モノマー溶液を用いた。凝集性のグルを生 成させろためには最小滞留時間が必要であると思われた。いったん域値を越える と滞留時間はタルの特性・に影響を与えないように思われた。この最小グ゛ル化 時間：ま一般にチューブ直径に正比例する（はぼ下記の直線関数として）、。

ｔｇ＝６４＋０．８６ 二の式中ｔｇは最小ｉル化時間（分）であり、ｄｉはチューブ直径（朋）である 。

グ゛ルを１％グルタルアルデヒド溶液中で１６時間架橋させ、蒸留水中でさらに ２４時間すすいだ。試料を切断し、特性の測定のため作存した。

押出速度はグ′ルの特性に大きな影響を与えるように思われた。

表■は３．４　＋ｎｍ　（内径）のシリコーンゴム製チューズから３７℃の浴を 甲いて押出した４種の試料の強度および配回に対する影コラーゲンの物理的特性 に対する押出速度（直線速度）の影響４１１　静的グル化　３６０−３６２　５ ．３４１０　１．７３　１７８−３７０　３．８４０９　３．４３　２３２−３ ９３　３．４３９３　６．６７　１０４−３１６　３．２２０ ※　デニールは織物に関する同値等級であり、長さ９０００ｍの線維の重量（！ ＡＫ等しい。

速度が増大すると原線維の配向に破壊的な影響を与えると思われる。これはより 大きな、またはより小さなチューブを用いた実、験に：Ｆ−３−・でも同様であ った。凝集性のダル、・ま少なくとも約６濯／分まで反復製造することができた が、１〜３　ｃｍ／分の範囲が好ましい。

５７調よりも大きく、その直径の１０倍よりも短かい長さをもつチューブの場合 、七ツマー溶液の重力排出が問題となった。

この寸法よりも大きなチューブを用いろ場合、直径の１０倍以上の長さをもつチ ューブを用いること、およびチューブに栓をしてグル化を開始することが必要で あった。最初の静的グル化ののち役を取り、ポンプを始動させて普通に押出した 。この方、去では少なくとも約９．５朋のチューブが用いられた。しかしこれよ りも大きなチューブでは、品質の劣るグ”ルが生成した。このため、６〜８韮程 度の直径をもつチューブが最大有用寸法であると思われた。

コラーグ“ン溶液の予備グ゛ル化が特性に与える影響を証明するため、注射器温 度を徐々に４″Ｃの冷域室温度から３３℃にまで高める実験を行った。３７℃の 浴と共に４．８ｍｍのチューブを用いた、試料を３分毎に取出した。試料の偏光 比および機械的強度ともに４０分間の試験中、直線的に劇的に低下した。これば さらに、モノマー溶液中の層流が原線維の配向の原因である証拠であると考えろ 。

具体例および本文には細いチューブおよび対流を用いろ本発明を実施するための 現時点で好ましい方法につき土として詳述したが、本発明の重要な知見は層流領 域におけるコラーグ′ンモノマーの配向、および配向を維持するための後続の溶 液ダル化であることは明らかであろう、従って熱ｙ／ｌ／化に際してコラーゲン 溶液中１ｃｉれを誘発するだめの他の既知の方法もここに含ま几るものとする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａｌ　実質的Ｖこモノマー状のコラーゲン内らなろコラーゲン溶液を供給 し、 ｆｂ）　コラーゲン溶液中に実質的に層流を誘発させてこれによりコラーゲンモ ノマー分子を流れの方向に配回させ、ｆｃ）　分子か流九の方向に配向した状態 でコラーゲングルを熱グ゛ル化させてコラ−ダンタルとなし、ｆｄｌ　コラーゲ ングルを架橋により安定化し、（ｅｌ　安定イヒしたコラーゲングルを不可逆的 状光点以下まで乾燥させ、 （１−）乾燥したコラーゲングルを再水相し、そして騰）再水和ざルたコラーゲ ングルから生体材料移植組織を作成する７ ことよりなる、配向したコラーゲン原線維を含む生体材料移植組織の製造方法。 ２、約１２０ｎｍ２以下の横断面積をもつ円筒状チューブにコラーゲン溶液を導 入し、この円筒状チューブの外表をコラ−グツ溶液内に対流が起こる速度で加熱 する工程によりコラーダン溶ｌ夜（て流１Ｌを特徴する請求））範囲第１項記載 の生体材料移植組織の製造方法。 ３、円筒状のチューブが厚さの約２倍以下の幅、および厚さの約４倍以上の高さ をもつ、請求の範囲第２項記載の方法。 ４、チューブの横断面が円形であり、約Ｌ２ｍｍ以下の内径をもつ、請求の範囲 第２項記載の方法。 ラ　フイブυログイ・シスがチューブ外表を約２０〜４０″Ｃの温度をもつ流体 と接触させることにより誘発される、請求の範囲第４項記載の方法。 ６　チューブの軸線がフィブリログ不シスに際して実質的に垂直の配回状態に保 持される、請求の範囲第５項記載の方法。 ７　コラ−ダン溶液を小径の伸長したチューブを通して押出すことによりコラー ゲン内に流れを特徴する請求の範囲第１項記載の生体材料移植組織を製造するた めの方法。 ８　チューブの長さおよびコラーゲン溶液の流速が、該溶液がチューブを通過す るのに要するほぼ時間内に溶液がグル化するものである、請求の範囲第７項記載 の方法。 ９、コラーゲン浴液の流速が約６．：ｍ７分以下である、請求の範囲第８項記載 の方法。 １０、［ａｌ　主としてモノマー状のコラーゲン内以下の流速で伸長したチュー ンに連続的に送入し、（ｂｌ　チューブの外表をチューブ内で熱グ゛ル化が起こ る速度で加熱し、 （ｃ）　ゲル化したコラーゲンを連続的にチューりから取出し、そして （ｄｉ’　コラ−’ｒ”ング′ルを架橋により安定化させる、ことよりなる配向 したコラ−ダン原線維を含むコラーゲン系材料の連続的製造方法。 １１、（ａｌ　主としてモノマー状のコラーゲンの溶液を約１２　ｏｎ、ｍ２以 下の横断面積をもつ円筒状チューブに導入し、（ｂｌ　円筒状チューブの外表を 、コラ−ダン溶液内に対流が生じる速度で、かつコラーゲンモノマーのフイプリ ロダ２４ 坏りスが誘発されてコラーゲンダルとなる温度に加熱し、（ｃｌ　コラーゲング ルを化学的架橋により安定化し、そして（ｄ）安定化されたコラーゲングルをチ ューブから取出す、ことよりなる配向したコラーグ′ンの原線維を含むコラ−ダ ン系材料の製造方法。 １２　円筒状チューブが厚さの約２倍以下の幅、および厚さの約・１倍以上の高 さをもつ、請求の範囲第１１項記載の方法、１３　円筒状チューブの横断面が実 質的に円形または正方形である、請求の範囲第１２項記載の方法。 １４　チューブの横断面が円形であり、内径が約１２−よりも大きくないもので ある、請求の範囲第１３項記載の方法。 １５　チューブの外表を約２Ｑ〜４０℃の温度の流体と接触させろことによりフ イブリロダ不シスを誘発させる、請求の範囲第１１項記載の方法。 １６　チューブの軸線がフイブリロダイ・シスに際して実質的に垂直の配向状態 に保持される、請求の範囲第１１項記載の方法。 １７、コラ−ダンが約０６〜３０■／　ｍｌの溶液状である、請求の範囲第１１ 項記載の方法。