CN111184910B - 一种可注射软骨修复水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可注射软骨修复水凝胶，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶5～15份、甲基丙烯酸酯化透明质酸1～10份、纳米纤维素1～2份、负载2‑([1,1‑联苯]‑4‑基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子0.1～0.5份。本发明的水凝胶以邻苯二酚官能化网络充当顺磁性金属离子螯合的支架，合成的黑色素基材料具有出色的生物相容性和协调孤立的顺磁性金属中心的能力，负载促软骨修复小分子化合物载2‑([1,1‑联苯]‑4‑基氨基甲酰)苯甲酸，将纳米粒分散到可注射水凝胶中，能够显著诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化，具有极强的促进软骨形成作用，同时实现MRI、光声和光热多种成像模式检测软骨修复情况，从而增强在医学临床中的应用。

Description

一种可注射软骨修复水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种可注射软骨修复水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程材料领域。
背景技术
近年来，随着人口老龄化加速，越来越多的人为关节软骨损伤而烦恼。关节软骨可能会因为运动时受到挫伤，或是车祸等意外事件造成机械性伤害，使关节软骨破损掉落。由于软骨本身自行修护的能力非常弱，是一种无壁和无血管的组织，它的再生常因其天生缺乏足够的愈合反应能力而受到损害。一旦受到损害，就无法自行复原，渐渐地磨损，等腐蚀到软骨下方的骨头时，就会有疼痛、肿胀等现象产生，限制了病人的运动能力。如果关节软骨损伤过度，到了不堪使用时，只有进行全膝关节置换手术，将破损不堪的关节锯下，以其他材料取代。
临床上膝关节软骨修复有多种方法可供选择，如关节镜下清创术、微骨折术、自体或异体软骨移植、软骨细胞移植、干细胞、组织工程化软骨修复及基因治疗技术。然而，获得具有正常解剖结构和功能的天然透明软骨在临床应用中仍具有挑战性。修复后的软骨缺乏完整软骨应有的力学性能和带状组织，可能导致进一步的退化。
现有的软骨修复的方式大多是通过手术移植治疗受损关节。常见的异体移植是置换金属关节，但是金属关节会出现异体排斥，寿命短，仅有十五到二十年，届时其与骨头相接的界面就会不堪使用，患者可能需再次手术置换，增大患者的痛苦。而自体软骨虽然不会出现排斥反应，但是自体移植依赖于充分的整合和具有额外的缺陷的缺点。所以寻找一种通过恢复透明软骨来修复软骨的治疗方式迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可注射软骨修复水凝胶及其制备方法，，该水凝胶能够显著诱导BMSCs(骨髓间充质干细胞)向软骨分化，具有极强的促进软骨形成和腱-骨愈合作用，同时该水凝胶还能能够通过MRI实时检测软骨的修复情况。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种可注射软骨修复水凝胶，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)5～15份、甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA-MA)1～10份、纳米纤维素(CNC)1～2份、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)0.01～0.05份。
黑色素是结构单元含有酚羟基、氨基和亚氨基的一类大分子，广泛存在于动植物体内，具有特殊的化学结构和许多优异的生物功能，如光保护特性、自由基捕获、光热转换功能等。由于类黑色素聚多巴胺中含有大量的酚羟基、氨基和亚氨基等反应活性官能团，可以作为结合点固定目标分子，例如通过氧化还原性或螯合作用与过渡金属离子结合。
小分子化合物2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(kartogenin，KGN)在关节软骨治疗中对抑制软骨退变及促进软骨再生。研究发现，加入KGN后软骨细胞相关的基因产物明显增加，聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、lubricin蛋白、盘状结构域受体均增加，而骨钙蛋白表达降低，金属蛋白酶Ⅰ的抑制剂、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖含量均增多，可以保持软骨表型并阻止基质金属蛋白酶对细胞外基质的进一步破坏。
纤维素作为地球上最丰富的可再生生物资源，具有价格低廉、产量丰富的特点，以天然纤维素为原料来获得纳米纤维素的各种制备手段已经非常成熟。纳米纤维素(CNC)是纤维素经过酸水解得到的一种纳米级纤维素结晶体。纳米纤维素作为生物高聚物增强相，具有其他增强相无可比拟的特点。
明胶是胶原部分水解后的产物。胶原分子是由三条多肽链相互缠绕所形成的螺旋体，通过工艺过程的处理，胶原分子螺旋体变性分解成单条多肽链(α-链)的α-组分和由两条α链组成的β-组分及由三条α链组成的γ-组分，以及介于其间和小于α-组分或大于γ-组分的分子链碎片。明胶的化学改性较多地在明胶与高分子化合物的单体进行接枝反应上进行开发与研究，这是因为通过接枝共聚反应所得到的接枝共聚物，既保留了母体明胶原有的许多宝贵的性能，如形成凝胶和形成螺旋结构的能力以及耐热性好等，又能从接枝组分中获得新的性质。
透明质酸基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。
本发明通过以邻苯二酚官能化网络充当顺磁性金属离子螯合的支架，合成的黑色素基材料具有出色的生物相容性和协调孤立的顺磁性金属中心的能力，然后再负载促软骨修复小分子化合物KGN，将纳米粒分散到可注射水凝胶中，材料具有修复软骨的功能，同时实现MRI、光声和光热多种成像模式检测软骨修复情况，从而增强在医学临床中的应用。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶10份、甲基丙烯酸酯化透明质酸5份、纳米纤维素1份、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子0.05份。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：将明胶溶于PBS缓冲溶液中，边搅拌边缓慢滴加甲基丙基酸酐，搅拌反应，反应结束后将反应液透析、冻干，即得甲基丙烯酸酯化明胶。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述明胶与甲基丙基酸酐的质量比为(0.8～1.2)：(0.5～0.8)。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)的制备方法为：将1g的明胶溶解于10mL的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，50℃边搅拌边缓慢滴加0.6mL甲基丙基酸酐，1小时后，反应结束，将溶液装入透析袋(MW＝3500KDa)40℃水浴透析24小时，冻干，即得甲基丙烯酸酯化明胶。明胶质量为0.8～1.2g，优选为1.0g；甲基丙烯酸酐用量为0.5～0.8mL，优选为0.6mL；透析袋的截留分子量为3500Da；磁力搅拌转速为500～800rpm/min，优选为600rpm/min；磁力搅拌时间为1～4小时，优选为1小时。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述甲基丙烯酸酯化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水中搅拌过夜，然后边搅拌边滴加甲基丙基酸酐，调节pH值为8～9，搅拌反应；反应结束后向反应液中加入丙酮，析出固体，离心，将固体溶于水中，透析、冻干，即得甲基丙烯酸酯化透明质酸。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述透明质酸与甲基丙基酸酐的质量比为(0.8～1.2)：(0.3～0.6)。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA-MA)的制备方法为：将1g透明质酸溶解于50mL去离子水中搅拌过夜，然后边搅拌边滴加0.4mL甲基丙基酸酐，用5M的NaOH使溶液pH维持在8～9，然后反应24小时；将反应完的溶液倒入200mL的丙酮中，析出固体，在3000rpm转速下离心10分钟，将固体溶解于水中，装入透析袋(MW＝3500KDa)透析72小时，冻干，即得甲基丙烯酸酯化透明质酸。透明质酸质量为0.8～1.2g，优选为1.0g；甲基丙烯酸酐用量为0.3～0.6mL，优选为0.4mL；透析袋的截留分子量为3500Da；磁力搅拌转速为500～800rpm/min，优选为600rpm/min；磁力搅拌时间为20～30小时，优选为24小时；离心转速为3000～8000rpm/min，优选为3000rpm/min；离心时间为10～15min，优选为10min。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的制备方法为：
(1)黑色素纳米粒子的制备：将盐酸多巴胺和FeCl3·6H2O溶于去离子水中，室温搅拌，然后加入三羟甲基氨基甲烷的水溶液，搅拌反应，反应结束后离心，即得黑色素纳米粒子；
(2)负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的制备：将2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸溶于丙酮中，氮气条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液，搅拌，然后加入黑色素纳米粒子的水溶液，搅拌反应，反应结束后离心，即得负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸与黑色素纳米粒子的质量比为(1～6)：(10～30)。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述黑色素纳米粒子(SMNP)的制备方法为：称取45mg盐酸多巴胺和6.2mg FeCl3·6H2O溶解于130mL去离子水中，室温搅拌1小时；然后称取450mg三羟甲基氨基甲烷(tris)溶解于20mL去离子水后，迅速倒入上述溶液中，溶液的颜色立即由黄色变为红色，半小时后，溶液逐渐变为黑色，继续反应1.5小时，用10000rpm转速下离心10分钟，然后用去离子水冲洗完继续离心，重复三次，即得黑色素纳米粒子。盐酸多巴胺的用量为30～50mg，优选为45mg；离心时间为15～40min，优选为20min。
作为本发明所述可注射软骨修复水凝胶的优选实施方式，所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)的制备方法为：称取5mg KGN溶解于1mL丙酮中，通氮气除去烧瓶中的空气，另称取10mg EDC和7mg NHS溶解于4mL水中，然后加入KGN溶液中，搅拌10分钟；将黑色素纳米粒子溶于10mL水中，然后加入上述溶液中，搅拌8小时，10000rpm转速下离心得到沉淀，用去离子水冲洗三次，即得负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子。KGN的用量为1～6mg，优选为5mg；SMNP的用量为10～30mg，优选为20mg；离心时间为15～40min，优选为20min。
第二方面，本发明提供了上述可注射软骨修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子溶于PBS缓冲溶液中，超声分散，然后加入甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化透明质酸、纳米纤维素，水浴搅拌，然后加入光引发剂，用蓝光手电筒光照引发交联反应，即得可注射软骨修复水凝胶。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述PBS缓冲溶液的用量为甲基丙烯酸酯化明胶重量的10倍，所述水浴搅拌温度为50℃，水浴搅拌时间为1～4h，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，所述蓝光的波长为365～760nm。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，包括以下步骤：将负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子溶于1mL PBS中，超声使其完全分散，然后称取0.1g甲基丙烯酸酯化明胶、0.05g甲基丙烯酸酯化透明质酸和0.01g纳米纤维素，加入上述溶液中，50℃水浴搅拌1小时后，加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，即得可注射软骨修复水凝胶。
作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述水浴搅拌的转速为500～800rpm/min，优选为600rpm/min；所述水浴搅拌的时间为1小时；所述蓝光的波长为420nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的水凝胶以邻苯二酚官能化网络充当顺磁性金属离子螯合的支架，合成的黑色素基材料具有出色的生物相容性和协调孤立的顺磁性金属中心的能力，然后再负载促软骨修复小分子化合物载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸，将纳米粒分散到可注射水凝胶中，能够显著诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化，具有极强的促进软骨形成作用，无需进行软骨移植就可以修复损伤的软骨，同时实现MRI、光声和光热多种成像模式检测软骨修复情况，从而增强在医学临床中的应用；
(2)本发明的水凝胶用可注射水凝胶作为纳米粒的载体，能更好地分散纳米粒，包封在水凝胶中的纳米粒子可以实现原位长时间停留，可明显减少给药次数和纳米粒子可能存在的体内循环毒性问题；
(3)本发明的水凝胶制备操作简单，所需的原材料易得，有望在生物医学工程材料领域得到广泛的应用。
附图说明
图1为对比例2制备的水凝胶的成胶过程图。
图2为对比例1～3制备的水凝胶的扫描电子显微镜图，其中，A为对比例1的制备的水凝胶的扫描电子显微镜图，B为对比例2的制备的水凝胶的扫描电子显微镜图，C为对比例3的制备的水凝胶的扫描电子显微镜图。
图3为黑色素纳米粒子和负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图，其中，A为黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图，B为负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。
图4为明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、透明质酸、甲基丙烯酸酯化透明质酸、甲基丙基酸酐的红外光谱图。
图5为对比例4～5制备的水凝胶的的光热升温图。
图6为实施例1制备的水凝胶的光热成像图。
图7为实施例1和对比例1制备的水凝胶的MRI成像图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种可注射软骨修复水凝胶，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)10份、甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA-MA)5份、纳米纤维素(CNC)1份、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)0.05份。
本实施例可注射软骨修复水凝胶的制备方法为：称取500μg SMNP-KGN溶于1mLPBS中，超声使其完全分散，然后称取0.1g Gel-MA、0.05g HA-MA和0.01g CNC，加入上述的溶液，50℃水浴搅拌1小时后，加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC/SMNP-KGN水凝胶。
其中，Gel-MA的制备方法为：将1g的明胶溶解于10mL的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，50℃边搅拌边缓慢滴加0.6mL甲基丙基酸酐，1小时后，反应结束，将溶液装入透析袋(MW＝3500KDa)40℃水浴透析24小时，冻干，即得甲基丙烯酸酯化明胶。
HA-MA的制备方法为：将1g透明质酸溶解于50mL去离子水中搅拌过夜，然后边搅拌边滴加0.4mL甲基丙基酸酐，用5M的NaOH使溶液pH维持在8～9，然后反应24小时；将反应完的溶液倒入200mL的丙酮中，析出固体，在3000rpm转速下离心10分钟，将固体溶解于水中，装入透析袋(MW＝3500KDa)透析72小时，冻干，即得甲基丙烯酸酯化透明质酸。
负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的制备方法为：(1)称取45mg盐酸多巴胺和6.2mg FeCl3·6H2O溶解于130mL去离子水中，室温搅拌1小时；然后称取450mg三羟甲基氨基甲烷(tris)溶解于20mL去离子水后，迅速倒入上述溶液中，溶液的颜色立即由黄色变为红色，半小时后，溶液逐渐变为黑色，继续反应1.5小时，用10000rpm转速下离心10分钟，然后用去离子水冲洗完继续离心，重复三次，即得黑色素纳米粒子。(2)称取5mg KGN溶解于1mL丙酮中，通氮气除去烧瓶中的空气，另称取10mg EDC和7mg NHS溶解于4mL水中，然后加入KGN溶液中，搅拌10分钟；将黑色素纳米粒子溶于10mL水中，然后加入上述溶液中，搅拌8小时，10000rpm转速下离心得到沉淀，用去离子水冲洗三次，即得负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子。
实施例2
一种可注射软骨修复水凝胶，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)5份、甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA-MA)1份、纳米纤维素(CNC)1份、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)0.01份。
本实施例可注射软骨修复水凝胶的制备方法为：称取100μg SMNP-KGN溶于1mLPBS中，超声使其完全分散，然后称取0.05g Gel-MA、0.01g HA-MA和0.01g CNC，加入上述的溶液，50℃水浴搅拌1小时后，加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC/SMNP-KGN水凝胶。
Gel-MA、HA-MA、SMNP-KGN的制备方法同实施例1。
实施例3
一种可注射软骨修复水凝胶，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)15份、甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA-MA)10份、纳米纤维素(CNC)2份、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)0.05份。
本实施例可注射软骨修复水凝胶的制备方法为：称取500μg SMNP-KGN溶于1mLPBS中，超声使其完全分散，然后称取0.15g Gel-MA、0.1g HA-MA和0.02g CNC，加入上述的溶液，50℃水浴搅拌1小时后，加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC/SMNP-KGN水凝胶。
Gel-MA、HA-MA、SMNP-KGN的制备方法同实施例1。
对比例1
一种Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶，其制备方法为：称取0.05g Gel-MA、0.05g HA-MA和0.01g CNC，加入1mL的PBS缓冲溶液，50℃水浴搅拌1小时，然后加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶。
Gel-MA、HA-MA的制备方法同实施例1。
对比例2
一种Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶，其制备方法为：称取0.1g Gel-MA、0.05g HA-MA和0.01g CNC，加入1mL的PBS，50℃水浴搅拌1小时，然后加入0.05mL2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶。
Gel-MA、HA-MA的制备方法同实施例1。
对比例3
一种Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶，其制备方法为：称取0.15g Gel-MA、0.05g HA-MA和0.01g CNC，加入1mL的PBS，50℃水浴搅拌1小时，然后加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶。
Gel-MA、HA-MA的制备方法同实施例1。
对比例4
一种Gel-MA/HA-MA/CNC/SMNP水凝胶，其制备方法为：称取250μg SMNP溶于1mLPBS中，超声使其完全分散，然后称取0.1g Gel-MA、0.05g HA-MA和0.01g CNC，加入上述的溶液，50℃水浴搅拌1小时后，加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到Gel-MA/HA-MA/CNC/SMNP水凝胶。
Gel-MA、HA-MA、SMNP的制备方法同实施例1。
对比例5
一种Gel-MA/HA-MA/CNC/SMNP水凝胶，其制备方法为：称取500μg SMNP溶于1mLPBS中，超声使其完全分散，然后称取0.1g Gel-MA、0.05g HA-MA和0.01g CNC，加入上述的溶液，50℃水浴搅拌1小时后，加入0.05mL 2％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)，用波长为420nm的蓝光手电筒引发交联，得到水凝胶。
Gel-MA、HA-MA、SMNP的制备方法同实施例1。
效果例
(1)水凝胶形貌
将对比例1～3制备的水凝胶放入-20℃冷冻12小时，冻干后切取合适大小放置铜台，喷金，观察。对比例2制备的水凝胶的成胶过程如图1所示，对比例1～3制备的水凝胶的扫描电子显微镜图如图2所示，其中，A为对比例1的制备的水凝胶的扫描电子显微镜图，B为对比例2的制备的水凝胶的扫描电子显微镜图，C为对比例3的制备的水凝胶的扫描电子显微镜图。
由图2可知，Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶中Gel-MA的质量体积比越高，孔隙越小率越高。这是因为Gel-MA/HA-MA/CNC水凝胶中Gel-MA的比例越高，交联网络结构越密集，从而使得水凝胶的孔隙越小。
将黑色素纳米粒子(SMNP)和负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)进行透射电子显微镜观察，透射电子显微镜图如图3所示，其中，A为黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图，B为负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的透射电子显微镜图。由图3可知，黑色素纳米粒子为球状，直径大概在150-200nm之间。
(2)红外光谱表征
用溴化钾压片法制备待测样品(明胶、甲基丙烯酸酯化明胶、透明质酸、甲基丙烯酸酯化透明质酸、甲基丙基酸酐)，使用傅里叶红外光谱仪测定红外光谱，明胶(Gel)、甲基丙烯酸酯化明胶(Gel-MA)、透明质酸(HA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸(HA-MA)、甲基丙基酸酐(MA)的红外光谱图如图4所示。
由图4可知，HA的主要带数为3600cm-1，对应于O-H拉伸，HA-MA没有出现这个峰说明甲基丙基酸酐接枝到透明质酸。Gel-MA在2800cm-1出现了峰值，说明甲基丙基酸酐接枝到明胶。
(3)光热升温实验
将对比例4～5制备的水凝胶分别用1W和2W的功率NIR照射10分钟，每30秒取一个点的温度，实验结果如图5所示。由图5可知，在2W的功率条件下500μg/mL的材料可以在10分钟内升温25℃。
(4)光热成像试验
将实施例1制备的水凝胶用2W的功率NIR照射10分钟，每2分钟取一个点的温度，实验结果如图6所示。由图6可知，在2W的功率条件下500μg/mL的材料具有热成像的作用，可以在10分钟内升温25℃。
(5)MRI成像试验
将对比例1和实施例1制备的水凝胶进行MRI的T1扫描，MRI成像图如图7所示，其中，左边为实施例1制备的水凝胶的MRI成像图，右边为对比例1制备的水凝胶的MRI成像图。由图7可知，负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子(SMNP-KGN)具有MRI成像的功能。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (2)

1.一种可注射软骨修复水凝胶，其特征在于，所述水凝胶包含如下重量份的组分：甲基丙烯酸酯化明胶10份、甲基丙烯酸酯化透明质酸5份、纳米纤维素1份、负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子0.05份；
所述甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：将明胶溶于PBS缓冲溶液中，边搅拌边缓慢滴加甲基丙基酸酐，搅拌反应，反应结束后将反应液透析、冻干，即得甲基丙烯酸酯化明胶；所述明胶与甲基丙基酸酐的质量比为(0.8～1.2)：(0.5～0.8)；
所述甲基丙烯酸酯化透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水中搅拌过夜，然后边搅拌边滴加甲基丙基酸酐，调节pH值为8～9，搅拌反应；反应结束后向反应液中加入丙酮，析出固体，离心，将固体溶于水中，透析、冻干，即得甲基丙烯酸酯化透明质酸；所述透明质酸与甲基丙基酸酐的质量比为(0.8～1.2)：(0.3～0.6)；
所述负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的制备方法为：
(1)黑色素纳米粒子的制备：将盐酸多巴胺和FeCl3·6H2O溶于去离子水中，室温搅拌，然后加入三羟甲基氨基甲烷的水溶液，搅拌反应，反应结束后离心，即得黑色素纳米粒子；
(2)负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子的制备：将2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸溶于丙酮中，氮气条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液，搅拌，然后加入黑色素纳米粒子的水溶液，搅拌反应，反应结束后离心，即得负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子；所述2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸与黑色素纳米粒子的质量比为(1～6)：(10～30)；
所述可注射软骨修复水凝胶的制备方法，包括以下步骤：将负载2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的黑色素纳米粒子溶于PBS缓冲溶液中，超声分散，然后加入甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化透明质酸、纳米纤维素，水浴搅拌，然后加入光引发剂，用蓝光手电筒光照引发交联反应，即得可注射软骨修复水凝胶。
2.如权利要求1所述的可注射软骨修复水凝胶，其特征在于，所述PBS缓冲溶液的用量为甲基丙烯酸酯化明胶重量的10倍，所述水浴搅拌温度为50℃，水浴搅拌时间为1～4h，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂，所述蓝光的波长为365～760nm。
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