CN113440651A - 水凝胶组合物、水凝胶、仿生软骨及其制备方法和应用 - Google Patents

水凝胶组合物、水凝胶、仿生软骨及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水凝胶组合物、水凝胶、仿生软骨及其制备方法和应用。该水凝胶组合物，包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶1～20份，甲基丙烯酰化透明质酸0.1～3份，和甲基丙烯酰化硫酸软骨素0.1～5份。该水凝胶组合物可通过灌注或3D打印等方法制得仿生软骨，制备方法简单可行。所制得的仿生软骨固化强度高，生物兼容性好，可降解，可被再生软骨取代，可抑制骨化成骨，并可诱导软骨形成。

Description

水凝胶组合物、水凝胶、仿生软骨及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种水凝胶组合物、水凝胶、仿生软骨及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨病变作为一个基本的病理过程，几乎参与了所有临床常见的关节疾病病理变化早期阶段。由于软骨组织内缺乏血管和淋巴分布，软骨细胞含量少，缺少细胞分化所必须的祖母细胞且包埋于稠厚的细胞外基质中，迁徙难度大，无法有效移动到损伤部位参与修复，因此其自我修复能力非常差，即使是微小的软骨缺损也难以自然修复。
组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。支架材料是组织工程技术的三大要素之一。目前已有很多研究用不同的生物材料制备仿生软骨。然而，现有的高分子材料仿生软骨在使用过程生物兼容性差，吸收时间难控制；而纯天然生物材料仿生软骨强度太低，且制备困难；现有软骨修复配方在使用过程中易骨化或纤维化，目前尚无软骨修复效果良好的临床产品。
发明内容
本发明为了解决现有技术中高分子材料仿生软骨生物兼容性差，吸收时间难控制；而纯天然生物材料仿生软骨强度太低，且制备困难；现有软骨修复配方在使用过程中易骨化或纤维化的缺陷，从而提供了一种水凝胶组合物、水凝胶、仿生软骨及其制备方法和应用。由本发明的水凝胶组合物制备的仿生软骨固化强度高，生物兼容性好，可降解，可被再生软骨取代，可抑制骨化成骨，并可诱导软骨形成；且制备方法简单可行。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种水凝胶组合物，其包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)1～20份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)0.1～3份，和
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)0.1～5份。
本发明中，所述甲基丙烯酰化明胶的用量较佳地为5～15份，例如8份、10份或12份。
所述甲基丙烯酰化明胶可为本领域常规，可商购，也可采用本领域常规的方法对明胶(Gel)进行甲基丙烯酰化得到。
所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化程度较佳地为40％～80％。其中，所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化程度利用核磁共振氢谱(1H NMR)来计算，具体为：选取苯丙氨酸标准峰(7.1～7.4ppm)的积分面积作为1，计算明胶改性前后赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积下降的百分比，即：
GelMA的甲基丙烯酰化程度＝(Gel的赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积-GelMA的赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积)/Gel的赖氨酸信号在2.8～2.95ppm处的峰面积*100％。
本发明中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的用量较佳地为0.5～2份，例如0.5份、1份、1.5份。
所述甲基丙烯酰化透明质酸可为本领域常规，可商购，也可采用本领域常规的方法对透明质酸(HA)进行甲基丙烯酰化得到。所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量较佳地为890～950kDa。
所述甲基丙烯酰化透明质酸的甲基丙烯酰化程度较佳地为30％～50％。其中，所述甲基丙烯酰化透明质酸的甲基丙烯酰化程度利用核磁共振氢谱(1H NMR)来计算，具体为：
HAMA的甲基丙烯酰化程度＝甲基丙烯酰胺-乙烯基在5.6ppm处的峰面积/N-乙酰基葡萄糖在1.9ppm处的峰面积*100％。
本发明中，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的用量较佳地为0.5～3份，例如1份、2份或2.5份。
所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素可为本领域常规，可商购，也可采用本领域常规的方法对硫酸软骨素(CS)进行甲基丙烯酰化得到。所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的分子量较佳地为30～50kDa。
所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的甲基丙烯酰化程度较佳地为30％～50％。其中，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的甲基丙烯酰化程度利用核磁共振氢谱(1H NMR)来计算，具体为：
CSMA的甲基丙烯酰化程度＝甲基丙烯酰胺-乙烯基在5.6ppm处的峰面积/N-乙酰基葡萄糖在1.9ppm处的峰面积*100％。
本发明中，所述甲基丙烯酰化明胶、所述甲基丙烯酰化透明质酸和所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的质量比较佳地为(2-15)：1：(1-3)，例如10:1:3，5:2:2，15:1:1或8:1:3。
本发明中，所述水凝胶组合物还可包括光引发剂0.01～1份。所述光引发剂的用量较佳地为0.1～0.5份，例如0.25份。
所述光引发剂可为本领域常规的光引发剂，较佳地为蓝光引发剂、紫外光引发剂或绿光引发剂；所述蓝光引发剂较佳地为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)、核黄素、黄素单核苷酸或曙红Y；所述紫外光引发剂较佳地为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(I2959)；所述绿光引发剂较佳地为三联吡啶氯化钌/过硫酸钠(Ru/SPS(1/10))。
本发明中，所述水凝胶组合物还可包括增稠剂，所述增稠剂的用量较佳地为0.1～25份。所述增稠剂可为本领域常规，较佳地为聚环氧乙烷(PEO)、聚乙二醇(PEG)、海藻酸钠、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、结冷胶和黄原胶中的一种或多种。
其中，当所述增稠剂包括海藻酸钠时，所述海藻酸钠的用量较佳地为1～2份。当所述增稠剂包括透明质酸时，所述透明质酸的用量较佳地为0.5～2份。当所述增稠剂包括聚乙烯吡咯烷酮时，所述聚乙烯吡咯烷酮的用量较佳地为2～10份。当所述增稠剂包括阿拉伯树胶时，所述阿拉伯树胶的用量较佳地为0.1～25份。当所述增稠剂包括结冷胶时，所述结冷胶的用量较佳地为0.1～2份。当所述增稠剂包括黄原胶时，所述黄原胶的用量较佳地为0.1～1份。
本发明中，所述水凝胶组合物还可包括合成类光敏材料。所述合成类光敏材料的用量较佳地为5～30份。所述合成类光敏材料可为本领域常规，较佳地包括聚乙二醇丙烯酸酯(PEGDA)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺中的一种或多种。所述合成类光敏材料较佳地为聚乙二醇丙烯酸酯。
本发明中，所述水凝胶组合物还可包括凝胶介质。所述凝胶介质可为本领域常规，较佳地为生理盐水、细胞培养基和磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中的一种或多种。其中，所述生理盐水即为0.9％NaCl水溶液。所述细胞培养基可为本领域常规的细胞培养基，例如DMEM、DMEM/F12、RPMI 1640等常用培养基。所述磷酸盐缓冲溶液可为本领域常规，所述磷酸盐缓冲溶液的pH较佳地为7.4。
本发明中，所述凝胶介质的用量可为本领域常规，较佳地使得所述水凝胶组合物中：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5％-20％，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)0.1％～3％，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)0.1％～5％，
光引发剂0.01％～1％；
其中所述百分比为每100mL凝胶介质含有的组分质量(g)。
本发明中，较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5～15份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)0.5～2份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)0.5～3份，
和光引发剂0.1～0.5份。
在本发明一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)5份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)2份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)2份，
和光引发剂0.25份。
在本发明一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)10份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，
和光引发剂0.25份。
在本发明一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)15份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)1份，
和光引发剂0.25份。
在本发明一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)8份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，
和光引发剂0.25份。
在本发明一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)8份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，
海藻酸钠2份，
和光引发剂0.25份。
在本发明一较佳的实施方案中，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶(GelMA)8份，
甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)1份，
甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA)3份，
PEGDA 10份，
和光引发剂1份。
本发明中，所述水凝胶组合物是指形成水凝胶的原料组合物，其中各组分可以以混合物的形式存在，也可单独分装。当所述水凝胶组合物包括凝胶介质时，所述凝胶介质一般不与其他组分混合。当所述水凝胶组合物不包括凝胶介质且各组分以混合物形式存在时，其可为粉状、片状或絮状。
本发明还提供一种水凝胶的制备方法，其包括：将所述水凝胶组合物的各组分混合。
本发明中，较佳地，所述水凝胶的制备方法包括以下步骤：先将所述甲基丙烯酰化明胶、所述甲基丙烯酰化透明质酸和所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素与凝胶介质混合，再加入所述光引发剂。这样做的目的是，先将所述甲基丙烯酰化明胶、所述甲基丙烯酰化透明质酸和所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素溶解于所述凝胶介质中，以便于水凝胶组合物的稳定保存，在使用时临时加入所述光引发剂，避免保存过程中光引发剂的存在导致水凝胶组合物一定程度的交联。
本发明中，所述水凝胶的制备方法还可包括光交联的步骤。
本发明中，所述光交联可采用本领域常规的方法在光照射下进行；较佳地，所述光交联在波长365～405nm、强度5～50mW/cm2的光照射下进行；更佳地，所述光交联在波长405nm、强度10mW/cm2的光照射下进行，该条件更适合带细胞打印，可以减少对细胞的损伤或紫外照射可能引起的突变。
本发明还提供一种水凝胶，其由所述水凝胶的制备方法制备得到。
本发明还提供一种仿生软骨的制备方法，其采用所述水凝胶组合物为原料制备。
本发明一较佳的仿生软骨的制备方法为灌注法，其包括以下步骤：将所述水凝胶组合物的各组分混合，然后将混合物灌注于软骨模具中进行光交联，得到固化水凝胶；将所述固化水凝胶冷冻干燥即得。
其中，所述软骨模具可采用本领域常规的方法根据所需软骨的形状和大小设计而成。
本发明另一较佳的仿生软骨的制备方法为直接3D打印法，其包括以下步骤：将所述水凝胶组合物的各组分混合，对混合物进行3D打印同时进行光交联，得固化水凝胶；将所述固化水凝胶冷冻干燥即得。
本发明另一较佳的仿生软骨的制备方法为间接3D打印法，又称为3D工程法，其包括以下步骤：
S1、将牺牲材料进行3D打印，得到阴模；其中，所述牺牲材料为可溶于有机溶剂的硬质高分子材料；
S2、将所述水凝胶组合物的各组分混合，将混合物灌注于阴模中进行光交联，得到固化水凝胶-阴模复合体；
S3、用有机溶剂溶解所述阴模以脱除阴模，将所得固化水凝胶冷冻干燥即得。
本发明中，所述硬质高分子材料的定义为：以形成尺寸为10*10*10mm的立方体支架为目标对高分子材料进行3D打印，实际形成的支架的尺寸误差在10％以内，该高分子材料即可称为硬质高分子材料。此处所述立方体支架为判断高分子材料是否为硬质高分子材料的标准，并不对材料可形成的形状产生限制。采用硬质高分子材料进行3D打印，形态维持良好，可实现高精度打印。目前行业内通常使用的常规牺牲材料，例如普朗尼克、卡波姆、明胶颗粒、蔗糖等，在3D打印过程中无法维持形态，不能实现精细打印。
本发明中，所述牺牲材料较佳地为生物相容的。所述“生物相容的”标准为：采用本领域常规的方法进行生物相容性测试，细胞存活率在75％以上。
本发明中，所述牺牲材料较佳地为透明的。
本发明中，所述牺牲材料较佳地为聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己烷二甲醇酯(PETG)或合成类光敏树脂。所述合成类光敏树脂较佳地为聚丙烯酸酯类光敏树脂。
本发明中，步骤S1中，较佳地，先将颜料混于所述牺牲材料中，然后将带颜色的牺牲材料进行3D打印，得到带颜色的阴模。这样做的作用为，在步骤S3脱除阴模时，颜色消失可以作为阴模脱除成功的监控指标。
本发明中，步骤S1中，所述3D打印的方式可为本领域常规的可以实现精确细微结构的打印方式，较佳地为挤出方式(即熔融堆积方式)或光固化方式。所述光固化方式可为立体光固化成型技术(SLA)、数字光投影技术(DLP)或液晶显示技术(LCD)。
本发明中，步骤S1中，所述阴模的形状、大小和结构可根据所需的仿生组织支架按照本领域常规的方法设计。
本发明中，所述有机溶剂，可根据形成阴模的牺牲材料的特性进行选择，可溶解所述阴模即可。所述有机溶剂较佳地为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃或1,4-二氧六环。
在上述仿生软骨的制备方法中，所述冷冻干燥的时间较佳地为8～24h；所述冷冻干燥前较佳地进行预冷步骤；所述预冷的温度较佳地为-20℃，所述预冷的时间较佳地为1～3h。
在上述仿生软骨的制备方法中，所述光交联如前所述。
本发明还提供一种仿生软骨，其由所述仿生软骨的制备方法制得。
本发明还提供一种所述水凝胶组合物、所述水凝胶或所述仿生软骨在骨软骨组织工程中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供的水凝胶组合物可通过灌注或3D打印等方法制得仿生软骨，制备方法简单可行。所制得的仿生软骨具有以下优点：(1)固化强度高；(2)可降解，被再生软骨取代；(3)生物兼容性好；(4)抑制骨化成骨；(5)诱导软骨形成。
附图说明
图1为本发明效果实施例1的水凝胶在光照下模量随时间的变化。
图2为本发明效果实施例2的固化水凝胶支架的应力-应变曲线。
图3为细胞在本发明效果实施例3的固化水凝胶中培养7天后的存活率(活细胞绿染，死细胞红染)。
图4为本发明效果实施例4中大体观察照片。
图5为本发明效果实施例5中组织切片图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中，甲基丙烯酰化明胶(GelMA：SR-3DP-0201)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA：SR-3DP-0301)、甲基丙烯酰化硫酸软骨素(CSMA：SR-3DP-0401)和LAP均购自华夏司印(上海)生物技术有限公司。其中，GelMA的甲基丙烯酰化程度65％；HAMA的分子量为900kDa，甲基丙烯酰化程度40％；CSMA的分子量为30kDa，甲基丙烯酰化程度40％。
实施例1
称取0.05g GelMA、0.02g HAMA、0.02gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL 0.9％NaCl溶液(pH＝7.4)中，将该混合物灌注于预制的模具中，在405nm波长、强度10mW/cm2的蓝光照射下实现光交联，即可获得5％GelMA/2％HAMA/2％CSMA固化水凝胶。然后，将制备的固化水凝胶放置于-20℃冰箱中预冷2h，再用冻干机冻干24h，即可制备5％GelMA/2％HAMA/2％CSMA的仿生软骨。
实施例2
称取0.1g GelMA、0.01g HAMA、0.03gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，将该混合物灌注于预制的模具中，在405nm波长、强度10mW/cm2的蓝光照射下实现光交联，即可获得10％GelMA/1％HAMA/3％CSMA固化水凝胶。然后，将制备的固化水凝胶放置于-20℃冰箱中预冷2h，再用冻干机冻干20h，即可制备10％GelMA/1％HAMA/3％CSMA的仿生软骨。
实施例3
称取0.15g GelMA、0.01g HAMA、0.01gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL PBS溶液(pH＝7.4)中，将该混合物置于蓝光辅助挤出式3D打印机中，在405nm波长、强度10mW/cm2的蓝光照射下3D打印，即可获得15％GelMA/1％HAMA/1％CSMA固化水凝胶。然后，将制备的固化水凝胶放置于-20℃冰箱中预冷2h，再用冻干机冻干12h，即可制备15％GelMA/1％HAMA/1％CSMA的仿生软骨。
实施例4
3D工程法制备仿生软骨：
(1)根据所需仿生软骨设计合适的阴模，采用PLA作为牺牲材料，3D打印得到阴模；
(2)称取0.08g GelMA、0.01g HAMA、0.03gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于培养基中，将该混合物灌注于阴模中，在405nm波长、强度10mW/cm2的蓝光照射下实现光交联，即可获得8％GelMA/1％HAMA/3％CSMA固化水凝胶-阴模复合体；
(3)将该固化水凝胶-阴模复合体浸泡在二氯甲烷中，二氯甲烷溶解阴模，即可获得8％GelMA/1％HAMA/3％CSMA固化水凝胶；
(4)将固化水凝胶放置于-20℃冰箱中预冷2h，再用冻干机冻干8h，即可制备8％GelMA/1％HAMA/5％CSMA的仿生软骨。
实施例5
称取0.08g GelMA、0.01g HAMA、0.03g CSMA、0.02g海藻酸钠(Alg)和2.5mg LAP，在37℃下溶于1ml培养基中，将该混合物置于蓝光辅助挤出式3D打印机中，在405nm波长、强度10mW/cm2的蓝光照射下3D打印，即可获得8％GelMA/1％HAMA/3％CSMA/2％Alg固化水凝胶。然后，将制备的固化水凝胶放置于-20℃冰箱中预冷2h，再用冻干机冻干20h，即可制备8％GelMA/1％HAMA/3％CSMA/2％Alg的仿生软骨。
实施例6
称取0.08g GelMA、0.01gHAMA、0.03g CSMA、0.1g PEGDA和0.01g LAP，在37℃下溶于1ml培养基中，将该混合物灌注于预制的模具中，在405nm波长、强度10mW/cm2的蓝光照射下实现光交联，即可获得8％GelMA/1％HAMA/3％CSMA/10％PEGDA固化水凝胶。然后，将制备的固化水凝胶放置于-20℃冰箱中预冷2h，再用冻干机冻干20h，即可制备8％GelMA/1％HAMA/3％CSMA/10％PEGDA的仿生软骨。
对比例1
称取0.05g GelMA、0.02g HAMA、0.12gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL 0.9％NaCl溶液(pH＝7.4)中，发现CSMA含量过高会影响配方中其它成分的溶解性，无法继续制备水凝胶。
对比例2
称取0.35g GelMA、0.02g HAMA、0.02gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL 0.9％NaCl溶液(pH＝7.4)中，发现GelMA难以完全溶解，无法继续制备水凝胶。
对比例3
称取0.05g GelMA、0.08g HAMA、0.02gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL 0.9％NaCl溶液(pH＝7.4)中，发现HAMA难以完全溶解，无法继续制备水凝胶。
效果实施例1：水凝胶的流变分析
称取0.05g GelMA、0.02g HAMA、0.02gCSMA和2.5mg LAP，在37℃下溶于1mL 0.9％NaCl溶液(pH＝7.4)中。在25℃时，使用一块平行板(P20TiL，20mm直径)在Haake Mars旋转流变仪上进行动态流变学实验。在蓝光(405nm，30mW/cm2)照射下，以10％应变(CD模式)、1Hz频率和0.5mm间隙进行60s的扫描测试。模量随时间的变化如图1所示，凝胶点为储能模量(G’)超过损耗模量(G”)时的时间，可知凝胶点为3s。在10s左右储能模量达到最大，说明固化非常迅速，储能模量数值持续保持至测试结束，表明形成的凝胶结构稳定。
效果实施例2：水凝胶的力学性能
配制5％GelMA+1％HAMA+1％CSMA+0.25％LAP溶液，放入直径10mm、高度8mm的圆柱体模具中，在405nm波长的蓝光照射下实现光交联，即得5％GelMA+1％HAMA+1％CSMA固化水凝胶支架，作为测试样品。用GT-TCS-2000型单柱仪对固化水凝胶支架的力学性能进行测试，压缩速度设定为1mm/min，至压碎停止，得到应力-应变曲线，如图2所示。固化水凝胶支架破碎前的最大压强即为极限应力，弹性模量根据应力-应变曲线的15％-20％的斜率计算获得。由图2可知，该固化水凝胶支架的极限应力为170.8kPa，弹性模量为123.7kPa。
效果实施例3：仿生软骨的细胞相容性测试
称取0.05g GelMA、0.02g HAMA和0.02gCSMA，与含有P2代兔软骨细胞的培养基混合，加入2.5mg LAP，在蓝光405nm照射下，5秒固化成胶，培养7天后，用Calcein/AM活死细胞染色试剂盒检测细胞存活情况，结果见图3，细胞在水凝胶中的存活率>90％。
效果实施例4：骨软骨缺损修复试验
1、骨软骨支架的制备：
(1)按照实施例1的方法制备5％GelMA/2％HAMA/2％CSMA的仿生软骨。
(2)称取10g聚乳酸(PLA)溶于20mL二氯甲烷后至完全溶解，加入1g羟基磷灰石(HAP)，搅拌至均匀溶液，然后置于通风橱待二氯甲烷挥发后，放入真空干燥箱烘干24h，即可制成为HAP/PLA高分子材料。将HAP/PLA高分子材料采用熔融沉积式3D打印机打印成型(打印头温度：210℃；平台温度：50℃；打印速度：60mm/s；填充率：50％)，得到HAP/PLA骨层。
(3)用医用胶水(金象)将仿生软骨和HAP/PLA骨层连接，即得骨软骨支架。
2、骨软骨缺损修复试验
取新西兰白兔15只，雌性，体重3-3.5kg，5月龄，骨骼成熟，在兔股骨滑车和内髁处钻孔，制造骨软骨缺损模型。在内髁缺损处植入上述骨软骨支架，作为实验组；软骨层周边填充GelMA基软骨水凝胶，滑车处不处理，作为空白对照。12周后安乐死，进行大体观察(见图4)和组织学检测(见图5)。
如图4所示，植入了骨软骨支架的内髁处术后3个月，可以看到光滑的新生软骨，并与周围正常软骨连接良好，融为一体。
如图5所示，空白对照的滑车处的软骨缺损严重，依然是一个空坑。图5的组织学分析还表明，内髁缺损处有软骨细胞陷窝生成，而滑车空白对照处无软骨细胞陷窝；番红O染色软骨基质呈红色，甲苯胺蓝染色呈紫红色，说明内髁缺损处分泌了新的软骨基质，且软骨下观察到松质骨的生成；而空白对照滑车处无软骨基质分泌，也没有松质骨的生成。

Claims (10)

1.一种水凝胶组合物，其包括按质量份数计的以下组分：
甲基丙烯酰化明胶1～20份，
甲基丙烯酰化透明质酸0.1～3份，和
甲基丙烯酰化硫酸软骨素0.1～5份。
2.根据权利要求1所述的水凝胶组合物，其特征在于，所述甲基丙烯酰化明胶的用量为5～15份，例如8份、10份或12份；
和/或，所述甲基丙烯酰化明胶的甲基丙烯酰化程度为40％～80％；
和/或，所述甲基丙烯酰化透明质酸的用量为0.5～2份，例如0.5份、1份、1.5份；
和/或，所述甲基丙烯酰化透明质酸的分子量为890～950kDa；
和/或，所述甲基丙烯酰化透明质酸的甲基丙烯酰化程度为30％～50％；
和/或，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的用量为0.5～3份，例如1份、2份或2.5份；
和/或，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的分子量为30～50kDa；
和/或，所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的甲基丙烯酰化程度为30％～50％；
较佳地，所述甲基丙烯酰化明胶、所述甲基丙烯酰化透明质酸和所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素的质量比为(2-15)：1：(1-3)，例如10:1:3，5:2:2，15:1:1或8:1:3；
和/或，所述水凝胶组合物还包括增稠剂，所述增稠剂的用量较佳地为0.1～25份；所述增稠剂较佳地为聚环氧乙烷、聚乙二醇、海藻酸钠、透明质酸、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯树胶、结冷胶和黄原胶中的一种或多种；
和/或，所述水凝胶组合物还包括合成类光敏材料，所述合成类光敏材料的用量较佳地为5～30份；所述合成类光敏材料较佳地包括聚乙二醇丙烯酸酯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的水凝胶组合物，其特征在于，所述水凝胶组合物还包括光引发剂0.01～1份；
所述光引发剂的用量较佳地为0.1～0.5份，例如0.25份；
所述光引发剂较佳地为蓝光引发剂、紫外光引发剂或绿光引发剂；所述蓝光引发剂较佳地为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂、核黄素、黄素单核苷酸或曙红Y；所述紫外光引发剂较佳地为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮；所述绿光引发剂较佳地为三联吡啶氯化钌/过硫酸钠。
4.根据权利要求3所述的水凝胶组合物，其特征在于，所述水凝胶组合物还包括凝胶介质；
所述凝胶介质较佳地为生理盐水、细胞培养基和磷酸盐缓冲溶液中的一种或多种；
较佳地，所述凝胶介质的用量使得所述水凝胶组合物中：甲基丙烯酰化明胶5％-20％，甲基丙烯酰化透明质酸0.1％～3％，甲基丙烯酰化硫酸软骨素0.1％～5％，光引发剂0.01％～1％；其中所述百分比为每100mL凝胶介质含有的组分质量(g)。
5.根据权利要求3所述的水凝胶组合物，其特征在于，
所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶5～15份，甲基丙烯酰化透明质酸0.5～2份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素0.5～3份，和光引发剂0.1～0.5份；
较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶5份，甲基丙烯酰化透明质酸2份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素2份，和光引发剂0.25份；
较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶10份，甲基丙烯酰化透明质酸1份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素3份，和光引发剂0.25份；
较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶15份，甲基丙烯酰化透明质酸1份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素1份，和光引发剂0.25份；
较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶8份，甲基丙烯酰化透明质酸1份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素3份，和光引发剂0.25份；
较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶8份，甲基丙烯酰化透明质酸1份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素3份，海藻酸钠2份，和光引发剂0.25份；
较佳地，所述水凝胶组合物包括按质量份数计的以下组分：甲基丙烯酰化明胶8份，甲基丙烯酰化透明质酸1份，甲基丙烯酰化硫酸软骨素3份，聚乙二醇丙烯酸酯10份，和光引发剂1份。
6.一种水凝胶的制备方法，其包括：将权利要求4所述水凝胶组合物的各组分混合；
较佳地，所述水凝胶的制备方法包括以下步骤：先将所述甲基丙烯酰化明胶、所述甲基丙烯酰化透明质酸和所述甲基丙烯酰化硫酸软骨素与所述凝胶介质混合，再加入所述光引发剂；
较佳地，所述水凝胶的制备方法还包括光交联的步骤；较佳地，所述光交联在波长365～405nm、强度5～50mW/cm2的光照射下进行；更佳地，所述光交联在波长405nm、强度10mW/cm2的光照射下进行。
7.一种水凝胶，其由权利要求6所述的水凝胶的制备方法制备得到。
8.一种仿生软骨的制备方法，其采用权利要求4所述水凝胶组合物为原料制备；
所述仿生软骨的制备方法较佳地包括以下步骤：将权利要求4所述水凝胶组合物的各组分混合，然后将混合物灌注于软骨模具中进行光交联，得到固化水凝胶；将所述固化水凝胶冷冻干燥即得；
或者，所述仿生软骨的制备方法较佳地包括以下步骤：将权利要求4所述水凝胶组合物的各组分混合，对混合物进行3D打印同时进行光交联，得固化水凝胶；将所述固化水凝胶冷冻干燥即得；
或者，所述仿生软骨的制备方法较佳地包括以下步骤：
S1、将牺牲材料进行3D打印，得到阴模；其中，所述牺牲材料为可溶于有机溶剂的硬质高分子材料；
S2、将权利要求4所述水凝胶组合物的各组分混合，将混合物灌注于所述阴模中进行光交联，得到固化水凝胶-阴模复合体；
S3、用有机溶剂溶解所述阴模以脱除阴模，将所得固化水凝胶冷冻干燥即得；
其中，所述冷冻干燥的时间较佳地为8～24h；所述冷冻干燥前较佳地进行预冷步骤；所述预冷的温度较佳地为-20℃，所述预冷的时间较佳地为1～3h；
所述光交联如权利要求6所述。
9.一种仿生软骨，其由权利要求8所述仿生软骨的制备方法制得。
10.一种权利要求1～5中任一项所述水凝胶组合物、权利要求7所述水凝胶或权利要求9所述仿生软骨在骨软骨组织工程中的应用。
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