CN115634321A

CN115634321A - 一种复合水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115634321A
Application number: CN202211190666.9A
Authority: CN
Inventors: 王薇; 李丹杰; 李菲; 夏培斌; 王超威; 杨亚杰; 余刘洋; 韩亚丽; 任永成
Original assignee: Henan Camel Medical Device Research Institute Co ltd
Current assignee: Henan Camel Medical Device Research Institute Co ltd
Priority date: 2022-09-28
Filing date: 2022-09-28
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-09-28
Also published as: CN115634321B

Abstract

本发明涉及生物医用材料，具体公开了一种复合水凝胶及其制备方法与应用，将明胶于磷酸盐缓冲液（PBS）加热搅拌至完全溶解，加入甲基丙烯酸酐（MA）反应合成得到甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液一，所述GelMA溶液一经透析、冷冻、溶解、脱泡后加入光引发剂混匀得到GelMA溶液二，所述GelMA溶液二与聚乙烯吡咯烷酮（PVP）‑明胶混合溶液等比例混合、搅拌、真空脱泡制得复合水凝胶；将上述复合水凝胶应用于3D打印可得到半月板支架，本发明可有效解决3D打印材料种类单一、打印制品机械性能差等问题。

Description

一种复合水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种复合水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着疾病治疗的需求与医学研究的深入，生物 3D 打印在组织工程、药物筛选、体外病理模型构建等领域受到了广泛的关注与研究，它是以计算机三维设计模型为基础，通过软件分层离散和数控成形方法，定位装配细胞或生物材料，制造人工植入支架、组织、器官和医疗辅具等生物医学产品的技术，被业界称为推动21世纪医疗个性化、精准化发展的重要技术支撑。

目前组织器官支架、模型等的个性化3D打印面临的技术瓶颈较多，主要为材料的精准成型难、机械性能差、生物活性低、仿生功能难以实现、生物相容性低和降解性能差等难题。水凝胶是一种亲水性聚合物，可以通过化学或物理交联形成的高分子网络结构，亲水极性强，与水分子结合后有一定的柔韧性，是一种理想的生物3D打印材料。另外，以水凝胶为载体的载药水凝胶，既可以保留水凝胶本身的特性，同时可以控制药物释放速度，提高药物的治疗效果，而且能避免全身用药的不良反应，在药物治疗方面备受关注，但具有载药功能且良好机械性能的复合水凝胶研究较少。

目前，市面上最常用的海藻酸盐系生物墨水成形性能和力学性能都比较好，但是生物兼容性较差，影响细胞向组织的分化；来自动物体内的胶原类生物墨水，有很好的生物相容性，打印出来的人体支架力学性能较差。

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的是要提供一种复合水凝胶的制备方法及应用，其制备的复合水凝胶能够满足3D打印的更高要求，不仅可以打印出具有优异的力学性能和良好的生物相容性的支架，例如心脏支架、半月板结构、血管等，且打印支架形式多样；同时，本发明制备的复合水凝胶能够包裹一些人体溶解度和生物利用率较低的药物，达到药物缓释的效果。

发明内容

基于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种复合水凝胶及其制备方法与应用，实现性能符合要求的仿生器官的制备。

为克服上述技术缺陷，本发明采用以下技术方案：

一种复合水凝胶，其特征在于：包括以下配比的原料：

PVP：明胶为1%-3%：2%-12%；

光引发剂：0.1%-0.3%；

GelMA；

所述复合水凝胶的制备方法：将明胶于磷酸盐缓冲液（PBS）加热搅拌至完全溶解，加入甲基丙烯酸酐（MA）反应合成得到甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液一，所述GelMA溶液一经透析、冷冻、干燥、溶解、脱泡后加入光引发剂混匀得到GelMA溶液二，所述GelMA溶液二与聚乙烯吡咯烷酮（PVP）-明胶混合溶液等比例混合、搅拌、真空脱泡制得复合水凝胶。

进一步的，所述GelMA由明胶与MA合成得到，其接枝率为50%-90%。

一种复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备PVP-明胶混合溶液：称取明胶，溶于PBS缓冲液中，得到的明胶溶液；称取PVP粉末加入所述明胶溶液中，50℃水浴搅拌均匀后进行真空脱泡，得到备用的PVP-明胶混合溶液；

（2）合成GelMA：称取明胶，溶于PBS缓冲液中，50℃条件下加热搅拌至完全溶解，向其加入的MA，反应3h后，加入5倍体积的PBS缓冲液，终止反应，得到GelMA溶液A；

（3）透析处理：将（2）中的GelMA溶液A转移至透析袋中，将透析袋置于纯化水中，40℃透析4天，每天更换3次纯化水，以除去其中未反应的MA及其他杂质，得到GelMA溶液B；

（4）冷冻干燥：对步骤（3）中透析结束的GelMA溶液B进行抽滤处理，将GelMA溶液B置于-80℃冷冻3h，然后放入冷冻干燥机干燥3天，收集得到GelMA；

（5）含光引发剂GelMA溶液制备，称取步骤（4）中制备的甲基丙烯酰化明胶（GelMA），溶于PBS缓冲液中，50℃水浴至完全溶解，真空脱泡后即可得到GelMA溶液；向所述GelMA溶液中加入含光引发剂得到的GelMA溶液；

（6）制备复合水凝胶：取步骤（1）中制备的PVP-明胶混合溶液与步骤（5）中的含光引发剂GelMA溶液等比例混合，置于50℃水浴搅拌，真空脱泡得到复合水凝胶。

进一步的，所述PVP是乙烯基吡咯烷酮均聚而成的一种水溶性白色树脂状固体，其分子式（C6H9NO）n,为K15、K17、K25、K30、K90中的任意一种或多种。

进一步的，所述透析袋为截留分子量12-14KDa的透析袋。

进一步的，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）、2-羟基-4-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮（I2959）、4-苯基二苯甲酮、1-羟基-环已基-苯基甲酮中的任意一种或多种。

一种复合水凝胶在3D打印中的应用，将复合水凝胶用于制备3D打印的半月板支架，包括以下步骤：

（1）建立半月板支架模型：通过三维扫描、计算机辅助设计，建立目标模型，然后将目标模型进行切片处理，导出STL格式，传输至3D打印机；

（2）半月板支架打印：将上述权利要求1-2制备的复合水凝胶吸入至注射器中，用铝箔纸将注射器包裹完全后置于4℃冷冻装置静置30min。去除铝箔纸将注射器装装上针头后置入料仓，按照打印参数进行打印即得到半月板支架。

进一步的，步骤（2）中的打印参数如下表所述：

进一步的，所述复合水凝胶也可以用于制备具有药物缓释载庆大霉素的复合水凝胶。

本发明达到的有益效果有：

1、本发明采用PVP-明胶-GelMA配方制备的支架，其具有优异的力学性能；

2、本发明制备方法多采用合成、共混，不需要经过多次接枝改性，制备过程简便易于操作；

3、本发明适用范围广，所制备的复合水凝胶可以用来打印心脏支架、半月板结构、血管等。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，其中：

图1为实施例4打印的半月板支架；

图2为实施例5打印的正方体支架；

图3为实施例6打印的人工耳廓模型；

图4为实施例7庆大霉素释放曲线；

图5为对比例1中GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P的相转变温度测试结果；

图6为对比例1中GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P的粘弹性测试结果；

图7为对比例1中GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P的模拟打印测试结果；

图8为对比例1中GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P的压缩模量测试结果；

图9为对比例2与实施例4打印的半月板支架在受力条件下的结构稳定性照片；

图10为对比例3与实施例5打印的半月板支架在受力条件下的结构稳定性照片；

图11为对比例4与竞品的力学性能（应力应变曲线）对比图；

图12为本发明制备的复合水凝胶宏观图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例制备了一种PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比1%：2%）复合水凝胶，具体制备步骤：

（1）制备PVP-明胶混合溶液：称取1g明胶，溶于50mlPBS缓冲液中，得到的2%明胶溶液；称取0.5gPVP粉末加入所述明胶溶液中，50℃水浴搅拌均匀后进行真空脱泡，得到备用的PVP-明胶混合溶液；

（2）合成GelMA（接枝率为50%-90%）：称取10明胶，溶于100mlPBS缓冲液中，50℃条件下加热搅拌至完全溶解，向其加入MA，体积为1-8ml，反应3h后，加入5倍体积的PBS缓冲液，终止反应，得到GelMA溶液A；

（5）含光引发剂GelMA溶液制备，称取步骤（4）中制备的GelMA，溶于PBS缓冲液中，50℃水浴至完全溶解，真空脱泡后即可得到GelMA溶液；向所述GelMA溶液中加入苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）（0.1%-0.3%）得到含光引发剂的GelMA溶液；

（6）制备复合水凝胶：取步骤（1）中制备的PVP-明胶混合溶液与步骤（5）中的含光引发剂GelMA溶液等比例混合，置于50℃水浴搅拌，真空脱泡得到PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比1%：2%）复合水凝胶。

实施例2

本实施例制备了一种PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶，具体制备步骤为：

（1）制备PVP-明胶混合溶液：称取3.5g明胶，溶于50mlPBS缓冲液中，得到的7%明胶溶液；称取1gPVP粉末加入所述明胶溶液中，50℃水浴搅拌均匀后进行真空脱泡，得到备用的PVP-明胶混合溶液；

（2）合成GelMA（接枝率为50%-90%）：称取10明胶，溶于100mlPBS缓冲液中，50℃条件下加热搅拌至完全溶解，向其加入的MA，体积为1-8ml，反应3h后，加入5倍体积的PBS缓冲液，终止反应，得到GelMA溶液A；

（6）制备复合水凝胶：取步骤（1）中制备的PVP-明胶混合溶液与步骤（5）中的含光引发剂GelMA溶液等比例混合，置于50℃水浴搅拌，真空脱泡得到PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶。

实施例3

本实施例制备了一种PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比3%：12%）复合水凝胶，具体过程为：

（1）制备PVP-明胶混合溶液：称取6g明胶，溶于50mlPBS缓冲液中，得到的12%明胶溶液；称取1.5gPVP粉末加入所述明胶溶液中，50℃水浴搅拌均匀后进行真空脱泡，得到备用的PVP-明胶混合溶液；

（6）制备复合水凝胶：取步骤（1）中制备的PVP-明胶混合溶液与步骤（5）中的含光引发剂GelMA溶液等比例混合，置于50℃水浴搅拌，真空脱泡得到PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比3%：12%）复合水凝胶。

实施例4

本实施例制备PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶，打印半月板支架，具体过程为：

（7）建立半月板支架模型：通过三维扫描、计算机辅助设计，建立目标模型，然后将目标模型进行切片处理，导出STL格式，传输至3D打印机；

（8）半月板支架打印：将上述步骤（6）制备的PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶吸入至注射器中，用铝箔纸将注射器包裹完全后置于4℃冷冻装置静置30min。去除铝箔纸将注射器装上针头后置入料仓，按照打印参数进行打印，即得到半月板支架。

（9）半月板打印参数如下表所述：

实施例5

本实施例提供了一种PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶，打印正方体支架的方法，其与实施例4的制备方法的不同之处在于步骤（7）中，建立正方体支架模型，步骤（8）中，正方体支架打印，步骤（9）中，正方体支架打印参数如下表所述。

实施例6

本实施例提供了一种PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶，打印人工耳廓支架的方法，其与实施例4的制备方法的不同之处在于步骤（7）中，建立人工耳廓支架模型，步骤（8）中，人工耳廓支架打印，步骤（9）中，人工耳廓支架打印参数如下表所述。

实施例7

本实施例提供了一种载庆大霉素-PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶的制备方法，其与实施例2的制备方法的不同之处在于，步骤（1）中，首先，制备载庆大霉素-PVP粉末：称取10gPVP粉末，加热溶于100ml纯化水中，得到PVP溶液，向其中加入1g庆大霉素，混合均匀后冷冻干燥，得到备用的载庆大霉素-PVP粉末；其次，制备载庆大霉素-PVP-明胶混合溶液：称取3.5g明胶，溶于50mlPBS缓冲液中，得到的明胶溶液；称取1g载庆大霉素-PVP粉末加入所述明胶溶液中，50℃水浴搅拌均匀后进行真空脱泡，得到备用的载庆大霉素-PVP-明胶混合溶液；

制备载庆大霉素-PVP-明胶-GelMA（PVP-明胶配比2%：7%）复合水凝胶复合水凝胶：取步骤（1）中制备的载庆大霉素-PVP-明胶混合溶液与步骤（6）中的含光引发剂GelMA溶液等比例混合，置于50℃水浴搅拌，真空脱泡得到载庆大霉素复合水凝胶。

对比例1

本对比例制备了GelMA、GelMA和明胶复合水凝胶，与实施例1和实施例3的区别在于是否添加明胶和PVP，具体过程为：

（1）合成GelMA（接枝率为50%-90%）：称取10明胶，溶于100mlPBS缓冲液中，50℃条件下加热搅拌至完全溶解，向其加入的MA，体积1-8ml，反应3h后，加入5倍体积的PBS缓冲液，终止反应，得到GelMA溶液A；

（2）透析处理：将（1）中的GelMA溶液A转移至透析袋中，将透析袋置于纯化水中，40℃透析4天，每天更换3次纯化水，以除去其中未反应的MA及其他杂质，得到GelMA溶液B；

（3）冷冻干燥：对步骤（2）中透析结束的GelMA溶液B进行抽滤处理，将GelMA溶液B置于-80℃冷冻3h，然后放入冷冻干燥机干燥3天，收集得到GelMA；

（4）含光引发剂GelMA溶液制备，称取步骤（3）中制备的GelMA6.25g，溶于50mlPBS缓冲液中，50℃水浴至完全溶解，真空脱泡后即可得到12.5%GelMA溶液；向所述GelMA溶液中加入LAP得到含0.1%光引发剂的GelMA溶液；

（5）GelMA和明胶复合水凝胶的制备：称取1g明胶，溶于50mlPBS缓冲液中，得到的2%明胶溶液；取明胶混合溶液与步骤（4）中的含光引发剂GelMA溶液等比例混合，置于50℃水浴搅拌，真空脱泡得到明胶-GelMA（PVP-明胶配比1%：2%）复合水凝胶。

本对比例制备了GelMA、GelMA和明胶复合水凝胶，与实施例1和实施例3的区别在于是否添加明胶和PVP，从相转变温度、粘弹性、模拟打印和压缩模量四个方面对实施例和对比例中的配方进行分析对比（实验结果中，GelMA简称为GM；GelMA和明胶复合水凝胶简称为GM-Gel；不同含量PVP的复合水凝胶分别简称为GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P）。

（1）相转变温度测试方法：打开流变仪，分别校准仪器和夹具，设置好测试参数，温度：10-40℃，形变：1%，角速度：10rad/s，分别从4个西林瓶中中取0.9 mL置于流变仪测试平板上进行测试。

相转变温度结果分析：如图5所示。结果显示：GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P、GM-Gel-3%P四个配方的相转变温度依次为25.84℃、28.5℃、29.0℃、29.75℃。随着明胶和PVP的加入，复合水凝胶形成氢键的数量逐渐增加，更有利于与GM形成双网络结构，从而增强复合水凝胶的力学性能，而相转变温度是反应水凝胶是否具有打印性的关键性指标。由此可得出结论，添加Gel和PVP的水凝胶的相转变温度更利于打印。

（2）粘弹性测试方法：参考相转变温度测试方法（1）中的测试步骤，粘弹性测试参数调整如下，温度：22℃，剪切速率：0.1-1000 1/s。

粘弹性测试结果：如图6所示。结果显示：随着剪切速率的增加，GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P、GM-Gel-3%P四个配方的黏度呈现非线性下降趋势，均符合非牛顿流体的性质,满足挤出式打印要求，同时明胶和PVP的加入增强了水凝胶的粘度，更有利于打印支架。

（3）模拟打印测试步骤：参考相转变温度测试方法（1）中的测试步骤，模拟打印测试参数，step1:温度22℃，时间：100s，角速度：10rad/s，形变：1%；step2:温度22℃，角速度：10rad/s，形变：1-2000%；step3: 温度22℃，时间：300s，角速度：10rad/s，形变：1%。

模拟打印测试结果：如图7所示。结果显示：在模拟打印的过程中，阶段一：为水凝胶原始状态，储能模量远大于损耗模量；阶段二：随着剪切速率的增加，水凝胶的氢键受到不同程度的破坏，储能模量开始逐渐减小，损耗模量逐渐增加，表明水凝胶由固态变为流动态；阶段三：随着形变恢复到阶段一，氢键被破坏的水凝胶又恢复到原来的状态，即水凝胶具有自愈合功能，满足挤出式打印要求，加入明胶和PVP的复合水凝胶的自愈合性能更好，即打印成型效果更好。

（4）压缩模量测试样品制备：将脱泡完成的四种水凝胶分别装入直径为10mm的自制圆柱模具中，4℃冷藏凝固后放入UV固化箱中，405nm光固化10min。将光固化好的样品切成直径10mm、厚6mm的小圆柱形备用。

压缩模量测试步骤：打开流变仪，分别校准仪器和夹具，设置好测试参数，温度：25℃，恒定线性速率：50μm/s，测试时间：120s。分别将不同水凝胶样品置于流变仪测试平板上进行测试。

压缩模量测试结果：如图8所示，结果显示：GM、GM-Gel、GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P的压缩模量分别是72.5kPa、7.7kPa、6.2kPa、5.9kPa。压缩模量代表材料的抗压强度，即刚性，GM-Gel、GM-Gel-1%P和GM-Gel-3%P的刚性明显小于GM的刚性，刚性小，说明韧性大，由此可得出结论：明胶和PVP的添加更利于软组织模型的打印。

对比例2

本对比例与实施例4的区别在于未添加PVP和明胶，实验结果如图9所示。将对比例2和实施例4打印的半月板支架分别用手进行拉伸，在同样的受力条件下，实施例4打印的半月板支架具有更好地保持结构完整的能力，由此可得出结论：实施例4的半月板支架具有较强的力学强度。

对比例3

本对比例与实施例5的区别在于未添加PVP和明胶，实验结果如图10所示。将对比例3和实施例5打印的正方体支架分别用手进行按压，在同样的受力条件下，对比例3的正方体支架一压就破，实施例5的正方体支架能够保持结构的完整性，由此可得出结论：实施例5的正方体支架具有较强的力学性能。

对比例4

本对比例制备的水凝胶采用实施例2中的步骤（2）到步骤（5），与市面上的GelMA进行力学性能对比，实验结果如图11所示。市面上购买的水凝胶简称G1，本对比例制备的水凝胶简称LG1，参考实施例2中的步骤（6）分别制备G1-Gel-1%P（三个平行）和LG1-Gel-1%P（三个平行），从图11的应力应变曲线可以看出，在同一应力下，LG1-Gel-1%P具有更大的形变量；应力应变曲线的斜率，反映了水凝胶的压缩模量的大小，从应力应变曲线中可以看出，LG1-Gel-1%P的斜率更小，即压缩模量更小，说明其韧性更好。由此可以得出结论：自制水凝胶的形变量和韧性（抗压强度）明显优于竞品公司水凝胶配方的形变量和抗压强度，即自制水凝胶的力学性能优于竞品公司水凝胶的力学性能。

可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之。

Claims

1.一种复合水凝胶，其特征在于：包括以下配比的原料：

PVP：明胶为1%-3%：2%-12%；

光引发剂：0.1%-0.3%；

GelMA；

2.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述GelMA由明胶与MA合成得到，其接枝率为50%-90%。

3.根据权利要求1所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

制备PVP-明胶混合溶液：称取明胶，溶于PBS缓冲液中，得到的明胶溶液；称取PVP粉末加入所述明胶溶液中，50℃水浴搅拌均匀后进行真空脱泡，得到备用的PVP-明胶混合溶液；

合成GelMA：称取明胶，溶于PBS缓冲液中，50℃条件下加热搅拌至完全溶解，向其加入的MA，反应3h后，加入5倍体积的PBS缓冲液，终止反应，得到GelMA溶液A；

透析处理：将（2）中的GelMA溶液A转移至透析袋中，将透析袋置于纯化水中， 40℃透析4天，每天更换3次纯化水，以除去其中未反应的MA及其他杂质，得到GelMA溶液B；

4.根据权利要求3所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述PVP是乙烯基吡咯烷酮均聚而成的一种水溶性白色树脂状固体，其分子式（C6H9NO）n,为K15、K17、K25、K30、K90中的任意一种或多种。

5.根据权利要求3所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述透析袋为截留分子量12-14KDa的透析袋。

6.根据权利要求1所述的复合水凝胶，其特征在于，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）、2-羟基-4-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮（I2959）、4-苯基二苯甲酮、1-羟基-环已基-苯基甲酮中的任意一种或多种。

7.一种权利要求1所述的复合水凝胶在3D打印中的应用。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将复合水凝胶用于制备3D打印的半月板支架，包括以下步骤：

（2）半月板支架打印：将上述权利要求1-2制备的复合水凝胶吸入至注射器中，用铝箔纸将注射器包裹完全后置于4℃冷冻装置静置30min,去除铝箔纸将注射器装装上针头后置入料仓，按照打印参数进行打印即得到半月板支架。

9.根据权利要求6所述的半月板支架应用制备步骤，其特征在于，步骤（2）中的打印参数如下表所述：

。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述复合水凝胶也可以用于制备具有药物缓释载庆大霉素的复合水凝胶。