CN114621467A - 一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶及其制备方法，所述的方法包括如下步骤：A相制备：2‑8℃下向醋酸或盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，加入抗氧化剂，混合得到A相，2‑8℃保存；B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液、Tris‑HCl缓冲溶液、巴比妥钠‑盐酸缓冲液中的一种；将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行辐照灭菌，在2‑8℃保存，使用时将A相和B相混合，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。本发明方法制备的凝胶可无菌状态提供，经过灭菌后仍然可以保持成胶性能，接触体液环境后短时间内可迅速成胶，本发明的凝胶现用现配，更符合实际使用要求。

Description

一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，因其具有低免疫原性、可降解性以及可促进组织再生等特质，多年来一直被认为是理想的组织工程支架材料。

目前全球范围内的胶原蛋白类产品主要分为两类，一类始终保持固态，如经冷冻干燥制成的胶原蛋白海绵或经脱细胞工艺得到的脱细胞动物组织（主要为胶原蛋白），通过外科手术的方式固定在缺损部位，发挥诱导再生的作用；另一类产品具有流动性，如胶原水凝胶、胶原蛋白植入剂等，可以微创手术或注射的方式打入体内，这类材料降解时间短、整体力学性能差，在体液丰沛的缺损处使用效果不佳。市面上一直欠缺一种接触体液后可由流动状态转变为固态的产品以拓宽胶原蛋白在不规则组织缺损以及微创手术中的应用。

鉴于以上原因，特提出本发明。

发明内容

为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶及其制备方法，本发明方法制备的凝胶经过辐照灭菌后仍然可以保持成胶性能，接触体液环境后可由流动状态转变为固态。

本发明的第一目的，提供了一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：2-8℃下向醋酸或盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，加入抗氧化剂，混合得到A相，2-8℃保存；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行辐照灭菌，2-8℃保存，使用时将A相和B相混合，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

进一步的，步骤（1）中醋酸的浓度为0.05-0.5M，盐酸浓度为0.005-0.05M。

进一步的，步骤（1）中胶原蛋白在A相中的质量分数为1-10%。

进一步的，步骤（1）中抗氧化剂为芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇、抗坏血酸和甘油中的一种或几种。

进一步的，步骤（1）中的抗氧化剂为甘油与芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇和抗坏血酸中的一种几种混合。

进一步的，步骤（1）中抗氧化剂在A相中的浓度为2-300mM。

其中，各抗氧化剂的浓度分别优选为芦丁2-30mM、表儿茶素2-30mM、儿茶素2-30mM、甘露醇0.02-0.3M、抗坏血酸2-30mM、甘油0.02-0.3M。当抗氧化物为两种物质混合时，各物质的比例可以为任意比例。

进一步的，步骤（2）中所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比（0.5-3）:（0.005-0.05）:（0.005-0.05）:（0.02-0.3）混合，加水至磷酸盐总浓度为0.5-1.5M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。

进一步的，步骤（2）中Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比（3-5）:（3-5）混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.3-0.8M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。

进一步的，步骤（2）中巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比（5-8）:（4-7）混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.3-0.8M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。

本发明中缓冲溶液pH值与原料的配比有关，调节pH值前根据测定的pH值大小，通过酸和碱共同调节pH值达到所需的范围。

进一步的，步骤（3）中A相和B相的体积比为（2:1）-（9:1），辐照灭菌中辐照剂量为10-20kGy，辐照灭菌采用电子束灭菌，灭菌温度为-40-20℃。

本发明中的A相和B相混合，可以采用静态混合或者注射器混合方式。

本发明的第二目的，提供了一种所述方法制备的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）胶原蛋白本身具有可自组装成胶的特性，本发明的胶原蛋白在特定的缓冲溶液体系、温度及pH值环境下，可以使胶原蛋白溶液发生从液态向凝胶态的转变；

（2）胶原蛋白凝胶化工程中主要是胶原的氨基与羧基在适宜条件（A相和B相混合后）下发生键合，使胶原蛋白分子形成紧密项链的网状结构，从而锁住水分，由溶液转变为凝胶，本发明中采用辐照灭菌的方式，辐射能量会使水电离产生·OH自由基，进而与蛋白质发生反应，这会导致胶原分子间的氨基、羧基产生键合，产生不可逆交联，最终产品无法在使用时再发生凝胶转变，为了避免灭菌后交联的问题，第一本发明采用电子束灭菌方式与Co-60灭菌方式相比，其经受辐射的时间缩短了近百倍；第二控制灭菌时胶原蛋白处于低温状态（-40-20℃），在低温下电子束灭菌可以有效减少水电离程度，从而减少自由基数量，第三加入抗氧化剂，使电离出的自由基优选与抗氧化剂反应，从而降低交联的程度；

（3）本发明方法制备的凝胶可无菌状态提供，经过灭菌后仍然可以保持成胶性能，接触体液环境后短时间内可迅速成胶，本发明的凝胶现用现配，更符合实际使用要求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的一种A相和B相混合为静态混合方式图；

图2是本发明的一种A相和B相混合为注射器混合方式图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

如图1和2所示，为本发明的A相和B相的两种混合方方式，图1为静态混合，A相和B相位于不同的管中，挤压时进行混合，图2为注射器混合，A相和B相分别位于两个注射器中进行混合。

实施例1

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：2℃下向浓度为0.05M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，2℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为1%，甘油在A相中的浓度为0.02M；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比0.5:0.05:0.005:0.3混合，加水至磷酸盐总浓度为0.5M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为10kGy，灭菌温度为-10℃，2℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为2:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例2

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：5℃下向浓度为0.25M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘露醇，混合得到A相，5℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为5.5%，甘露醇在A相中的浓度为0.16M；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比1.75:0.0275:0.0275:0.16混合，加水至磷酸盐总浓度为1M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为15kGy，灭菌温度为-40℃，5℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为5:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例3

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：8℃下向浓度为0.5M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入儿茶素，混合得到A相，8℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为10%，儿茶素在A相中的浓度为30mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液，所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比3:0.005:0.05:0.02混合，加水至磷酸盐总浓度为1.5M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为20kGy，灭菌温度为20℃，8℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为9:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例4

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：4℃下向浓度为0.005M的盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，在4℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为2%，甘油在A相中的浓度为300mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为Tris-HCl缓冲溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比3:5混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.3M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成。

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为12kGy，灭菌温度为-30℃，4℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为3:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例5

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：6℃下向浓度为0.0275M的盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入抗坏血酸，混合得到A相，6℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为3%，抗坏血酸在A相中的浓度为30mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为Tris-HCl缓冲溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比1:1混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.55M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成。

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为15kGy，灭菌温度为-10℃，6℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为4:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例6

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：8℃下向浓度为0.04M的盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，8℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为4%，甘油在A相中的浓度为150mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为Tris-HCl缓冲溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比5:3混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.8M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成。

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为19kGy，灭菌温度为10℃，8℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为7:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例7

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：2℃下向浓度为0.1M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，在2℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为1%，甘油在A相中的浓度为100mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为巴比妥钠-盐酸缓冲液，所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比5:7混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.3M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为10kGy，灭菌温度为-40℃，2℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为2:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例8

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：3℃下向浓度为0.1M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，3℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为1%，甘油在A相中的浓度为100mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为巴比妥钠-盐酸缓冲液，所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比7:5混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.55M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为13kGy，灭菌温度为0℃，3℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为7:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

实施例9

本实施例的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：7℃下向浓度为0.2M的醋酸中加入胶原蛋白，混合均匀，再加入甘油，混合得到A相，7℃下保存，其中，胶原蛋白在A相中的质量分数为10%，甘油在A相中的浓度为100mM；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为巴比妥钠-盐酸缓冲液，所述的巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比8:4混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.8M，用盐酸和氢氧化钠调节pH值至7.2-7.6而成；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，辐照剂量为10kGy，灭菌温度为-40℃，7℃保存，使用时将A相和B相混合，A相和B相的体积比为4:1，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

对比例1

本对比例的凝胶的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（1）的A相中不加抗氧化剂。

对比例2

本对比例的凝胶的制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤（3）中不做灭菌处理。

试验例1成胶时间

测定实施例1-3和对比例1-2制备的凝胶的成胶时间，如表1所示，将A相和B相混合后，在37℃环境下以固定频率进行检测，30min内每隔10s取点一次，记录储能模量，以储能模量达到储能模量最大值90%的首个时间点作为成胶时间。

从表1的数据可以看出，A相中不添加抗氧化剂时，经过灭菌后不成胶，不进行灭菌处理的凝胶与实施例1-3样品均呈现质地均一的凝胶态。

本发明人对其他实施例制备的凝胶也进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。

试验例2推挤力试验

本发明人经过在实验中发现，灭菌引起的分子间交联会直接影响A相的推挤顺畅程度，产品使用前要把A、B相混合，而A相推挤力过大或频繁出现堵塞情况会导致两相无法均匀混合，大大增加了操作难度，因此推挤力也是产品的重要指标之一。

使用拉力机参照ISO7886-1标准对实施例1-3及对比例1中的A相灭菌后进行推挤力测试，以及对比例2中的A相不灭菌进行推挤力测试，推挤速度为25mm/min，注射器装量为1mL，推挤长度为10mm，不使用针头，规定在稳定推挤过程中的平均推挤力为产品的推挤力，对于出现力值波动的测量结果，规定力值大于平均推挤力2倍的为异常力值波动，记录异常波动次数，异常力值波动代表着推挤过程中出现堵塞情况。结果见表2。

结果表明，实施例1-3与对比例2在推挤过程中十分顺畅，无堵塞情况，而不添加抗氧化剂的对比例1推挤困难，无法满足临床使用要求。实施例1-3间推挤力差异是由胶原浓度引起的，不影响使用。

本发明人对其他实施例制备的A相也进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。

试验例3热变性温度

将实施例1-3和对比例1-2制备的凝胶在37℃环境下反应30min后冷冻干燥，加入适量PBS溶液，进行同步热分析，规定胶原蛋白变性吸热峰的峰值为热变性温度，峰面积积分为焓变值，焓变值是测试材料的固有属性，结果见表3。

从表3中可以看出，对比例1的热变性温度和焓变值明显低于实施例1-3，且出现40℃以下的吸热峰，表明不加抗氧化剂灭菌处理使得胶原的发生交联，结构破坏，实施例1-3和对比例2的热变性温度相近，表明抗氧化剂保护了胶原蛋白的结构。

本发明人对其他实施例制备的凝胶也进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。

试验例4交联情况研究

不添加抗氧化剂的对比例1在灭菌后呈现为固态凝胶的性状，因此我们对其交联情况进行了研究分析。茚三酮与游离氨基在适宜条件下会生成蓝色物质，通过特定波长的吸光度可以得出自由氨基的含量，将交联前后胶原产品的自由氨基数量进行比较，既可得出有氨基参与交联过程的交联程度。测试实施例1-3和对比例1-2制备的凝胶的交联度结果见表4。

其中，戊二醛交联样品为按照CN102924731B中比较例1制备的一重胶原蛋白纤维；

碳化二亚胺交联样品为按照CN102924731B中比较例4制备的一重胶原蛋白纤维。

实验结果表明，实施例1-3和对比例1-2的交联度数据无明显差异，均在0%-10%之间，而常用化学交联的交联度在60%、80%左右。胶原的化学交联是在氨基、羧基间形成牢固的化学键，而成纤维或自组装等分子间交联过程是形成键能较弱的氢键，这种结构在茚三酮显色反应条件下会被破坏。

本发明的灭菌过程实际上是在辐射能量的作用下，胶原发生了类似自组装的分子间交联，这种交联并不是化学交联。

本发明人对其他实施例制备的凝胶也进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。

试验例5

只改变步骤（3）中灭菌的温度，其他均与实施例1相同，考察温度对胶原蛋成胶时间和推挤力的影响，成胶时间测定和推挤力测定参照试验例1和2，结果如表5所示。

通过表5可知，低于本发明的灭菌温度时推挤力变大，出现多次异常力值，同时成胶明显变差。高于本发明的灭菌温度时虽然推挤力小，但出现多次异常力值，实际上发生了明显的固液分离，混合后也不再成胶。只有在本发明的灭菌温度下制备的凝胶才具有较好的推挤力和成胶时间。

试验例6

只改变抗氧剂的种类，总浓度不变，其他均与实施例1相同，考察抗氧化剂种类对胶原蛋白成胶时间及推挤力的影响，成胶时间及推挤力测定同试验例1、2，结果如表6所示，推挤力测试中均未出现异常力值。

通过表6可知，本发明人经过大量的试验发现当抗氧化性选择甘油与其他物质混合时，推挤力更小，成胶时间更短。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

（1）A相制备：2-8℃下向醋酸或盐酸中加入胶原蛋白，混合均匀，加入抗氧化剂，混合得到A相，2-8℃保存；

（2）B相制备：配制缓冲溶液体系，所述的缓冲溶液体系为磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种；

（3）将A相和B相分别装入不同的容器，同时进行电子束灭菌，2-8℃保存，使用时将A相和B相混合，得到所述的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中醋酸的浓度为0.05-0.5M，盐酸浓度为0.005-0.05M。

3.根据权利要求1或2所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中胶原蛋白在A相中的质量分数为1-10%。

4.根据权利要求1所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中抗氧化剂为芦丁、表儿茶素、儿茶素、甘露醇、抗坏血酸和甘油中的一种或几种。

5.根据权利要求1或4所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中抗氧化剂在A相中的浓度为2-300mM。

6.根据权利要求1所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的磷酸盐缓冲溶液为氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠按照摩尔比（0.5-3）:（0.005-0.05）:（0.005-0.05）:（0.02-0.3）混合，加水至磷酸盐总浓度为0.5-1.5M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。

7.根据权利要求1所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中Tris-HCl缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷与盐酸按照摩尔比（3-5）:（3-5）混合，加水至三羟甲基氨基甲烷与盐酸总浓度为0.3-0.8M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。

8.根据权利要求1所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中巴比妥钠-盐酸缓冲液为巴比妥钠与盐酸按照摩尔比（5-8）:（4-7）混合，加水至巴比妥钠与盐酸总浓度为0.3-0.8M，用酸和碱调节pH值至7.2-7.6而成。

9.根据权利要求1所述的一种无菌自固化胶原蛋白修复凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中A相和B相的体积比为（2:1）-（9:1），电子束灭菌中辐照剂量为10-20kGy，灭菌温度为-40-20℃。

10.一种权利要求1-9任一方法制备的无菌自固化胶原蛋白修复凝胶。

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