CN110527024A - 一种纳米壳聚糖衍生物、其制备方法及应用 - Google Patents

一种纳米壳聚糖衍生物、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米壳聚糖衍生物、其制备方法及其应用，其中，所述制备方法为将壳聚糖溶于稀酸后，与甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯混合，进行自聚接枝反应，得到带有活性环氧基团的中间体，在碱性条件下，水解为带有大量枝链结构的羟基活性官能团，所述纳米壳聚糖衍生物的颗粒大小为50‑600nm。采用本发明所述方法制备的纳米壳聚糖衍生物具有优良的亲水性，能高选择性、特异性的富集和纯化糖基化多肽，适用于生物样品中低丰度的糖基化多肽的富集和纯化。

Description

一种纳米壳聚糖衍生物、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医学纳米材料技术领域，涉及纳米壳聚糖衍生物及一锅法反应制备方法和利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性和特异性富集和纯化糖基化多肽的方法。
背景技术
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研究的热点课题。蛋白质的糖基化是最常见的、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，蛋白质的糖基化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，新陈代谢，免疫应答，肿瘤发生等，一些糖基化蛋白质作为治疗疾病的相关靶或生物标识物用于癌症的早期检测和鉴定，如癌胚抗原用于检测直肠癌，乳腺癌，前列腺癌和肺癌；CA－125用于检测卵巣癌；专一性前列腺癌胚抗原用于检测前列腺癌；Her2/neu用于检测乳腺癌；等等，因此对糖基化蛋白质的分析和鉴定具有十分重要的作用。
目前，质谱技术已经发展成为鉴定糖基化蛋白的重要工具之一。但是质谱在鉴定糖基化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，糖基化蛋白在细胞内所有蛋白中为低丰度；第二，酶解产物中存在的大量非糖基化多肽的质谱信号通常会淹没糖基化多肽的离子信号。鉴于此，当前国际上的主要研究策略是利用现有技术体系，分离富集糖蛋白质/糖肽，实现大规模高通量蛋白质的糖基化位点的鉴定。
常用的糖蛋白质/糖肽分离富集技术有：凝集素亲和技术、肼化学富集法、苯硼酸亲和法、亲水相互作用色谱法等。其中亲水相互作用色谱法越来越广泛地用于糖肽的富集，因为它是基于糖肽具有强的亲水性。在高有机相的水溶液中，糖肽与色谱材料上的亲水基团发生相互作用从而可实现糖肽与非糖肽的分离。目前应用最广泛的糖蛋白/糖肽分离富集方法是凝集素亲和法，但该方法不适于低丰度糖基化多肽的纯化和富集，也无法实现大规模糖肽的纯化和富集。
壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1,4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.Carbohydrate Polymers 62(2005)142–158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。壳聚糖上带有大量的羟基和氨基，但是其易溶于酸限制了它的应用。
发明内容
为克服现有技术中的上述难题，本发明首先提供一种纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述纳米壳聚糖衍生物是壳聚糖与烯酸环氧丙酯发生自聚接枝反应的产物，再在碱性条件下发生水解反应得到的，并且所述纳米壳聚糖衍生物带有活性羟基官能团，颗粒直径大小为50-600nm；
其中，所述反应是一锅法反应完成；
其中，所述烯酸环氧丙酯为C3-C8直链或支链烯酸环氧丙酯；
其中，所述碱性条件为碳酸盐的水溶液，优选碳酸钠或碳酸钾；
其中，所述烯酸环氧丙酯为甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。
本发明另一方面提供，上述纳米壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将壳聚糖溶于含有0.1-20wt％酸的水溶液，再与烯酸环氧丙酯混合，加入引发剂后进行自聚接枝反应，其中，所述壳聚糖的含量为1.5-2.5wt％，所述烯酸环氧丙酯的含量为2-10wt％，反应温度为40-100℃，反应时间为0.5-4小时，得到中间体；
(2)在步骤(1)得到的所述中间体中，加入碳酸盐水溶液，反应温度为50-80℃，反应时间4-6小时，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到纳米壳聚糖衍生物；
其中，所述烯酸环氧丙酯为C3-C8直链或支链烯酸环氧丙酯；
其中，所述烯酸环氧丙酯为甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯；
其中，所述引发剂为偶氮二异丁腈、正丁基锂、过硫酸钾、硝酸铈铵、硫代碳酸-溴酸钾、二高碘酸铜酸钾、过硫酸氨或硫代硫酸钠中的一种或多种，所述引发剂的加入量为反应体系的1-5wt％；
其中，所述酸为甲酸或乙酸；
其中，所述碳酸盐水溶液为碳酸钠或碳酸钾。
以反应原料是壳聚糖、甲基丙烯酸环氧丙酯和碳酸钠为例，本发明的反应原理为：
其中，1代表壳聚糖，GMA可以同壳聚糖上的C2氨基发生反应，也可以和C3或C6上的羟基发生反应，也可能与自身的活性官能团反应，GMA和壳聚糖经自聚接枝反应得到上述反应式中的中间体，该中间体带有活性环氧基团，然后该中间体再在碱性水溶液中水解，从而得到带有羟基活性官能团的纳米壳聚糖衍生物2。
本发明还提供上述方法制备的纳米壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽方面的应用；
其中，所述富集和纯化糖基化多肽的方法为，将酶解后的待分析物溶于上样液中，将其加入到所述壳聚糖衍生物纳米材料中进行富集，洗涤后得到选择性吸附有糖基化多肽的纳米壳聚糖衍生物，直接用于质谱分析或洗脱负载的糖基化多肽；
其中，所述上样液为含有含有89％乙腈和1-3％三氟乙酸的水溶液；
其中，所述洗脱溶液为含有50％乙腈和0.5％三氟乙酸的水溶液；
其中，所述酶解操作所用的酶为胰酶、蛋白内切酶Glu-C或糜蛋白酶；
其中，所述纳米壳聚糖衍生物可涂在芯片上进行微量的糖基化多肽的富集和纯化，或填充入色谱柱中进行大规模的糖基化多肽的富集和纯化；
其中，所述待分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液。
本发明利用壳聚糖衍生物纳米材料富集和分离糖基化多肽的方法可按本领域常规操作步骤进行，但是优化了富集糖基化多肽的过程，包括吸附、洗涤和洗脱来选择性地富集糖基化多肽。该方法具有较高的特异性，可用于生物样品中低丰度糖基化多肽的纯化和富集。此外，本发明将所述纳米材料作为色谱填料，用于糖基化多肽的富集和纯化，从而实现大规模的糖基化多肽的分离提纯。
本发明的有益效果在于：本发明的壳聚糖衍生物纳米材料相对于现有材料而言，所选择材料廉价，一锅法反应得到，这样的反应在经济上和环境友好上极为有利。材料具有良好的生物相容性，性质稳定，颗粒大小为50-600nm，外比表面积大，具有很强的吸附能力，可制膜和填充于色谱柱中，富集糖基化多肽后可直接用于质谱分析。另外，由于壳聚糖是天然多糖，糖基化多肽含有糖基，根据相似相容原理和羟基能与糖基形成氢键，因此该纳米壳聚糖衍生物具有优良的亲水性，能高选择性、特异性的富集和纯化糖基化多肽。再用质谱技术鉴定生物标识物或疾病相关靶。
附图说明
图1为纳米材料的红外吸收光谱图；
图2为壳聚糖衍生物纳米材料的扫描电镜图，由图可以看出，此纳米材料为球型，颗粒大小为50-600nm；
图3为壳聚糖衍生物纳米材料的水接触角图，由图可以看出，此纳米材料具有极强的亲水性，水一接触到材料，它立即扩散。
图4A为辣根过氧化物酶酶解产物(浓度为2×10-8M)的MALDI-TOF质谱图,图4B为纳米壳聚糖衍生物对辣根过氧化物酶酶解产物中糖基化多肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽。
图5A为免疫球蛋白(IgG)酶解产物(浓度为2×10-6M)的MALDI-TOF质谱图；图5B为纳米壳聚糖衍生物对IgG酶解产物中糖基化多肽富集和纯化的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽。
图6A为辣根过氧化物酶酶解产物(浓度为2×10-8M)与牛血清白蛋白的酶解产物以1：100摩尔比例混合的MALDI-TOF质谱图；图6B为纳米壳聚糖衍生物对其进行糖基化多肽的富集和纯化的MALDI-TOF质谱图，其中*为糖基化多肽。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明给予进一步的说明。
实施例1-5为聚甲基丙烯酸甘油酯@壳聚糖一锅法反应的制备方法，实施例6-9为利用本发明的衍生物富集和纯化糖基化多肽的方法。
实施例1：一锅法反应制备聚甲基丙烯酸甘油酯@壳聚糖(PGMA@CS)
在装有搅拌器，温度计和冷凝管的100mL三口烧瓶中，将0.5克的壳聚糖(青岛海汇生物有限公司，脱乙酰度91％)溶于30mL含有乙酸2wt％的水溶液中，加入0.5mL的甲基丙烯酸环氧丙酯，搅拌，再加入0.035克过硫酸铵和0.035克硫代硫酸钠，升温至50℃，反应2小时，停止反应，降至室温。再加入2M碳酸钠的水溶液20mL，升温到60℃，反应5小时，停止反应，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到固体物。干燥后，用碾钵碾碎。
由图1聚甲基丙烯酸甘油酯@壳聚糖介质的扫描电镜图可以看出，此材料为球型，大小为50-600nm；图2的红外波谱特征峰为：3434.4,2936.3,1732.3,1641.9,1452.7,1390.4,1262.9,1153.5,1061.9,993.2,904.9,843.4,755.7；其中1732.3的特征吸收峰归属于C＝O的吸收峰。元素分析结果为C 51.51％，H 6.806％，N2.451％。图3为壳聚糖衍生物纳米材料的水接触角图，由图可以看出，水一接触到材料，水立即扩散，说明此纳米材料具有极强的亲水性。
实施例2：与实施例1的方法相同，其中原料丙烯酸环氧丙酯替代甲基丙烯酸环氧丙酯。
实施例3-4：与实施例1的方法相同，除了其中的引发剂分别为偶氮二异丁腈和正丁基锂之外。
实施例5：与实施例1的方法相同，其中的碳酸盐为碳酸钾。
实施例6：糖基化多肽的富集
1).样品溶液的制备：25μg辣根过氧化物酶(Sigma)，加入25μL含50mM的碳酸氢氨溶液中,在95℃加热10分钟；冷至室温，加入0.3M的磷酸三(2-氯乙基)酯(TCEP)至终浓度为10mM，在67℃加热10分钟，冷至室温，按照与胰蛋白酶的质量比为(40:1)的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，酶解温度控制在37℃，过夜反应，加入2％三氟乙酸(TFA)终止反应。获得的蛋白酶解溶液储存在-80℃冰箱中备用。牛血清白蛋白和免疫球蛋白的酶解方法同上。
2).糖基化多肽的富集和MALDI-TOF质谱分析：将2×10-8mM的辣根过氧化物酶酶解溶液100μL的上样液(含89％乙腈和3％三氟乙酸的水溶液)，加入到装有约0.2mg纳米壳聚糖衍生物的EP管中。在30℃，振速为1000rpm下，振动20分钟，离心去上清液，用上样液洗涤两次即可用于质谱分析。吸取0.5μL上述富集有糖基化多肽材料的混浊液点在靶板上，再与0.5μL含1％H3PO4和50％乙腈的DHB(25mg/mL)基质溶液混合，用枪头抽吸几次，放干，用MALDI-TOF-MS测定得质谱图，所有的MALDI-TOF质谱分析是在岛津的AXIMA-CFP plus(KRATOS Analytical,Shimadzu Group Company)飞行时间质谱仪上完成，N2脉冲激光的波长为337.1nm，实验中所得数据都在线性正离子模式中进行，质谱分子量的校正采用外标法，所用标准物为II Bradykinin(fragment 1-7)(M/z 757.3997),血管紧张素肽(Angiotensin II，M/z 1046.5423),[Glu1]-Fibrinopeptide B(M/z 1570.6852)和ACTH(fragment 18-39)(M/z2465.1989)。所得谱图再用内标法进行校正，所用内标为m/z2533.30和4986.20。
图4A是0.5μL 2×10-8mM的辣根过氧化物酶酶解所得多肽的质谱图，由图可知，谱图中主要为非糖基化多肽，只能观察到2个很弱的糖基化多肽。图4B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，由图可知共有25个强的糖基化多肽检出，非糖肽基本上被除去，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的糖基化多肽，分析结果见下表1。
实施例7
与实施例6的方法相同，其中所用质谱仪为nano-LC-ESI-MS。
实施例8：免疫球蛋白(IvIg)的糖基化多肽的富集及其分析
与实施例6的方法相同，其中所分析物为静脉免疫球蛋白(IvIg)的酶解溶液。
图5A是0.5μL 2×10-8mM的免疫球蛋白(IvIg)的酶解所得多肽的质谱图，无任何糖基化多肽检出。图5B是用所述纳米材料对其进行富集后所得质谱图，由图可知共有38个强的糖基化多肽检出，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的糖基化多肽，分析结果见下表2。
实施例9：特异性富集和纯化糖基化多肽
样品的制备和分析：将2μL 2pmol的糖基化蛋白辣根过氧化物酶酶解产物与非糖基化蛋白牛血清白蛋白的酶解产物以1：100摩尔比例混合，使总体积为200μL的上样液，加入到装有约0.2mg的壳聚糖衍生物纳米材料的EP管中。其他与实施例6的方法相同，图6A是0.5μL 2×10-8mM的辣根过氧化物酶酶解产物与牛血清白蛋白酶解产物所得多肽以1：100的比例混合所得质谱图，由图可见，无任何糖基化多肽检出；图6B是用纳米壳聚糖衍生物富集和纯化后所得的质谱图，共检出11个糖肽，说明此纳米材料能特异的和高效的富集和纯化低丰度的糖基化多肽。
表1检测到的HRP糖基化多肽的糖基化类型、氨基酸序列及分子量
表2检测到的IVIG糖基化多肽的糖基化类型、氨基酸序列及分子量
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (18)

1.一种纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述纳米壳聚糖衍生物是壳聚糖与烯酸环氧丙酯发生自聚接枝反应的产物，再在碱性条件下发生水解反应得到的，并且所述纳米壳聚糖衍生物带有活性羟基官能团，颗粒直径大小为50-600nm。
2.根据权利要求1所述的纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述反应是一锅法反应完成。
3.根据权利要求1-2任一项所述的纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述烯酸环氧丙酯为C3-C8直链或支链烯酸环氧丙酯。
4.根据权利要求1-3任一项所述的纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述碱性条件为碳酸盐的水溶液，优选碳酸钠或碳酸钾。
5.根据权利要求1-4任一项所述的纳米壳聚糖衍生物，其特征在于，所述烯酸环氧丙酯为甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。
6.根据权利要求1-5任一项所述的纳米壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将壳聚糖溶于含有0.1-20wt％酸的水溶液，再与烯酸环氧丙酯混合，加入引发剂后进行自聚接枝反应，其中，所述壳聚糖的含量为1.5-2.5wt％，所述烯酸环氧丙酯的含量为2-10wt％，反应温度为40-100℃，反应时间为0.5-4小时，得到中间体；
(2)在步骤(1)得到的所述中间体中，加入碳酸盐水溶液，反应温度为50-80℃，反应时间4-6小时，降至室温后，过滤，用水洗涤至中性，得到纳米壳聚糖衍生物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述烯酸环氧丙酯为C3-C8直链或支链烯酸环氧丙酯。
8.根据权利要求6-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述烯酸环氧丙酯为甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈、正丁基锂、过硫酸钾、硝酸铈铵、硫代碳酸-溴酸钾、二高碘酸铜酸钾、过硫酸氨或硫代硫酸钠中的一种或多种，所述引发剂的加入量为反应体系的1-5wt％。
10.根据权利要求6-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酸为甲酸或乙酸。
11.根据权利要求6-10任一项所述的制备方法，其特征在于，所述碳酸盐水溶液为碳酸钠或碳酸钾。
12.纳米壳聚糖衍生物在富集和纯化糖基化多肽方面的应用，其特征在于，所述纳米壳聚糖衍生物为权利要求1-5任一项所述的纳米壳聚糖衍生物、或为权利要求1-11任一项所述的制备方法获得的纳米壳聚糖衍生物。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述富集和纯化糖基化多肽的方法为，将酶解后的待分析物溶于上样液中，将其加入到所述壳聚糖衍生物纳米材料中进行富集，洗涤后得到选择性吸附有糖基化多肽的纳米壳聚糖衍生物，直接用于质谱分析或洗脱负载的糖基化多肽。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述上样液为含有89％乙腈和1-3％三氟乙酸的水溶液。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述洗脱溶液为含有50％乙腈和0.5％三氟乙酸的水溶液。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述酶解操作所用的酶为胰酶、蛋白内切酶Glu-C或糜蛋白酶。
17.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述纳米壳聚糖衍生物可涂在芯片上进行微量的糖基化多肽的富集和纯化，或填充入色谱柱中进行大规模的糖基化多肽的富集和纯化。
18.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，其中所述待分析物是血清、血浆、体液、组织或细胞裂解液。
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