CN113016819A - 用于有害生物防控的耐碱的磷酸钙/核酸混杂运载体及生产颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于有害生物防控的耐碱的磷酸钙/核酸混杂运载体及生产颗粒的方法。一种稳定的水性悬浮液包括含有纳米颗粒的组合物，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。所述纳米颗粒组合物和悬浮液具有高的核酸负载和高的稳定性，并且可以用于保护作物不受害虫侵害以及用于下调害虫物种中的靶基因的表达，从而防止和/或控制有害生物侵扰。

Description

用于有害生物防控的耐碱的磷酸钙/核酸混杂运载体及生产 颗粒的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119要求2019年12月9日提交的系列号为62/945780的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。

技术领域

本公开涉及用于将核酸递送到细胞或微生物中的组合物。具体地，本公开涉及将杀虫性RNA递送给有害生物和昆虫以保护植物和作物。

背景技术

据估计，植物虫害和病原体使全球作物每年减产30％至40％。同时，已经使用了数十年并且被认为是目前控制有害生物种群的最佳选择的化学防控(即，使用杀虫剂)现在已被视为健康风险的潜在来源，因为它可能导致许多严重的健康影响和疾病，并且可持久地毒害环境。由化学杀虫剂的过度使用或滥用引起的第二个问题是有害生物对这些化学试剂产生的抗性。已知具有短世代时间的有害生物能更快得产生抗性，这使得杀虫剂迅速不可用。虽然已考虑使用表达杀虫蛋白的转基因植物，但部署转基因植物面临公众抵触，在某些国家可能不符合某些法规。因此，对保护作物的新方法的需求日益增长。

RNA干扰(RNAi)已被研究人员用于基因研究多年，但最近证明RNA干扰可用于使有害生物中的某些目标基因沉默。RNAi是19-30个小的核酸RNA分子触发互补转录物的破坏或衰减的过程。基于RNAi的有害生物防控通过提供针对目标物种的高特异性来改进传统的小分子杀虫剂。这种生物学方法似乎很有吸引力，因为可以将特定的有害生物作为目标并控制其种群而不影响非目标物种，而使用化学杀虫剂是不可能实现的。例如，已经证明引入到蚊子幼虫中的dsRNA可以诱导雄性致育基因的RNAi介导的敲减。只需将适当的RNA喷在马铃薯植物的叶子上，即可以利用RNA干扰来控制科罗拉多马铃薯甲虫(CPB)种群。

现在已经众所周知的是，如果RNA干扰是具有前景的选择，那么将RNA分子递送给昆虫的方法仍然是要解决的主要问题。理想情况下，需要通过简单的口服递送将RNA递送给有害生物，例如昆虫。然而，对于口服治疗，dsRNA必须挺过摄入，然后必须被上皮细胞吸收并迁移到适当的组织以激活RNAi机制。要解决的另一个重要问题是来自于RNA分子在环境中的低稳定性，RNA会被RNA酶迅速消化，并且在阳光下会发生自我裂解。RNA酶可能存在于目标昆虫的消化道中，也可能存在于环境中。

以前使用RNAi控制有害生物的一些尝试涉及将没有任何保护的裸RNA简单局部施用在植物表面上，例如叶片表面上，但是这种技术需要大量的核酸，因为它们中的大多数通常在不到一周的时间内在田间迅速降解，这使得该处理在经济上不可行。据估计，这种基于RNAi的处理必须持续至少一个月才能获得经济利益，但为此必须保护RNA免受外界侵害。

另一个问题是，当目标有害生物是昆虫时，一旦RNA到达目标有害生物，它必须抵抗在昆虫肠腔中观察到的恶劣环境。例如，鳞翅目(lepidopteran)的肠道可展现出10-11的pH，这与烘炉清洁剂的pH值相当，而烘炉清洁剂会快速导致最具抵抗性的分子水解。另外，在消化道中存在许多核酸酶，它们也可以引起RNA的降解。针对RNA干扰表达感兴趣的RNA的酵母可作为天然载体用于喂养目标有害生物。然而，酵母是活生物体，这使得产品的使用和储存变得复杂。

保护RNA并改善其在目标生物体细胞内的递送的一种简单方法是在带负电荷的RNA和一些带正电荷的聚阳离子之间形成复合物。该复合物称为多聚复合物(polyplex)，其被广泛用于转染以用于治疗应用。在有效的聚阳离子中，源自天然生成的几丁质的合成PEI或壳聚糖以及含胍的聚合物被广泛用于该目的。为了更进一步改善对核酸酶的保护，提出使用聚合物，例如硫酸葡聚糖，已知其是核酸酶的有效抑制剂，因为大多数硫酸化聚阴离子是核酸酶抑制剂(参见例如第8,841,272B2号美国专利)。

最近，已经提出了用于将双链RNA递送至植物的粘土组合物，其保护植物免受多种生物的影响。在这种方法中，RNA被简单地吸附在层状双氢氧化物(LDH)粘土复合物上。该组合物可以是可以喷到植物上的悬浮液形式(参见，例如，第3116312号欧洲专利申请)。LDH是二价和三价金属的混合氢氧化物，具有过量正电荷，其被内部离子平衡，并且可以吸收带负电荷的核酸。尽管这样的核酸和无机载体的组合看起来很容易实施，但是适量的核酸递送可能不是那么有效。最近，在第10,405,539号美国专利中报告了对基于粘土的技术的改进，其通过在接触RNA之前，先用聚阳离子来预处理粘土颗粒来作为额外的步骤，以增加经过这样涂覆的粘土和带负电荷的核酸之间的静电相互作用来实现。当使用聚乙烯亚胺(PEI)预处理时，所报告的RNA在固体体系中的负载仅为1重量％。这样的RNA负载量不足以高到用于应用，特别是基于植物的应用。但是，通过用合成的阳离子聚合物聚(甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙基酯)(PDMAEMA)处理粘土，他们获得了高达25％的RNA负载。尽管这种改进的方法能够实现更高的RNA负载，但该方法需要使用合成聚合物涂覆的额外步骤。

这些结果显示在无机运载体的表面上吸收适当量的核酸仍然具有挑战性，并且很大程度上取决于所用的聚阳离子。

在20世纪70年代初，Graham和van der Eb(Virology；第2期，第52卷，1973年4月，第456-467页)发现，DNA与通过氯化钙和磷酸盐缓冲液之间的反应所形成的磷酸钙共沉淀，并且当接触到细胞时，被细胞吸附。在过去的几十年中，该技术被广泛用于体外转染哺乳动物细胞，并且这种磷酸钙无机纳米颗粒被认为是用于基因治疗应用的具有前景的非病毒载体。然而，由Graham开发的技术需要使用大量过量的钙来增加细胞运输并因此促进纳米颗粒的内在化，从而促进核酸渗透到细胞质中。通常，在Graham的方案中，钙与磷酸盐的比值>200。

大量过量的钙离子增加了离子强度，这对静电稳定的悬浮液的稳定性具有有害作用。钙的这种过量导致得到不稳定的磷酸钙/核酸悬浮液，其经历快速聚集和不受控制的尺寸增加。产生的悬浮液絮凝并且不够稳定而无法贮存，实际上它们必须在制备后立即用于转染。因此，Graham和许多其他作者报道的依赖高的钙与磷比值的方法不能用于制备可以满足植物检疫组合物要求进行贮存的稳定悬浮液。在另一个实例中，M Jordan等人在“Transfecting mammalian cells:optimization of critical parameters affectingcalcium-phosphate precipitate formation(转染哺乳动物细胞：影响磷酸钙沉淀形成的关键参数的优化)”，96-601Nucleic Acids Research《核酸研究》，1996年，第4期，第24卷中报道，反应混合物中的可溶性DNA可以在不到1分钟的时间内与磷酸钙结合成不溶性复合物，但是将反应时间延长至20分钟会导致不受控制的聚集和/或生长。

因此，需要用于制备具有高核酸负载的CaP/核酸混杂纳米颗粒的稳定悬浮液的组合物和方法，以避免要在作物上喷洒大量无机物来达到通过RNA干扰控制有害生物所需的RNA量，或者避免对动物给予过多的药物而不够高效。

发明内容

根据第1方面，一种组合物包括纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒包括核酸，其至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。在某些实施方式中，至少部分被包封在磷酸钙基质中的核酸包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述组合物还包括包盖剂，其至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。

在某些实施方式中，所述包盖剂包含聚阳离子。在某些实施方式中，聚阳离子选自下组：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺、壳聚糖、寡肽，阳离子化多糖、阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白、鱼精蛋白、二乙基氨基乙基-葡聚糖，聚酰胺型胺类、聚(β-氨基酯)、氨基多糖、聚甲基吖丙啶、聚烯丙胺、聚乙烯胺均聚物或共聚物、聚(乙烯基吡啶)均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酰胺均聚物或共聚物及其衍生物。在某些实施方式中，聚阳离子是聚乙烯亚胺。

在某些实施方式中，纳米颗粒的峰值粒度小于500nm。在某些实施方式中，纳米颗粒的峰值粒度在50nm至500nm的范围内。在某些实施方式中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸的重量比为100:1至1:1.5。在某些实施方式中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸与包盖剂的重量比为2:1:2至2:5:2。在某些实施方式中，聚阳离子中的带正电荷的氮原子数目与核酸中的磷原子的数目的比值大于1。在某些实施方式中，纳米颗粒悬浮在pH为6至11的水性分散体中。在某些实施方式中，纳米颗粒悬浮在pH为7至8的水性分散体中。在某些实施方式中，所述组合物是稳定的水性悬浮液。

根据第2方面，一种稳定的水性悬浮液包括：包含纳米颗粒的组合物，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。在稳定的水性悬浮液的某些实施方式中，所述组合物还包括包盖剂，其至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。在某些实施方式中，相对于纳米颗粒的总质量，核酸负载量为约0.1重量％至约50重量％。在某些实施方式中，水性悬浮液中的磷酸钙浓度小于100μg/ml。在某些实施方式中，磷酸钙悬浮液中的钙与磷的摩尔比为1.5:1至5:1。在某些实施方式中，所述悬浮液是耐碱的。在某些实施方式中，所述稳定的水性悬浮液还包括添加剂，所述添加剂选自下组：核酸酶抑制剂、表面活性剂、润湿剂、UV吸收剂、抗氧化剂、防冻剂、防腐剂、着色剂、杀虫剂、杀真菌剂、引诱剂、驱避剂和流变改性剂。

根据第3方面，一种保护作物不受昆虫侵害的方法，所述方法包括：向作物给予组合物，其中，所述组合物包括纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。在某些实施方式中，至少部分被包封在磷酸钙基质中的核酸包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述组合物还包括包盖剂，其至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。在某些实施方式中，所述组合物通过喷洒、滴给或灌溉来给予作物。在某些实施方式中，所述组合物中的核酸包含杀虫性双链核糖核酸。在某些实施方式中，所述方法包括：保护作物不受半翅目(hemiptera)、鞘翅目(coleoptera)、蚤目(siphonaptera)、网翅目(dichyoptera)、鳞翅目(lepidoptera)、直翅目(orthoptera)和双翅目(diptera)的侵害。

根据第4方面，一种用于生产混杂纳米颗粒的方法包括：将核酸添加到位于反应器中的钙盐溶液或磷酸盐溶液中的一种中；将所述钙盐溶液和磷酸盐溶液的pH调节到约6至约9；以及将所述钙盐溶液与所述磷酸盐溶液混合以形成磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒。在某些实施方式中，所述方法还包括：将聚阳离子溶液添加到所述混合溶液中。在某些实施方式中，所述钙盐选自下组：氯化钙、硝酸钙、乙酸钙和乳酸钙。在某些实施方式中，所述磷酸盐选自下组：磷酸三钠、磷酸三钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸铵和磷酸氢铵。在某些实施方式中，所述核酸至少部分被包封在磷酸钙纳米颗粒中。在某些实施方式中，混杂纳米颗粒的峰值粒度在50nm至500nm的范围内。在某些实施方式中，钙盐溶液的pH为约7.5。在某些实施方式中，磷酸盐溶液的pH为约7.5。在所述方法的某些实施方式中，所述反应器选自下组：间歇式反应器、半间歇式反应器、连续流动反应器、先进流动反应器、流化床反应器及其组合。

根据第5方面，一种用于在连续流动反应器中制备混杂纳米颗粒的悬浮液的方法包括：向钙盐溶液或磷酸盐溶液中的一种添加核酸；使钙盐溶液流到流动反应器的第一进口中；使磷酸盐溶液流到流动反应器的第二进口中，以使磷酸盐溶液物流与钙盐溶液物流混合并产生流自所述反应器的磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒物流；从所述反应器收集并处理包含磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒的悬浮液。在某些实施方式中，所述方法还包括：使包盖聚合物溶液流到流动反应器的第三进口中，以使包盖聚合物物流与磷酸钙物流混合而产生流自所述反应器的聚合物包盖、包封有核酸的磷酸钙物流。在某些实施方式中，所述方法还包括：从所述反应器收集并处理聚合物包盖、包封有核酸的磷酸钙。在某些实施方式中，纳米颗粒的ζ(zeta)电位为-50至50毫伏。在某些实施方式中，纳米颗粒的中值粒度在30nm至250nm的范围内。在某些实施方式中，纳米颗粒悬浮在液体介质中。在某些实施方式中，所述液体介质选自下组：水、醇、烃和油。

根据第6方面，一种油包水型乳液(W/O乳液)包括一种组合物，所述组合物包含纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。在某些实施方式中，至少部分被包封在磷酸钙基质中的核酸包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述组合物还包括包盖剂，其至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。

根据第7方面，一种水包油包水型双重乳液(W/O/W乳液)包括一种组合物，所述组合物包含纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。在某些实施方式中，至少部分被包封在磷酸钙基质中的核酸包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。在某些实施方式中，所述组合物还包括包盖剂，其至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。

根据第8方面，一种玻璃容器，其容纳含有纳米颗粒的水性悬浮液和组合物，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。

附图简要说明

附图和以下说明阐释了本说明书中所述主题的一个或多个实施方案的细节。根据说明书、附图和权利要求书，本申请的主题的其他特征、方面和优点将变得显而易见。

图1根据本文所示和所述的一个或多个实施方式，例示了用于制备核酸负载的磷酸钙纳米颗粒(无聚阳离子)的基本方法的示意性流程图以及所得到的混杂纳米颗粒的透视图。

图2根据本文所示和所述的一个或多个实施方式，例示了用于制备具有聚阳离子包盖的核酸负载的磷酸钙纳米颗粒的基本方法的示意性流程图以及所得到的包盖的混杂纳米颗粒的透视图。

图3根据本文所示和所述的一个或多个实施方式，例示了显示出磷酸钙-DNA纳米颗粒的颗粒DLS尺寸的图表。

图4根据本文所示和所述的一个或多个实施方式，例示了无任何核酸负载的磷酸钙(CaP)颗粒，负载DNA的磷酸钙(CaP/DNA)颗粒和被PEI聚阳离子包盖的磷酸钙/核酸(CaP/DNA/PEI)颗粒的ζ电位的条形图。

图5例示了显示出核酸运载体颗粒CaP/DNA[2:1]在酸性pH、中性pH和碱性pH时的尺寸的图表，所述核酸运载体颗粒CaP/DNA[2:1]由根据实施例1中所述的方法制备的CaP和核酸制成。

图6例示了显示出核酸运载体颗粒CaP/DNA/PEI[2:1:2]在酸性pH、中性pH和碱性pH时的尺寸的图表，所述核酸运载体颗粒CaP/DNA/PEI[2:1:2]由根据实施例3中所述的方法制备的PEI外层、CaP和核酸制成。

图7例示了显示出稀释和未稀释的CaP/DNA[2:1]和CaP/DNA/PEI[2:1:2]的粒度演变的图表。

图8例示了显示出管式流动反应器装置的示意图，该反应器用于根据实施例4以连续模式(流动)制备悬浮液。

图9例示了显示推定的AFR反应器装置的示意图，该反应器用于根据本文所示和所述的一个或多个实施方式以连续模式制备悬浮液。

图10A和10B根据本文所示和所述的一个或多个实施方式，分别示出了阴性对照和被GFP质粒转染的细胞的荧光图像。

图11根据本文所示和所述的一个或多个实施方式，示出了在各种纳米颗粒样品中的DNA图谱的电泳迁移率。

图12示出了SEM显微照片，其显示出由根据实施例13所述的方法制备的dsDNA/磷酸钙/PEI[2:4:0]所制备的纳米颗粒的形态(干燥状态)。

图13A和13B示出了在两种放大倍数下的SEM显微照片，其示出了由dsDNA/磷酸钙/PEI[2:1:2]制备的纳米颗粒的形态和尺寸(干燥状态)。

图14是示出了对根据实施例10所述的方法制备的两种浓度的dsRNA/磷酸钙/PEI[2:1:2]纳米颗粒悬浮液进行的凝胶阻滞实验(0.8％琼脂糖)的图像。

不同附图中的相似附图编号和标记表示相似的元件。

具体实施方式

现将对附图所示的各个实施方式进行详细说明。只要可能，在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部分。附图中的各部件不一定按比例绘制，而是着重于说明示例性实施方式的原理。

如上所述，本公开的技术一般涉及用于将期望的材料，例如核酸，递送到细胞和组织中的组合物和方法。在各个实施方式中，本文提供了包含颗粒，例如纳米颗粒的组合物和系统，其用于将治疗剂递送到植物、动物和昆虫的细胞或组织，以及其制造和使用方法。

定义

下文提供了如本说明书中所用的某些术语的定义。除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语一般具有本公开的技术所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。

定义

在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，内容有另外明确表示的除外。因此，例如，提到的“一种”部件包括具有两种或更多种这类部件的方面，除非文本中有另外的明确表示。例如，提及“一种细胞”包括两种或更多种细胞的组合等。并且，当在词语“或”的后面没有“任一”(或指示“或”明确表示为排他性的其他类似语言——例如，x或y中的仅一种等)的情况下使用词语“或”时，其应被解释为包含性的(例如，“x或y”表示x或y中的一种或两种)。通常，本文所用的命名和下述细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学中的实验室步骤均为本领域熟知和常用的。

术语“和/或”也应被解释为包含性的(例如“x和/或y”意为x或y中的一种或两种)。在“和/或”或者“或”用作三个或更多个条目的组的连接的情况下，该组应被解释为仅包括一个条目，所有条目在一起，或这些条目的任何组合或数量。另外，说明书和权利要求中使用的术语，例如具有、具备、涵盖和含有应被理解为与术语包含和包括同义。由“和/或”从句特定指出的要素以外的其他要素可选存在，不论是否与那些特定指出的要素相关。作为一个非限制性实例，提到的“X和/或Y”在一个实施方式中可仅指X(任选包括除Y之外的要素)；在一些实施方式中可仅指Y(任选包括除X之外的要素)；在一些实施方式中既指X又指Y(任选包括其他要素)。

如本文所用，关于数字的术语“约”一般被认为包括落在某数字在任一方向(大于或小于)上的1％、5％或10％以内的数字，除非另有说明或从上下文中明显看出(除非该数字是小于0％的可能值或超过100％的可能值)。

除非另有陈述，否则本文所用的“粒度”是指颗粒直径。粒度例如表示为峰值粒度，其代表通过动态光散射(DLS)技术得到的颗粒的流体动力学直径。粒度还表示为中值或平均粒度。

本技术涉及由核酸和沉淀的碱稳定性磷酸钙并组合至少一种阳离子聚合物制备的稳定的水性悬浮液，其用于将核酸递送给有害生物，以及涉及用于生产所述水性悬浮液的方法。本技术的方法涉及在要负载的核酸的存在下，由钙盐和磷酸盐自发形成磷酸钙纳米颗粒，从而得到稳定的磷酸钙/核酸纳米颗粒悬浮液。附加的方法涉及用聚阳离子外涂覆核酸/磷酸钙颗粒，以在可变的pH条件中，包括在高碱性条件中，提供稳定性。

组合物

本技术的方面涉及包含纳米颗粒的组合物和悬浮液。在各个实施方式中，所述纳米颗粒包括基质，其包括磷酸钙(CaP)。在各个实施方式中，CaP代表含有钙阳离子和磷酸根阴离子的矿物家族。示例性的矿物可以包括但不限于羟磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)或其合适的前体，单相或双相磷酸钙，磷酸二钙，磷酸三钙、β-磷酸三钙(β-Ca₃PO₄)，硫酸钙和羟磷灰石的复合物，羟磷灰石的复合物或其组合。合适的纳米颗粒基质材料包括可以用于各种药物、生物医学、食品和化妆品应用的CaP生物材料。

具有磷酸钙基质的纳米颗粒还可以包括核酸，所述核酸至少部分被包封在所述基质中。所述核酸可以被包封在CaP基质内或结合到CaP基质中，可以涂覆或位于CaP基质表面上，或者可以既被包封在内又被涂覆在纳米颗粒表面上。合适的核酸包括任何核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，其可以是未经修饰或经过修饰的。在各个实施方式中，核酸包括但不限于单链和双链RNA，单链和双链DNA，单链区和双链区混合RNA，单链区和双链区混合DNA，以及包含DNA和RNA的杂交分子，该DNA和RNA可以是单链的，或者更通常地，可以是双链的或者是单链区和双链区混合的。此外，核酸是指包含RNA或DNA或两者，包含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及出于稳定性或其他原因而修饰了骨架的DNA或RNA的三链区。在一些实施方式中，纳米颗粒可以包括除核酸之外的其他治疗剂。合适的核酸和治疗剂可以选自下组：基因、shRNA、siRNA、微小RNA、DNA片段、RNA片段、质粒及其组合。在一些实施方式中，核酸包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。在一些实施方式中，核酸包含核糖核酸或其衍生物。在另一些实施方式中，核酸包含脱氧核糖核酸或其衍生物。在一些实施方式中，核酸包含干扰核糖核酸分子。在一些实施方式中，核酸包含小干扰RNA(siRNA)。

所述纳米颗粒可以包括包盖剂，其至少部分涂覆或渗透纳米颗粒，或者既涂覆又渗透纳米颗粒。在各个实施方式中，所述包盖剂可以包括有助于将核酸递送给细胞的化合物或组合物。例如，包盖剂可以包括阳离子化合物，所述阳离子化合物是具有极性基团的化合物，所述极性基团在生理pH时或生理pH附近带正电荷。由于这些化合物具有中和核酸电荷的能力，因此推测这些化合物有助于将核酸递送到细胞中。示例性的阳离子化合物包括但不限于聚阳离子、阳离子脂质、阳离子聚合物或其混合物。在某些实施方式中，所述包盖剂包含聚阳离子。待用作包盖剂的聚阳离子可以是合成聚合物、天然生成的聚合物或经化学修饰的天然生成的聚合物。聚阳离子在5至11之间的pH时合适地具有多个带正电荷基团。带电荷的基团可以选自烷基胺(包括伯胺、仲胺、叔胺和季胺)、亚胺、胍盐和芳族胺。聚阳离子可以是支链或直链的。例如，在PEI的情况中，直链聚乙烯亚胺(PEI)含有全部的仲胺，相较之下，支链PEI含有伯、仲和叔氨基。带正电荷的氨基的pKa可以大于7.5，例如，大于8、大于9或大于10。对于某些应用，在碱性条件下维持净阳离子电荷。结果，核酸保持与聚阳离子结合，这提供了一定的保护以防止被核酸酶降解(已知聚阳离子/核酸复合物展现出比非复合形式更佳的稳定性)。聚阳离子可以含有具有不同pKa值的一种或几种类型的氨基。聚阳离子可以是均聚物或共聚物。当带正电荷的聚合物是共聚物时，选择待与包含带电荷氨基的单体共聚的共聚单体，以维持对共聚物足够水平的水溶性。可以在壳聚糖及其衍生物(例如三甲基壳聚糖、胍基化壳聚糖)，阳离子化多糖(例如DEAE葡聚糖)和阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白中选择其他水溶性聚阳离子。

合适的聚阳离子包括但不限于：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺、壳聚糖、寡肽，阳离子化多糖、阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白、鱼精蛋白、活化树状聚合物、二乙基氨基乙基葡聚糖、聚酰胺型胺类、聚(β-氨基酯)、氨基多糖、聚甲基吖丙啶、聚烯丙胺、聚乙烯胺均聚物或共聚物、聚(乙烯基吡啶)均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酰胺均聚物或共聚物及其衍生物、包含肽和蛋白质片段的阳离子化合物或者它们的组合。优选的实例是聚乙烯亚胺(PEI)、溴化己二甲铵[可以商标名聚凝胺(polybrene)获得]、聚六亚甲基胍(PHMG)、聚六亚甲基双胍、聚烯丙基胺、胍基化聚(烯丙基胺)、聚氨基丙基甲基丙烯酰胺、聚-[N-(3-胍基丙基)甲基丙烯酰胺]、聚(甲基)丙烯酸氨基乙酯、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)。在各个实施方式中，聚阳离子包括聚乙烯亚胺。

可以添加足够量的聚阳离子的量，以将CaP/核酸母颗粒的负电荷转换成正电荷颗粒，并且表面电荷为至少+10mV，例如至少+20mV，从而提供可接受的胶体稳定性。

在另一方面，本文提供了包含本文所述的纳米颗粒组合物的悬浮液。稳定的悬浮液可以包括悬浮在合适溶剂中的磷酸钙-核酸纳米颗粒。示例性的溶剂包括水和水溶性有机溶剂。示例性的溶剂包括水、醇、烃和油。在各个实施方式中，稳定的水性悬浮液包括可以是包括本文所述的磷酸钙纳米颗粒的稳定水性悬浮液的组合物。在各个实施方式中，所述悬浮液可以包括悬浮在水性分散体中的CaP-核酸纳米颗粒。所述稳定的水性悬浮液可以由核酸和沉淀的碱稳定性磷酸钙制备。

所述悬浮液的水性分散体可以合适地具有接近中性或碱性pH。例如，所述悬浮液可以包括悬浮在pH为约6至约11的水性分散体中的纳米颗粒。这包括下述pH：约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、约7至约8、8至约11、约8至约10、约8至约9、约9至约11、约9至约10或者约10至约11，或包括这些值中任意两个值和/或在这任意两个值之间的任意范围。在各个实施方式中，所述悬浮液可以包括悬浮在pH为约7至约8的水性分散体中的纳米颗粒。

所述纳米颗粒是独特的，因为核酸被包藏在颗粒内，以及被吸附在颗粒表面上。因此，核酸负载显著更高并且可与多种应用相容。负载在纳米颗粒上的核酸量可以高于使用传统的吸附方法获得的量。在一些实施方式中，相对于纳米颗粒的总质量，负载在纳米颗粒上的核酸的量可以大于约0.1重量％。在另一些实施方式中，相对于纳米颗粒的总质量，负载在纳米颗粒上的核酸的量可以大于约10重量％。在一些实施方式中，相对于纳米颗粒的总质量，负载在纳米颗粒上的核酸的量可以大于约20重量％。在各个实施方式中，相对于纳米颗粒的总质量，在纳米颗粒中的核酸负载可以在约0.1重量％至约55重量％的范围内。例如，相对于纳米颗粒的总质量，其中的核酸负载可以为约0.1重量％至约50重量％，约1重量％至约45重量％，约5重量％至约40重量％，约10重量％至约35重量％，约15重量％至约30重量％，或约20重量％至约20重量％，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在各个实施方式中，相对于纳米颗粒的总质量，在纳米颗粒中的核酸负载为约0.1重量％至约50重量％。

虽然在某些应用中可能可使用部分絮凝的磷酸钙/核酸纳米颗粒悬浮液，但是对于大多数工业应用，期望免于聚集的稳定悬浮液。优选稳定的悬浮液以避免递送设备堵塞并确保均匀沉积和递送。因此，为了避免絮凝，最终的悬浮液中的磷酸钙浓度可以小于200μg/ml。例如，悬浮液中的磷酸钙浓度可以小于约150μg/ml，小于约120μg/ml，小于约100μg/ml，小于约90μg/ml，小于约80μg/ml，小于约70μg/ml，小于约60μg/ml，或小于约50μg/ml。悬浮液中的磷酸钙浓度可以为约1μg/ml至约150μg/ml，约10μg/ml至约100μg/ml，约20μg/ml至约90μg/ml，约30μg/ml至约80μg/ml，约40μg/ml至约70μg/ml，或约50μg/ml至约60μg/ml，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在各个实施方式中，悬浮液中的磷酸钙浓度小于100μg/ml。在各个实施方式中，悬浮液中的磷酸钙浓度小于50μg/ml。

钙相对于总磷酸根离子(即，磷酸盐的磷酸根加上来自核酸的磷酸根)的含量可影响纳米颗粒的稳定性。钙相对于磷酸根离子略微过量对于产生稳定的纳米颗粒悬浮液是可取的。然而，过量过多的钙可能导致纳米颗粒在悬浮液中迅速聚集。悬浮液中的钙与磷的摩尔比(Ca/P)可以在约1.5:1至5:1的范围内，例如约1.6:1至4.5:1、约1.7:1至4:1、约1.8:1至3.5:1、约1.9:1至3:1或约2:1至2.5:1，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在各个实施方式中，磷酸钙悬浮液中的钙与磷的摩尔比为1.5:1至5:1。在各个实施方式中，悬浮液中的钙与磷的摩尔比为约1.7:1。

本技术的悬浮液不仅展现出高的稳定性，而且它们还耐碱性。包盖的纳米颗粒的聚阳离子/核酸复合物可能稳定到高至聚阳离子的pKa值。高于所述pKa，复合物可能解离并释放复合的核酸。耐碱性对于纳米颗粒被递送到昆虫的消化系统的应用来说是重要的，已知昆虫的消化系统是高度碱性的(例如pH>9.0)，并且使核酸经受得住这种恶劣的碱性环境仍具有挑战性。本文所述的悬浮液有利地具有耐碱性。

所述稳定的水性悬浮液还可以包括本领域已知以及本文所列的添加剂。合适的添加剂包括但不限于：核酸酶抑制剂、表面活性剂、润湿剂、UV吸收剂、抗氧化剂、防冻剂、防腐剂、着色剂、杀虫剂、杀真菌剂、引诱剂、驱避剂和流变改性剂。除非另有提及，否则添加剂的量基于悬浮液中的纳米颗粒的总重量计。当存在时，悬浮液可以包含约0.01重量％至约5重量％的添加剂。

所述组合物的混杂纳米颗粒具有窄的粒度分布和最佳的流体动力学直径。更窄的粒度范围对应于更均匀的粒度分布。流体动力学直径一般略大于颗粒的几何直径，这是因为其既包括本身的粒度又包括包围颗粒的溶剂化壳。纳米颗粒的峰值粒度小于约500nm，例如，小于约450nm，小于约400nm，小于约350nm，小于约300nm，小于约250nm，小于约200nm，小于约150nm，小于约100nm，或小于约50nm。纳米颗粒的峰值粒度可在约20nm至约500nm的范围内，例如，约50nm至约500nm，约100nm至约400nm，约150nm至约300nm或约200nm至约250nm，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在各个实施方式中，纳米颗粒的峰值粒度在50nm至500nm的范围内。在各个实施方式中，纳米颗粒的峰值粒度在50nm至100nm的范围内。

所用的CaP与核酸比值可以影响核酸的结合或包封的程度以及纳米颗粒悬浮液的稳定性。在核酸大大过量的情况中，认为一些核酸保持未被结合，因此纳米颗粒的稳定性降低。纳米颗粒中的磷酸钙与核酸的重量比在约100:1至1:1.5的范围内，包括但不限于约80:1至1:1.2，约50:1至1:1，约20:1至2:1，或约10:1至5:1，约2:1至1:1，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在各个实施方式中，CaP与核酸的重量比为约2:1。在所述比值时，磷酸钙/核酸展现出高的稳定性，并且几乎全部的给定核酸可以被捕获在纳米颗粒中。

对于CaP/核酸/包盖剂混杂纳米颗粒，用这三种组分的比值来表达的质量负载比(有效负载，payload)为使得所有的核酸与CaP或包盖剂缔合。因此，为了最大程度地结合核酸，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸与包盖剂的重量比在约2:1:2至约2:5:2的范围内，包括但不限于约2:1.5:2至约2:4.5:2、约2:2:2至约2:4:2、约2:2.5:2至约2:3.5:2、或约2:2.7:2至约2:3:2，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在各个实施方式中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸与包盖剂的重量比为约2:1:2至约2:5:2。

为了向颗粒提供足够高的正电荷以赋予悬浮液可接受的胶体稳定性，N/P比值(其中，N是聚阳离子中的带正电的氮原子数目，并且P是核酸的磷原子数目)可以高于1，例如，高于5或者甚至高于10。当在最终pH时的ζ电位高于+10mV时，例如，高于+20mV时，可以实现这种稳定性。除了有更佳的悬浮稳定性之外，正电荷能够使颗粒粘着于带负电的细胞膜，这是内在化过程(内吞)的先决条件。在各个实施方式中，聚阳离子中的带正电荷的氮原子数目与核酸中的磷原子数目的比值大于1。

虽然本文所述的水性悬浮液可以原样使用，但是其也可以有利地被结合在乳液或多重乳液中。乳液可以是油包水型乳液或多重乳液。多重乳液的实例包括双重乳液，例如水包油包水型(W/O/W)乳液。还可使用其他单一或多重乳液。W/O/W乳液表示双重乳液，其中包封了水(W)滴的油(O)滴分散在水(W)中。W/O/W乳液易于用水稀释以递送合适量的核酸。不希望囿于理论，推测包封了水性悬浮液的油滴可对核酸提供额外的保护以免受核酸酶影响。这种双重乳液广泛地用于生物杀虫剂应用。最终的外相是水，并且可以通过添加更多的水作为稀释剂来简单地稀释产物。含有颗粒悬浮液的内相通过中间油相得到保护。含有纳米颗粒水性悬浮液的油滴粘附于疏水性表面，例如，植物或作物应用中的叶片表面。

虽然本文所述的实施方式针对的是核酸，但是所述纳米颗粒可以用于包含其他合适的治疗剂或药剂，其可以包括用于治疗或预防任何给定疾病或病症或者用于调节人或动物对象中的生理状况的任何化合物或物质。在一些实施方式中，治疗剂可以包括抗生素、抗真菌剂、肽、蛋白质、聚合物或其组合。在一些实施方式中，纳米颗粒可以包括除包含在其中的核酸之外的治疗剂。

方法

各种方法可以用于产生本文所述的纳米颗粒、组合物、悬浮液和乳液。例如，本技术提供了简单的方法来制备耐碱性的磷酸钙/核酸纳米颗粒的悬浮液，相对于颗粒的总质量，所述纳米颗粒展现出极高的核酸负载量(例如，0.1至50重量％)。悬浮液的制备依赖于单步过程，其中，在磷酸钙沉淀的过程中，大量的核酸至少部分被包封在纳米颗粒内侧。

本技术的方面涉及用于在无包盖剂的情况下产生磷酸钙和核酸的纳米颗粒的方法。在各个实施方式中，用于制备纳米颗粒的方法包括：共沉淀磷酸钙和核酸。现在参考图1，其例示了用于制备CaP/核酸悬浮液的基本过程的示例性示意流程图。如图所示，可以使用本领域已知的钙盐和磷酸盐来制备磷酸钙。在各个实施方式中，所述方法包括：向钙盐溶液或磷酸盐溶液添加核酸，将盐溶液或混合溶液的pH调节到合适的值，以及将钙盐溶液与所述磷酸盐溶液混合以形成磷酸钙-核酸纳米颗粒。

磷酸钙纳米颗粒的形成以及CaP颗粒生长的动力学受钙盐和磷酸盐的浓度、温度和pH驱使。如图1所示，在混合前，可以使用缓冲溶液独立地调节钙盐溶液和/或磷酸盐溶液的pH，所述钙盐溶液和磷酸盐溶液中的至少一者具有核酸。替代性地，盐溶液——其中的至少一者具有核酸——可以首先经过混合，然后可以将pH调节至期望值。相应地，共沉淀过程在高于6且低于9的pH下进行，例如，在7至8之间的pH下进行。如果pH低于6，则仅可获得很少的颗粒，而在pH超过9时，可能难以控制颗粒的生长。在各个实施方式中，钙盐溶液的pH为约7.5。在各个实施方式中，磷酸盐溶液的pH为约7.5。

混合期间的温度可以为约1℃至70℃，包括但不限于约1℃至70℃，约5℃至60℃，约10℃至50℃，约15℃至40℃，或约20℃至30℃，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。在室温下形成纳米颗粒所需的时间可以为几秒至几分钟。合适的反应或混合时间可以为约5s至约10分钟，包括但不限于约8s至约5分钟、约10s至约1分钟、约20s至约2分钟、或约30s至约1分钟，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。

所述方法因此提供了在要负载的核酸的存在下，由钙盐和磷酸盐自发形成磷酸钙纳米颗粒，从而得到高度稳定的磷酸钙/核酸纳米颗粒悬浮液。通过单步过程，在磷酸钙的形成期间存在的核酸变成被包封在CaP颗粒中。在一方面，所述方法提供了一种悬浮液，其包括水性介质，在其中悬浮有纳米颗粒，所述纳米颗粒由嵌在磷酸钙中的感兴趣的核酸(例如RNA)制成。由于核酸提供的颗粒的表面负电荷，这种由不具有任何外涂层的CaP/核酸纳米颗粒制造的悬浮液展现出高度稳定性，并且可以原样递送或施用于植物、动物或昆虫。

本技术的另一方面涉及用于在有包盖剂的情况下产生磷酸钙和核酸的混杂纳米颗粒的方法。在各个实施方式中，用于制备纳米颗粒的方法包括：共沉淀磷酸钙和核酸，以及用合适的包盖剂包盖CaP/核酸颗粒。现在参考图2，其例示了用于制备具有聚阳离子包盖(外层)的核酸负载的纳米颗粒的方法的示例性示意流程图以及得到的混杂纳米颗粒的理想化视图。如图所示，CaP/核酸颗粒的悬浮液可以参考上图1所述制备，并且可以使用合适的包盖剂进一步包盖得到的颗粒。例如，可以将包盖剂(或其盐)的溶液缓慢加入到CaP/DNA颗粒悬浮液中。可以用合适的溶剂(例如水)混合并进一步稀释所述悬浮液。在各个实施方式中，所述方法包括：向钙盐溶液或磷酸盐溶液添加核酸，将盐溶液或混合溶液的pH调节到合适的值，使钙盐溶液与所述磷酸盐溶液混合以形成磷酸钙-核酸纳米颗粒，以及向纳米颗粒添加包盖剂溶液以展示出混杂的CaP/核酸/包盖剂纳米颗粒悬浮液。在各个实施方式中，由于与包盖剂的结合，包盖方法能够使核酸至少被部分包封在磷酸钙纳米颗粒中和/或涂覆到纳米颗粒的表面上。

用于制备磷酸钙的合适的钙盐和磷酸盐在本领域中是已知的并且可用于本技术的方法。示例性的钙盐包括但不限于氯化钙、硝酸钙、乙酸钙和乳酸钙。示例性的磷酸盐包括但不限于磷酸三钠、磷酸三钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸铵和磷酸氢铵。

基于快的生成动力学，可以使用流动反应器大规模且低成本来有利地制备核酸/磷酸钙纳米颗粒的悬浮液，以满足市场需求。可以用于本技术方法的示例性反应器包括但不限于间歇式反应器、半间歇式反应器、连续流动反应器、先进流动反应器、流化床反应器及其组合。图8和9分别描绘了合适的反应器的实例，例如流动反应器和先进流动反应器。

在另一方面中，本文提供了用于在连续流动反应器中制备混杂纳米颗粒的悬浮液的方法。所述方法包括：向钙盐溶液或磷酸盐溶液中的一种添加核酸；使钙盐溶液流到流动反应器的第一进口中；使磷酸盐溶液流到流动反应器的第二进口中，以使磷酸盐溶液物流与钙盐溶液物流混合并产生流自所述反应器的磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒物流；以及从所述反应器收集并处理包含磷酸钙-核酸纳米颗粒的悬浮液。在某些方面中，所述方法还可以包括：使包盖聚合物溶液流到流动反应器的第三进口中，以使包盖聚合物物流与磷酸钙物流混合而产生流自所述反应器的聚合物包盖、包封有核酸的磷酸钙物流。

可以利用纳米颗粒表面的ζ电位改变来研究核酸在纳米颗粒表面上的结合或者包盖剂在纳米颗粒表面上的结合。ζ电位的改变指示了配体结合到表面或表面涂层。ζ电位是纳米颗粒上的表面电荷的量度，并且可以影响悬浮液中的颗粒的稳定性和聚集。在各个实施方式中，纳米颗粒被构造成其具有某种材料，在处于有效地将核酸结合到CaP基质内侧的pH水平时，该材料具有低的ζ电位。对于具有包盖剂的颗粒，由于纳米颗粒表面上的涂层，纳米颗粒显示出高的ζ电位。例如，CaP/核酸颗粒可以展现出负电荷，而CaP/核酸/包盖剂可展现出正电荷。在各个实施方式中，纳米颗粒的ζ电位为约-50至约50毫伏(mV)，包括-50mV至约0mV，-40mV至约0mV，约-30mV至约0mV，约-20mV至约0mV，约-10mV至约0mV，约0mV至约10mV,0mV至约20mV，约0mV至约30mV，约0mV至约40mV，约0mV至约50mV，约-10mV至约10mV,-15mV至约15mV，约-20mV至约20mV，约-25mV至约25mV，约-30mV至约30mV，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。

通过本技术的方法形成的纳米颗粒悬浮在液体介质中，例如水、醇、烃和油。纳米颗粒的平均或中值粒度可以在约30nm至约250nm的范围内，包括约40nm至约200nm，约50nm至约150nm，约60nm至约100nm，约70nm至约80nm，或者包括和/或介于这些数值中的任何两个数值之间的任何范围。

本文所述的纳米颗粒组合物和悬浮液可以递送给各种类型的细胞。容许核酸递送的任何类型的细胞可以用作本技术的转换目标。实例包括但不限于昆虫细胞、动物细胞和胚胎、真菌、鱼、酵母和植物细胞。稳定的水性悬浮液可以用作植物检疫组合物的部分以用于防控有害生物。例如，稳定的悬浮液可以用于保护作物不受昆虫侵害，在这种情况中，核酸是杀虫性双链RNA。使用干扰核糖核酸(RNA)分子，所述组合物和悬浮液可以用于预防和/或控制植物的有害生物侵扰。本技术的包含干扰RNA分子的组合物和组合以例如杀虫剂的形式局部施用。

本技术的方面涉及保护作物不受昆虫侵害的方法，所述方法包括：向作物给予本文所述的包含纳米颗粒的组合物或悬浮液。在各个实施方式中，所述方法包括：保护作物不受半翅目(hemiptera)、鞘翅目(coleoptera)、蚤目(siphonaptera)、网翅目(dichyoptera)、鳞翅目(lepidoptera)、直翅目(orthoptera)和双翅目(diptera)的侵害。可以使用本领域已知的各种方法向作物给予所述组合物，例如，喷洒、滴给或灌溉。在这些方法中，所述组合物中的核酸可以包含杀虫性双链核糖核酸。

本技术的另一个方面涉及用于下调害虫物种中的靶基因的表达，以预防和/或控制害虫侵扰的方法，所述方法包括使所述害虫物种与有效量的本文所述的混杂纳米颗粒的组合物或悬浮液接触，所述纳米颗粒包含至少一种干扰核糖核酸(RNA)。合适的干扰RNA在本领域中是已知的，例如，如第WO2012143542A1号PCT公开中所述，所述文献通过引用全文纳入本文。在某些实施方式中，本技术涉及使用含RNAi的纳米颗粒组合物来防控有害生物的方法，其涉及将不含任何保护的裸RNA简单地局部施用在植物表面上，例如，叶片表面上。

本技术的另一个方面涉及一种玻璃容器，其包含有本文所述的组合物和水性悬浮液。可以使用适于容纳液体材料并且对所述组合物和悬浮液惰性或不与之反应的任何玻璃容器。示例性的玻璃容器包括玻璃瓶、玻璃小瓶、玻璃桶、玻璃囊、玻璃缸、玻璃罐、玻璃球等。

本技术的组合物和悬浮液有利地提供了磷酸钙/核酸纳米颗粒，其中，包围核酸的无机材料是磷酸钙，所述颗粒在中性和碱性pH时稳定，并且在酸性pH时迅速溶解。因此，所述颗粒在环境中以及在昆虫肠道中存在的碱性介质中稳定，从而在某种程度上保护了核酸，但是在内体pH下迅速溶解，从而在目标昆虫的细胞内释放核酸。运载核酸(例如杀虫性RNA)的亚微米级颗粒易被目标有害生物的消化道的细胞吸收。在没有添加任何聚阳离子的情况下，混杂磷酸钙/核酸纳米颗粒中负载的核酸量(也被称为有效负载)可以高于30重量％，这显著高于本领域已知方法所提供的量。因此，可以最大程度地减少要喷洒在田地上的无机运载体的量，因为较低量的运载体将能够递送有效量的杀虫剂量。相比于现有技术所述的简单的表面吸附，用于本技术的共沉淀方法能够实现显著更高的核酸负载。事实上，吸附在载体表面上的核酸量仍有限，例如，小于1重量％，即使当使用亚微米尺寸的颗粒时也如此。在本技术所用的共沉淀方法的情况中，核酸被大量地捕获在复合结构内侧，而不是仅在运载体的表面处。发明人发现，在颗粒形成期间捕获了超过90％的核酸，这提供了高的包封收率，并且避免了浪费昂贵的核酸。当将聚阳离子(例如PEI)施涂到核酸/磷酸钙颗粒的表面上时，收率几乎达到100％，这是因为在共沉淀过程期间，聚阳离子能够捕获未结合的核酸。形成运载体的磷酸钙材料是完全生物相容、可生物降解、无毒以及非免疫源性的，并且由安全且廉价的试剂(例如钙盐和磷酸盐)制备，因此简化了生产并降低了生产成本。当用于作物保护时，除了其有害生物的防控作用，核酸/磷酸钙颗粒可以被认为是潜在的肥料，因为它们是磷源。颗粒的亚微米尺寸促进了在酸性环境中快速溶解，因此有利于磷的可利用性。本技术的方法能够制备稳定的悬浮液(即，免于聚集)以用于植物检疫组合物。该稳定的悬浮液可含有至少20μg/ml的双链核酸(例如RNA)，其通常是使用RNA干扰进行作物保护所需的。负载的颗粒及其悬浮液可稳定数周并且可以原样喷洒或包含到乳液中来喷洒到植物上。

对本领域的技术人员显而易见的是，可以在不偏离所要求保护的主题的精神或范围的情况下进行各种修改和变动。因此，所要求保护的主题不受所附权利要求书及其等同形式以外的任何内容所限。

实施例

将通过以下实施例进一步阐明各个实施方式，这些实施例绝不旨在将本公开限于此。

实施例1：稳定的核酸/CaP纳米颗粒悬浮液的制备

在玻璃小瓶中加入718.6μl的纯H₂O，500μl的溶液HEPES(50mM,pH 7.5)，其含有7.5mM Na₃PO₄，以及31.4μl的10mg/ml的已剪切的鲑鱼精ds-DNA。然后在剧烈搅拌下滴加在超纯(UP)水中的含有pH为7.5的1150μl的10mM Tris HCl和100μl的62.5mM CaCl₂的第二混合物。总体积为2500μl。通过将2,500μl制备好的颗粒悬浮液加入到10,000μl超纯水中，立即稀释颗粒悬浮液。最终体积为12,500μl。基于进料计，该溶液理论上含有628μg的磷酸钙和314μg的DNA。因此，理论核酸负载为约33重量％。最终的悬浮液中的核酸浓度为约24μg/ml，并且磷酸钙的理论浓度为48μg/ml。所得的稳定悬浮液由平均流体动力学直径为49nm且平均ζ电位为-11mV的颗粒制成。

使用马尔文(Malvern)公司的Zetasizer Nano分析仪来提供水性悬浮液的粒度表征，所述分析仪通过动态光散射(DLS)技术来确定颗粒的流体动力学直径。图3示出了DLS图表，其显示出通过在没有任何聚阳离子的情况下共沉淀制备的CaP/DNA颗粒的尺寸，在没有任何CaP的情况下由DNA和PEI聚阳离子络合得到的多聚复合物的尺寸，以及最后通过共沉淀制备但是具有PEI包盖的颗粒的尺寸。该图表清楚地显示出CaP/DNA/PEI颗粒具有最大的流体动力学直径，并且明显比简单的DNA/PEI多聚复合物的更大。该图表还显示出可以实现窄的粒度分布。图4是示出了无任何核酸负载的磷酸钙(CaP)颗粒，负载DNA的磷酸钙(CaP/DNA)颗粒和被PEI聚阳离子包盖的磷酸钙/核酸(CaP/DNA/PEI)颗粒的ζ电位的条形图。这些颗粒分别表现出中性电荷、负电荷和正电荷。

悬浮液随着时间而展现出有限的稳定性。图5例示的图表显示了由核酸和CaP制成的核酸运载体颗粒CaP/DNA[2:1]在酸性pH、中性pH和碱性pH时的尺寸，并且下表2归纳了在各种pH条件下粒度随着时间的变化。数据显示出核酸运载体在酸性pH时迅速溶解，而在中性和碱性pH时不溶解。

表2：

作为比较例，重复相同的方案，但是在颗粒形成后不稀释悬浮液。所得到的悬浮液含有125μg/ml的核酸和215μg/ml的磷酸钙。观察到所获得的稳定悬浮液由平均流体动力学直径为220nm且平均ζ电位为-26mV的颗粒制成。尽管有高的ζ电位，但是悬浮液显示出粒度迅速增加，超过10μm，如图7所示。

实施例2：稳定的核酸/CaP纳米颗粒悬浮液的放大制备

重复实施例1，但是所有量均乘以5，以显示出可以放大纳米颗粒的形成而对所获得的粒度或表面电荷不会有显著影响。获得了稳定的悬浮液并且颗粒具有相同尺寸和相同表面电荷。

实施例3：稳定的PEI包盖的核酸/CaP纳米颗粒悬浮液的制备

在玻璃小瓶中加入718.6μl的纯H₂O，500μl的溶液HEPES(50mM,pH7.5)，其含有7.5mM磷酸三钠Na₃PO₄，以及31.4μl的10mg/ml的已剪切的鲑鱼精ds-DNA作为ds-RNA的替代物。然后在剧烈搅拌下，在先前的溶液中滴加在超纯(UP)水中的含有pH为7.5的1150μl的10mM Tris HCl和100μl的62.5mM CaCl₂的第二混合物。接着，将购自聚合科学股份有限公司(Polysciences,Inc.，美国宾夕法尼亚州沃灵顿市)的628μl的在水中的pH为7的1μg/μl直链PEI盐酸盐(由Mw 25,000，目录号为23966-1的PEI制备并根据供应商方案转化成其氯化物盐)滴加到CaP/DNA颗粒悬浮液中。获得的总体积为3,128μl。

通过在搅拌下将3,128μl制备好的颗粒悬浮液加入到12,512μl超纯水中，立即稀释颗粒悬浮液。最终体积为15,640μl。该溶液含有628μg的磷酸钙和314μg的DNA以及628μg的PEI。观察到颗粒组合物的CaP/DNA/PEI比值为2:1:2。因此，该颗粒中的理论核酸负载为20重量％。最终的悬浮液中的核酸浓度为约20μg/ml，PEI的浓度为约40μg/ml，并且磷酸钙的理论浓度为约40g/ml。观察到所获得的稳定悬浮液由流体动力学直径为约155nm且ζ电位为+22mV的颗粒制成。该悬浮液随着时间展现出极高的稳定性，并且在至少20天后不显示出颗粒生长的任何迹象。

作为比较例，重复相同的方案，但是在颗粒形成后不马上稀释悬浮液。所得到的悬浮液含有100μg/ml的核酸，200μg/ml的磷酸钙和200μg/ml的PEI。

图6例示的图表显示了由核酸、CaP和PEI外层制成的核酸运载体颗粒CaP/DNA/PEI[2:1:2]在酸性pH、中性pH和碱性pH时的尺寸，并且下表3归纳了在各种pH条件下粒度随着时间的变化。

表3：

该悬浮液显示出粒度快速增加超过10μm，如图7所示。观察到所获得的稳定悬浮液由流体动力学直径为164nm且ζ电位为+22mV的颗粒制成。尽管有高的ζ电位，但是悬浮液显示出在RT下贮存5天后，粒度迅速增加，超过10μm，如图7所示。下表4概括了根据实施例1和3制备的未稀释和稀释的组合物的粒度、ζ电位和悬浮液稳定性。

表4：

实施例4：以连续模式制备稳定的PEI包盖的核酸/磷酸钙纳米颗粒悬浮液

使用如图8的方案中所示的反应器装置，以连续模式制备稳定的PEI包盖的核酸/磷酸钙纳米颗粒悬浮液。简单来说，使用双注射器输注泵，并且通过两个PFA1/16"OD管将所述泵连接到由PEEK制成的Y形连接器，来制备小型管式流动反应器。Y形连接器的出口连接到PFA 1/16"OD管以收集悬浮液。第三注射器放置在下游并通过第二Y形连接器连接。用含有718.6μl的纯H₂O，500μl的溶液HEPES(50mM,pH 7.5)，其含有7.5mM Na₃PO₄，以及31.4μl的10mg/ml的已剪切的鲑鱼精ds-DNA的溶液填充第一注射器(总体积容量＝1.5ml)。用在超纯水中的1150μl的pH为7.5的10mM Tris HCl和100μl的62.5mM CaCl₂填充第二注射器。用628μl的1μg/μl的Mw为25,000的直链PEI盐酸盐填充第三注射器。以合适的速率递送试剂，从而得到150-200nm粒度的纳米颗粒。

或者，也可使用其他类型的微通道反应器，例如康宁股份有限公司(CorningInc.)的先进流动反应器(AFR)，来以连续模式制备稳定的PEI包盖的核酸/磷酸钙纳米颗粒悬浮液，如图9所示。

实施例5：核酸捕获测量

通过在将悬浮液在13000rpm/4℃下离心60分钟后，测量上清液在260nm时的光密度来估计共沉淀过程中的核酸捕获效率。在每个测试样品中添加100μl的880μg/ml CaCl₂，以使悬浮液失去稳定(证明这样加入CaCl₂不会诱导裸核酸发生任何沉淀)。空白为仅DNA而没有任何CaP。使用0至125μg/ml的各种DNA浓度来制作校准曲线。假设前体生成Ca₅(PO₄)₃(OH)，通过用根据盐前体浓度计算到的所形成的CaP的理论量，以及根据OD值确定的捕获的核酸的量，间接估算混杂纳米颗粒中负载的核酸的重量％，即，有效负载。在PEI包盖的颗粒的情况中，将PEI的量与CaP和核酸的量相加来计算运载体的总质量。下表5概括了共沉淀之前和之后，样品中的核酸(DNA)的浓度。结果显示，在磷酸钙沉淀期间捕获了大多数的核酸。

表5：

使用不同的质量比，例如，0:1:0,2:1:0,2:1:2，确定CaP/dsDNA/PEI的质量负载比值(有效负载)。

实施例6：混杂CaP/DNA/PEI纳米颗粒的细胞摄取的测量

为了显示负载在新型混杂CaP/DNA/PEI纳米颗粒中的核酸可以被细胞内在化并且该核酸仍具有功能，根据实施例3制备CaP/DNA/PEI[2:1:2]颗粒，但是用相同量的编码绿色荧光蛋白(GFP)的GFP质粒代替10重量％的鲑鱼精DNA，即31.4μg。将500K个细胞接种到在4ml培养基(RPMI+10％FBS+PS+Glu)中的6W细胞结合板的每个孔中，并使其附着和生长一天。然后更换培养基，并且将相当于5.1μg总DNA，以及0.51μg质粒的悬浮液体积加入到孔中。在将颗粒悬浮液加入到细胞单层后一天，收获细胞并且通过流式细胞术确定绿色荧光蛋白(GFP)的表达。图10a和10b分别示出了使用纳米颗粒运载体被GFP质粒转染的细胞的荧光以及未添加任何转染剂的具有HEK 293T细胞的阴性对照的荧光。结果显示，超过65％的细胞表达GFP，这证明了本技术的负载核酸的混杂颗粒被内在化并且发生了转染，而阴性对照显示出无荧光。

实施例7：稳定的PEI包盖的核酸/磷酸钙纳米颗粒悬浮液的制备

重复实施例3所述的过程，但是DNA的量适于实现[2:2:2]的Cap/DNA/PEI质量比。观察到所获得的稳定悬浮液由流体动力学直径为约197nm的颗粒制成。该悬浮液展现出随着时间有优异的稳定性并且不显示出任何絮凝迹象。

实施例8：不同DNA浓度的稳定的PEI包盖的核酸/磷酸钙纳米颗粒悬浮液的制备

重复实施例3所述的过程，但是Cap/DNA/PEI质量比变化到2:1:2、2:2:2、2:3:2、2:4:2、2:5:2、2:7.5:2、2:10:2和2:20:2。

使用0.8％琼脂糖凝胶，使得到的混合物经受凝胶电泳。如图11所示，随着核酸的量相对于CaP和PEI增加，底部带的针对游离DNA的强度变得更强，表明一些DNA未结合。在2:1:2至2:5:2时观察到核酸与CaP/PEI完全结合。该比值对应于20重量％至55重量％的DNA负载。在这些比值时，所有核酸与CaP/PEI缔合，因此未留下游离DNA沿凝胶向下迁移。

实施例9：稳定的dsRNA/磷酸钙[2:1]纳米颗粒悬浮液的制备

重复实施例1的过程，但是使用dsRNA替代dsDNA。由不含核酸酶的水制备缓冲液，并且在使用前进行高压蒸气处理。根据良好的实验室操作规程操作，以防止核酸酶污染。为了证明具有各种尺寸的dsRNA可以被结合到颗粒中，使用具有21至500个碱基对的退火双链RNA片段。制备的混杂颗粒的理论dsRNA负载为约33重量％。最终的悬浮液中的核酸浓度为约24μg/ml，并且磷酸钙的理论浓度为48μg/ml。观察到所获得的稳定悬浮液由流体动力学直径为120nm且ζ电位为-18mV的颗粒制成。

实施例10重量比为[2:4]的稳定的dsDNA/磷酸钙纳米颗粒悬浮液的制备

重复实施例1，但是CaP与DNA的重量比为2:4。在图12所示的SEM显微照片中描绘了由dsDNA/磷酸钙/PEI[2:4:0]制备的纳米颗粒(处于干燥状态)的形态。

实施例11使用聚(甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯)(PDMAEMA)替代PEI制备稳定的dsDNA/磷酸钙/聚阳离子[2:1:2]纳米颗粒悬浮液。

重复实施例3的过程，但是使用PDMAEMA[Mn 33.000，购自聚合物源公司(PolymerSource Inc.)]替代直链PEI。在进行共沉淀过程之前，使用盐酸将1μg/μl PDMAEMA溶液的pH调整到7.2。通过DLS测量时所获得的颗粒展现出195nm的流体动力学直径，并且ζ电位为+21mV。

实施例12使用支链PEI制备稳定的dsDNA/磷酸钙/聚阳离子[2:1:2]纳米颗粒悬浮液

重复实施例3的过程，但是使用支链PEI[通过LS得到的平均Mw～25,000，通过GPC得到的平均Mn～10,000，购自西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)]替代直链PEI。颗粒展现出156nm的流体动力学直径和+28mV的ζ电位。图13A和13B示出了在两种放大倍数下的SEM显微照片，其显示了由dsDNA/磷酸钙/PEI[2:1:2]制备的纳米颗粒的形态和尺寸(干燥状态)。颗粒的平均尺寸为52nm，并且它们具有均匀的尺寸分布。

实施例13稳定的dsRNA/磷酸钙/PEI[2:1:2]纳米颗粒悬浮液的制备

重复实施例3的过程，但是类似于实施例9所述，使用dsRNA替代dsDNA。对于稀释的溶液，[2:1:2]比值时的颗粒中的理论核酸负载因此为20重量％。最终的悬浮液中的dsRNA浓度为约20μg/ml，PEI的浓度为约40μg/ml，并且磷酸钙的理论浓度为约40g/ml。观察到所获得的稳定悬浮液由流体动力学直径为约188nm且ζ电位为+24mV的颗粒制成。

还如实施例10所述制备悬浮液，但是未稀释(注：“浓”或“conc”代表浓缩)。为了证明所有的dsRNA均被结合，使用0.8％琼脂糖凝胶对获得的悬浮液进行凝胶电泳。如图14所示，对于所述2:1:2比值，显示出dsRNA与CaP/PEI完全结合。在这些比值时，所有核酸与CaP/PEI缔合，因此未留下游离DNA沿凝胶向下迁移。该比值对应于20重量％的dsRNA负载。

除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法不应理解为其步骤需要按具体顺序进行，或者要求使任何设备具有特定取向。因此，如果方法权利要求没有实际叙述其步骤要遵循的顺序，或者任何设备权利要求没有实际叙述各组件的顺序或取向，或者权利要求书或说明书中没有另外具体陈述步骤限于具体顺序，或者没有叙述设备组件的具体顺序或取向，那么在任何方面都不应推断顺序或取向。这适用于解释上的任何可能的非表达性基础，包括：涉及步骤安排的逻辑问题、操作流程、组件的顺序或组件的取向问题；由语法组织或标点派生的明显含义问题和说明书中描述的实施方式的数量或类型问题。

所公开的范围应理解为包含任何及所有子范围或各个范围包含的任何和所有的单个值，并且为描述这些子范围或单个值的权利要求提供支持。例如，陈述的1至10的范围应被理解为在最小值1与最大值10之间的任何及所有子范围或者它们之间的单个值(包括和/或不包括端点)，并且为描述这些子范围或单个值的权利要求提供支持；也即，以最小值1或更大的数值开始并以最大值10或更小的数值结束的所有子范围(例如5.5至10、2.34至3.56等)或者1至10的任何值(例如3、5.8、9.9994等)。任何列出的范围无疑可以被认为是进行了充分的描述，并且能够使同样的范围分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性实例，本文所讨论的每个范围可以容易地被分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还应理解的是，所有语言如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”以及类似语言包括所述的数字并且指代可以随后被分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解的是，范围包括各单独的成员。因此，例如，具有1-3个层的组指代具有1、2或3个层的组。类似地，具有1-5个层的组指代具有1、2、3、4或5个层的组，以此类推。

附图应被解释为例示了按比例绘制的一个或多个实施方式和/或未按比例绘制的一个或多个实施方式。这意味着附图可被解释为，例如，示出的：(a)所有事物均按比例绘制，(b)所有事物均未按比例绘制，或(c)一个或多个特征按比例绘制而一个或多个特征未按比例绘制。因此，附图可单独或彼此组合地为描述任何例示的特征的大小、比例和/或其他尺寸提供支持。此外，所有这些大小、比例和/或其他尺寸应被理解为可在任一个方向上变化0-100％，并因此对描述这些数值或者可由这些数值形成的任何及所有范围或子范围的权利要求提供支持。

权利要求中所述的术语应当通过参考广泛使用的通用词典和/或相关技术词典中的相关条目，本领域技术人员通常理解的含义等来确定它们的普通和惯用含义，并且应理解为，由这些来源中的任何一个或组合所赋予的最广泛的含义(例如，应组合两个或更多个相关词典的条目以提供条目组合的最广泛含义等)仅受以下例外的约束：(a)如果术语的使用方式比其普通和惯用含义更广泛，则该术语应具有其普通和惯用含义加上额外的扩展含义，或(b)如果术语已明确定义为通过在术语后面的短语“本文件中使用的术语应意为”或类似的语言(例如，“该术语意为”、“该术语定义为”、“出于本公开的目的，该术语是指”等等)来描述该术语，则该术语明确定义为具有不同的含义。提到具体实例时使用的“即”、词语“技术”等并不意味着援引例外情况(b)或以其他方式来限制所述的要求保护的术语的范围。除了例外情况(b)所适用的情形外，本文件中的任何内容均不应视为放弃或拒绝权利要求的范围。

除非另外定义，本文中所使用的所有术语(包括科技术语)的含意与本技术所属领域普通技术人员通常所理解的相同。还应理解，术语，诸如在常用词典中定义的术语，应被解释为具有与其在本申请和相关领域上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义解释，除非本文明确定义。虽然下文没有明确定义，但是应当根据其通常含义理解这类术语。

另外，当按照马库什群(Markush group)描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员应认识到，本公开还可由此按照所述马库什群的任意单独组成部分或组成部分的子群描述本发明。

需要具体说明的是，除非另有说明，否则本文描述的本技术的各个特征可以以任意组合方式使用。此外，本公开还考虑了在一些实施方式中，可以排除或省略本文所示的任何特征或特征的组合。举例说明，如果说明书指出复合体包含组分A、B和C，其具体旨在说明A、B或C中任意一种或其组合可以被省略并且单独或以任意组合方式排除。

除非以其他方式明确地指出，所有特定的实施方式、特征和术语旨在包括所述实施方式、特征或术语及其生物学等同物。

本文所引用或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物(包括所有附图和表格)均通过引用全文并入本文，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾即可。

Claims (34)

1.一种组合物，其包括纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒包括核酸，所述核酸至少部分被包封在包含磷酸钙的基质中。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述核酸包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其衍生物。

3.如权利要求1所述的组合物，其还包括包盖剂，所述包盖剂至少部分涂覆纳米颗粒或渗透纳米颗粒，或者既涂覆纳米颗粒又渗透纳米颗粒。

4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述包盖剂包括聚阳离子。

5.如权利要求3所述的组合物，其中，聚阳离子选自下组：多胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、聚亚烷基亚胺、壳聚糖、寡肽、阳离子化多糖、阳离子化植物蛋白或阳离子化动物蛋白、鱼精蛋白、二乙基氨基乙基-葡聚糖，聚酰胺型胺类、聚(β-氨基酯)、氨基多糖、聚甲基吖丙啶、聚烯丙胺、聚乙烯胺均聚物或共聚物、聚(乙烯基吡啶)均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酸酯均聚物或共聚物、聚(甲基)丙烯酰胺均聚物或共聚物及其衍生物。

6.如权利要求3所述的组合物，其中，所述聚阳离子是聚乙烯亚胺。

7.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒的峰值粒度小于500nm。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，纳米颗粒的峰值粒度在50nm至500nm的范围内。

9.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸的重量比为100:1至1:1.5。

10.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒中的磷酸钙与核酸与包盖剂的重量比为2:1:2至2:5:2。

11.如权利要求1所述的组合物，其中，聚阳离子的带正电荷的氮原子数目与核酸的磷原子数目的比值大于1。

12.如权利要求1所述的组合物，其中，纳米颗粒悬浮在pH为6至11的水性分散体中。

13.一种稳定的水性悬浮液，其包含如权利要求1所述的组合物。

14.如权利要求13所述的稳定的水性悬浮液，其中，相对于纳米颗粒的总质量，核酸负载为约0.1重量％至约50重量％。

15.如权利要求13所述的稳定的水性悬浮液，其中：

(i)悬浮液中的磷酸钙浓度小于100μg/ml；或

(ii)磷酸钙悬浮液中的钙与磷的摩尔比为1.5:1至5:1。

16.如权利要求14所述的稳定的水性悬浮液，其还包括添加剂，所述添加剂选自下组：核酸酶抑制剂、表面活性剂、润湿剂、UV吸收剂、抗氧化剂、防冻剂、防腐剂、着色剂、杀虫剂、杀真菌剂、引诱剂、驱避剂和流变改性剂。

17.一种保护作物免受害虫侵害的方法，所述方法包括给予作物如权利要求1所述的组合物。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述组合物中的核酸包含杀虫性双链核糖核酸。

19.如权利要求17所述的方法，其中，所述方法包括：保护作物不受半翅目、鞘翅目、蚤目、网翅目、鳞翅目、直翅目和双翅目的侵害。

20.一种用于生产混杂纳米颗粒的方法，所述方法包括：

将核酸添加到位于反应器中的钙盐溶液或磷酸盐溶液中的一种中；

将所述钙盐溶液和磷酸盐溶液的pH调节到约6至约9；以及

将所述钙盐溶液与所述磷酸盐溶液混合以形成磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒。

21.如权利要求20所述的方法，其还包括：将聚阳离子溶液添加到所述混合溶液中。

22.如权利要求20所述的方法，其中：(i)钙盐选自下组：氯化钙、硝酸钙、乙酸钙和乳酸钙；或(ii)磷酸盐选自下组：磷酸三钠、磷酸三钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸铵和磷酸氢铵。

23.如权利要求20所述的方法，其中，所述核酸至少部分被包封在磷酸钙纳米颗粒中。

24.如权利要求20所述的方法，其中，混杂纳米颗粒的峰值粒度在50nm至500nm的范围内。

25.如权利要求20所述的方法，其中，钙盐溶液或磷酸盐溶液的pH为约7.5。

26.一种在连续流动反应器中制备混杂纳米颗粒的悬浮液的方法，所述方法包括：

将核酸添加到钙盐溶液或磷酸盐溶液中的一种中；

使钙盐溶液流到流动反应器的第一进口中；

使磷酸盐溶液流到流动反应器的第二进口中，以使磷酸盐溶液物流与钙盐溶液物流混合并产生流自所述反应器的磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒物流；

从所述反应器收集并处理包含磷酸钙-核酸混杂纳米颗粒的悬浮液。

27.如权利要求26所述的方法，其还包括：使包盖聚合物溶液流到流动反应器的第三进口中，以使包盖聚合物物流与磷酸钙物流混合而产生流自所述反应器的聚合物包盖、包封有核酸的磷酸钙物流。

28.如权利要求27所述的方法，其还包括：从所述反应器收集并处理聚合物包盖、包封有核酸的磷酸钙。

29.如权利要求26所述的方法，其中，纳米颗粒的ζ电位为-50至50毫伏。

30.如权利要求26所述的方法，其中，纳米颗粒的中值粒度在30nm至250nm的范围内。

31.如权利要求26所述的方法，其中，纳米颗粒悬浮在液体介质中。

32.一种油包水(W/O)型乳液，其包括如权利要求1所述的组合物。

33.一种水包油包水(W/O/W)型双重乳液，其包括如权利要求1所述的组合物。

34.一种玻璃容器，其包含如权利要求1所述的组合物，或者含有权利要求1的组合物的稳定的水性悬浮液。

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