CN1863555A - 操作哺乳动物中抗原特异性抗体的水平的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了增加哺乳动物中自身抗原特异性IgM抗体的水平，并因此减少哺乳动物中循环自身抗原的水平的组合物和方法。使用这些自身抗原特异性IgM抗体，本发明提供了改善哺乳动物自身免疫性疾病的组合物和方法。在一个方面，本发明提供了增加哺乳动物中抗原特异性IgG抗体的水平，并因此减少哺乳动物中循环抗原的水平的组合物和方法。通过使用这些抗原特异性IgG抗体，本发明提供了改善哺乳动物疾病和状况例如癌症或外来抗原诸如病原体的组合物和方法。

Description

操作哺乳动物中抗原特异性抗体的水平的组合物和方法
技术领域
[0001]本发明涉及免疫学和医学领域。在一个方面，本发明提供增加哺乳动物中自身抗原-特异性IgM抗体的水平，并因此减少哺乳动物中循环自身抗原(circulating autoantigen)的水平的组合物和方法。通过使用这些自身抗原-特异性IgM抗体，本发明提供了改善哺乳动物自身免疫疾病的组合物和方法。在一个方面，本发明提供增加哺乳动物中抗原-特异性IgG抗体的水平，并因此减少哺乳动物中循环抗原的水平的组合物和方法。通过使用这些抗原-特异性IgG抗体，本发明提供了改善哺乳动物疾病或状况，例如癌症或外来抗原诸如病原体的组合物和方法。
背景技术
[0002]自身免疫性指免疫系统成分与正常或异常的自我的某些反应活性。免疫系统最重要的功能之一是去除由持续破损的细胞产生的细胞残骸。如果由持续破损的细胞产生的胞质内高分子量(MW)的物质得以积聚在循环中，那么就可能产生针对自己的毒性和/或致病性自身抗体反应。CD5+细胞的产物，自身抗原-特异性IgM，能够帮助去除/代谢胞质内自身抗原，以帮助维持对自身的耐受性。天然发生的IgM抗体参与去除组织降解产物。特异性循环IgM抗-组织抗体已经发现存在于处于疾病状态里的人中，在所述疾病状态中发生有细胞降解现象，例如抗-心脏抗体发现于患有心急梗塞的患者中，发现于某些肝病中，以及灼伤损伤之后。因此，由对颗粒性亚细胞组分具有特异性的IgM抗体组成的限制型免疫应答(restricted formof immune response)可以存在于正常个体中。
[0003]细胞死亡，例如因毒性损害、组织缺氧等引起的细胞死亡之后，隐蔽性自身抗原(cryptic autoantigens)会暴露于免疫系统。隐蔽性自身抗原可以被释放到组织空间、血液、尿、内脏等中，在其中，它们可以启动IgM抗体应答，然后被去除和/或分解代谢掉。如果隐蔽性自身抗原因暴露于修饰剂(化学试剂、毒性试剂、感染性试剂等)而被修饰，那么这些修饰的自身抗原将作为外来物质而被识别，并随后发生致病性IgG应答。这会对目标器官产生直接的损害，或通过免疫复合物产生间接损害，免疫复合物例如由修饰/未修饰的抗原和停留在肾小球、其他血管、结缔组织和类似物中的致病性IgG抗体组成。
发明概述
[0004]本发明提供了增加哺乳动物中自身抗原-特异性IgM抗体的水平的方法和组合物，包括下述步骤：(a)提供包括未修饰的自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对于所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(b)以足以增加个体中抗原-特异性IgM抗体的水平的量给予所述哺乳动物以组合物。本发明提供了减少哺乳动物中循环自身抗原的水平的方法和组合物，包括下述步骤：(a)提供包括未修饰的自身抗原和抗原-特异性多价抗体的组合物，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(b)以足以增加个体中抗原特异性IgM抗体的水平，进而减少所述哺乳动物中循环自身抗原的水平的量给予所述哺乳动物以组合物。本发明提供了改善哺乳动物自身免疫疾病的方法和组合物，包括下述步骤：(a)提供包括未修饰的自身抗原和抗原-特异性多价抗体的组合物，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(b)以足以减少所述哺乳动物中循环自身抗原的水平，进而改善所述哺乳动物自身免疫疾病的量给予所述哺乳动物以组合物。在可选择的方面，通过改善所述方法能够治疗的自身免疫疾病，减轻自身免疫疾病的严重性，减缓或预防自身免疫疾病的发作，和/或减缓自身免疫疾病的进展。在一个方面，哺乳动物是人。
[0005]在可选择的方面，用于本发明方法和组合物的多价抗体包括具有三价、四价、五价或更多的价的实体(entities)。在一个方面，多价抗体包括IgM。在可选择的方面，多价抗体包括多个抗原-结合部分，即多-抗原结合位点，包括多-片段，子序列(subsequences)、互补决定区(CDRs)，它们保留了与抗原结合的能力，包括多-(i)Fab片断，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片断；(ii)F(ab’)2片断，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片断的二价片断；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片断；(iv)由抗体的一个臂(a single arm)的VL和VH结构域组成的Fv片断；(v)由VH结构域组成的dAb片断(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，和/或(vi)分离出的互补决定区(CDR)。在一个方面，多价抗体包括多-单链抗体。
[0006]在一个方面，用于本发明方法和组合物的多价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。多价抗体可以包括嵌合抗体，例如人源化的抗体。在一个方面，多价抗体包括在转基因小鼠中产生的人抗体。转基因小鼠可以包括人免疫球蛋白基因座(locus)。用于本发明任何方法和组合物的多价抗体可以包括在能够产生人抗体的转基因非人动物，诸如小鼠中产生的人抗体，例如如美国专利5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318所述。
[0007]在一个方面，在制备包括自身抗原和抗原-特异性多价抗体的组合物时，在给药之前即刻将未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合；或在给药之前约1分钟至2小时或更长时间之间，将未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合；或在给药之前约5分钟至1小时之间，将自身抗原与所述多价抗体所述混合；或在给药之前约10分钟至30分钟之间，将自身抗原与所述多价抗体所述混合。
[0008]在一个方面，在制备包括自身抗原和抗原-特异性多价抗体的组合物时，未修饰的自身抗原与多价抗体混合，并将所述混合物冷冻-干燥。在给药时，冷冻干燥的混合物可以重构成制剂，用于给药。冷冻干燥的混合物可以保存在约-20℃和4℃之间的温度中。冷冻干燥的混合物重构在水制剂中，诸如无菌蒸馏水，或缓冲盐水，例如PBS、林格氏溶液(Ringer’s)和类似物中。
[0009]在一个方面，用于本发明方法和组合物的自身抗原包括纯化的自身抗原。自身抗原可以包括重组的和合成的多肽。自身抗原可以包括可溶性抗原或颗粒性抗原。自身抗原可以包括小分子量的抗原，例如具有约0.1至10kd或约0.5至5kd之间的分子量；或自身抗原可以包括大分子量的抗原，例如具有在约5至50kd或约10至25kd之间的分子量。
[0010]在一个方面，用于本发明方法和组合物的自身抗原包括参与自身免疫应答的自身抗原。自身抗原可以包括肾小管致肾炎抗原(kidney tubular nephritogenicantigen)、肾小球致肾炎抗原(glomerular nephritogenic antigen)、子宫内膜repro-EN-1.0抗原(endometrial repro-EN-1.0 antigen)、子宫内膜IB1抗原(endometrial IB1 antigen)、谷氨酸脱羧酶、核仁ASE-1抗原(nucleolar ASE-1antigen)、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、转醛缩酶(transaldolase)、髓鞘碱性蛋白、70kD线粒体胆汁自身抗原(70kD mitochondrial biliary autoantigen)、人软骨糖蛋白39、人Sp17蛋白或人胎盘Hp-8。用于本发明方法和组合物的自身抗原还可以包括参与自身免疫应答的多种自身抗原。
[0011]在一个方面，自身抗原包括参与自身免疫应答的亚细胞组分(subcellularfraction)、细胞、组织或器官。细胞或组织可以包括亚细胞组分、细胞或组织匀浆或细胞、组织或器官提取物。在一个方面，亚细胞组分、细胞、组织或器官包括肾近端小管(renal proximal tubule)或肾近端曲小管(renal proximal convolutedtubule)或其亚细胞组分。自身免疫应答可以包括对肾小球基膜(kidney glomerularbasement membrane)自身抗原或肾近端曲小管抗原的自身免疫应答。
[0012]在一个方面，自身免疫疾病包括自身免疫肾病，诸如被动海曼氏肾炎(passive Heymann nephritis)、狼疮性肾炎或膜性肾病(membranous nephropathy)。在可选择的方面，自身免疫疾病包括类风湿关节炎、重症肌无力、子宫内膜异位、自身免疫胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、自身免疫甲状旁腺功能减退症、多发性硬化症(MS)、原发性胆汁性肝硬变症(PBC)、自身免疫溶血性贫血症、接触敏感性皮炎(contactsensitivity dermatitis)、自身免疫发泡性紊乱(autoimmune blistering disorders)(例如寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮(bolus pemphigoid))、自身免疫不孕症、自身免疫性阿狄森病、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎或硬皮病。
[0013]在一个方面，以摩尔为基础，存在于组合物中的自身抗原比所述多价抗体多约1％至1000％。例如，在可选择的方面，以摩尔为基础，存在于所述组合物中的自身抗原比多价抗体多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。在一个方面，包括等摩尔量的多价抗体和抗原的可供选择的制剂可以用于实施本发明。在一些方面，制剂的维持剂量只需等摩尔的多价抗体和抗原制剂。
[0014]在可选择的方面，本发明的药物组合物和用于本发明方法的组合物可以包括约1μgm至500mg或更多数量之间的抗原和合适数量的抗体(二价或多价抗体)，以维持抗原的摩尔数超过抗体。在其他方面，本发明的药物组合物和用于本发明方法的组合物可以包括约0.1mg至10mg之间或0.1mg至1.0mg之间的抗原和合适数量的抗体，以维持抗原的摩尔数超过抗体。在一个方面，组合物包括约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合适数量的抗体，以维持抗原的摩尔数超过抗体。在一个方面，用于本发明方法或组合物的抗体(二价或多价抗体)具有已知的滴度(titer)(对抗原来说)。
[0015]在可选择的方面，本发明的药物组合物和用于本发明方法的组合物可以通过任何途径，例如肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。在一个方面，组合物一天一次、一天两次、或一天三次给药。组合物可以一周约一次至两次给药。组合物可以最初一周两次给药，给药约3周，然后每周一次给药，给药约5个月，然后每月一次给药。在一个方面，一旦免疫系统被调整(tuned)为对注射的本发明复合物产生应答，那么仅仅注射自身抗原也能维持特异性免疫应答(尽管在较低的免疫应答水平)。
[0016]本发明提供了药物组合物，其包括(i)未修饰的自身抗原和抗原-特异性多价抗体，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体天然来自所述哺乳动物或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔量存在于组合物中；和(ii)药学上可接受的赋形剂。在可选择的方面，用于本发明的药物组合物和方法的多价抗体包括具有三价、四价、五价或更多价的实体。在一个方面，多价抗体包括IgM。在可选择的方面，多价抗体包括多-抗原结合部分，即多抗原结合位点，包括多-片段、子序列、互补决定区(CDRs)，其保留了与抗原结合的能力，包括多-(i)Fab片断，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片断；(ii)F(ab’)2片断，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片断的二价片断；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片断；(iv)由抗体的一个臂的VL和VH结构域组成的Fv片断；(v)由VH结构域组成的dAb片断(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，和/或(vi)分离出的互补决定区(CDR)。在一个方面，多价抗体包括多-单链抗体。在一个方面，用于本发明方法和组合物的多价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。多价抗体可以包括嵌合抗体，例如人源化的抗体。在一个方面，多价抗体包括在转基因小鼠中产生的人抗体。转基因小鼠可以包括人免疫球蛋白基因座。用于本发明的任何药物组合物和方法的多价抗体可以包括由能够产生人抗体的转基因非人动物，诸如小鼠产生的人抗体，例如如美国专利5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318所述。在一个方面，多价抗体包括IgM。在一个方面，多价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。在一个方面，用于本发明药物组合物的多价抗体包括人源化的抗体。
[0017]本发明提供药物组合物和制备它们的方法，所述的制备包括在给药之前即刻混合未修饰的自身抗原和多价抗体。在一个方面，在给药之前约1分钟至2小时之间，将未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合，或在给药之前约5分钟至1小时之间，将自身抗原与多价抗体混合；或在给药之前约10分钟至30分钟之间，将自身抗原与多价抗体混合。
[0018]本发明提供药物组合物和制备它们的方法，所述的制备包括冷冻干燥或冻干自身抗原和抗原-特异性多价抗体的混合物。混合物可以是新鲜的混合物，或如上所论述，在未修饰的自身抗原和多价抗体混合物被冷冻干燥或冻干之间可以经历一段时间(延迟)。给药时，冷冻-干燥的混合物可以重构成制剂，用于给药。冷冻-干燥的混合物可以保存在约-20℃和4℃之间的温度中。冷冻-干燥的混合物可以重构在水制剂中，例如无菌蒸馏水或缓冲盐水或类似物中。
[0019]本发明提供了药物组合物，其包含纯化或分离出的自身抗原、或包括重组或合成的多肽的自身抗原。自身抗原包括可溶性抗原或颗粒性抗原，或小分子量抗原，例如具有约0.1至10kd或约0.5至5kd之间的分子量(MW)；或自身抗原可以包括大分子量抗原，例如具有约5至50kd或约10至25kd之间的MW。
[0020]本发明提供了包括参与自身免疫应答的自身抗原的药物组合物。自身抗原可以是任何已知的自身抗原，或新的自身抗原，其用常规的筛选方法确定。在可选择的方面，自身抗原包括肾小球基膜抗原、肾小管致肾炎抗原、肾小球致肾炎抗原、子宫内膜repro-EN-1.0抗原、子宫内膜IB1抗原、谷氨酸脱羧酶、核仁ASE-1抗原、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、转醛缩酶、髓鞘碱性蛋白、70kD线粒体胆汁自身抗原、人软骨糖蛋白39、人Sp17蛋白、人胎盘Hp-8。
[0021]在一个方面，本发明的药物组合物还可以包括参与一种或多种自身免疫应答的的单一自身抗原(single autoantigen)或许多不同的自身抗原。在一个方面，自身抗原包括参与自身免疫应答的亚细胞部分、细胞、组织或器官。在一个方面，所述细胞或组织包括亚细胞部分、细胞或组织匀浆或细胞、组织或器官提取物。所述亚细胞部分、细胞、组织或器官可以包括肾近端小管或肾近曲小管或其亚细胞部分。自身免疫应答可以包括针对肾小球基膜自身抗原或肾近曲小管抗原的自身免疫应答。自身免疫应答包括自身免疫肾病，诸如被动海曼肾炎、狼疮性肾炎或膜性肾病。自身免疫应答可以包括任何自身免疫疾病，例如类风湿关节炎、重症肌无力、子宫内膜异位、自身免疫胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征、自身免疫甲状旁腺功能减退症、多发性硬化症(MS)、原发性胆汁性肝硬变症(PBC)、自身免疫溶血性贫血症、接触性敏感性皮炎、自身免疫发泡性紊乱(例如寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、团块状类天疱疮)、自身免疫不孕症、自身免疫性阿狄森病、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病。
[0022]在本发明的药物组合物的一个方面，以摩尔为基础，存在于组合物中的自身抗原比所述多价抗体多约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。本发明的药物组合物可以包括约1μgm至500mg或更多数量之间的抗原和合适数量的抗体，以维持抗原的摩尔数超过抗体。在一个方面，本发明的药物组合物和用于本发明方法的组合物可以包括约0.1mg至10mg之间，或0.1mg至1.0mg之间的抗原和合适数量的抗体，以维持抗原的摩尔数超过抗体。在一个方面，组合物包括约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合适数量的抗体，以维持抗原的摩尔数超过抗体。
[0023]在一个方面，本发明的药物组合物可以配制成通过任何途径给药，例如通过肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。在一个方面，本发明的药物组合物一天一次、一天两次、或一天三次给药。在一个方面，本发明的药物组合物一周约一次至两次给药。在一个方面，本发明的药物组合物可以最初一周两次给药，给药约3周，然后每周一次给药，给药约5个月，然后每月一次给药。
[0024]在一个方面，本发明的药物组合物作为无菌液体制剂进行配制，例如无菌盐水、PBS、林格氏溶液和类似物，用于例如注射、灌输、喷雾和类似给药方式。
[0025]本发明提供了增加哺乳动物中抗原-特异性IgG抗体的水平的方法，包括下述步骤：(a)提供包括修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体的组合物，其中所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(b)以足以增加个体中抗原-特异性IgG抗体的水平的量给予所述哺乳动物组合物。本发明提供了减少哺乳动物中循环抗原的水平的方法，包括下述步骤：(a)提供包括修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体的组合物，其中所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(b)以足以增加个体中抗原-特异性IgG抗体的水平，进而减少所述哺乳动物中循环抗原的水平的量给予所述哺乳动物组合物。本发明提供了改善哺乳动物疾病或状态的方法，包括下述步骤：(a)提供包括修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体的组合物，其中所述抗原与疾病或状态有关，所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(b)以足以增加哺乳动物中抗原-特异性二价抗体的水平，进而改善所述哺乳动物疾病或状态的量给予所述哺乳动物组合物。本发明提供了药物组合物，包括(i)修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体，其中所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔量存在于组合物中；和(ii)药学上可接受的赋形剂。在一个方面，哺乳动物是人。
[0026]在可选择的方面，用于本发明方法和组合物的二价抗体包括IgG或IgA。在可选择的方面，二价抗体包括两个抗原结合部分，即二价抗原结合位点，包括二价片段、子序列、互补决定区(CDRs)，其保留了结合抗原的能力，包括二价(i)Fab片断，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片断；(ii)F(ab’)2片断，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片断的二价片断；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片断；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片断；(v)由VH结构域组成的dAb片断(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，和/或(vi)分离出的互补决定区(CDR)。在一个方面，抗体包括二价单链抗体。
[0027]在一个方面，用于本发明方法和组合物的二价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。二价抗体可以包括嵌合抗体，例如人源化的抗体。在一个方面，二价抗体包括在转基因鼠中产生的人抗体。转基因鼠可以包括人免疫球蛋白基因座。用于本发明任何药物组合物和方法的二价抗体可以包括由能够产生人抗体的转基因非人动物，诸如鼠产生的人抗体，例如如美国专利5,939,598；5,877,397；5,874,299；5,814,318所述。在一个方面，二价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。
[0028]在一个方面，用于本发明方法和组合物的二价抗体通过包括在给药之前即刻混合修饰的抗原和二价抗体的方法而制备。在可选择的方面，用于本方法的组合物(例如，药物组合物)或本发明的组合物通过这样的方法制备，该方法包括在给药之前约1分钟至2小时之间，将修饰的抗原与抗体(例如二价抗体或多价抗体)混合，或在给药之前约10分钟至1小时之间，混合修饰的抗原与二价抗体；或在给药之前约30分钟至1小时之间，混合修饰的抗原与二价抗体；
[0029]在一个方面，用于本方法的组合物(例如，药物组合物)或本发明的组合物通过包括冷冻干燥或冻干修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体的方法而制备。在给药时，冷冻干燥的混合物可以重构成制剂，用于给药。冷冻干燥的混合物可以保存在约-20℃和4℃之间的温度中。冷冻干燥的混合物可以重构在水制剂中，诸如无菌蒸馏水，或缓冲盐水，例如PBS、林格氏溶液和类似物中。
[0030]在用于本方法的组合物(例如药物组合物)或本发明组合物的一个方面，抗原包括纯化或分离的抗原；或抗原包括重组和合成的多肽；或抗原包括可溶性抗原或颗粒性抗原；或自身抗原包括小分子量抗原，例如具有约0.1至10kd或约0.5至5kd之间的MW；或自身抗原包括大分子量抗原，例如具有约5至50kd或约10至25kd之间的MW。
[0031]在用于本方法的组合物(例如药物组合物)或本发明组合物的一个方面，抗原包括癌症-特异性抗原或对增生细胞或组织具有特异性的抗原。抗原可以包括外来抗原(foreign antigen)，例如细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、酵母抗原或原生动物抗原。抗原可以包括亚细胞部分、细胞、组织或器官。细胞或组织可以包括亚细胞部分、细胞或组织匀浆或细胞、组织或器官提取物。癌症可以是黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、乳癌、肺癌或胃癌。外来抗原可以包括来自病原体或感染性疾病媒介物(infectious disease agent)的抗原。所述来自病原体或感染性疾病媒介物的抗原可以包括细菌抗原、病毒抗原或来自原生动物的抗原，例如来自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(E.coli)、流感病毒、甲型、乙型或丙型肝炎或疟疾的抗原。
[0032]在用于本方法的组合物(例如药物组合物)或本发明组合物的一个方面，以摩尔计算，存在于组合物中的修饰的抗原比二价抗体多约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。在一个方面，组合物包括约0.1mg至10mg之间的抗原和合适数量的二价抗体，以保持抗原的摩尔数超过二价抗体；或组合物包括约0.1mg至1.0mg之间的抗原和合适数量的二价抗体，以维持抗原的摩尔数超过二价抗体；或组合物包括约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合适数量的二价抗体，以维持抗原的摩尔数超过抗体。
[0033]在一个方面，组合物(例如药物组合物)通过肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。组合物可以一天一次、一天两次、或一天三次或更多次给药。组合物可以一周约一次至两次给药。组合物可以最初一周两次给药，给药约3周，然后每周一次给药，给药约5个月，然后每月一次给药。在一个方面，一旦通过注射本发明的复合物，免疫系统被调整为对修饰的抗原适当地产生应答，那么仅仅注射修饰的抗原也能维持特异性免疫应答(尽管免疫应答水平较低)。在一个方面，为了维持高水平的特异性循环IgG抗体，通过依照微微过量的抗原，持续注射本发明的合适的复合物，免疫系统的细胞受到比平时更多的刺激。例如，当癌细胞被消除或在数量上减少时，或实体肿瘤退化或转移性癌症位点消失或减少时，和/或感染终止时，或自身免疫疾病或状态被改善时，本发明合适的复合物的给药频率可以减少，和/或可以给予较少剂量的本发明合适的复合物。癌症是否成功得到改善可以通过常规的程序测定，例如实验室试验，包括活组织检查、特异性血清分析、成像方法(例如X-射线、超声波扫描图、MRI)和类似方法。病原体或感染性病是否成功得到改善可以通过常规的程序测定，例如征兆、症状的存在与否、实验室检查和类似方法。
[0034]在一个方面，用于本方法的组合物(例如药物)或本发明组合物，包括无菌水制剂，诸如无菌蒸馏水或缓冲盐水，例如PBS、林格氏溶液和类似物。
[0035]在一个方面，用于本方法的组合物(例如药物)或本发明组合物包括佐剂。在一个方面，组合物与佐剂一起给药。佐剂可以包括明矾或弗氏佐剂。
[0036]在一个方面，用于本方法的组合物(例如药物)或本发明组合物是修饰的抗原，例如来自病原体、疾病源和类似物的修饰抗原。在一个方面，用于本发明方法或组合物的修饰的抗原与“耐受的”或“天然的”蛋白质有足够的不同以致于被识别为外来物，然而也足够地相似以致于它能够与耐受的蛋白质交叉反应。然而，本发明不受限于任何特定的作用机制，为了让给药的(例如注射的)抗原(例如蛋白质)激发免疫应答，并从而终止无应答性状态(unresponsive state)(耐受)，抗原必须与“耐受的”蛋白质足够不同以致于被识别为外来物。在一个方面，抗原也足够相似，以致于它能够与耐受的蛋白质交叉反应。
[0037]抗原可以用半抗原修饰。抗原可以在体外用各种小MW物质半抗原化，以获得半抗原-蛋白质偶联物，诸如对氨基苯基砷酸(arsanil)-蛋白质、对氨基苯磺胺(sulfanil)-蛋白质、对氨基苯基砷酸-对氨基苯磺胺蛋白质和类似物。在一个方面，免疫-复合物制备成抗原的摩尔数微微超过特异性高滴度的二价抗体(例如IgG、IgA、融合的单链Abs或CDRs)，所述二价抗体是针对所述抗原。
[0038]半抗原-修饰的抗原可以包括半抗原-蛋白质结合体。半抗原-蛋白质结合体可以包括对氨基苯基砷酸-蛋白质结合体、对氨基苯磺胺-蛋白质结合体或对氨基苯基砷酸-对氨基苯磺胺蛋白质结合体。
[0039]本发明一个或多个方面的细节阐述在下面的附图和说明书中。通过阅读说明书和附图和权利要求书后，本发明其他的特征、目标和优点将会显而易见。
[0040]在此引用的所有出版物、专利、专利申请、GenBank序列和ATCC保藏物均在此明确引入，可用作所有目的的参考。
附图描述
[0041]图1以图示出了实验和对照动物中的蛋白尿(proteinuria)，如在下面实施例1中详细描述。
[0042]在不同附图中同样的标记符号表示同样的元素。
发明详述
[0043]本发明提供了控制哺乳动物免疫系统的新型方法。在一个方面，本发明提供了增加哺乳动物中自身抗原-特异性IgM抗体的水平的组合物和方法。通过增加哺乳动物中自身抗原-特异性IgM抗体的水平，减少自身抗原的水平，包括减少可溶性或循环形式的自身抗原。利用这些自身抗原-特异性IgM抗体，本发明提供了改善——包括预防或治疗——自身免疫疾病的组合物和方法。在一个方面，本发明的组合物和方法可以用于改善——包括预防或治疗——同种异体移植物排斥，例如组织、器官或细胞(例如骨髓)移植排斥。
[0044]在一个方面，本发明提供了增加哺乳动物抗原-特异性IgG抗体的水平的组合物和方法。增加哺乳动物中抗原-特异性IgG抗体的水平可减少自身抗原的水平，包括减少哺乳动物中可溶的，或循环形式的抗原。使用这些抗原-特异性IgG抗体，本发明提供了改善哺乳动物疾病或状态，例如癌症或外来抗原诸如病原体的组合物和方法。所述组合物和方法可以用于治疗或预防疾病或状态。
[0045]尽管本发明不限于任何特定的作用机制，本发明的方法部分地基于这样的新发现：当胞质内抗原被释放时(例如细胞破坏之后)，那么将会立即产生特异性IgM抗体，并在清除细胞残骸中发挥生理作用。哺乳动物，包括人，对胞质内颗粒性抗原无耐受性。自身免疫系统的这种武器是生理性的，并因此对个体是有利的，其通过提供最有效的清除机制来去除不想要的、被破坏的细胞成份，而不想要的、破坏的细胞成份在因损伤、感染、创伤、组织缺氧引起的细胞死亡后产生，或细胞生命周期结束之后产生。
通用技术
[0046]本发明提供了包括分离的、重组的或合成的自身抗原、抗体和抗原的组合物。可以被用来实施本发明的核酸，例如基因组DNA、质粒、病毒或它们的杂交子，可以分离自各种来源，遗传工程化的、扩增的、和/或表达的/重组产生的。由这些核酸产生的重组多肽(例如自身抗原、抗体、抗原)可以单独分离或克隆并测试需要的活性。可以使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
[0047]可替代地，用于实施本发明的核酸和多肽可以用已知的化学合成技术体外合成，诸如描述于下述文献中：Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acids Res.25：3440-3444；Frenkel(1995)Free Radic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry 33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利4,458,066。
[0048]操作核酸的技术，诸如亚克隆、标记探针(使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交和类似技术已在科学和专利文献中充分描述，参见例如Sambrook，ed.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL(2ND ED.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
[0049]本发明提供了包括用于实施本发明的自身抗原、抗体、抗原的融合蛋白质，和编码它们的核酸。本发明的多肽可以融合到异源肽或多肽，诸如N-末端识别肽(N-terminal identification peptides)，其赋予想要的特征，诸如增加的稳定性或简化的纯化。本发明的肽和多肽也可以作为在其上连接有一个或多个额外的结构域的融合蛋白质而被合成和表达，用于例如产生更具免疫原性的肽、制备修饰的抗原、更容易地分离重组合成的肽(例如抗原)、鉴定和分离抗体和表达抗体的B细胞和类似用途。
[0050]有助于检测和纯化的结构域包括例如金属螯合肽(metal chelating peptides)诸如使得可以在固定化金属上进行纯化的多组氨酸(polyhistidine tracts)和组氨酸-色氨酸模块(histidine-tryptophan modules)、使得可以在固定化的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域，和用于FLAGS延展/亲合纯化系统的结构域(ImmunexCorp，Seattle WA)。在纯化结构域和包含模体的(motif-comprising)的肽或多肽之间加入可切割的连接序列诸如Xa因子或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)，可帮助纯化。例如，表达载体可以包括编码表位的核酸序列，其连接到六个组氨酸残基，随后是硫氧还蛋白和肠激酶结合位点(参见例如Williams(1995)Biochemistry34：1787-1797；Dobeli(1998)Protein Expr.Purif.12：404-414)。肠激酶切割位点提供了将表位从融合蛋白的残留部分纯化出来的手段，组氨酸残基则帮助检测和纯化。
[0051]转基因非人动物可以被用于产生核酸或多肽(例如自身抗原、抗体、抗原)，由此来实施本发明。转基因非人动物例如可以是山羊、兔、绵羊、猪、牛、大鼠和小鼠。转基因非人动物可以用本领域任何已知的方法设计和产生，参见例如美国专利6,211,428；6，187,992；6,156,952；6,118,044；6,111,166；6,107,541；5,959,171；5,922,854；5,892,070；5,880,327；5,891,698；5,639,940；5,573,933；5,387,742；5,087,571，它们描述了制备和使用转化的细胞和卵细胞以及转基因小鼠、大鼠、兔、绵羊、猪和牛。
[0052]转基因植物和植物细胞可以被用于产生核酸或多肽(例如自身抗原、抗体、抗原)，由此来实施本发明。转基因植物可以被用于产生大量的多肽(例如自身抗原、抗体、抗原)。例如，参见Palmgren(1997)Trends Genet.13：348；Chong(1997)Transgenic Res.6：289-296(使用生长素诱导型的、双向甘露氨酸合成酶(mas1′，2′)启动子和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘转化方法，在转基因马铃薯植物中转产生人乳蛋白β-酪蛋白)。使用已知的方法，技术人员可以通过检测转基因植物中转基因mRNA或蛋白质的增加或减少来筛选表达本发明的自身抗原、抗体、抗原的植物。检测和量化mRNA或蛋白质的方法是本领域已知的。
[0053]用于实施本发明的多肽或肽(例如自身抗原、抗体、抗原)可以分离自自然来源，可以是合成或重组产生的多肽。肽和蛋白质可以在体外或体内重组表达。用于实施本发明的肽或多肽可以用本领域已知的任何方法来制备和分离。用于实施本发明的多肽或肽也可以用本领域已知的化学方法整体或部分地合成。参见Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.225-232：Banga，A.K.，Therapeutic Peptides and Proteins，Formulation，Processing and Delivery Systems(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA。例如，肽合成可以使用各种固相技术进行(参见例如Roberge(1995)Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)，并可以实现自动化合成，例如依据制造商提供的说明书使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)进行。
[0054]用于实施本发明的肽或多肽也可以进行糖基化。糖基化可以通过化学方法或通过细胞生物合成机制在翻译后加入，其中后者结合使用已知的糖基化模体，其可以天然源自序列或可以作为肽加入，或加入到核酸编码序列中。糖基化可以是O-连接或N-连接。
[0055]用于实施本发明的肽和多肽包括所有“模拟的”和“肽模拟的”形式。术语“模拟的(mimetic)”和“肽模拟的(peptidomimetic)”指具有与本发明的多肽实质上相同的结构和/或功能特征的合成的化学化合物。该模拟物或者完全由合成的非天然的氨基酸类似物组成，或者是由部分天然的肽氨基酸和部分非天然的氨基酸类似物构成的嵌合分子。所述模拟物也可以包括任意数量的天然氨基酸保守取代，只要这样的取代本质上不改变该模拟物的结构和/或活性。用于实施本发明的多肽模拟化合物可以含有非天然结构组分的任何组合。在可供选择的方面，本发明的模拟化合物包括以下三种结构基团中的一种或所有：a)不是天然酰胺键(“肽键”)连接的残基连接基团；b)取代天然发生的氨基酸残基的非天然残基；或者c)诱导二级结构拟态(mimicry)的残基，即是，为了诱导或者稳定二级结构，如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象，等等。各个肽模拟物残基可以通过肽键、其它的化学键或者偶联方式连接，如，通过戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或者N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)连接。可以替代传统的酰胺键(“肽键”)连接的连接基团包括，如，酮基亚甲基(如，-C(＝O)-CH2-代替-C(＝O)-NH-)、氨基亚甲基(CH2-NH)、次乙基、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、retroamide、硫代酰胺或者酯(参见如，Spatola(1983)在Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，第7卷，267-357页，“Peptide Backbone Modifications”MarcellDekker，NY)。
[0056]芳香族氨基酸的模拟物可以通过用以下的取代来产生，如，D-或者L-萘基丙氨酸；D-或者L-苯基甘氨基，D-或L-2thieneyl丙氨酸；D-或者L-1，-2，3-或者4-芘基丙氨酸；D-或者L-3thieneyl丙氨酸；D-或者L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或者L-(2-吡嗪基)-丙氨酸，D-或者L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基丙氨酸；D-p-氟-苯基丙氨酸；D-或者L-p-二苯基苯基丙氨酸；D-或者L-p-甲氧基-二苯基苯基丙氨酸；D-或者L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和，D-或者L-烷基丙氨酸，其中的烷基可以是取代的或者非取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基，戊基、异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基或者非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括，如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。
[0057]酸性氨基酸的模拟物可以通过用以下的取代来产生，如，保持有负电荷的非羧酸氨基酸；(膦酰基)丙氨酸；硫酸化的苏氨酸。羧基侧链(如，天冬氨酰基或者谷氨酰基)也可以通过与碳二亚胺(R′-N-C-N-R′)反应进行选择性的修饰，所述碳二亚胺如1-环己基-3(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3(4-氮-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。天冬氨酰基或者谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基。碱性氨基酸的模拟物可以通过用如，(除了赖氨酸和精氨酸外)鸟氨酸、瓜氨酸、或者(胍基)-乙酸，或者(胍基)烷基-乙酸的取代产生，其中烷基如以上定义。腈衍生物(如，含有取代COOH的CN-部分)可以取代天冬酰胺或者谷氨酰胺。天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基可以脱氨基成为相应的天冬氨酰基或者谷氨酰基。精氨酸残基模拟物可以通过精氨酰基与例如一种或者多种常规试剂在优选为碱性的条件下反应而产生，所述的常规试剂包括如苯乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮或者茚三酮。酪氨酸残基模拟物可以通过酪氨酰基与例如芳香重氮化合物或者四硝基甲烷反应而产生。N-acetylimidizol和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。半胱氨酸残基模拟物可以通过半胱氨酰残基与例如α-卤素乙酸例如2-氯乙酸或者氯乙酰胺和相应的胺反应而产生；得到羧甲基或者羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通过半胱氨酰残基与例如溴代-三氟丙酮、α-溴-β-(5-imidozoyl)丙酸；氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物；甲基2-吡啶基二硫化物；p-氯汞苯甲酸盐；2-氯汞-4硝基苯酚，或者，氯-7-硝基苯并-氧杂-1，3-二唑反应而产生。可以通过赖氨酰基与例如琥珀酸或者其它的羧酸酸酐反应而产生赖氨酸模拟物(和改变氨基末端残基)。赖氨酸和其它的含有α-氨基的残基模拟物也可以通过与亚氨酸酯例如methyl picolinimidate、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基-苯磺酸、O-甲基异脲、2，4，戊二酮的反应，和与乙醛酸的转酰胺基酶催化的反应而产生。甲硫氨酸的模拟物可以通过与例如甲硫氨酸亚砜反应而产生。脯氨酸的模拟物包括，例如，2-哌啶酸、四氢噻唑羧酸、3-或4-羟脯氨酸、脱氢脯氨酸、3-或4-甲基脯氨酸，或者3，3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过组氨酰基与例如二乙基原碳酸酯或者对溴苯甲酰甲基溴化物反应而产生。其它的模拟物包括，例如，由脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用产生的模拟物；由丝氨酰或者苏氨酰的羟基的磷酸化作用产生的模拟物；由赖氨酸、精氨酸和组氨酸的α氨基基团的甲基化作用产生的模拟物；由N-末端胺的乙酰化作用而产生的模拟物；由主链酰胺残基的甲基化或用N-甲基氨基酸取代而产生的模拟物；或者，由C-末端羧基的酰胺化而产生的模拟物。
[0058]用于实施本发明的多肽可以通过天然过程改变，诸如翻译后加工(例如磷酸化作用，酰化作用等)，或通过化学修饰技术改变，得到修饰的多肽。修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、共价连接核黄素、共价连接血红素组分、共价连接核苷酸或者核苷酸衍生物、共价连接脂质或者脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联的环化作用、形成二硫键、去甲基作用、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰基化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、形成GPI锚、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻酰基化作用、氧化作用、聚乙二醇化、蛋白水解过程、磷酸化作用、异戊烯作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸盐化作用，和转移RNA介导氨基酸添加到蛋白质中，如精氨酰化。参见，如，Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed.，W.H.Freeman和Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，11-12页(1983)。
[0059]固相化学肽合成方法也可以用于合成用于实施本发明的多肽或片段，参见例如Merrifield(1963)Am.Chem.Soc.85：2149-2154；Stewart，J.M.and Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Co.，Rockford，Ill，pp.11-12；商业上可利用的实验室肽设计和合成试剂盒，例如Cambridge ResearchBiochemicals。此种商业上可利用的实验室试剂盒通常利用H.M.Geysen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3998(1984)的教导，在多个“杆(rods)”或“针(pins)”的尖端(tips)上合成肽，所有的“杆”或“针”连接到单个板。
抗体和基于抗体的筛选方法
[0060]本发明提供了使用抗体的方法和组合物，抗体包括二价和多价抗体，其分别特异性地结合到癌症或致病性抗原，或自身抗原。用于实施本发明的抗体可以是分离的、合成的或重组的抗体。
[0061]抗体也可以用于免疫沉淀、染色、免疫亲合柱和类似物。如果需要，编码特定抗原的核酸序列可以通过进行免疫，然后分离多肽或核酸、扩增或克隆和表达本发明的多肽而产生。可替代地，这些方法可以用于修饰抗体的结构，例如抗体与抗原(自身抗原、致病性抗原、癌症抗原)的亲和力可以被增加或减少。
[0062]免疫、产生和分离抗体(多克隆和单克隆抗体)的方法是本领域技术人员知道的，并描述于科学和专利文献中，例如参见Coligan，CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)BASIC AND CLINICALIMMUNOLOGY(7th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(2d ed.)Academic Press，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，NewYork。除了使用动物的传统体内方法外，抗体也可以例如使用表达重组抗体结合位点的噬菌体展示文库体外产生。参见例如Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45。
[0063]抗体可以被用于免疫亲合层析程序，以分离或纯化被用于实施本发明的多肽，或测定多肽是否存在于生物样品中。在免疫亲合程序中，抗体被附着到固体支持物，诸如珠或其他柱基质。在一定的条件下，放置蛋白质使之与抗体接触，在所述条件中，抗体特异性地结合到想要的多肽(例如抗原、其他抗体)。洗涤去除未特异性结合的蛋白质之后，洗脱特异性结合的多肽。
[0064]在生物样品中的蛋白质(例如抗原)结合抗体的能力可以使用本领域技术人员熟悉的各种方法中的任何一种来测定。例如，结合可以通过用可检测标记诸如荧光试剂、酶标记或放射性同位素对抗体进行标记来测定。可替代地，抗体与样品的结合可以使用其上具有此种可检测标记的二抗来检测。具体的测定方法包括ELISA测定、夹层测定(sandwich assays)、放射性免疫测定和Western印迹。
[0065]为了制备单克隆抗体，可以使用提供由持续细胞系培养物产生的抗体的任何技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler and Milstein，Nature，256：495-497，1975)、三体瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，Immunology Today 4：72，1983)和EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
[0066]已描述的用于产生单链抗体的技术(参见例如美国专利4,946,778)可以被调整用于产生单链抗体，以用于本发明的方法和组合物。
[0067]如上所述，转基因鼠可以用于表达人或人源化的抗体，用于本发明的方法和组合物。
试剂盒
[0068]本发明提供了试剂盒，其包括组合物，例如本发明的免疫复合物和/或药物。试剂盒可以含有说明性材料，其教导本发明的方法和工业用途，如本文中所述。
自身抗体和自身免疫疾病
[0069]本发明提供了增加哺乳动物自身抗原-特异性IgM抗体水平、降低哺乳动物自身抗原水平和改善自身免疫疾病的方法和组合物。用于本发明的组合物和方法的自身抗原以及它们的由本发明方法所靶向的相应疾病包括，例如：髓鞘碱性蛋白(MBP)和多发性硬化症(MS)；少突细胞糖蛋白、髓鞘碱性蛋白(MBP)和实验性自身免疫性脑炎(experimental autoimmune encephalitis)(EAE)；乙酰胆碱受体和重症肌无力；胰岛素、IA-2抗原、谷氨酸脱羧酶(GAD)和I型糖尿病；甲状腺球蛋白(thyrogobulin)和自身免疫性甲状腺炎；胶原蛋白IV型α3-链(collagen type IVα3-chain)和Goodpasture综合症；核仁纤维蛋白和硬皮病。
[0070]在一个方面，本发明的组合物和方法使用修饰或未修饰的隐性自身抗原，包括隐性自身抗原，和/或显性自身抗原(暴露于免疫细胞，例如循环中的、组织内的血细胞的表面上的自身抗原)。给药之后，修饰的自身抗原被识别为外来物，并启动免疫应答，例如病原性免疫应答，其可以包括体液(IgG)和/或细胞介导的应答。
胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)
[0071]本发明提供了用于改善自身免疫胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的方法和组合物，IDDM为与胰腺的分泌胰岛素的β细胞有关的自身免疫反应。参见例如美国专利6,214,985。本发明的方法和组合物使用与IDDM相关的抗原，包括谷氨酸脱羧酶同工型、胰岛素、羧肽酶H、ICA516和64kD整合膜蛋白、hsp65、若干分泌型粒蛋白(例如胰岛素分泌型粒抗原)、鼠胰岛素分泌型粒抗原(imogen 38)。
[0072]胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)是自身免疫疾病，其因胰腺分泌胰岛素的β-细胞受到破坏而引起。患有IDDM的患者具有胰岛炎，兰格罕氏小岛的淋巴细胞浸润，胰岛特异性Th1淋巴细胞，以及针对胰岛细胞的成份的抗体。
[0073]可以在IDDM动物模型中，使用和测试用于改善IDDM的本发明方法和组合物。动物模型中的IDDM是T细胞介导的，并需要CD8+，I类MHC限制性T细胞和CD4+，II类MHC限制性T细胞的参与。已经证明了MHC II类DR4多态性等位基因和疾病敏感性之间的相关性，这表明应答是由抗原驱动的。
[0074]本发明的方法和组合物使用若干β-细胞蛋白质，它们已被鉴定为IDDM中的抗原，包括两种谷氨酸脱羧酶同工型、胰岛素、羧肽酶H、ICA 516和64kD整合膜蛋白、hsp65、若干分泌型粒蛋白(例如胰岛素分泌型粒抗原)、鼠胰岛素分泌型粒抗原(imogen 38)。这些抗原中的一些已经被发现存在于糖尿病和糖尿病前期个体的血清中。参见例如美国专利6,211,352；6,025,176；5,792,620。
[0075]与GABA能神经元内的谷氨酸脱羧酶GAD具有反应活性的自身抗体存在于大多数患有罕见的神经疾病Stiff Man综合征的患者的血清中。GAD自身抗体阳性的患者具有多内分泌腺自身免疫性(polyendocrine autoimmunity)例如IDDM的频率会增加。在IDDM临床前阶段期间以及在临床IDDM有最近发作的患者中，频频检测到针对胰岛细胞MW 64,000蛋白，或某一种形式的GAD的自身抗体。
系统性红斑狼疮(SLE)
[0076]本发明提供了用于改善系统性红斑狼疮(SLE)的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与系统性红斑狼疮相关的抗原，包括核仁蛋白ASE-1、纤连蛋白、心磷脂、组蛋白H2A-H2B-DNA、KU-DNA蛋白激酶、高尔基体蛋白(golgin)和/或胶原蛋白、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、HP-8。参见例如美国专利6,177,254；6,111,088；5,807,993。
[0077]使用针对核仁蛋白ASE-1的克隆区域产生的抗体的间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence analysis)表明，该蛋白质出现在推断的rDNA转录位点中的核仁的纤维中心处。在细胞分化期间，ASE-1停留在染色体的核仁组织区，在这里它与RNA聚合酶紧密结合。作为自身抗原核仁蛋白，已经发现ASE-1是系统性红斑狼疮(SLE)可靠的血清标记。该发现使得ASE-1用于疾病的临床检测和表征。为了诊断SLE在个体患者中存在与否，可以取血清样品并用克隆的ASE-1蛋白进行筛选，以鉴定含有抗-ASE-1自身抗体的血清。该筛选可以通过使用ELISA测定方法、western印迹技术进行，或通过将抗原结合到微球体并通过流式细胞术鉴定反应性血清而进行。
[0078]针对核糖核蛋白复合物(RNPs)的循环抗体的产生是某些风湿性自身免疫疾病的共同特征。在SLE和密切相关的病症中最常见的抗原包括：Ro/SSA、La/SSB、nRNP和Sm。最初，这些抗体通过使用双向免疫扩散(double immunodiffusion)而被发现，但是近来，已经开发出灵敏的固相测定方法来对自身抗体进行定量。已经发现，Ro/SSA RNA-蛋白质颗粒是目前所有被评测的人细胞的组成成分。
[0079]用于本发明方法和组合物来治疗SLE的另一抗原是HP-8。HP-8转录子在脑、心脏、胎盘、肺、骨骼肌、胰腺组织和肾中被表达。
子宫内膜异位
[0080]本发明提供了用于改善子宫内膜异位的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与子宫内膜异位相关的抗原，例如Repro-EN-1.0，IB1。参见美国专利6,525,187。
[0081]子宫内膜异位是疼痛性病症，其特征是功能性子宫内膜组织异位移植到腹壁和各种器官的外表面上，最常见地，包括是直肠(lower bowel)、卵巢和输卵管。P.Vigano et al.(1991)Fertility and Sterility 56：894。子宫内膜异位具有自身免疫成份。与多种子宫内膜抗原反应的IgG和IgA自身抗体已被记录存在于患有子宫内膜异位的患者中。研究已经显示，结合多种子宫内膜蛋白的循环IgG抗体可以在患有不同程度子宫内膜异位的妇女中被检测到。35％至74％的患者具有子宫内膜蛋白反应活性的血清，参见例如Odukoya(1996)Acta Obstet.Gynecol.Scand.75：927-931；Kim(1995)Am.J.Reprod.Immunol.34：80-87；Odukoya(1995)Hum.Reprod.10：1214-1219。
[0082]Repro-EN-1.0和它的另一种剪接变体IB1被用于本发明的组合物和方法中。诊断患有子宫内膜异位的对象已被发现具有特异性结合Repro-EN-1.0多肽和/或IB1多肽的抗体。这些抗体是子宫内膜异位的高灵敏性和特异性诊断标记。重组Repro-EN-1.0蛋白质和重组IB1蛋白质可用于在免疫测定中检测此类抗体。
获得性甲状旁腺功能低下症(AH)
[0083]本发明提供了用于改善获得性甲状旁腺功能低下症的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与获得性甲状旁腺功能低下症(AH)相关的抗原，包括钙敏感受体(calcium sensing receptor)(CA-SR)。参见例如美国专利6,066,475。
[0084]获得性甲状旁腺功能低下症(AH)反应于70kDa和80kDa的胞质抗原(cytosolic antigen)，以及120-140kDa的膜相关抗原，钙敏感受体(CA-SR)。在许多患有AH的患者中发现甲状旁腺特异性自身抗体，证明了该疾病的自身免疫特性，而CA-SR的反应活性表位定位在它的外部结构域表明，受体的激活能够诱发抑制该疾病中PTH的分泌。
多发性硬化症(MS)
[0085]本发明提供了用于改善多发性硬化症(MS)的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与MS相关的抗原，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、转醛缩酶。参见例如美国专利6,018,021；5,879,909。
原发性胆汁性肝硬变症(PBC)
[0086]本发明提供了用于改善原发性胆汁性肝硬变症(PBC)的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与原发性胆汁性肝硬变症(PBC)相关的抗原，包括线粒体抗原。参见例如美国专利5,891,436。
[0087]原发性胆汁性肝硬变症(PBC)是慢性疾病，特征为肝内胆管的进行性炎症性阻塞。该疾病的特点是针对线粒体的自身抗体应答，这最初用免疫荧光鉴定。特异性蛋白已经被认为是PBC的抗线粒体抗体(AMA)的目标。特别地，针对70千道尔顿(kd)蛋白的血清抗体在超过95％的PBC患者中发现，但在患有其他自身免疫肝病的患者中没有被发现。
类风湿关节炎(RA)
[0088]本发明提供了用于改善类风湿关节炎的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与类风湿关节炎(RA)相关的抗原，包括II型胶原质、骨桥蛋白(osteopontin)、蛋白多糖、纤连蛋白(fibronectin)、葡萄糖-6-磷酸异构酶、角蛋白、高尔基体蛋白(golgin)、HC gp-39。参见例如美国专利5,869,093；5,843,449。
[0089]本发明提供了用于涉及佐剂性关节炎(AA)的研究的方法和组合物，佐剂性关节炎是炎症性关节疾病的实验模型，例如类风湿关节炎的模型。佐剂性关节炎通过皮内注射处于油中的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MT)的悬浮液而被诱发。注射之后10至15天，动物患上严重的进行性关节炎。
[0090]由于它与人类类风湿关节炎在临床和组织病理学特征上的相似性，AA已被用作模型，来研究免疫介导的关节疾病的机制，和来研究治疗器官特异性自身免疫疾病的方法，并可以用于确定本发明方法和组合物中的制剂和剂量等。
[0091]人软骨糖蛋白39(HC gp-39)是RA患者中的目标自身抗原，其激发特定T细胞，从而引起或介导炎症性过程。HC gp-39衍生的肽主要被来自RA患者的自身反应性T细胞识别，但是很少被来自正常供体的T细胞识别，因而表明HC gp-39是RA中的自身抗原。
自身免疫不孕症
[0092]本发明提供了用于改善自身免疫不孕症的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与自身免疫不孕症相关的抗原，包括哺乳动物Sp 17蛋白质。参见例如美国专利5,820,861。
自身免疫性阿狄森病
[0093]本发明提供了用于改善自身免疫性阿狄森病的方法和组合物。本发明的方法和组合物使用与自身免疫性阿狄森病相关的抗原，包括肾上腺自身抗体。参见例如美国专利5,705,400。
[0094]肾上腺自身抗体的表位观察到的分子量为约50,000至约60,000，通过下述方法获得：使肾上腺均质化，对匀浆进行差异离心以获得微粒体部分，将微粒体部分悬浮在磷酸盐缓冲液中，在胆酸钠存在下离心悬浮液形成上清液，将聚乙二醇和额外的胆酸钠加入到上清液并混合上清液，离心混合的上清液形成沉淀(pellet)，将沉淀再次悬浮在含水胆酸钠中形成悬浮液，用含水胆酸钠透析悬浮液以形成增溶的微粒体制品，并通过柱层析纯化增溶的微粒体制品以获得含有蛋白质的柱级分。蛋白质可以从人肾上腺获得。
药物的制剂和给药
[0095]在一个方面，本发明提供了包括未修饰的自身抗原和抗原-特异性多价抗体的药物组合物。在一个方面，本发明提供了修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体的药物组合物。在一个方面，药物组合物是包括药理学上有效数量的这些抗体和抗原的制剂。在一个方面，药理学上有效数量的本发明的药物组合物是足以改善自身免疫疾病(当给予包括未修饰的自身抗原和抗原-特异性多价抗体的组合物时)，或改善与外来抗原或病原体相关抗原诸如癌症抗原、细菌或病毒抗原和类似抗原相关的疾病或状态(当给予包括修饰的抗原和抗原-特异性二价抗体的组合物时)的数量。在可选择的方面，通过改善自身免疫疾病或与外来抗原或病原体相关抗原相关的疾病或状态，本发明的方法和组合物可以治疗自身免疫疾病或与外来抗原或病原体相关抗原有关的疾病或状态、减轻它们的严重性、减缓或预防它们的发作，和/或减缓它们的进展。
[0096]本发明的药物可以通过任何方式，以任何合适的制剂给药。确定药物给药方案和制剂以实施本发明的方法的常规手段被充分描述在专利和科学文献中。例如，有关制剂、剂量、给药和类似事宜的技术细节描述在例如最新版的Remington′sPharmaceutical Sciences，Maack Publishing Co，Easton PA中。
[0097]本发明的制剂可以包括药学上可接受的载体，其可以含有生理学上可接受的化合物，其用来例如稳定组合物或增加或减少药物组合物的吸收。生理上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质、减少任何共同给药的试剂的清除或水解的组分，或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲物。洗涤剂也可以用于稳定组合物或用于增加或减少药物组合物的吸收。其他生理学上可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，其特别用于防止微生物的生长或活动。各种防腐剂是公知的，例如抗坏血酸。本领域技术人员将认识到药学上可接受的载体包括生理学上可接受的化合物的选择取决于例如给药途径和取决于共同给药的试剂的特定物理-化学特性。
[0098]在一个方面，用于给药的组合物包括药学上可接受的载体，例如含水载体。可以使用各种载体，例如缓冲盐水和类似物。这些溶液是无菌的，并通常无不想要的物质。这些组合物可以通过常规、已知的灭菌技术灭菌。当需要接近生理条件时，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂和类似物，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠和类似物。活性试剂在这些制剂中的浓度可以在宽范围内变化，并将主要根据流体体积、粘性、体重和类似情况，根据选定的特定给药方式和成像模态进行选择。
[0099]本发明的药物组合物可以各种单位剂型被给药，取决于每个患者的一般医学状态、给药方法和类似情况。有关剂量的细节充分描述在科学和专利文献中，参见例如最近版的Remington′s Pharmaceutical Sciences。本发明药物的精确数量和浓度以及给定剂量的制剂的量，或“有效数量”可以通过常规方法确定，例如由临床医师测定(参见上面对药学上有效数量的本发明组合物的论述)。“剂量方案(dosingregimen)”将取决于各种因素，例如患者健康的一般状态、年龄和类似情况。通过使用描述了其它剂量方案例如使用其他成像造影剂的指南，技术人员能够通过常规试验确定本发明药物组合物的最有效的浓度。本发明不受任何特定剂量范围的限制，本发明的药物可以以替代剂量给药。
[0100]例如，抗原，无论是可溶性的、颗粒的、超声破碎的或部分降解的，其数量(其在组合物中可以表示成mg/ml)可以根据接受者的大小和/或重量而变化，以获得可能最好的理想的免疫应答。抗体——其对抗原的滴度为已知——的数量可以进行调节，以便在Ag:Ab复合物中抗原微微超出。
[0101]例如，在一个方面，组合物根据下述接种疫苗方案给药：最初一周两次给药，约3周，然后每周1次给药，约5个月，然后每月一次给药(给药频率将取决于征兆、症状和实验室检查)。为了保持高水平的特异性循环IgM自身抗体，免疫系统的细胞受到比平时更多的刺激，这通过连续注射Ag微微超量的本发明的合适的Ab:Ag复合来物进行。当致病性抗体应答终止时，本发明的Ab:Ag复合物的给药频率可以开始减少，包括给予摩尔量相等或抗体超量的Ab:Ag复合物。然而，在两种制剂中，特别是Ab过量时，抗体应答被抑制。
[0102]在一个方面，一旦免疫系统被谐调至对通过本发明Ab:Ag复合物给药的(例如注射的)修饰抗原产生应答时，那么仅仅给予修饰的抗原也能维持特异性免疫应答(尽管免疫应答水平较低)。
[0103]在实施本发明的方法中，合适的剂量可以由熟练的临床医师确定。在一个方面，抗原的数量，无论是可溶性的、颗粒状的、超声破碎的、还是部分降解的，在药物组合物中都表述为mg/ml，抗原的数量可以根据接受者的大小/体重而变化，以便在期望的时间内，获得最好的可能的免疫应答。对抗原的抗体滴度已知的抗体的数量可以以这样的方式调节，以便本发明的Ag:Ab复合体中抗原微微过量。抗原的给予(例如给药方法)、抗原给药频率、抗原剂量、在本发明Ag:Ab复合体中过量的抗原的量和类似情况将决定免疫应答。一般来讲，在本发明Ag:Ab复合体中低剂量的抗原可以在个体中引发和维持，存在于Ag:Ab复合体中的同一类抗体针对存在于Ag:Ab复合体中的该抗原的增高的免疫应答(抗体信息传递(antibodyinformation transfer))。
[0104]本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何手段传递，全身性的(例如静脉内)、区域性的、或局部的(例如肿瘤内或肿瘤周围或胞质内注射)通过例如动脉内、肿瘤内、静脉内(IV)、肠胃外、胸膜腔内、表皮、口或局部给药，如皮下、气管内(例如通过气雾剂)或经粘膜(例如口腔、膀胱、阴道、子宫、直肠、鼻粘膜)、肿瘤内(例如经皮涂敷或局部注射)给药。例如，动脉内注射可以用于获得“区域性效果”，例如以集中在特定器官(例如脑、肝、脾、肺)上。
[0105]适合于口服给药的制剂可以包括液体溶液，诸如有效数量的溶解于稀释剂中的化合物，稀释剂诸如水、盐水或果汁；胶囊、袋剂(sachets)或片剂，每一个含有预先设定数量的活性成分，如固体、颗粒或冷冻干燥的细胞；含水液体中的溶液或悬浮液；以及水包油乳状液或油包水乳状液。片剂形式可以包括一种或多种乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微结晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶状二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、云母、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲试剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂和药理学上相容的载体。用于经口传递的合适的制剂也可以被合并入到合成和天然的聚合微球体中，或其他介质中，以保护本发明的试剂在肠胃道内免遭降解。参见例如Wallace(1993)Science260：912-915。
[0106]本发明的药物组合物可以制成气雾剂，以通过吸入给药。这些气雾剂可以置入加压的可接受的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮和类似物。
[0107]Cyanovirins或其结合物——单独或与其他抗病毒化合物或吸收调节物联合使用——可以制成合适的制剂，以经皮涂敷和吸收。经皮电穿孔或离子等渗法也可以用于促进和/或控制本发明多肽经皮肤的系统性传递，例如参见Theiss(1991)Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.13：353-359。
[0108]适合于局部给予本发明药物组合物的制剂可以包括糖锭(lozenges)，其包括在风味剂通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶中的活性组分；锭剂(pastilles)，其包括在惰性物质中的活性组分，惰性组分诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口剂，其包括在合适液体载体中的本发明的药物组合物；以及膏剂、乳状液、凝胶和类似物。
[0109]适合于肠胃外给药的制剂可以包括含水和非含水等渗压无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与目标接受者的血液具有等渗压的溶质，以及含水和非含水无菌悬浮液，其包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
[0110]本发明的药物制剂可以以单剂量或多剂量密封容器提供，诸如安瓿和瓶，可以保存在冷冻干燥(冻干)条件中，仅需要在使用之前即刻加入无菌液体赋形剂，例如水，以用于注射。即配即用注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备而得。
[0111]治疗组合物也可以以液体制剂给药，例如与脂质体复合，或以脂/核酸复合体给药，或封装入脂质体，如封装入针对特定细胞的免疫脂质体。这些液体制剂可以局部、全身性给药，或通过气雾剂传递。参见例如美国专利6,149,937；6,146,659；6,143,716；6,133,243；6,110,490；6,083,530；6,063,400；6,013,278；5,958,378；5,552,157。
[0112]在一个方面，本发明的药物制剂可以与增加吸收的试剂一起给药。可以使用任何增加吸收的试剂，例如那些与蛋白质和肽药物组合使用，用于经口传递和通过其他途径传递的试剂。参见例如van Hoogdalem，Pharmac.Ther.44，407-443，1989；Davis，J.Pharm.Pharmacol.44(Suppl.1)，186-190，1992。用于本发明组合物和方法的增强剂包括，例如(a)螯合剂，诸如EDTA、水杨酸盐和胶原质的N-酰基衍生物；(b)表面活性剂，诸如十二烷基硫酸盐(lauryl sulfate)和聚氧乙烯-9-十二烷基醚；(c)胆汁盐，诸如乙醇酸盐和牛磺胆酸盐以及衍生物，诸如牛磺双氢褐霉素盐(taurodihydrofusidate)；(d)脂肪酸，诸如油酸和癸酸，和它们的衍生物，诸如酰肉碱、甘油单酯和甘油二酯；(e)非表面活性剂，诸如不饱和环尿(cyclic ureas)；(f)皂甙；(g)环糊精，和(h)磷脂。
[0113]增加蛋白质和肽药物(例如本发明的抗原：抗体复合物)经口传递的其他方法也可以用于实施本发明，例如进行化学修饰，以增加对肠胃酶的稳定性和/或增加亲脂性。可替代地，或此外，本发明的药物制剂可以与其他药物或物质联合给药，所述药物或物质直接抑制蛋白酶和/或蛋白质和肽的酶促降解的其他潜在来源。防止或延迟肠胃吸收cyanovirin的另一可替代方法是将它并入传递系统，传递系统设计成保护本发明药物制剂中蛋白质或肽不与肠腔中的蛋白水解酶接触，并仅在达到有利于它接受的区域时释放完整的蛋白质或肽。在一个方面，将生物可降解的微囊或微球体与本发明的药物制剂一起使用，不但保护它们免遭降解，也实现活性药物的延长释放，参见例如Deasy，in Microencapsulation and Related Processes，Swarbrick，ed..，Marcell Dekker，Inc.：New York，1984，pp.1-60，88-89，208-211。微囊也可以提供有效的途径，以实现本发明药物制剂在注射之后传递的延长，参见例如Maulding，J.Controlled Release 6，167-176，1987。
实施例
实施例1：致病性自身抗体应答的下调
[0114]下述实施例表明本发明的组合物和方法能有效地下调哺乳动物致病性自身抗体应答。本发明首次描述了致病性自身抗体介导的疾病进程的抗原特异性下调。抗原特异性下调已经在自身免疫肾病，即称为缓慢进行性海曼氏肾炎(SPHN)的鼠实验性自身免疫肾病的模型中得到证明，参见下面的实施例2。该自身免疫疾病由致病性自身抗体启动和维持，该抗体引起免疫复合物肾小球肾炎，从而导致蛋白尿。
[0115]通过注射本发明的示范性免疫复合物，在SPHN鼠中致病性自身抗体应答被下调，其中所述示范性免疫复合物含有天然致肾炎抗原和特异性IgM自身抗体，其中抗原超量。注射的免疫复合物提高了循环非致病性IgM自身抗体的水平，其反过来，通过移除注射的改变了的致肾炎自身抗原和释放的自身抗原(来自肾小管)，大大地减少致病性自身抗体的产生和肾小球中免疫沉积物(immune deposits)的持续积聚。较早被治疗的动物的反应比进入疾病状态较晚被治疗的鼠更好，但考虑到蛋白尿的改善、肾损害的减少和致病性自身抗体应答的改善，它们都表现得很好。在29周实验结束时，80％的鼠具有可以忽略不计的低水平的循环IgG自身抗体，这表明致病性自身抗体停止产生，疾病过程相应终止。另一方面，未治疗的鼠在实验结束时依然具有高水平的循环致病性自身抗体，这表明存在持续的疾病进展(发展)(progression)。
[0116]如上所述，海曼氏肾炎(HN)是自身免疫肾病的经典模型(art-recognizedmodel)。它是真正的鼠自身免疫肾病，由Heymann和同事首先描述，参见例如Adorini(1993)Immunol.Today 14：285-289。它是得到最好研究的实验自身免疫肾病模型之一。该疾病由致病性自身抗体启动和维持，参见例如Glassock(1968)J.Exp.Med.127：573-588；Mendrick(1980)Kidney Int.18：328-343。在IP或足垫内(intra-footpad)注射同源的化学修饰的或未修饰的肾小管抗原之后——最常见的是掺入到FCA中——典型的HN发展起来，表现为免疫复合物肾小球肾炎和蛋白尿。
[0117]自体同源和异源肾小管抗原也可以与佐剂一起使用，来产生肾病。致肾炎抗原被纯化并被若干研究人员表征，制备物分别命名为gp 330和gp 600。参见例如Kerjaschki(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 79：5557-5581。其他更小的MW的致肾炎抗原也已被鉴定。当以合适的形式注射时，所有纯化的抗原都能够在易感品种的鼠中诱发疾病，参见例如Kerjaschki(1983)J.Exp.Med.157：667-686。免疫病理性事件——其导致肾形态变化——已被组织学研究、荧光抗体和电子显微术研究充分描述；由循环致病性自身抗体和蛋白尿表征的功能变化已被充分地记录。
[0118]本发明也提供了新的、缓慢进行性HN(SPHN)肾病模型。在诱导疾病之后17周，忠有SPHN的动物开始出现蛋白尿，早期的肾损害也不太严重。该新的实验自身免疫肾病模型被用于证明本发明组合物和方法特异性除去循环致肾炎抗原，从而阻止它们刺激产生致病性自身抗体的免疫细胞的功效。因此，本发明的组合物和方法也帮助防止免疫复合物沉积在肾小球中。本研究通过在两群动物中使用本发明的组合物和方法研究了介入(intervention)的效果。在一群鼠中，介入在实验开始之前开始并在整个实验中持续，在另一群中，在疾病确定之后14周开始。未治疗的正常鼠和患有肾病的动物作为对照。
[0119]动物：两个月大的雄性斯普拉道来氏鼠(Sprague Dawley rat)被用于实验。将来自当地饲养场的动物用耳朵辨认系统(ear identification system)编号，并随机分配到代谢对照和测试组。对异氟烷麻醉的鼠实施侵入性实验操作。在实验结束时，诱导疾病后29周，通过IP注射Euthanyl(MTC药物)(180mg/kg体重)对鼠实施安乐死。
实验设计
[0120]组I代谢对照：该组包括8只鼠。这些动物未被注射和治疗。然而，与其他组的鼠同时进行每周一次的蛋白尿研究，从这些鼠定期获得血液收集物和肾样品。
[0121]组II缓慢进行性海曼氏肾炎(SPHN)：通过前述技术(B+C+B+L 29)，10只鼠皮下注射明矾和瘟热复合病毒疫苗(Alum and Distemper complex virus vaccine)(Olson 30)中的超声的超离心(u/c)Azo-rKF3抗原。鼠用0.2ml的抗原佐剂混合物注射三次。在第0天，混合物含有160μg抗原，在第16天和33天，含有80μg抗原。在第26、43、65、72、79和86天，额外地六次皮下(SC)注射160μg的含水超声的u/c Azo-rKF3抗原。肩胛之间的背面用于所有SC注射。
[0122]组III进行预先处理(pre-treated)并且之后被治疗(post-treated)的SPHN鼠：10只鼠(在用组II动物中使用的同样方案诱导SPHN之前的27天)用0.2ml IP注射的抗原或下述组合进行预先处理：在第-27天，以500μg含水rKF3抗原/鼠进行预先处理。在第-22、-20和-15天，以100μg含水rKF3抗原/鼠进行预先处理。在第-12天，以0.2ml带有特异性IgM抗体的免疫复合物(MICs)—所述MICs含有60μg超声的u/c rKF3抗原和150μg rarKF3 IgM/鼠——进行预先处理；在第-8、-5和-1天，用含有30μg超声的u/c rKF3抗原和75μg rarKF3 IgM/鼠的MICs进行预先治疗。在诱导SPHN之后，在头4周中，鼠用含有30μg超声的u/c rKF3抗原和75μg的rarKF3IgM/鼠的0.2ml MICs，每周两次进行后期治疗，然后每周一次给予同样剂量的MICs，直到实验结束。
[0123]组IV-进行后期治疗的SPHN鼠：通过组II鼠中所描述的同样方案，在10只鼠中诱导SPHN。从诱导疾病之后的14周起，鼠每周一次以含有30μg超声的u/c rKF3抗原和75μg的rarKF3 IgM/鼠的0.2ml IP注射MICs进行治疗。
[0124]鼠肾小管级分3抗原(rat kidney tubular fraction 3 antigen)(rKF3)的制备：在出血并用冷生理盐水洗去它们的血管之后，从安乐死的成年斯普拉道来氏鼠获得正常的鼠肾脏。收集肾样品，并用0.25mol/L缓冲蔗糖溶液pH 7.4洗涤若干次，并均质化制得精细的(fine)悬浮液。鼠肾级分3通过利用本文中描述的技术在4℃，用差异离心方法获得。
[0125]超声处理的超离心(u/c)Azo-rKF3的制备：利用两步程序。在超声处理和超离心之前，测定之前制备的rKF3级分的蛋白浓度并调整到10mg/ml。将超离心的上清液——命名为超声u/c rKF3制品——的蛋白含量，调节到4mg/ml，参见实施例2。超声u/c rKF3制品的化学偶联作用在含有重氮盐的0.1mol/L缓冲硼砂溶液pH 8.2中进行。在彻底透析azo-蛋白制品(以除去未偶联的重氮盐)之后，将它的蛋白含量调节到4mg/ml(B+L，29)。
[0126]抗-rKF3 IgM的制备：可以提高针对肾小管BB区域的循环中的天然发生的IgM自身抗体的低水平。参见例如Weir(1966)Clin.Exp.Immunol.1：433-442。成年Wistar鼠每周一次注射，IP给予PBS中的0.2ml 50μg rKF3抗原，进行4周。最后一次注射之后4天，使鼠出血以获得血清，个体血清样品在正常鼠肾切片上，用间接荧光抗体测试方法进行测试。收集在1∶70-1∶180滴度之间的、对肾小管bb相关抗原具有高IgM抗体活性的鼠血清，并等份装入瓶中，用于MIC制备，并保存在-35℃直到使用。如实验需要，为了获得额外的rarKF3IgM抗体，重新刺激鼠。
[0127]命名为MICs的超声u/c rKF3x rarKF3IgM免疫复合物的制备：下述试剂是制备MICs所必需的。超声u/c rKF3抗原：5mg/ml和rarKF3 IgM抗体，对肾小管BB相关抗原具有约1∶120的活性。我们的制品的IgM浓度考虑为约2mg/ml。在注射之前制备新鲜的MICs制品。每只鼠接受IC中的30μg超声u/c rKF3抗原和75mg rarKF3 IgM，除非另外指明。例如，为了制备用于IP注射10只鼠的MICs，使用下述程序：提供300μg超声u/c rKF3抗原和750μg rarKF3 IgM，并且它的体积用PBS调节到2ml。注射之前，温育混合物，并在室温(RT)旋转30分钟。MIC品中的抗原被考虑为微微超量。
[0128]光学显微术：将皮质肾组织固定在10％的中性缓冲福尔马林中，并包埋在石蜡中。将3μm厚的切片用苏木精和伊红，过碘酸-Schiff反应和通过六亚甲基四胺银染料染色，如Barabas(1969)Clin.Exp.Immunol.5：419-427所述。
[0129]电子显微术：将1mm的肾皮质块(block)固定在缓冲戊二醛中，然后固定在Caulfield’s四氧化锇中，并包埋在Peon中。适当染色的薄切片用Hitachi H600电子显微镜检查，如Barabas(1969)Clin.Exp.Immunol.5：419-427描述。
[0130]尿蛋白评估：在开始实验之前8周，从代谢笼(metabolic cages)中的鼠个体上收集二十四小时尿样品，以获得代表性基线值。每周收集尿，持续到在29周实验结束。通过biurette方法，在540nm处使用Spectromic GENESIS 5TM分光光度计，用0.5ml尿样品测定尿蛋白含量。
免疫荧光研究
[0131]直接荧光抗体测试：8周时以及实验结束时的鼠个体的3μ厚的新鲜肾切片在Microm HM500M恒冷切片机上切割，并固定在醚∶醇(50∶50)中。洗过的肾切片进行染色，对于鼠IgG用Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)的合适稀释物，对于鼠IgM，用Alexa Fluor山羊抗-鼠IgM((μ)链)(Molecular Probe)的合适稀释物。在实验结束时，肾切片也用单克隆小鼠抗-鼠C5b-9 IgG抗体对C5b-9染色，并用Alexa Fluor488高吸附的山羊抗-小鼠IgG(H+L)(MolecularProbe)的合适稀释物进行复染色(counter-stain)。
[0132]间接荧光抗体试验：对在第0、2、8、16、22和29周获得的所有鼠血清稀释物进行测试，以测试鼠IgG和IgM抗体对正常鼠肾冷冻切片上的鼠肾小管成份的活性。记录IgG和IgM抗体的抗体滴度，用可得到阳性结果的最后稀释度的倒数表示，制成表格，计算G/M比率。用Axioscop Zeiss显微镜观察免疫荧光抗体染色的切片，拍摄数字图片，并保存在Micron计算机中。
[0133]因鼠IgG沉积在肾小球中而引起的肾小球损伤的分级：对最丰富的免疫球蛋白鼠IgG进行分级，鼠IgG是肾脏自身免疫病理学的原因所在。根据下述描述，肾小球中的荧光强度和荧光物质(成珠的免疫复合物)的数量分级为0-4+等级。也观察到鼠IgG存在于肾小管基底膜(TBM)、近端肾小管的刷状缘区域(BB)和鲍曼氏囊中，并记录下来。
[0134]IgM也发现存在于肾小球系膜(mesangium)和肾小球毛细血管中。根据荧光强度和荧光物质的数量，依照0-4+等级，对珠状(beaded)肾小球系膜沉积物进行分级。也观察到并记录下肾小球毛细血管周围小量的鼠IgM珠状沉积。
[0135]蛋白尿：在诱发肾病之前，通过8个每周一次收集的尿样，由所有鼠获得基线蛋白尿量度(Baseline proteinuria measurements)。尿也被收集来检查用MICs对组III鼠进行的预先处理是否会影响蛋白尿。未治疗的SPHN鼠具有最高水平的蛋白尿，而进行预先处理并而后治疗的组III鼠在整个实验中，与组I代谢对照具有差不多同样水平的蛋白尿。用MICs进行后期治疗的组IV鼠显示出稍微增加水平的蛋白尿。当我们在实验结束时将平均日蛋白尿结果与对照组I鼠的尿蛋白产生进行比较时，预先处理并而后治疗的SPHN鼠增高12％，后治疗的鼠增高81％，未处理的鼠尿蛋白损失增高230％，这说明在治疗过的鼠中蛋白尿值显著减少。
[0136]组III鼠的早期处理导致蛋白尿增加非常微小
组织学
组I         8，13
正常鼠：    2，3，6，8 in I after I el.γG.         (6)
SPHN组II    9，10，17，25，47，50，65，81，83，87   (7)
SPHN p/p TX(III)组VI     21，40，41，43，44，56，61，68，76        (5)
SPHN/p TX(IV)组VII       3，7，12，16，20，45，51，66，83，89，92  (6)
[0137]光学显微术：H&E切片显示，在SPHN组II、III和IV鼠的肾小球中没有显著的变化，但是在所有SPHN动物的肾中观察到肾小球细胞结构(glomerularcellularity)的些许增加。蛋白尿组II鼠的甲胺银(silver methanamine)染色的肾切片显示出增厚并常常显示出空泡的(vacuolated)肾小球毛细血管，在它们的外周围和显著的系膜区域(prominent mesangial areas)周围有大量的银阳性突起(silver positive projections)。
[0138]电子显微术：代谢组I对照鼠在它们的肾小球里没有显示出免疫沉积。组II蛋白尿动物显示出典型的HN肾损害。在GBM的上皮一侧具有由小到大的电子致密沉积物(electron dense deposits)，部分地或完全地被基底膜(BM)样物质包围。观察到BM样突起不规则地增厚GBM，并且，与沉积相关的足突融合(foot-processfusions)被观察到。上皮细胞显示出斑状嗜锇区域(patchy osmiophilic areas)，尤其是与沉积物相对应。预先处理和后治疗组III的鼠显示出温和形式的HN肾损害。在这些动物中，GBMs未被增厚，位于GBM的上皮一侧的偶尔的沉积没有BM样突起。足突保留在大部分的区域中，其融合仅仅涉及沉积。在组IV鼠中，HN肾损害大致在组II和组III鼠的肾损害之间。沉积物的一些限制在GBM上皮一侧的区域，其中GBM样物质开始有突出物环绕或包围沉积物。在这些区域中，上皮细胞融合，嗜锇区域存在于上皮细胞的细胞质中。在其他区域，沉积物位于GBM没有明显变化的GBM上皮一侧。
[0139]直接荧光抗体试验结果：下表1显示了通过直接荧光抗体试验结果获得的有关组II、III和IV中的鼠的肾脏切片的许多重要的观察结果。在第8周，在组II、III和IV鼠的肾小球中观察到具有不同程度的晚期损害的肾脏活检。在组II和IV鼠的肾切片上观察到中等程度的珠状肾小球毛细血管沉积物，对鼠IgG具有强烈的荧光染色。在组III鼠中，在肾小球毛细血管的周围，观察到具有相对不强烈的荧光的小量的鼠IgG沉积。仅仅在组II和IV鼠中，在一些鼠肾切片上，肾小管基底膜(TBMs)、BBs和鲍曼氏囊(BCs)着色。代谢对照鼠的肾切片未出现针对鼠IgG的染色。在所有组的鼠中(包括代谢对照组)，针对鼠IgM而进行染色的鼠肾切片的系膜区域具有类似的荧光强度和等级。在早期阶段，在系膜沉积方面，治疗或不治疗没有明显区别。
[0140]在第29周，实验结束时，在组II鼠的肾切片上，存在有具有更强烈荧光和增加数量的肾小球沉积并对之进行分级，在组III动物中，依然较少受累(involvement)。在组IV鼠中，对于鼠IgG，肾小球免疫沉积染色在荧光强度和数量上增加，但是未达到组II动物同样的程度。对于鼠IgM的沉积，组I和II鼠肾的系膜区域具有与以前在第8周大致相同的等级。另一方面，组III鼠和组IV动物尤其显示出大大减少的等级，这表明在系膜中具有更少的IgM沉积。在实验结束时，肾切片也对C5b-9染色。针对该膜攻击复合体(membrane attack complex)的组II鼠肾染色，显示出在肾小球毛细血管周围有模糊的珠状沉积。组III在它们的肾小球中没有C5b-9，而在组IV中的鼠具有非常模糊的沉积。
[0141]间接荧光抗体试验结果：已经知道，SPHN，HN的变体，由致病性IgG自身抗体引发并维持，致病性IgG自身抗体是在注射改变的致肾炎抗原之后产生的。因此，疾病的进展由循环中的致病性IgG自身抗体的数量确定。通过除去循环致肾炎抗原，可期待致病性抗体应答减少，并相应地出现形态和功能变化的改善。
[0142]在该实验中，代谢对照鼠未被处理，作为正常对照。在这组中被分析的血清样品显示，针对近曲小管的BB区域的循环的天然发生的IgM自身抗体水平低。在鼠个体中，在一个分析和下一个分析之间，循环IgM自身抗体的水平稍微有所变化，但是变化程度不大。
[0143]在组II未治疗的SPHN鼠中，平均循环致病性自身抗体应答相当高，既便是在29周的实验结束时也如此。在G/M比率或低或高的5只鼠组中分析和平均的血清样品，也未显示出自身抗体介导的免疫应答有下降趋势。在实验结束时，80％的鼠对肾中的目标抗原依然具有高的自身抗体应答。在组III的预先处理和而后治疗的SPHN鼠中，在整个实验中，平均循环致病性IgG自身抗体水平低。在第29周实验结束时，总体上说，在90％的鼠中，它低于1∶10稀释度，在80％鼠中，它为0。同时，在80％的动物中，循环的天然发生的IgM自身抗体被提高，G/M比率接近0。增加水平的IgM自身抗体能够除去大部分的注射的化学改变的rKF3抗原，并因此，预防了增高的致病性IgG自身抗体产生的发展。
[0144]组IV鼠在诱发疾病后14周，用MICs进行后期治疗。在大约头8周期间，最初的致病性IgG自身抗体应答是高的，在许多方面类似于在组II鼠中观察到的应答。在开始治疗之后不久，它开始下降，直到29周实验结束时，平均IgG抗体滴度为约1∶10。80％的鼠具有明显低的IgG自身抗体水平，50％的鼠没有循环IgG自身抗体。在任何阶段用MICs进行治疗，都将通过除去改变的致肾炎自身抗原，引起致病性自身抗体应答的下调，并导致减轻。
[0145]自身免疫疾病过程在治疗和未治疗的鼠中的总体上的进展：观察到，与组II未治疗的鼠的进展相比，用MICs预先治疗并后期治疗的鼠具有最弱的发展，后期治疗的鼠的疾病发展大大减弱。通过维持高的IgM自身抗体应答，破坏性的IgG自身抗体产生被抑制，致病性应答继而出现减缓甚至停止。观察在整个实验中总体的疾病发展，可以注意到组III鼠比组II鼠好出16倍，组IV鼠比组II鼠好出4.5倍。如果我们观察在临界点时的致病性自身抗体应答的上调或下调，(8至16周的结果)其通过组II和在治疗之前和治疗之后的后期治疗组IV动物的G/M比率测得，那么我们可以注意到下述内容。在组II动物中，致病性自身抗体应答猛增90％，而在组IV鼠中，在致病性自身抗体的产生中有几乎250％的下调应答，这表明了对治疗具有令人惊讶的快速应答。在29周，实验结束时，观察到组II的鼠依然显示出进行性疾病(G/M比率＞3)，而在组III和IV鼠中，观察到致病性自身抗体应答几乎停止，表现出非常低的G/M比率(分别为0.0636和0.105)。
[0146]表1示出了在第8周和第29周的肾脏切片，其通过直接荧光抗体试验对鼠IgG和IgM染色。在各组中给出的是平均值。示出了SPHN未治疗的(组II)和测试的(组III和IV)鼠的荧光强度和肾小球损伤等级。也对代谢对照组(组I)进行分级。除了代谢对照组，每个组有10只鼠，对照组有8只鼠。
                                              表1
8周                        抗-鼠IgG               抗-鼠IgM
肾小球强度 肾小球等级 等级增加按TBM、BB、BC染色+ TBM、BB、BC存在* 系膜强度 系膜等级 肾小球环存在
  组I代谢对照组II SPHN组III SPHN用MICs预先处理并之后治疗组IV SPHN用MICs后期治疗29周   03.80.92.7   02.80.331.5 03.2(2)0.33(10)1.8(7) 0503   2.533.63.2   0.60.710.7   7/89/107/108/10
  组I代谢对照组II SPHN组III SPHN用MICs预先处理并之后治疗组IV SPHN用MICs后期治疗   03.71.63.2   03.111.9 03.65(1)1(7)2.2(3) 0725   2.52.21.60.6   0.70.70.40.18   7/88/106/107/10
缩写：BB：刷状缘，BC：鲍曼氏囊，MICs：免疫复合体M，SPHN：缓慢进行性海曼氏肾炎TBM：肾小球基底膜，Tx：治疗的；w/：用；
*这些结构中的一个或多个有染色的鼠肾的数量；+肾小球损伤等级在2级以下的鼠肾的数量(在括号中)。
实施例2：缓慢进行性海曼氏肾炎新型模型的产生
[0147]本发明提供了缓慢进行性海曼氏肾炎的新型模型。该缓慢进行性海曼氏肾炎(HN)的新型模型被用于证明本发明的组合物和方法的功效，如本文中所述(例如见实施例1)。
[0148]缓慢进行性自身免疫肾病通过下述方法在Sprague Dawley鼠中产生：皮下注射整合入明矾和瘟热复合物疫苗的化学修饰的肾抗原(rkF3)；然后皮下注射同样抗原的含水制剂。肾病通过发展致病性自身抗体，然后通过它们与肾小球固定的致肾炎抗原反应而诱发。结果，免疫病理学事件导致慢性进行性免疫复合体肾小球肾炎和蛋白尿。
[0149]该缓慢发展的疾病在形态上和功能上与海曼氏肾炎相似。通过直接荧光抗体试验、组织学和电子显微术，于第8周和实验结束时，在收集的实验动物肾样品中观察到的损害与在海曼氏肾炎鼠肾脏发现的典型的损害相似，但严重性减弱。从17周开始(而不是通常的4-8周)动物出现蛋白尿，在8个月实验结束时，100％的鼠有蛋白尿。该新型的自身免疫肾病实验模型不会因腹膜内沉积和保留Freund’s完全佐剂和肾小管抗原而变得复杂，这使得我们能从不同的方面研究疾病过程的发病机理，而且是研究进一步的治疗方案的更好的模型。
[0150]实验性肾病，类似于HN，也已被描述，诸如被动海曼肾炎和进行性被动海曼肾炎，参见例如Adler(1984)Kidney Int.26：830-837；Barabas(1974)Br.J.Exp.Pathol.55：282-290；Barabas(1974)Br.J.Exp.Pathol.55：47-55；Feenstra(1975)Lab.Invest.32：235-242。通过IV注射针对鼠肾小管抗原的异源抗体，后面这些状态可以在敏感鼠中产生。后面这些形式的肾病因注射的异源抗体与肾小球固定抗原(fixed antigens)反应而产生，这反过来又在肾小球中激发补体介导的额外的损伤，从而导致蛋白尿。这些状态不是自身免疫疾病，而且它们在寻找人类天然存在的自身免疫肾病的治疗方案中的实用性(relevance)不清楚。然而，加快肾小球中的免疫复合体分解将是最理想的成就，因为各种事件——其在HN和被动性HN中发生并引起肾小球损伤——能够被减弱或甚至可能被阻止。
[0151]本发明提供了新的缓慢进行性海曼氏肾炎(SPHN)模型，从发作和发展来看，SPHN与人的膜性肾小球肾炎非常相似。用于产生SPHN的新方法最初在3组鼠中，在不同的时期进行研究，显示出重复性。在本文描述的一个实验中，将该新的SPHN模型与对照和HN鼠比较。在进行疾病的诱导之后，HN鼠在4周时患有蛋白尿，而在新的实验模型中的鼠在17周后逐渐患蛋白尿。类似地，新实验组的鼠的致病性自身抗体应答(利用间接荧光抗体技术用抗体滴度来量度)在疾病诱发期的最初8周内大大减少。
[0152]尽管HN是研究自身免疫肾病的发病机理和出现的形态及功能变化的优良实验模型，但是在某些情况下，由于其快速且不可逆转的过程，它不适合研究治疗选择方案。本发明提供了鼠的实验性自身免疫肾病模型，其逼真地模拟缓慢进行的天然存在的人自身免疫疾病。本发明的SPHN肾病模型可以操作免疫系统，这样，可以比在HN中更容易地减慢或终止免疫病理学事件。
[0153]鼠肾小管(级分3)抗原的制备：将成年正常斯普拉道来氏鼠进行安乐死，立即放血，并用冷的生理盐水洗血管。将肾收集在0.25mol/L的缓冲蔗糖溶液pH7.4中，并通过Cyclone virtishear(Virtis)均质化，成为相对精细的悬浮液。通过随后在Potter-Elverhjem均质器中均质化该精细的肾悬浮液，获得胞内成份。使用Beckman Model J2.21离心机，通过差异离心收集鼠肾级分3(rKF3)，线粒体丰富的级分，如Hubscher(1965)Biochem.J.97：629-642；Pinckard(1966)Clin.Exp.Immunol.1：33-43所述；所有程序都在4℃中进行。
[0154]超声破碎的超速离心rKF3级分的制备：将用上述技术制备的rkF3重新悬浮在0.25mol/L的缓冲蔗糖溶液中，并保存在-35℃中，直到使用。解冻的rKF3制备物的蛋白质浓度通过缩二脲蛋白评价方法(biurette protein estimation)测定，如Weichselbaum(1946)Am.J.Clin.Path.Tech.Suppl.10：40-49所述。将rKF3制备物的最终蛋白浓度调到10mg/ml，然后在设置为60％工作循环和微探头设限为8(8micro-tip limit)的情况下，使用Branson Sonifier 250，于4℃中超声破碎5分钟。使用Beckman L8-M超高速离心机，在4℃中，以100,000G，将超声破碎的制备物超离心1小时。收集上清液，命名为u/c rKF3制品。将蛋白质含量调节为4mg/ml。
[0155]Azo-u/c rKF3的制备：然后使用Lannigan和Barabas描述的方法来制备Azo-rKF3，如Lannigan(1969)J.Pathol.97：537-543所述。制品的化学偶联在0.1mol/L的缓冲硼砂溶液pH 8.2中，于4℃中进行2小时。在不断搅拌和维持pH的条件下，将重氮盐逐滴加到制品中。用PBS pH 7.3透析Azo-蛋白质制品，PBS更换3次，从而除去未偶联的重氮盐。使用聚乙二醇8000，将制品的蛋白质含量调节到4mg/mL。
[0156]尿蛋白评价-在诱导疾病之前，从代谢笼中的鼠个体上收集24小时尿样品，每周1次，共6次，然后在诱导疾病之后的整个实验中进行每周一次的收集。使用Spectronic Genesis 5分光光度计，在540nm处，通过缩二脲方法测定尿蛋白含量，方法参见Weichselbaum(1946)supra。
[0157]光学显微术：将肾样的代表性的样品固定在10％甲醛盐水中，并包埋在石蜡中，3μm厚的组织切片用苏木素-伊红，过碘酸希夫反应(periodic acid-Schiffreaction)，和甲胺银(methanamine silver stain)染色，如Barabas and Lannigan(1969)supra所述。
[0158]电子显微术：将肾脏的代表性样品的1mm3的皮质块固定，准备用于电子显微术，如Barabas and Lannigan(1969)supra所述。
免疫荧光研究：
[0159]直接荧光抗体试验：在进行疾病的诱导之后8周，和在8个月实验结束时，从每个鼠获得肾脏活体样品。用Microm HM 500M恒冷切片机中切割出2-3μ厚的冷冻切片，置于0.9％盐水中20分钟，然后固定在醚-醇(50∶50)中。固定之后，将切片洗涤两次，再进行染色，对于鼠IgG，用Alexa Fluor488-山羊抗-鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)的合适稀释物，对于鼠IgM，用Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgM(μ链)(Molecular Probe)的合适稀释物。Alexa Fluor染色的切片用Axioscop Zeiss显微镜观察，用数码相机(Diagnostic Instruments inc.)拍摄数码相片，并存入微型计算机。在实验结束时，从鼠个体获得的切片，也用单克隆小鼠抗-鼠C5b-9 IgG抗体对C5b-9染色，并用Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)的合适稀释物进行复染。
[0160]间接荧光抗体试验：从鼠个体收集血液，以用于评价肾特异性自身抗体的循环水平。在0，2，7，8，12，16，22，26，29和32周，从三组鼠获得血液，以获取血清样品。将从鼠个体收集到的血清样品保存在-35℃，直到使用。切割新鲜正常的鼠肾切片，用于研究。测试血清稀释物与肾小管细胞成份的反应活性，以测试IgG和IgM。记录血清滴度，以反映IgG和IgM组分的反应活性。
[0161]从患病的鼠肾洗脱γ球蛋白：使用pH 3.2的0.02mol/L的柠檬酸，通过洗脱程序，从典型的HN和SPHN患病鼠的均质化肾脏获得洗脱的γ-球蛋白，如例如由Freedman(1960)Arch.Int.Med.105：224-235；Freedman(1959)Lancet 2：45-46；Lerner(1968)J.Immunol.100：1277-1287所述。洗脱2小时后，将含有γ-球蛋白的上清液重新调整到pH 7.2，用PBS透析，然后用carborax 8000将体积减少到0.5cc/2肾脏。它们的蛋白质含量通过缩二脲试验测定，它们与肾脏结构成份的反应活性在间接荧光抗体试验中，在正常鼠肾脏切片上观察。通过IV注射洗脱的γ-球蛋白，在正常鼠中测试它们的生物反应性(在去除它们的其中一个肾脏之后)。注射后四天，杀死动物，就鼠IgG和鼠IgM对它们的肾脏切片染色。在注射洗脱的γ-球蛋白之前，类似地测试被去除的肾脏。
[0162]对患病鼠的肾小球中的鼠IgG分级：用半定量方法对最丰富的成份，即负责自身免疫肾病的启动和维持的成份，进行分级，描述如下：
Figure A20048002572100501
(1)荧光 强度记录为0-4+等级。对荧光的分级受到存在于肾小球中的荧光物质(珠状免疫复合物)的数量影响，并因此由该数量决定。在固定的显微镜设置中观察0-4级别的荧光，记录荧光强度的差异。
(2)沉积在肾小球毛细血管环(loop)中的荧光物质(珠状免疫复合物)的数量也可以分级为0-4：
-0级损伤，在肾小球中没有珠状沉积；
-1级损伤，在肾小球毛细血管环周围有少量和很少数目的小的免疫复合物；
-2级损伤，在肾小球毛细血管环周围具有变化数量和数目的免疫复合物，但是分布依然相当稀疏；
-3级损伤，在紧密靠近肾小球毛细血管环周围具有许多由小到大的免疫复合物，并且常常是多层排列；
-4级损伤，在肾小球毛细血管的周围具有弥漫的大的珠状沉积，并且常常是多层形式。
[0163]也观察到在肾小球毛细血管之外的地方存在鼠IgG，并记录到鼠IgG存在于肾小管基底膜(TBM)、肾小管细胞质、肾小管的刷状缘(BB)和鲍曼氏囊中。
[0164]鼠IgM的存在也发现并记录在系膜(mesangium)中。就荧光强度，将珠状系膜沉积分级为0-4等级，也按照0-4等级来描述存在于系膜中的荧光物质的数量(从在系膜中没有沉积到在系膜树(mesangial tree)内有大量的IgM沉积)。也观察并记录到在肾小球毛细血管的周围存在具有珠状图案的很少数量的IgM，通常带有微微的荧光。
[0165]实验设计：各个编号的鼠随机分派到实验的三个组中。
[0166]代谢对照：10只鼠不进行注射，作为对照。在与试验组中的鼠相同的时间进行下面操作：将该组的鼠放血获取血清，对它们的肾脏进行组织活检，收集它们的尿并进行分析。
[0167]试验组I：缓慢进行性海曼氏肾炎(SPHN)：10只鼠皮下注射在明矾和瘟热复合体病毒疫苗中的u/c Azo-rKF3(Olson et al.，2000)。明矾与免疫原-明矾混合物的最终体积比是1∶3。佐剂抗原混合物如下制备：
[0168]在注射之前，将1体积的明矾(Imject Alum，Pierce)逐滴加入到下述两种物质的混合物中：1体积的瘟热复合病毒疫苗(Duramune DA2P+PV，Fort Dodge，Iowa，USA)和2体积的Azo u/c rKF3(将PBS加入到抗原，使它达到2体积)，并在室温中搅拌30分钟。
[0169]鼠用0.2mL的抗原佐剂混合物注射4次。在0天，混合物含有160μg，在第10、20和35天，含有80μg抗原。在第42、49和55天，通过额外3次SC注射给予100μg的含水Azo u/c rKF3抗原。所有的SC注射在肩胛之间的背面实施。
[0170]试验组II：海曼氏肾炎(HN)肾病：10只鼠腹膜内4次注射加入到FCA中的Azo-rKF3抗原。FCA与免疫原-FCA混合物的最终体积比率是1∶2。佐剂抗原混合物按如下制备：在注射之前，使用带有18G 2way针的注射器，向2体积的FCA(含有2mg结核分枝杆菌/mL)加入1体积的Azo-rKF3(24mg/mL)，进入乳化。在第0、10、20和35天，鼠腹膜内接受含有2mg Azo-rKF3抗原的0.25mL乳化的制品，在第42、49和55天在肩胛之间皮下给予含有2mg Azo-rKF3的0.25mL含水制品。
[0171]在第22、23和24周，试验组I和II的鼠通过SC注射，用0.2ml含水的100μg Azo u/c rKF3抗原制品重新刺激。
结果
[0172]蛋白尿：在整个实验中，每周一次的蛋白尿评价在获自鼠个体的24小时尿样品上实施。在开始实验之前6周，由鼠个体获得的蛋白尿测量值建立了良好的基线，并显示在三组所有的鼠中都没有蛋白尿症。在引发疾病之后13周，在试验组I SPHN鼠中，蛋白尿开始发展，从17周开始，它变为缓慢进行性。在32周实验结束时，100％的鼠患有中等程度的蛋白尿，其水平与HN鼠在引发它们的疾病之后约7周的水平相同。在试验组II HN鼠中，蛋白尿早在首次注射FCA中的Azo-rKF3抗原之后5周便开始，然后它变得强烈，尿蛋白损失水平大大提高。在试验结束时，100％的鼠患有严重的蛋白尿。在该阶段，动物每天几乎排泄出与它们总的血清蛋白含量相等的蛋白。此外，在该组中，因为与极度蛋白尿症相关的代谢功能障碍的缘故，大部分的鼠看上去瘦弱。代谢对照组——其被保持以了解在实验期间是否发生与年龄相关的蛋白尿增加现象——显示在38周的整个试验期间没有明显的变化，如图1所示。
[0173]光学显微术：HxE切片显示试验组I和II鼠的肾小球的细胞结构微微增加，而代谢对照中没有一个有增加。蛋白尿试验组I和II鼠的甲胺银染色的肾脏切片显示增厚的肾小球毛细血管，显著的系膜区域以及在增厚的肾小球毛细血管的外表面上的银阳性刺突(silver positive spikes)。
[0174]电子显微术：在实验结束时，从每组鼠获得三个代表性的鼠肾样品。携带SPHN的组I鼠显示出特征性的形态学损伤，其可以在活性海曼氏肾炎鼠的肾脏中观察到。肾小球的肾小球基底膜(GBMs)沿着它们整个周围被不规则地增厚，这是由于基底膜(BM)物质生长并在上皮方向部分地或完全地环绕着嗜锇致密物(osmiophilic densities)。与嗜锇沉积和GBM变化相关地，足突消失，覆盖损伤的上皮细胞的细胞质出现明显的嗜锇区域。系膜区域显示出电子致密沉积物和局灶性增加的系膜细胞。携带活性HN的组II鼠基本上显示出相似的但更为严重的肾小球和相关超微结构的变化，这表明有更进一步的损伤，这是由于致病性自身抗体水平增加引起的损害的缘故。GBMs受到不规则增厚的多层和多突出(multiprojected)的BM样物质——其环绕并围住由小及大的嗜锇沉积物——更为严重的影响。与沉积物和GBM变化有关地，足突消失，它们的上皮细胞细胞质含有不同程度的嗜锇染色。代谢对照肾脏的超显微图显示在它们的GBM和相关结构中没有超微结构的变化。
[0175]洗脱的γ-球蛋白的分析：在间接荧光抗体试验中，获自组I和II鼠的肾脏的洗脱的γ-球蛋白染色了正常鼠肾切片的近曲小管的BB区域。当洗脱的γ-球蛋白的样品静脉内注射入单边肾切除的鼠，并在4天后进行活组织检查时，在肾小球毛细血管环的周围观察到成片的微细的珠状鼠IgG沉积。在注射之前从该单边肾切除的鼠获得的肾切片在肾小球中没有显示鼠IgG。在注射洗脱的γ-球蛋白之前从单边肾切除的鼠获得的肾切片也对鼠IgM进行了染色。在注射前和注射后肾样中，观察到同样荧光图式的系膜和微细肾小球毛细血管环染色。从携带SPHN的组I鼠和从携带典型HN的组II鼠获得的洗脱γ-球蛋白样品给出了类似的体内和体外试验结果。
[0176]直接荧光抗体试验结果：下表2显示了在肾脏切片上的直接荧光抗体试验结果，肾脏切片在8周时和在32周实验结束时获自3组鼠。
[0177]代谢对照鼠：在8周或32周时，在它们的肾切片中没有IgG被定位的成份。然而，在所有鼠中，所有的鼠肾切片在它们的系膜中都具有确定的珠状IgM沉积，或局灶性地或弥漫性地具有很小至中等程度的受累和类似的荧光强度和等级。此外，也注意到肾小球毛细血管环的细微的珠状染色，这表明在这些位置有鼠IgM沉积物。
[0178]试验组I SPHN鼠：显示在肾小球、刷状缘相关区域和TBM中有IgG沉积物。在肾小球毛细血管中观察到最清楚存在的鼠IgG的珠状图样。在8和32周，在这些地方观察到稀少的小的珠状沉积物到大的汇合的多层珠状沉积物，对它们进行分级并记录。此外，偶尔的近曲小管的BB区域也被染色，但是荧光较微弱，在第8周时尤其如此，然后是在实验结束时。TBM染色有斑状分布(patchydistribution)的珠状图案。在8周较早时期，观察到该荧光图案，在32周时较不常见。在第8周和32周时，IgM存在于每个鼠肾切片的系膜中，具有珠状图案，它的存在和分布似乎不受疾病状态的影响。也观察到在第8和32周，在大部分的肾切片的肾小球毛细管的周围具有珠状的相当微弱的荧光。
[0179]试验组II HN鼠：在第8周时，鼠IgG被发现在肾小球毛细血管中有大量的粒状沉积，常常是多层模式的，在实验结束时，更加明显，具有汇合的大的沉积。在第8周，肾小管BB区域被染得弥漫而强烈，在实验结束时，肾小管BB染色更为强烈和弥漫，显示随着时间推移损害在增加。在第8周，鼠肾小管基底膜有染色，带有珠状图案的IgG染色，其相当广泛地分布在肾切片上，在实验结束时染色情况类似。鲍曼氏囊仅在实验结束时，在一些鼠肾切片上有针对IgG的部分染色，带有珠状沉积。鼠IgM在系膜和肾小球毛细血管环中被发现，如同代谢对照和SPHN鼠的情况。此外，5只鼠在第8周对IgM显示出少量的但明显的BB区域染色。在实验结束时，7只鼠对IgM显示出肾近端小管的弥漫性细胞质染色。1只鼠对IgM显示出珠状的肾小球毛细管弥漫性染色。
[0180]所有的鼠肾切片通过夹心技术对膜攻击复合物C5b-9进行染色。在实验结束时，组I和II鼠的肾切片的肾小球毛细管环针对C5b-9强烈地染出弥漫的珠状图案。来自代谢对照鼠的肾切片则没有出现染色。
间接荧光抗体试验结果
[0181]代谢对照：在实验之前和实验期间由间接荧光抗体试验分析的正常鼠的血清显示出低水平的循环的自然发生的IgM自身抗体，该抗体针对正常鼠肾切片的近曲小管的BB区域。在近曲小管的腔周区域(periluminal region)的免疫荧光的图案由复杂的微细的线型染色组成。最常见地，针对鼠IgM的典型的肾小管染色不是弥漫性的，而是随机地分布在肾切片上，涉及任意一个位置的一个或多个肾小管。在鼠个体中，在一个分析与下一个分析之间，循环IgM自身抗体的水平微微变化，但是变化程度不显著。血清样品对正常的鼠肾脏切片成份不具有鼠IgG抗体引起的抗体活性。
[0182]试验组I SPHN：在2周内，出现针对肾小管上皮细胞成份的中等程度的IgG抗体应答；到第7周，记录到极度增加的应答，其持续到第8和第12周。从16周起，自身抗体应答逐渐减弱，通过第22周起三次注射含水Azo u/c rKF3抗原而使其提高。在整个研究中，间接荧光抗体试验获得的肾小管荧光是弥漫性的，实际上涉及所有肾小管，这由具有典型的宽范围染色图案的BB相关区域染色显示出来。从实验开始到结束，针对肾小管BB相关区域的IgM抗体应答比正常生理范围平均增加四倍。自22周注射Azo u/c rKF3抗原后，IgM自身抗体应答也增加。
[0183]试验组II HN鼠：在该组鼠中，抗肾小管BB IgG抗体应答是迅速的，在诱发疾病之后两周时，平均抗体滴度超过1000。到7周时，抗体滴定度达到它的最高点，超过30,000，随后在第8、12和16周时，它依然高，但是出现减退，在32周时达到相对低但是依然明显高的水平(图14)。在该组中，每只鼠具有高的致病性自身抗体应答。就如在试验组I鼠中的情况，在间接荧光抗体试验中观察到典型的BB染色图案。在22周时用含水Azo-rKF3抗原再次刺激这些鼠，未增加抗体应答。到第7周时，对肾小管BB相关区域的IgM抗体应答平均超出正常生理值约100倍，然后在第8和12周时，依然保持非常高的水平，然后微微逐渐降低。在实验结束时，IgM抗肾小管抗体应答依然平均高出正常生理值10倍。针对IgM的肾近端小管的免疫荧光染色大大增强，显示出弥散的粒状细胞质染色和粗的多线条染色图样。
[0184]讨论：本发明提供了制备和使用新型自身免疫肾病的方法，其形态和功能上类似于HN，通过新的技术在斯普拉道来氏鼠中产生，所述新的技术是具有最低程度的侵入性的方法。在本文描述的实验中，动物接受SC注射的低剂量的化学修饰的肾小管抗原，所述抗原被掺入到明矾和瘟热复合体疫苗中，然后SC注射水介质中的同样的抗原。
[0185]患得的疾病是缓慢进行的。在第13周开始出现小量的蛋白尿，从17周开始出现明显的蛋白尿，在8个月实验结束时，100％的鼠有蛋白尿。用于直接荧光抗体研究的在8周获得的早期肾脏组织切片样品显示，在肾小球毛细管周围有成珠状图案的鼠IgG免疫沉积染色。
[0186]实验结束时，用于荧光抗体试验、组织学和电子显微术的获得的肾组织样品显示出典型的HN变化。通过直接荧光抗体试验，在为鼠IgG和C5b-9而染色的肾小球毛细血管周围，观察到免疫复合物的弥漫性珠状沉积；近曲小管的BB区域和TBMs也被染色，如表2所示。蛋白尿鼠的甲胺银染色的肾切片的组织学分析显示了增厚的肾小球毛细管，在它们的外周围以及显著的系膜处具有银阳性刺突。
[0187]电子显微术显示了包埋在不规则增厚的GBM外表面中的巨大的嗜锇沉积。此外，也观察到与沉积物相关的足突消失。
[0188]通过间接荧光抗体试验，我们检测了循环致病性和非致病性自身抗体的存在。显示，在实验开始时，特别是随着持续地注射掺入到明矾的抗原，循环致病性自身抗体的水平是高的，随着实验的进行，它的水平降低。在实验结束时，依然可以检测到针对肾小管BB相关抗原的低水平的循环自身抗体。这些自身抗体(其因自体样抗原(self-like antigens)的“非寻常的呈递(unusual presentation)”而产生)是引起最初阶段的事件的原因所在。因此，发展中的自身抗体与结合于肾小球的致肾炎抗原反应，并形成免疫复合物。如果随着实验进行没有额外的化学改变的抗原可以加以利用，那么有理由认为没有更多的循环致病性自身抗体形成，同样地，没有更多的抗原可以用于在GBM上皮面形成不断扩大和增长的免疫复合体(该复合体由致肾炎抗原、自身抗体和补体成份构成)。
[0189]表2说明了在3个实验组中进行染色的鼠个体的肾脏切片，所述染色是通过直接免疫荧光技术针对鼠IgG和IgM进行的染色。显示了在第8和32周时，各组鼠内的平均荧光强度和平均等级，以及肾组织被定位组分(kidney tissuelocalized components)的存在或不存在。
                                  表2
8周                   抗-鼠IgG              抗-鼠IgM
  肾小球强度   肾小球等级   BB存在   TBM存在   系膜强度   系膜等级   肾小球环存在
  代谢对照HNSPHN32周   阴性4+3.2+   阴性3.9+2   阴性10/106/11   阴性10/106/11   2+2.5+2.8+   0.60.90.9   9/108/1010/11
  代谢对照HNSPHN   阴性4+4+   阴性43   阴性10/103/11   阴性8/103/11   3.2+3.2+3+   0.710.7   8/108/105/11
BB：刷状缘，TBM：肾小球基底膜，HN：海曼氏肾炎，SPHN：缓慢进行性海曼氏肾炎
实施例3：由化学修饰的肾抗原产生海曼氏肾炎
[0190]本实施例描述了通过用化学修饰的肾抗原产生海曼氏肾炎(HN)，并证明了在水介质中的化学修饰的肾炎抗原，在不使用任何佐剂的情况下，能够在敏感鼠品系中引发致病性自身免疫应答。
[0191]形态上和功能上类似于海曼氏肾炎(HN)的自身免疫肾病，通过每周一次反复IP注射在水介质中的化学修饰的Azo超离心(u/c)rKF3抗原，在成熟雄性斯普拉道来氏鼠中被诱导。参见上面的实施例2。
[0192]在首次注射化学改变的抗原15周后，终止实验。在实验期间，血清样品被收集，并通过间接荧光抗体试验在正常鼠肾切片上进行分析，显示循环致病性自身抗体逐渐升高，所述循环致病性自身抗体针对近端小管刷状缘区域。蛋白尿存在于一些鼠的尿中并显著增加。通过组织学、直接荧光抗体和电子显微术检查，发展出的免疫复合物肾小球肾炎显示，在70％鼠中具有典型的HN肾病损伤。
[0193]类似地注射同样的化学未修饰的抗原的对照鼠未出现特征性的形态和功能变化。
[0194]这些数据首次描述了自身免疫肾病——命名为活性HN(active HN)——可以通过给予在水溶液中的化学改变的肾抗原而产生，并不由在佐剂中的致肾炎肾抗原的平常呈递产生。
[0195]动物：1年以上的成年雄性斯普拉道来氏鼠用于实验中。从当地饲养场获得鼠，进行编号并随机分配到对照组和试验组中。在异氟烷麻醉的鼠上进行所有侵入性实验程序。在实验结束时，通过IP注射Euthanyl(MTC pharmaceuticals)(180mg/kg体重)，对动物进行安乐死。
实验设计
[0196]对照鼠：该组使用15只鼠。这些动物每周一次腹膜内注射100μg的在0.2mlPBS pH 7.3中的未修饰的超声破碎的超离心rKF3制剂。
[0197]试验鼠：8只鼠每周一次腹膜内注射在0.2ml PBS pH 7.3中的100μg Azo-超声破碎的超离心rKF3制剂。
[0198]在实验开始前和在2、4、6、12和15周，从每只鼠获得血样，以获得血清。
[0199]在实验开始之前从每只鼠、在进入研究两周后从一些鼠，以及在实验结束时从所有鼠，获得肾脏活体组织样品，用于直接荧光抗体试验的分析。在研究结束时，对在整个实验中收集到的每一血清样品进行间接荧光抗体试验。此外，通过特异性染色组织切片的组织学技术，也检查每只鼠的肾样品。通过电子显微术，对所有试验组的肾进行了检查，但是在对照组中仅对一些肾样品进行了检查。在15周时，结束实验。
[0200]尿蛋白评价；在实验开始之前，从在代谢笼中的鼠个体上收集24小时尿样品，每周一次，共三次，然后在实验期间两次。使用Spectronic Genesis 5分光光度计，在540nm处，使用缩二脲方法，对0.5ml尿样品进行尿蛋白评价。计算日蛋白尿，并用mg/天蛋白质损失/100gm体重来表示。
[0201]鼠肾小管级分3(rKF3)抗原的准备：放血并用4℃PBS pH 7.2洗去血管之后，从安乐死的成年斯普拉道来氏鼠获得肾脏。将肾收集在4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液pH 7.4中，在缓冲液中洗涤若干次，以除掉血液成份。通过CycloneVirtishear(Virtis)，将肾样品均质成微细悬浮液，并使用Potter-Elverjhem Teflon均质机，将胞质内成份释放到蔗糖缓冲液中。鼠肾级分3，命名为rKF3，使用BeckmanModel L-2超高速离心机通过差异超离心[17]获得。所有程序在4℃中进行。rKF3制备物的蛋白质浓度通过缩二脲技术[16]测定，并在保存于-35℃中之前将浓度调节到30mg/ml。
[0202]超声破碎的u/c rKF3的准备：使用设为60％工作循环、微探头设限为9的Branson超声破碎仪250，将处于0.25mol/L缓冲蔗糖溶液pH 7.2中的10mg/mlrKF3制备物在4℃超声5分钟。使用Beckman L8-M超高速离心机，在4℃，以100,000G，将超声处理的制备物超高速离心1小时。所得的上清液命名为u/c rKF3制品，将蛋白含量调节到4mg/ml，再保存在-35℃中，直到使用。
[0203]Azo超声处理的u/c rKF3的制备：利用Lannigan等描述的方法来制备Azo-rKF3(Lannigan，et al.，Some experimental models of the nephritic syndrome. In：Bajusz E.，Jasmin G.，eds.Meth Achievement Experimental Pathology.New York：Karger，Basel，1969)。在4℃，在pH 8.2的0.1mol/l的缓冲硼砂溶液中进行超声处理过的u/c rKF3制品的化学偶联，2小时。在持续搅拌中，将重氮盐逐滴加入到制品中，同时将pH维持在8.2。用PBS pH 7.2对出现的黄色Azo-蛋白质制备物进行透析，PBS更换数次，以除去未偶联的重氮盐。使用聚乙二醇8000将Azo-蛋白质化合物的蛋白质含量重新调节到4mg/ml。
[0204]组织学：将肾样品的皮质部分固定在10％的中性缓冲福尔马林中，切割石蜡包埋的切片，并用苏木精和伊红(H&E)、高碘酸-Schiff(PAS)和高碘酸Schiff六亚甲基四胺(PASM)染料染色。切片用Zeiss Axioscope Microscope检查。
[0205]电子显微术：将代表性的肾样品1mm3的皮质块固定在2.5％的二甲胂酸盐缓冲的戊二醛中2小时，而后固定在Caulfield’s四氧化锇溶液中，并包埋在Epon中。含有肾小球的薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用Hitachi H600电子显微镜检查超薄切片。
[0206]免疫荧光研究：使用微米HM 500M恒冷切片机，将冷冻的皮质肾组织样品切片切割成2-3μ的厚度，并置于含有0.9％盐水的科普林染色缸(coplin staining jar)中10分钟，然后固定在醚∶醇(50∶50)中2分钟，然后再次洗涤。
[0207]直接荧光抗体试验：醚∶醇固定的切片用Alexa Fluor488-抗-鼠IgG(H+L)和Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgM(μ链)(Molecular Probe)的合适稀释物在湿盒(wet box)中温育30分钟。用标记的抗体温育之后，切片用更换两次的盐水洗涤，再用甘油/PBS(50∶50)封固(mount)。
[0208]夹心技术：在实验结束时从鼠个体获得的切片，也针对C5b-9用单克隆小鼠抗-鼠C5b-9IgG抗体染色，并用4000倍稀释的高度交叉吸附的Alexa Fluor488山羊抗-小鼠IgG(H+L)(Molecular Probe)复染色。类似地，鼠肾切片也针对鼠C-3用兔抗-鼠C-3IgG抗体染色，用Alexa Fluor488山羊抗-兔IgG(H+L)(MolecularProbe)复染色。
[0209]间接荧光抗体试验：对在实验之前、实验期间和实验结束时获得的鼠个体血清样品的稀释物进行测试，以测试对肾小管成份的活性，测试按鼠IgG和鼠IgM部分在正常鼠肾切片上进行。用血清稀释物温育之后，合适的切片组用Alexa Fluor488山羊抗鼠IgG(H+L)和Alexa Fluor488山羊抗-鼠IgM(μ链)(Molecular Probe)染色。在荧光抗体试验中包括有合适的对照。
[0210]从患病的鼠的肾洗脱γ-球蛋白：使用pH 3.2的0.02mol/L的柠檬酸，通过酸洗脱技术，从适当制备的肾小球制备物获得洗脱的γ-球蛋白，参见例如Freedman(1959)Lancet 2：45-6；Freedman(1960)Arch.Int.Med 105：224-235。洗脱过程进行2小时。离心之后，将含有洗脱的γ-球蛋白的上清液重新调节到pH 7.2，并用PBS透析，PBS更换3次，然后通过Carbovax 8000将体积减少到0.5ml/2肾。通过缩二脲试验测定浓缩样品的蛋白质含量(参见例如Weichelbaum(1946)Am.J.Clin.Path.Tech.Suppl.10：40-49)，在正常的鼠肾切片上，在间接荧光抗体试验中，观察它们与正常的鼠肾成份的反应活性。将洗脱的γ-球蛋白IV注射入单边肾切除的斯普拉道来氏鼠后，测试洗脱的γ-球蛋白的生物活性。在注射之后4天，将鼠安乐死，针对鼠IgG和鼠IgM将它的肾切片染色。在注射洗脱的γ-球蛋白之前，以类似的方法测试肾切片。
[0211]肾小球中被定位的(localized)自身成份的分级：最丰富的肾小球定位成份——其引起疾病形成——是鼠IgG。荧光的强度由荧光物质(珠状肾小球免疫复合物)的数量确定，在固定的显微镜设置上，通过半定量的方法，将它分为0-4+等级。在肾小球中的荧光物质的数量也分为0-4+等级(参见实施例2)。等级0损伤没有肾小球沉积，而等级4+损伤在肾小球毛细血管的周围具有弥漫性的大的常常是多层的珠状沉积。等级之间的中间等级，依据设定值进行确定。
[0212]也在肾小管基底膜(TBM)、肾小管细胞质、刷状缘(BB)和鲍曼氏囊中注意到并记录下存在鼠IgG。鼠IgM的存在也在系膜中观察到并记录。系膜中荧光强度和荧光物质的数量分级为0-4+分级。具有隐约的珠状图案的很少数量的IgM也存在于注射前和注射后的动物肾样品的肾小球中，对此进行记录。
结果
[0213]蛋白尿：实验之前从鼠个体获得的三个每周一次的蛋白尿结果显示在两组鼠中具有低水平的正常的蛋白尿值(12mg/天/100gr体重)。在实验结束时，实验组中的两只鼠具有高的蛋白尿水平，分别为140和290mg/天/100gr体重，而对照组中则没有。
[0214]光学显微术：试验组鼠的肾切片显示，在H&E切片上的细胞构成微微增加。PAS染色的肾切片显示，在测试组和对照组动物中，致病性硬化性肾小球损伤特征性地在年老的鼠中发现。两个具蛋白尿的试验组鼠的甲胺银染色的肾切片显示出显著的系膜区域和增厚的肾小球毛细血管，在它们的外周围具有多层银阳性刺突。四只非蛋白尿的试验组鼠显示出类似的但是更轻微一些的肾小管受累，在它们的外壁上偶尔有银阳性刺突。对照鼠没有典型的损伤。
[0215]电子显微术：通常在活性HN鼠肾中观察到的若干超微结构变化在两只蛋白尿鼠的肾小球中发现。厚重且不规则增厚的肾小球基底膜(GBM)朝向肾小球的上皮方向部分地或完全地包围大大小小的嗜锇沉积物。与GBM变化和足突融合相关地，上皮细胞细胞质显示出嗜锇区域，其强烈程度与沉积物本身一样。另外4只试验鼠的肾显示了更温和形式的活性HN损伤。在这些鼠中，观察到具有小的嗜锇沉积物的斑状不规则增厚的GBM。上皮细胞足突融合仅仅涉及发现有沉积物的GBM，而在许多不存在沉积物的区域则保留了足突。在试验组中的两只鼠没有HN肾损伤，对照组中没有鼠具有HN肾损伤。
[0216]直接荧光抗体试验结果：表3显示了在第0和15周，在肾组织中定位的鼠IgG和鼠IgM抗体的存在或不存在。在第0和15周，对照鼠显示，在肾小球或相关结构中没有IgG。另一方面，鼠IgM的系膜珠状沉积物——最常见地具有强烈的荧光——在所有鼠的肾切片中被观察到。在肾小球毛细血管的周围，也观察到微弱的鼠IgM珠状沉积物。在实验结束时的肾样品中，C5b-9以微弱量存在于系膜中，具有微弱的珠状免疫荧光图案，但不存在C-3。
[0217]在第0周时，试验组鼠显示出与对照相同的荧光抗体试验结果。在第一次注射修饰的肾抗原3周后，8只鼠中的5只被活检，检查皮质肾样品，结果显示，在一个肾活检样品中，在肾小球毛细血管具有微细的弥漫性珠状IgG沉积物，同一样品还显示在肾小管的刷状缘(BB)区域有几处染色。另外三个肾活检样品对于鼠IgG显示出几乎不能检测的微细的肾小球毛细血管环珠状染色，有一个样品为阴性。
[0218]在实验结束时，8只鼠中的6只患有免疫复合物肾小球肾炎，在5只鼠中表现为在肾小球毛细血管环周围具有严重的鼠IgG珠状沉积，在一只鼠中具有类似但是较轻微的沉积。在典型HN中在BB区域和TBM中发现的具有珠状图案的特征性鼠IgG定位也在三只鼠的肾中观察到，在2只鼠肾中，鲍曼氏囊的偶尔片段具有微弱的珠状图案染色。在实验结束时，也针对C5b-9和C-3，对肾切片染色。三只鼠的肾切片，肾小球毛细血管有针对C5b-9的不同程度的成珠状形式的染色，所有其他鼠的肾切片都显示出微弱的珠状系膜染色。四个鼠肾切片针对C-3染色有微细的弥漫性珠状图案。在实验结束时，鼠IgM以增加的数量、以珠状图案存在于系膜中，肾小球毛细血管的染色具有微弱的细小的弥漫性珠状荧光图案。
[0219]间接荧光抗体试验结果：在实验开始之前，对照和试验鼠的血清显示出低水平的循环的天然发生的IgM自身抗体，所述IgM自身抗体针对近曲小管的BB区域，在正常鼠肾切片上具有微细的线型荧光图案。未观察到对正常鼠肾组织成份具有循环鼠IgG抗体活性。在实验期间，六次从鼠个体中获得血清样品。
[0220]注射天然致肾炎抗原的对照鼠没有发展出致病性IgG自身抗体，但产生水平微微提高的、针对肾小管抗原的IgM自身抗体。注射化学修饰的致肾炎抗原的8只鼠中的6只，随着疾病进行，致病性IgG自身抗体的水平提高，所述抗体针对肾近曲小管的BB相关区域。比起对照鼠，非致病性IgM自身抗体水平也增加许多，表明对产IgM的细胞系的刺激增加。
[0221]洗脱出的γ-球蛋白的分析：洗脱的γ-球蛋白仅获自试验组的鼠。它以5mg/ml的蛋白质浓度，在间接荧光抗体试验中被测试。在达1∶40的稀释度时，它仍与近曲小管的BB区域反应。将0.5ml的洗脱的γ-球蛋白样品静脉内注射到单边肾切除的鼠中，4天后进行活检，直接荧光抗体试验显示，在肾小球毛细血管的周围观察到弥漫性的微细珠状鼠IgG沉积物。注射前的肾切片针对鼠IgG没有出现染色，但是针对鼠IgM出现染色，如同针对对照所描述的情况。
[0222]论述：本发明的方法通过反复注射在含水溶液中的化学修饰的致肾炎抗原，在一组鼠中产生HN。发展中的疾病，表现为在肾小球中具有免疫复合物沉积，在受影响最严重的鼠中具有蛋白尿。自身免疫疾病由致病性自身抗体引起并维持。那些注射了同样的但是化学未修饰的抗原的对照鼠，未患上自身免疫肾病。
[0223]这些实验表明，在致病性免疫应答发生之前，自身抗原必须被充分改变才能之后被适当的免疫细胞识别为外来物。这一点已经在用某些药物治疗并随后患上狼疮样综合症的患者中得到充分说明。参见例如Jiang(1994)Science266：810-813；Rich(1996)Postgrad.Med 100：299-298；Totoritis(1985)Postgrad.Med78：149-161；Yung(1995)Lab Invest.73：746-759。当药物被撤去时，狼疮样综合症消失。在敏感患者中，药物诱发的狼疮必定是通过活性成份或药物的降解产物而启动，这些物质能够充分改变合适的胞质内抗原并启动免疫病理学事件。在某些个体中，阳光或极度寒冷也能产生狼疮样综合症，如果随后不再暴露于这些危险的情况，症状便消失。
[0224]这些实验也证明了，在实验期间，反复注射了修饰的肾抗原的动物产生升高水平的致病性和非致病性自身抗体，而那些注射了天然肾抗原的鼠仅仅产生微微增加水平的天然发生的非致病性IgM自身抗体。
[0225]本实验，以及本发明的方法和组合物清楚证明，通过利用IgM自身抗体，自身免疫能够在帮助有效除去释放的胞质内成份方面，提供有益的作用。这些实验也证明，不恰当地提供充分改变的自身抗原在某些情况下会引起有害的致病性自身抗体应答并引起疾病。
[0226]表3显示了利用直接免疫荧光技术染色的肾切片，显示了在0和15周时，定位于组织的鼠IgG和鼠IgM的存在/不存在。
                                   表3
0周                       抗-鼠IgG                 抗-鼠IgM
  沉积物的F1*强度   肾小球损伤等级 在BB处的存在 在TBM处的存在   系膜沉积物的F1*强度 系膜沉积物的等级 在肾小球中的存在
对照试验15周 阴性阴性 阴性阴性 阴性阴性 阴性阴性 3+3+ 0.70.6   微弱的弥漫性珠状沉积微弱的弥漫性珠状沉积
对照试验 阴性5/8  4+1/8  2+2/8  阴性 阴性5/8  31/8  1.52/8  阴性 阴性3/8 阴性3/8 3.5+3.5+ 12   微弱的弥漫性珠状沉积微弱的弥漫性珠状
BB＝刷状缘；F1*＝荧光；TBM＝肾小管基底膜；对照中有15只鼠，试验组中有8只鼠。
实施例4：在用致肾炎抗原反复刺激的缓慢进行性海曼氏肾炎鼠中致病性自身抗体应答的下调
[0227]这些实验证明了本发明的方法和组合物的效果。特别地，它们证明了在用致肾炎抗原反复刺激的缓慢进行性海曼氏肾炎鼠中，致病性自身抗体应答的下调。
[0228]在3组鼠中，诱导称为缓慢进行性海曼氏肾炎(SPHN)(参见上面实施例2)的自身免疫肾病，这通过反复SC注射小剂量的azo超高速离心的(u/c)鼠肾脏级分3(rKF3)制备物而进行，所述制备物掺入到明矾和瘟热复合体病毒疫苗中。出现的肾病表征为免疫复合物肾小球肾炎(ICGN)和缓慢进行性蛋白尿。它由发展中的致病性自身抗体起始并维持，所述抗体针对存在于肾小球和鼠肾近曲小管的刷状缘(BB)区域中的致肾炎抗原。为了使疾病更具进行性，我们在首次注射之后24周以及最后一次注射致肾炎抗原后的14周，用含水azo u/c rKF3制备物重新注射所有SPHN鼠三次。组II鼠接受产生疾病的注射物，不接受其他治疗；组III动物此外还用免疫复合物(ICs)进行预先处理和后治疗，免疫复合物由rKF3抗原和鼠抗-rKF3IgM抗体构成，其中抗原过量，命名为“MICs”。组IV鼠在诱导疾病后7周注射MICs。
[0229]在那些用MICs注射的动物中循环特异性IgM自身抗体的水平提高，致病性IgG自身抗体应答减少。在MICs治疗的动物中，用含水azo u/c rKF3抗原重新刺激之后，这种抗原特异性下调的效果依然通过升高的循环IgM自身抗原水平而被维持。在实验结束时，MICs治疗的组III和IV鼠的60％在它们的循环中没有致病性IgG自身抗体，而在未治疗的组II鼠中则全部都有。在整个实验中，在未治疗的SPHN鼠中，循环致病性IgG自身抗体水平高，在用致肾炎抗原重新刺激后，在大部分鼠中变得更高一些。在这些动物中，疾病进行也更明显。
[0230]这些实验证明，使用定制的(tailor made)MICs(本发明的示范性组合物)，通过抗原特异性治疗方案，致病性IgG自身抗体诱导的实验性自身免疫肾病过程可以在疾病的早期和甚至慢性进行性阶段被下调。似乎是，通过除去或阻止致肾炎性抗原，发展的IgM自身抗体能够防止产生IgG自身抗体的细胞系受刺激制备出更多导致疾病的致病性自身抗体。
[0231]动物：对获自当地饲养场的两个月大的雄性斯普拉道来氏鼠进行随机分配并编号，用于实验。所有侵入性程序在异氟烷麻醉的鼠上实施，在32周实验结束时，通过IP注射Euthanyl(MTC pharmaceuticals)(180mg/kg体重)，对鼠实施安乐死。
实验设计
[0232]组I.代谢对照：10只鼠未注射、未治疗，但是进行蛋白尿研究，获取血液样品以获得血清，也获取肾样品，以研究变化。
[0233]组II.缓慢进行性海曼氏肾炎(SPHN)：通过前述方法，10只鼠被反复SC注射0.2ml的azo-u/c rKF3抗原，该抗原掺入到明矾和瘟热病毒疫苗中，参见上述实施例。在0天，注射含有160μg抗原的混合物；在10、20和35天，80μg；在42、49和55天，100μg含水azo u/c rKF3抗原。
[0234]组III.SPHN预先处理且随后治疗：10只鼠用MICs预先处理，描述如下。按照针对组II鼠所描述的方案诱导疾病之前的第-22、-18、-14、-8和-3天，动物被IP注射MICs，MICs含有在0.2ml PBS中的60μg rKF3和150μg rarKF3IgM，诱导疾病之后则每周一次注射。
[0235]组IV.SPHN后期治疗的鼠：按照与针对组II鼠所描述的方案相同的方案，在10只鼠中诱导SPHN。在诱导疾病之后7周，鼠通过每周一次IP注射MICs进行治疗，MICs含有在0.2ml PBS中的60μg rKF3和150μgrarKF3IgM。
[0236]组II、III和IV中的鼠在22周用100μg含水azo u/c超声处理的rKF抗原重新刺激，以5天为间隔，共进行3次。
[0237]azo u/c超声处理的rKF3抗原的制备：通过差异离心，在0.2M蔗糖pH 7.4中的均质化的正常鼠肾用于制备rKF3。将rKF3制备物超声处理并于100,000G超高速离心1小时，以获得u/c超声上清液制备物[B+C+D+C]。使用重氮盐，在pH 8.4的0.1mol/L缓冲硼砂溶液中，将它进行化学修饰，获得azo u/c超声rKF3制备物。将azo-蛋白结合物的蛋白质含量调节到4mg/ml。
[0238]鼠抗-rKF3 IgM的制备：低水平的循环的天然发生的IgM自身抗体可以被刺激，以获得针对肾近端小管的BB区域的更高水平的IgM自身抗体应答。通过IP给予在PBS中的100μg rKF3抗原，我们每周一次注射成年Wistar鼠，注射4周。最后一次注射抗原之后4天，将鼠个体放血以获得血清，并通过间接荧光抗体试验测试抗体活性，在正常鼠肾切片上测试针对BB相关抗原的鼠IgG和鼠IgM抗体活性。收集具有高IgM抗体滴度(1∶70-1∶180)的血清，等份分成几份，保存在-35℃直到使用。如果需要，在重新刺激同样的鼠后，获取额外的rarKF3IgM抗体。
[0239]命名为MICs的rKF3 x rarKF3 IgM免疫复合物的制备：每次制备用于10只鼠的新鲜MICs，描述如下：向600μg rKF3，加入1500μg rarKF3 IgM(2000μgIgM/ml血清)，所述IgM对BB抗原具有1∶120的抗体活性，并用PBS补到2ml。将抗原微微过量的混合物在室温中温育并旋转30分钟，然后在合适的时间以0.2ml的量IP注射试验鼠。
[0240]尿蛋白评价：从代谢笼中的鼠个体收集24小时的尿样品。在开始研究之前通过每周一次的采样获得8份尿样品，进行分析以获得基线值，研究开始之后每周一次收集样品并进行分析，以观察治疗和未治疗之间的差异。使用SpectronicGenesis 5分光光度计，在540nm处，用0.5ml的尿样品，测定尿蛋白值(参见上面描述)。
[0241]在肾皮质样品上进行组织学、电镜和直接荧光抗体试验：将10％中性缓冲福尔马林固定的肾皮质样品包埋在石蜡中，切割出3μm厚的切片，用苏木素-伊红和甲胺银染料[B+L]染色。用Hitachi H600电子显微镜，电子显微检查已被适当固定并染色的超薄肾皮质样品切片，如之前所述(B+C+B+L)。在第8周和实验结束时，将来自鼠个体的、适当处理的、3μm厚的新鲜肾皮质样品进行染色，以查看鼠IgG和鼠IgM存在与否，染色用Alexa Fluor488标记的山羊抗-鼠IgG(H+L)和山羊抗-鼠IgM(μ链)(Molecular Probe)的合适稀释物进行。也针对C5b-9使用单克隆鼠抗-鼠C5b-9IgG抗体对肾切片染色，并用Alexa Fluor488高度吸附的山羊抗-鼠IgG[H+L](Molecular Probe)的合适稀释物复染，这仅仅是在实验结束时(B+L+B+L)进行。参见表4。
[0242]间接荧光抗体试验和对因在肾小球中沉积鼠IgG而引起的肾小球损伤进行分级：测定针对正常鼠肾小管成份的、鼠个体的血清样品的鼠IgG和鼠IgM抗体的滴度，并用给出阳性结果的最末的血清稀释度的倒数表示。按照0-4+等级，对肾小球定位的免疫复合物的荧光强度和荧光物质的数量进行分级，如之前所述(B+C+B+L)。也记录到在肾小管基底膜、近端肾小管的刷状缘区域和鲍曼氏囊中存在鼠IgG，并且类似地，在系膜和肾小球毛细血管中发现鼠IgM，记录并进行分级。
[0243]疾病的进行(progression)：通过计算和对G/M比率作图，测定疾病的进行。G/M比是用最高IgM自身抗体滴度的倒数除最高IgG身抗体滴度的倒数所产生的数，滴度在间接荧光抗体试验中获得。产生疾病的IgG自身抗体为阴性的鼠的G/M比是0。对在第2、7、8、12、16、22、26、29和32周收集的鼠个体血清测定G/M比。确定在各组鼠内的平均G/M比，也计算了在5只具有最低值的鼠中和5只具有最高值的鼠中的同样的比率，并作图。
[0244]蛋白尿：在诱导肾病之前，分析从鼠个体获得的8份周尿样收集物，分析蛋白尿，建立代表性的基线值。然后在实验期间，代谢对照鼠提供持续的基线蛋白尿值。实验将要结束时，在该组鼠中，平均蛋白尿值微微增加，很可能是因为肾功能发生与年龄相关的变化。在实验结束时，将未治疗和治疗鼠中的蛋白尿增加与代谢对照组鼠中获得的蛋白尿值作比较。
[0245]组II的未被治疗的SPHN动物在诱导疾病13周后开始出现蛋白尿，到32周，100％的鼠患蛋白尿症，蛋白尿平均为350mg/天。用MICs预先处理而后治疗的携带SPHN的组III鼠也在诱导疾病13周后开始出现蛋白尿，到32周，50％的鼠患蛋白尿症，蛋白尿平均为140mg/天。
[0246]用MICs进行后期治疗的携带SPHN的组IV鼠，正如组II和III鼠，在诱导疾病13周后开始出现蛋白尿，到32周，80％的鼠患蛋白尿症，蛋白尿平均为220mg/天。
[0247]在实验结束时，与对代谢对照组相比，组II鼠多10倍，组III鼠多4倍，组IV鼠多6倍的蛋白尿。
[0248]光学显微术：在H&E和甲胺银染色的切片上，代谢对照鼠的肾切片没有显示形态学上的变化。携带SPHN的组II鼠的H&E染色的肾切片显示出增加的肾小球细胞构成，通过甲胺银染料，显示出显著的系膜区域以及增厚的肾小球毛细血管，在它们的外周围上具有银阳性突起(projections)。用MICs预先处理而后治疗的组III SPHN鼠显示出与组II鼠类似但是较不显著的肾损伤；蛋白尿值低于100mg/天的动物显示出均匀的薄的肾小球毛细血管环，在它们的外周围具有偶尔的银阳性突起。用MICs后期治疗的组IV SPHN鼠显示出组II和III鼠中观察到的肾损伤之间的肾损伤。
[0249]电镜：代谢鼠肾切片没有显示超结构异常。携带SPHN的组II鼠的超薄肾皮质切片显示出典型的HN肾损伤。在不规则增厚的GBM的上皮方向有大大小小的嗜锇沉积物，它们部分地或完全地被BM样物质包围。足突发生与沉积物相关的融合，上皮细胞细胞质显示出嗜锇区域，特别是靠近沉积物区域。用MICs预先处理而后治疗的组III SPHN鼠显示温和形式的HN。主要地，小的嗜锇沉积物存在于GBM的上皮侧。GBM突起在许多区域是明显的，但是因突起而引起的GBM增厚并没有产生多层沉积陷套(trapping of deposits)，而这种情况则在组II鼠的肾切片上被发现。足突发生与沉积物相关的融合，上皮细胞细胞质显示出嗜锇区域，与沉积物相对。用MICs后期治疗的组IV SPHN鼠显示一定范围的典型HN-肾损伤。高蛋白尿的鼠显示出在它们的GBMs上具有更多的沉积物，带有额外的典型变化，而低蛋白尿的鼠在它们的GBMs上具有较少的沉积物，如同组III鼠。
[0250]直接荧光抗体试验结果：在诱导疾病之后8周，在组II鼠的肾切片上观察到，在肾小球毛细血管环的周围的弥漫性珠状鼠IgG染色沉积，具有强烈的荧光。此外，在7只鼠的肾切片上记录到，鼠IgG存在于一种或所有下列结构中：BB、TBM和BC。组III和IV中预治疗和后治疗的鼠具有更低等级的肾小球损伤，更少的切片有BB、TBM和BC染色。代谢鼠的肾切片没有出现针对鼠IgG的染色。在所有组鼠中，包括代谢对照组的鼠，鼠肾切片的系膜区域对鼠IgM有染色，具有类似的荧光强度和等级。
[0251]在32周实验结束时，针对鼠IgG被ICs染色的肾小球沉积物在组II SPHN鼠中最为严重。最温和的肾小球损伤依然在用MICs治疗的组III和IV鼠中观察到。在这些动物中，发现较低等级的肾小球损伤，极少的鼠肾切片BB、TBM或BC染色。在组I和II鼠的肾中，鼠IgM的系膜沉积与在第8周时相同，但是在治疗组III和IV鼠中，大大减少。无论它们属于何组，在大部分鼠肾小球的肾小球毛细血管周围都观察到微弱的珠状鼠IgM沉积物。在实验结束时，也对肾切片染色，以查看C5b-9存在与否。未治疗组II鼠的肾小球毛细血管有针对C5b-9的强烈染色，成珠状图案，而大部分组III和IV鼠的肾小球染色为微弱的珠状荧光图案。
[0252]间接荧光抗体试验结果：SPHN的进行由循环中的致病性自身抗体维持。因此，周期性评价循环致病性和非致病性自身抗体能够给我们一个良好的主意，其相位(向下或向上的趋势)提示了未治疗和治疗的鼠的疾病进行情况。
[0253]组I.在实验期间，代谢对照鼠在它们的循环中具有低水平的天然发生的IgM自身抗体，所述抗体针对近曲小管的肾小管BB区域。
[0254]在组II SPHN未治疗鼠中，在整个实验中，甚至在实验结束时，平均循环IgG自身抗体水平高。IgM自身抗体水平低于IgG自身抗体水平，但稍微高于正常值。5只具有低G/M比的鼠具有较低的IgG自身抗体和较高的IgM自身抗体应答，表明至少在一些鼠中，出现了自然发生的下调趋势，其目标是终止疾病过程。然而，5只具有高G/M比的鼠，具有持续高的致病性自身抗体应答，没有显示出消除的迹象。
[0255]在22周，间隔5天，3次注射含水azo rKF3抗原，超过70％的鼠立即增加致病性自身抗体应答，该增加的应答在32周实验结束时，在约60％的鼠中依然明显。
[0256]在组III用MICs预先处理而后治疗的SPHN鼠中，到第2、7和8周，最初的致病性自身抗体应答是高的，尽管事实上，比组II动物低约3x，然后到12周时，低7x，16周时，低8x。后来，甚至在22周反复注射含水azo-rKF3抗原后，致病性自身抗体的水平在每只鼠的血清中也是低的，这表明，在低和高G/M比的鼠中，对注射的MICs都具有良好的应答。在实验结束时，在第7个月90％的鼠具有可忽略的低水平的循环IgG自身抗体；在第8个月，为70％的鼠。到7个月为止有5只鼠，到8个月为止有6只鼠在它们的循环中没有致病性自身抗体。这些结果显示，增加水平的特异性IgM自身抗体能够有效地将改变的自身抗原清出循环。该效果得到22周后的结果充分证明，即，当反复注射含水azo-rKF3抗原时，致病性自身抗体的增加仅仅是可忽略的水平，且仅仅持续一小段时间，之后甚至在6只鼠中减少为0。
[0257]在组IV用MICs后期治疗的SPHN鼠中，在第7和8周时，最初的致病性自身抗体应答相当高，之后它开始急剧下降，相应地，循环中IgM自身抗体的存在量增加。平均说来，在实验结束时，致病性IgG自身抗体水平是低的。在32周，在它们的血清中，90％的鼠具有可忽略的低水平的IgG自身抗体，60％的鼠没有IgG自身抗体。在第22周，用含水azo-rKF3抗原反复刺激组IV鼠，只是临时性地增加IgG抗体应答，到实验结束时，6只鼠在它们的循环中没有任何致病性自身抗体。这些结果显示，在发展的自身免疫疾病期间，通过免疫调节可以有效地控制由修饰的自身抗原驱动的致病性自身抗体应答。
[0258]治疗的和未治疗的鼠中的自身免疫疾病过程的总体进展：自身免疫疾病过程的总体进展显示在图X中。对于组II未治疗的鼠和用MICs治疗的组III和IV鼠，根据G/M比率的组合结果进行作图。相比起未治疗的组II鼠的疾病发展，组III中用MICs预先处理而后治疗的鼠，具有最少的自身免疫疾病发展，从第7周起，治疗的动物具有大大减弱的疾病发展。观察疾病在整个实验期间的总体进展，组III鼠比组II鼠好11倍，组IV鼠比II鼠好2.5倍。似乎，在组III动物中，在头8周的时间，由MICs引起的致病性自身抗体应答下调的效果不如疾病晚期的效果好。然而，到12周，对MIC治疗的下调性应答在组III和IV动物中都是效果最明显的。在22周用含水azo rKF3抗原重新刺激，组II鼠以明显而持续地产生致病性自身抗体作出应答，而组III和IV鼠却没有，这表明MICs产生良好的下调性效果。在32周实验结束时，在组II鼠中，平均G/M比是8，表明进行性自身免疫疾病在继续，而在组III和IV鼠中，平均G/M比分别是0.12和0.375，说明了致病性自身抗体应答的下调。
[0259]讨论：这些实验证明，本发明的方法和组合物可以用于改善自身免疫疾病。本发明的组合物包括抗原微微超量的ICs。在上述实验中，本发明的示范性的组合物包含致肾炎抗原和针对该抗原的同源IgM抗体。注射这些ICs(命名为MICs)，通过特异性地刺激CD5+B细胞系，增加了循环IgM自身抗体的水平。水平增加的IgM自身抗体能够除去循环的化学改变的和由肾近曲小管释放的未改变的致肾炎自身抗原，从而预防两大主要事件的持续发生，而所述两种事件的持续则是自身免疫疾病的慢性发展的重要促进因素。首先，本发明的方法和组合物有助于除去改变的自身抗原，从而防止致病性IgG自身抗体的产生，其次，本发明的方法和组合物有助于除去从近曲小管释放的未改变的致肾炎自身抗原，并防止这种自身抗原在肾小球中的进一步固定和沉积，从而释放IgG自身抗体位点。
[0260]这些实验证明，本发明的方法和组合物有效地、抗原特异性地下调致病性自身抗体应答。本发明的方法和组合物包括新的疫苗接种技术，该技术通过给予本发明的组合物(例如，通过注射的MICs)，利用抗体信息转移，来治疗大量的人类自身免疫疾病。本发明的治疗方案能够特异性地提高循环中的天然发生的IgM自身抗体的水平，能够终止致病性自身抗体应答——甚至在自身免疫疾病的急性或慢性阶段，而不引起副作用。
[0261]表4显示了，在8和32周通过直接荧光抗体试验对鼠IgG和鼠IgM染色的肾活检。给出了各个组的平均值。SPHN未治疗的鼠(组II)和接受不同治疗的鼠(组III和IV)的荧光强度和肾小球损伤等级被示出。代谢对照(组I)也被分级。每组有10只鼠。
[0262]本发明的许多实施方案已被描述。尽管如此，应该理解可以进行各种修改，而不脱离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案也在权利要求书的范围之内。
                                          表4
8周                       抗-鼠IgG          抗-鼠IgM
肾小球强度 肾小球等级 等级增加由于TBM、BB、BC染色+ TBM、BB、BC存在* 系膜强度 系膜等级 肾小球环存在
  组I代谢对照组II SPHN组III SPHN用MICs预先处理/之后治疗组IV SPHN用MICs后期治疗32周   03.22.73.4   01.960.661.76 02.4(9)0.7(10)2(7)   0724   22.92.52.9   0.60.90.60.7   10/1010/109/109/10
  组I代谢对照组II SPHN组III SPHN用MICs预先处理/之后治疗组IV SPHN用MICs后期治疗   043.23.8   0322.3 03.25(1)2.1(4)2.5(3)   0534   3.232.22.4   0.80.80.40.4   8/105/106/104/10
缩写：BB：刷状缘；BC：鲍曼氏囊；MICs：免疫复合物M；SPHN：缓慢进行性海曼氏肾炎；TBM：肾小管基底膜；
*这些结构中的一个或多个有染色的鼠肾数；+肾小球损伤等级在2以下的鼠肾数(在括号中)。

Claims (173)

1.增加哺乳动物中自身抗原特异性IgM抗体的水平的方法，包括下述步骤：
(a)提供包含未修饰的自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于所述组合物中；和
(b)以足以增加个体中抗原特异性IgM抗体的水平的量给予所述哺乳动物以所述组合物。
2.降低哺乳动物中循环自身抗原的水平的方法，包括下述步骤：
(a)提供包含未修饰的自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于所述组合物中；和
(b)以足以增加个体中抗原特异性IgM抗体的水平，进而降低所述哺乳动物中循环自身抗原的水平的量给予所述哺乳动物以所述组合物。
3.改善哺乳动物自身免疫疾病的方法，包括下述步骤：
(a)提供包含未修饰的自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于所述组合物中；和
(b)以足以降低所述哺乳动物中循环自身抗原的水平，进而改善所述哺乳动物自身免疫疾病的量给予所述哺乳动物以所述组合物。
4.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
5.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述多价抗体包括IgM。
6.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述多价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。
7.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述多价抗体包括人源化的抗体。
8.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述多价抗体包括在转基因鼠中产生的人抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述转基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
10.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中在制备包含所述自身抗原和所述抗原特异性多价抗体的组合物时，在给药之前即刻将所述未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合。
11.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中在制备包含所述自身抗原和所述抗原特异性多价抗体的组合物时，在给药之前约1分钟至2小时之间，将所述未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合。
12.如权利要求11所述的方法，其中，在给药之前约5分钟至1小时之间，将所述自身抗原与所述多价抗体混合。
13.如权利要求12所述的方法，其中，在给药之前约10分钟至30分钟之间，所述自身抗原与所述多价抗体混合。
14.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中在制备包含所述自身抗原和所述抗原特异性多价抗体的组合物时，将所述未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合，并将所述混合物冷冻干燥。
15.如权利要求14所述的方法，其中，在给药时，将所述冷冻干燥的混合物重构成制剂以用于给药。
16.如权利要求14所述的方法，其中，所述冷冻干燥的混合物保存在约-20℃至4℃之间的温度中。
17.如权利要求15所述的方法，其中，所述冷冻干燥的混合物重构成含水制剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述含水制剂包括无菌蒸馏水或缓冲盐水。
19.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括纯化的自身抗原。
20.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括重组或合成的多肽。
21.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括可溶性抗原。
22.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括颗粒性抗原。
23.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括小分子量抗原。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗原的分子量在约0.1至10kd或约0.5至5kd之间。
25.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括大分子量抗原。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗原的分子量在约5至50kd或约10至25kd之间。
27.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中所述自身抗原包括参与自身免疫应答的自身抗原。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述自身抗原包括肾小管致肾炎抗原、肾小球致肾炎抗原、子宫内膜repro-EN-1.0抗原、子宫内膜IB1抗原、谷氨酸脱羧酶、核仁ASE-1抗原、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、转醛缩酶、髓鞘碱性蛋白、70kD线粒体胆汁自身抗原、人软骨糖蛋白39、人Sp17蛋白、人胎盘Hp-8。
29.如权利要求27所述的方法，进一步包括多种参与自身免疫应答的自身抗原。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述自身抗原包括参与自身免疫应答的亚细胞组分、细胞、组织或器官。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞或组织包括亚细胞组分、细胞或组织匀浆或者细胞、组织或器官提取物。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述亚细胞组分、细胞、组织或器官包括肾近端小管或肾近曲小管或其亚细胞组分。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述自身免疫应答包括对肾小球基底膜自身抗原或肾近曲小管抗原的自身免疫应答。
34.如权利要求3所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括自身免疫肾病。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述自身免疫肾病包括被动海曼氏肾炎、狼疮性肾炎或膜性肾病。
36.如权利要求3所述的方法，其中所述自身免疫疾病包括类风湿关节炎、重症肌无力、子宫内膜异位、自身免疫胰岛素依赖性糖尿病、系统性红斑狼疮、干燥综合征、自身免疫甲状旁腺功能减退症、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬变症、自身免疫溶血性贫血症、接触敏感性皮炎、自身免疫发泡性紊乱、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、自身免疫不孕症、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病。
37.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中，按摩尔计算，存在于所述组合物中的所述自身抗原比所述多价抗体多约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
38.如权利要求3所述的方法，其中，所述组合物通过肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。
39.如权利要求3所述的方法，其中，所述组合物一天一次、一天两次、或一天三次给药。
40.如权利要求3所述的方法，其中，所述组合物一周约一次至两次给药。
41.如权利要求3所述的方法，其中，所述组合物先一周两次给药，给药约3周，然后每周一次给药，给药约5个月，然后每月一次给药。
42.如权利要求3所述的方法，其中，所述组合物包括无菌含水制剂。
43.药物组合物，包含(i)未修饰的自身抗原和抗原特异性多价抗体，其中所述多价抗体对所述自身抗原具有特异性，并且所述多价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述自身抗原以超过所述多价抗体的摩尔数存在于组合物中；和(ii)药学上可接受的赋形剂。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多价抗体包括IgM。
45.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。
46.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多价抗体包括人源化的抗体。
47.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多价抗体包括在转基因鼠中产生的人抗体。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述转基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
49.如权利要求43所述的药物组合物，其中在制备包含自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物中，在给药之前片刻，所述未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合。
50.如权利要求43所述的药物组合物，其中在制备包含自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物中，在给药之前约1分钟至2小时之间，所述未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中，在给药之前约5分钟至1小时之间，所述自身抗原与所述多价抗体混合。
52.如权利要求51所述的药物组合物，其中，在给药之前约10分钟至30分钟之间，所述自身抗原与所述多价抗体混合。
53.如权利要求43所述的药物组合物，其中在制备包含自身抗原和抗原特异性多价抗体的组合物中，所述未修饰的自身抗原与所述多价抗体混合，并且所述混合物被冷冻干燥。
54.如权利要求53所述的药物组合物，其中在给药时，所述冷冻干燥的混合物被重构成制剂，以用于给药。
55.如权利要求53所述的药物组合物，其中，所述冷冻干燥的混合物保存在约-20℃至4℃之间的温度中。
56.如权利要求53所述的药物组合物，其中，所述冷冻干燥的混合物被重构成含水制剂中。
57.如权利要求56所述的药物组合物，其中，所述含水制剂包括无菌蒸馏水或缓冲盐水。
58.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括纯化的自身抗原。
59.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括重组或合成的多肽。
60.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括可溶性抗原。
61.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括颗粒性抗原。
62.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括小分子量抗原。
63.如权利要求62所述的药物组合物，其中所述抗原的分子量在约0.1至10kd或约0.5至5kd之间。
64.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括大分子量抗原。
65.如权利要求64所述的药物组合物，其中所述抗原的分子量在约5至50kd或约10至25kd之间。
66.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括参与自身免疫应答的自身抗原。
67.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括肾小球基底膜自身抗原、肾小管致肾炎抗原、肾小球致肾炎抗原、子宫内膜repro-EN-1.0抗原、子宫内膜IB1抗原、谷氨酸脱羧酶、核仁ASE-1抗原、Ro/SSA、La/SSB、nRNP、Sm、转醛缩酶、髓鞘碱性蛋白、70kD线粒体胆汁自身抗原、人软骨糖蛋白39、人Sp17蛋白、人胎盘Hp-8。
68.如权利要求66所述的药物组合物，进一步包括多种参与自身免疫应答的自身抗原。
69.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述自身抗原包括参与自身免疫应答的亚细胞组分、细胞、组织或器官。
70.如权利要求69所述的药物组合物，其中所述细胞或所述组织包括亚细胞组分、细胞或组织匀浆或者细胞、组织或器官提取物。
71.如权利要求70所述的药物组合物，其中所述亚细胞组分、细胞、组织或器官包括肾近端小管或肾近曲小管或其亚细胞组分。
72.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述自身免疫应答包括对肾小球基底膜自身抗原或肾近曲小管抗原的自身免疫应答。
73.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述自身免疫应答包括自身免疫肾病。
74.如权利要求73所述的药物组合物，其中所述自身免疫肾病包括被动海曼肾炎、狼疮性肾炎或膜性肾病。
75.如权利要求66所述的药物组合物，其中所述自身免疫应答包括自身免疫疾病，包括类风湿关节炎、重症肌无力、子宫内膜异位、自身免疫胰岛素依赖性糖尿病、系统性红斑狼疮、干燥综合征、自身免疫甲状旁腺功能减退症、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬变症、自身免疫溶血性贫血症、接触敏感性皮炎、自身免疫发泡性紊乱、寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、大疱性类天疱疮、自身免疫不孕症、自身免疫性阿狄森病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病。
76.如权利要求43所述的药物组合物，其中，按摩尔计算，存在于所述组合物中的自身抗原比多价抗体多约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
77.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。
78.如权利要求43所述的药物组合物，其中，所述组合物一天一次、一天两次、或一天三次给药。
79.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述组合物一周约一次至两次给药。
80.如权利要求43所述的药物组合物，其中，所述组合物先一周两次给药，约3周，然后每周一次给药，约5个月，然后每月一次给药。
81.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成无菌液体制剂。
82.增加哺乳动物中抗原特异性IgG抗体的水平的方法，包括下述步骤：
(a)提供包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物，其中所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔数存在于所述组合物中；和
(b)以足以增加个体中抗原特异性IgG抗体的水平的量给予所述哺乳动物以所述组合物。
83.降低哺乳动物中循环抗原的水平的方法，包括下述步骤：
(a)提供包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物，其中所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔数存在于所述组合物中；和
(b)以足以增加个体中抗原特异性IgG抗体的水平，进而降低所述哺乳动物中循环抗原的水平的量给予所述哺乳动物以所述组合物。
84.改善哺乳动物的疾病或状态的方法，包括下述步骤：
(a)提供包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物，其中所述抗原与所述疾病或状态有关，所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对所述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔数存在于所述组合物中；和
(b)以足以增加哺乳动物中抗原特异性二价抗体的水平，进而改善所述哺乳动物疾病或状态的量给予所述哺乳动物以所述组合物。
85.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
86.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述二价抗体包括IgG。
87.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述二价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。
88.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述二价抗体包括人源化的抗体。
89.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述二价抗体包括在转基因鼠中产生的人抗体。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述转基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
91.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中在制备包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物时，在给药之前的片刻，将所述修饰的抗原与所述二价抗体混合。
92.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中在制备包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物时，在给药之前约1分钟至2小时之间，将所述修饰的抗原与所述二价抗体混合。
93.如权利要求92所述的方法，其中，在给药之前约10分钟至1小时之间，将所述抗原与所述二价抗体混合。
94.如权利要求93所述的方法，其中，在给药之前约30分钟至1小时之间，将所述修饰的抗原与所述二价抗体所述混合。
95.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中在制备包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物时，将所述修饰的抗原与所述二价抗体混合，并且将所述混合物冷冻干燥。
96.如权利要求95所述的方法，其中，在给药时，将所述冷冻干燥的混合物重构成制剂，以用于给药。
97.如权利要求95所述的方法，其中，所述冷冻干燥的混合物保存在约-20℃至4℃之间的温度中。
98.如权利要求95所述的方法，其中，所述冷冻干燥的混合物被重构成含水制剂。
99.如权利要求98所述的方法，其中，所述含水制剂包括无菌蒸馏水或缓冲盐水。
100.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括纯化的抗原。
101.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括重组或合成的多肽。
102.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括可溶性抗原。
103.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括颗粒性抗原。
104.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括小分子量抗原。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述抗原的分子量在约0.1至10kd或约0.5至5kd之间。
106.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括大分子量抗原。
107.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原的分子量在约5至50kd或约10至25kd之间。
108.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括癌症特异性抗原或对增生细胞或组织具有特异性的抗原。
109.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括外来抗原。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述外来抗原包括细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、酵母抗原或原生动物抗原。
111.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原包括亚细胞组分、细胞、组织或器官。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述细胞或组织包括亚细胞组分、细胞或组织匀浆或者细胞、组织或器官提取物。
113.如权利要求108所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、乳癌、肺癌或胃癌。
114.如权利要求109所述的方法，其中所述外来抗原包括来自病原体或感染性疾病媒介物的抗原。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述来自病原体或感染性疾病媒介物的抗原包括细菌抗原、病毒抗原或来自原生动物的抗原。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述病原体或感染性疾病媒介物包括葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、流感病毒、肝炎A、B或C或疟疾。
117.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中，按摩尔计算，存在于所述组合物中的所述修饰的抗原比所述二价抗体多约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
118.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述组合物包含约0.1mg至10mg的抗原和合适数量的二价抗体，维持所述抗原的摩尔数超过所述二价抗体。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述组合物包含约0.1mg至1.0mg的抗原和合适数量的二价抗体，维持所述抗原的摩尔数超过所述二价抗体。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述组合物包括约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合适数量的二价抗体，维持所述抗原的摩尔数超过所述二价抗体。
121.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述组合物通过肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。
122.如权利要求84所述的方法，其中，所述组合物一天一次、一天两次、或一天三次给药。
123.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述组合物一周约一次至两次给药。
124.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述组合物先一周两次给药，约3周，然后每周一次给药，约5个月，然后每月一次给药。
125.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述组合物包括无菌含水制剂。
126.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述组合物与佐剂一起给药。
127.如权利要求所述的方法126，所述佐剂包括明矾或弗氏佐剂。
128.如权利要求82至84中任何一项所述的方法，其中所述抗原用半抗原修饰。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述半抗原修饰的抗原包括半抗原-蛋白质偶联物。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述半抗原-蛋白质偶联物包括对氨基苯基砷酸-蛋白质、对氨基苯磺胺-蛋白质、或对氨基苯基砷酸-对氨基苯磺胺蛋白质偶联物。
131.药物组合物，包含(i)修饰的抗原和抗原特异性二价抗体，其中所述二价抗体对所述抗原具有特异性，并且所述二价抗体对述哺乳动物是天然的或对所述哺乳动物无免疫原性，所述修饰的抗原以超过所述二价抗体的摩尔量存在于组合物中；和(ii)药学上可接受的赋形剂。
132.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述二价抗体包括IgG。
133.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述二价抗体包括分离的抗体、合成产生的抗体、或重组产生的抗体。
134.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述二价抗体包括人源化的抗体。
135.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述二价抗体包括在转基因鼠中产生的人抗体。
136.如权利要求135所述的药物组合物，其中所述转基因鼠包含人免疫球蛋白基因座。
137.如权利要求131所述的药物组合物，其中在制备包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物中，在给药之前的片刻，所述修饰的抗原与所述二价抗体混合。
138.如权利要求131所述的药物组合物，其中在制备包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物中，在给药之前约1分钟至2小时之间，所述修饰的抗原与所述二价抗体混合。
139.如权利要求131所述的药物组合物，其中在给药之前约10分钟至1小时之间，所述修饰的抗原与所述二价抗体混合。
140.如权利要求139所述的药物组合物，其中，在给药之前约30分钟至1小时之间，将所述修饰的抗原与所述二价抗体混合。
141.如权利要求131所述的药物组合物，其中在制备包含修饰的抗原和抗原特异性二价抗体的组合物中，所述修饰的抗原与所述二价抗体混合，并且所述混合物被冷冻干燥。
142.如权利要求141所述的药物组合物，其中，在给药时，所述冷冻干燥的混合物被重构成制剂，以用于给药。
143.如权利要求141所述的药物组合物，其中，所述冷冻干燥的混合物保存在约-20℃至4℃的温度中。
144.如权利要求141所述的药物组合物，其中，所述冷冻干燥的混合物被重构成含水制剂。
145.如权利要求144所述的药物组合物，其中，所述含水制剂包括无菌蒸馏水或缓冲盐水。
146.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括纯化的抗原。
147.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括重组或合成的多肽。
148.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括可溶性抗原。
149.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括颗粒性抗原。
150.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括小分子量抗原。
151.如权利要求150所述的药物组合物，其中所述抗原的分子量在约0.1至10kd或约0.5至5kd之间。
152.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括大分子量抗原。
153.如权利要求152所述的药物组合物，其中所述抗原的分子量在约5至50kd或约10至25kd之间。
154.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括癌症特异性抗原或对增生细胞或组织具有特异性的抗原。
155.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括外来抗原。
156.如权利要求155所述的药物组合物，其中所述外来抗原包括细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、酵母抗原或原生动物抗原。
157.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原包括亚细胞组分、细胞、组织或器官。
158.如权利要求157所述的药物组合物，其中所述细胞或组织包括亚细胞组分、细胞或组织匀浆或者细胞、组织或器官提取物。
159.如权利要求154所述的药物组合物，其中所述癌症是黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、肝癌、乳癌、肺癌或胃癌。
160.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述外来抗原包括来自病原体或感染性疾病媒介物的抗原。
161.如权利要求160所述的药物组合物，其中所述来自病原体或感染性疾病媒介物的抗原包括细菌抗原、病毒抗原或来自原生动物的抗原。
162.如权利要求160所述的药物组合物，其中所述病原体或感染性疾病媒介物包括葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、流感病毒、肝炎A、B或C或疟疾。
163.如权利要求131所述的药物组合物，其中，按摩尔计算，存在于所述组合物中的所述修饰的抗原比所述二价抗体多约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％或200％。
164.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述组合物包括约0.1mg至10mg的抗原和合适数量的二价抗体，维持所述抗原的摩尔数超过所述二价抗体。
165.如权利要求164所述的药物组合物，其中所述组合物包括约0.1mg至1.0mg的抗原和合适数量的二价抗体，维持所述抗原的摩尔数超过所述二价抗体。
166.如权利要求165所述的药物组合物，其中所述组合物包括约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9mg的抗原和合适数量的二价抗体，维持所述抗原的摩尔数超过所述二价抗体。
167.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成通过肠胃外、经口、鼻内或眼睛途径给药。
168.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成无菌液体制剂。
169.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述组合物与佐剂一起给药。
170.如权利要求169所述的药物组合物，其中，所述佐剂包括明矾或弗氏佐剂。
171.如权利要求131所述的药物组合物，其中所述抗原用半抗原修饰。
172.如权利要求171所述的药物组合物，其中所述半抗原修饰的抗原包括半抗原-蛋白质偶联物。
173.如权利要求172所述的药物组合物，其中所述半抗原-蛋白质偶联物包括对氨基苯基砷酸-蛋白质偶联物、对氨基苯磺胺-蛋白质偶联物、或对氨基苯基砷酸-对氨基苯磺胺蛋白质偶联物。
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