CN110049773A

CN110049773A - TGFβ抗体、方法和用途

Info

Publication number: CN110049773A
Application number: CN201780056570.4A
Authority: CN
Inventors: G.J.卡文; T.舒尔普夫; K.特纳
Original assignee: Stone Supply Co
Current assignee: Stone Supply Co
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-07-23
Also published as: JP7128801B2; SG11201900200XA; KR102577551B1; BR112019000621A2; US20210277100A1; MA45690A; KR20190034560A; EP3484499A4; JP2022153406A; AU2017294772A1; CA3030862A1; MX2019000514A; JP2019524094A; IL264161A; US20190292254A1; EP3484499A1; WO2018013939A1

Abstract

ProTGFB1‑GARP复合物选择性抗体、能够编码proTGFB1‑GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的多核苷酸、表达proTGFB1‑GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的细胞、以及相关联的载体和带可检测标记的proTGFB1‑GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段能够被用来增强受治疗者中针对例如癌症的免疫应答。

Description

TGFβ抗体、方法和用途

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且该序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2017年7月10日，命名为JBI5093_SL.txt，并且大小为27,577字节。

技术领域

本发明涉及抑制生长因子活性的单克隆抗体以及制备和使用所述抗体的方法。

背景技术

调控T细胞或Treg是专门抑制免疫应答的CD4+T淋巴细胞的亚型。Treg功能不足导致自身免疫病变，而Treg功能过度则可能抑制癌症患者的抗肿瘤免疫应答。Treg抑制免疫应答的确切机制尚不完全清楚。由于其免疫抑制功能，Treg代表了自发或疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答的潜在抑制剂。在小鼠模型中，Treg耗尽能够改善针对实验肿瘤的免疫应答(Colombo等人，Nat.Rev.Cancer 2007,7:880-887)。因此，靶向人体内的Treg可改善针对癌症的免疫疗法的功效。

TGF-β1有助于激活人Treg，但其他类型的人T淋巴细胞(Stockis,J.等人，Eur.J.Immunol.2009,39:869-882)可能不是感兴趣的靶标。然而，发现针对hTGF-β1的抗体不具有前景。已在局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、特发性肺纤维化(IPF)和晚期恶性黑色素瘤或肾细胞癌(RCC)中进行了1期临床试验(Lonning S等人，Current PharmaceuticalBiotechnology 2011,12:2176-2189)。根据试验，在一些患者中观察到了不良事件。所报道的主要不良反应在于黑素瘤患者的角化棘皮瘤(KA)和鳞状上皮细胞癌(SCC)的发展。可能的是黑素瘤患者的KA或SCC病变由增殖受内源性TGF-β1抑制的癌前细胞演变而来(LonningS等人，Current Pharmaceutical Biotechnology 2011,12:2176-2189)。因此，关于在癌症情况下使用抗TGF-β1抗体的主要问题在于因为由内源性TGF-β1产生的肿瘤抑制效应对癌前细胞的抑制，所以这些抗体可能促进新肿瘤病变的出现。因此，需要通过防止TGF-β1从Treg释放来改善癌症治疗的新策略。

发明内容

本发明包括proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体及其抗原结合片段。还描述了能够编码所提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段的相关多核苷酸、表达所提供的抗体和抗原结合片段的细胞、以及相关联的载体和带可检测标记的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段。如在实施例4至6所示的条件下通过OctetRed_384测量的，抗体或其抗原结合片段并不选择性地结合TGFβ1生长因子结构域、TGFβ2生长因子结构域、TGFβ3生长因子结构域、与LTBP1共价缔合的proTGFβ1、与LTBP3共价缔合的proTGFβ1、与LRRC33共价缔合的proTGFβ1、以及未与人GARP缔合的proTGFβ1。

在一些实施方案中，本发明的抗体和抗原结合片段可具有：(1)对溶液中具有人糖蛋白A为主的重复序列的复合物(proTGFβ1-GARP复合物)中的人proTGFβ1而言小于或等于1nM的解离常数(Kd)；(2)对于抑制TGFβ1生长因子从细胞相关联的proTGFβ1-GARP复合物释放具有小于或等于10nM的抑制浓度(IC50)；以及(3)相对于TGFβ1生长因子结构域、TGFβ2生长因子结构域、TGFβ3生长因子结构域、与LTBP1共价缔合的proTGFβ1、与LTBP3共价缔合的proTGFβ1、以及与LRRC33共价缔合的proTGFβ1，对proTGFβ1-GARP复合物具有大于100倍的选择性，其中分离抗体或其抗原结合片段不结合未与人GARP缔合的proTGFβ1。

此外，还描述了使用所提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段的方法。所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体可用于希望调节免疫应答的治疗多种TGFβ1相关的疾病或障碍的方法，诸如多种免疫疗法应用，例如癌症、疫苗和感染性疾病。

在一些实施方案中，本发明包括分离抗体和抗原结合片段，其中在具有人糖蛋白A为主的重复序列的复合物(proTGFβ1-GARP复合物)处于溶液中时，抗体或抗原结合片段特异性地结合所述复合物中的人proTGFβ1。这些proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段可在体外抑制Treg功能。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段抑制TGFβ1的激活。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段结合至作为与人GARP形成复合物的结果而被修饰的人proTGFβ1的表位。该proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段能够以880pM或更小的结合亲和力结合proTGFβ1-GARP复合物的proTGFβ1。

表1：人proTGFβ-GARP复合物选择性mAb的CDR序列

(SEQ ID NO:)

在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段包含含有表1所述氨基酸序列中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述氨基酸序列中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体可包含SEQ ID NO:16和18的重链可变区序列，并且可包含SEQ ID NO 17和19的轻链可变区序列。

本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体包括具有与IgG同种型中的任一种组合的CDR和可变结构域的所述特征的抗体，包括其中Fc序列已经被修饰以实现不同效应子功能的修饰型式。

除所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段之外，还提供了能够编码proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段的多核苷酸序列。还提供了包含所述多核苷酸的载体，以及表达本文提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的细胞。还描述了能够表达本发明所公开的载体的细胞。这些细胞可以是哺乳动物细胞(诸如293F细胞、CHO细胞)、昆虫细胞(诸如Sf9细胞)、酵母细胞、植物细胞或细菌细胞(诸如大肠杆菌(E.coli))。还提供了用于制备proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的方法。

本发明还包括使用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的方法。用于本部分所讨论的方法中的ProTGFβ1-GARP复合物选择性抗体包括具有针对表1中的抗体所述的那组CDR的那些抗体。例如，TGFβ1在免疫应答中发挥的关键作用使其成为免疫疗法中具有吸引力的靶标，这包括诱导或增强针对任何弱免疫原性抗原(包括肿瘤抗原)的免疫应答。如此，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体可用于治疗各种癌症和感染性疾病。

在一个实施方案中，施用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体以阻止TGFβ1从Treg释放，并由此防止通过调控T细胞抑制效应T细胞的活性。此类抑制可通过本领域已知的多种方法来测定，包括例如通过监测T细胞增殖、已知激活标记物的表达或细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，向受治疗者施用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体，以降低调控T细胞的水平，例如降低肿瘤调控T细胞的水平。在另一个实施方案中，通过施用如本文所提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体来诱导或增强效应T细胞活性。

包括本发明所公开的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段的试剂盒在本发明的范围之内。所述试剂盒可用于实施使用本文提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的方法或本领域技术人员已知的其它方法。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段以及用于检测生物样本中proTGFβ1-GARP复合物的存在的试剂，以及任选地在不使用时容纳proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段的容器，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段的使用说明，附连至固体载体的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段，和/或proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段的可检测标记形式。

附图说明

图1示出将4B1C1和4B16B9添加至T细胞共培养物通过增强T效应细胞的生长来抑制T调控细胞活性。

图2示出4B1C1和4B16B9抑制TGFβ1的激活，如通过SMAD信号转导评估的。

图3示出由4B1C1和4B16B9剂量依赖性地抑制TGFβ1活性。

图4：proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选的Octet亲和力结果展示了结合人proTGFβ1-GARP复合物而非其它proTGFb1-复合物或可溶形式的TGFb1、2或3的特异性。

具体实施方式

定义

与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其它具体定义的术语应按照与本文提供的定义相符的方式理解。

如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。

如本文所用，术语“约”在涉及可测量值诸如量、时距等时，意指涵盖与指定值至多±10％的变化，因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在下述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望特性而变化。在最低程度上且不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的保护范围的前提下，至少应当根据所报告的数值的有效数位并通过应用惯常的四舍五入法来解释每一个数值参数。

尽管用以阐明本发明之宽范围的数值范围和参数是近似的，但在具体的示例中提出的数值却是尽可能精确地报告的。然而，任何数值均固有地含有某些误差，该误差必然会由存在于其各自测试测量法中的标准偏差产生。

“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其它生物组分(即其它染色体和染色体外DNA和RNA以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离的”核酸、肽和蛋白质可以是组合物的一部分，并且如果此类组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离的”抗体或抗原结合片段旨在意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体或抗原结合片段的抗体或抗原结合片段(例如，分离的抗体即proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体基本上不含不是proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体的抗体)。

如本文所用，术语“转化生长因子β-1”和“TGFβ1”具体地包括人TGFβ1蛋白质。TGFβ1在科学文献中也被称为TGFbeta1和TGFB1。TGFβ1生长因子与前结构域结合地合成，例如如GenBank^TM登录号AK291907，NCBI参考序列：NP_000651.3.1和UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01137.2所述(另参见Derynck等人，1985,Nature 316,701-705)。在一个具体的实施方案中，TGFβ1翻译蛋白质是具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的人蛋白质。包括前结构域和生长因子元件两者的TGFβ1在本文中被称为“proTGFβ1”。在一些实施方案中，proTGFβ1包括前结构域和生长因子组分，它们经蛋白水解而分离，但仍通过一种或多种化学相互作用而相关联。此类化学相互作用可包括但不限于疏水键、受范德华力影响的相互作用、极性和离子相互作用、氢键、以及非共价键。

如本文所用，术语“糖蛋白A为主的重复序列”和“GARP”是指人GARP。GARP又被称为富含亮氨酸重复序列的蛋白质32(LRRC32)和garpin。NCBI参考序列NP_001122394.1和NP_005503.1提供了示例性的人GARP氨基酸序列。在特定实施方案中，GARP为SEQ ID NO:1的人GARP。

除非另有说明，否则“抗体”是指包括各种单体、聚合和嵌合形式的免疫球蛋白的所有同种型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD和IgY)。术语“抗体”具体地涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)和抗体样多肽，诸如嵌合抗体和人源化抗体。

“抗原结合片段”是可以对特定抗原表现出结合亲和力的任何蛋白质性结构。抗原结合片段包括通过任何已知技术诸如酶切割、肽合成和重组技术提供的那些。一些抗原结合片段由完整抗体的保留亲本抗体分子的抗原结合特异性的部分构成。例如，抗原结合片段可包含已知结合特定抗原的抗体的至少一个可变区(重链可变区或轻链可变区)或者一个或多个CDR。合适的抗原结合片段的示例包括但不限于双体抗体和单链分子以及Fab、F(ab')2、Fc、Fabc和Fv分子；单链(Sc)抗体；单个抗体轻链；单个抗体重链；抗体链或CDR与其它蛋白质之间的嵌合融合体；蛋白质支架；重链单体或二聚体；轻链单体或二聚体；由一条重链和一条轻链组成的二聚体；由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；或如WO2007059782中所述的单价抗体；包含由铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；基本上由V.sub.H和C.sub.H1结构域组成的Fd片段；基本上由抗体的单臂的VL结构域和VH结构域组成的Fv片段；基本上由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341,544-546(1989))，并且也被称为结构域抗体(Holt等人，Trends Biotechnol.，2003年11月，21(11):484-90)；羊驼或纳米抗体(Revets等人，Expert Opin Biol Ther.，2005年1月，5(1):111-24)；分离的互补决定区(CDR)等。所有抗体同种型均可用于产生抗原结合片段。另外，抗原结合片段可包括非抗体蛋白质性框架，其可成功地以赋予感兴趣的给定抗原(诸如蛋白质支架)亲和力的取向并入多肽区段。抗原结合片段可重组产生或通过对完整抗体的酶切割或化学切割产生。短语“抗体或其抗原结合片段”可用于表示给定的抗原结合片段并入该短语中提及的抗体的一个或多个氨基酸区段。

术语“CDR”及其复数“CDRs”是指互补决定区(CDR)，其中三个构成轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)的结合特征，并且三个构成重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的结合特征。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且由包含支架或框架区的氨基酸序列分开。确切定义的CDR边界和长度受限于不同的分类和编号系统。因此，可通过Kabat、Chothia、contact或任何其它边界定义来引用CDR。尽管边界不同，但这些系统中的每一个在可变序列内构成所谓的“高变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可在长度和相对于相邻框架区域的边界区域方面不同。参见例如Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物No.91-3242(1991)；Chothia等人,“Canonical Structures FortheHypervariableRegions ofImmunoglobulins,”J.Mol.Biol.196:901(1987)；以及MacCallum等人，“Antibody-Antigen Interactions:Contact Analysis and Binding Site Topography”，J.Mol.Biol.262:732(1996))；这些文献中的每一篇据此全文均以引用方式并入。

通常，CDR形成可被分类为规范结构的环状结构。术语“规范结构”是指抗原结合(CDR)环所采用的主链构象。从比较结构研究中，已发现六个抗原结合环中的五个仅具有受限的可用构象库。每个规范结构可由多肽主链的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可具有非常相似的三维结构，尽管环的大部分区域具有高氨基酸序列可变性(Chothia等人，“Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins”，J.Mol.Biol.196:901(1987)；Chothia等人，“Conformations of ImmunoglobulinHypervariable Regions”，I 342:877(1989)；Martin和Thornton，“Structural Familiesin Loops ofHomologous Proteins:Automatic Classification,Modelling andApplication to Antibodies”，J.Mol.Biol.263:800(1996)；这些文献中的每一篇全文均以引用方式并入)。此外，采用的环状结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类的构象由环的长度以及位于环内以及保守框架内(即，环外部)关键位置处的氨基酸残基确定。因此，可基于这些关键氨基酸残基是否存在来进行对特定规范类的分配。

术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并且从其最广泛的意义上来讲，是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽物的化合物。亚基可由肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可由其它键连接，例如，酯、醚等。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然氨基酸或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D光学异构体和L光学异构体两者、氨基酸类似物和模拟肽物。如果肽链短，则三个或更多个氨基酸的肽通常被称为寡肽。如果肽链长，则肽通常被称为多肽或蛋白质。

当在抗体或抗体片段的上下文中使用时，“特异性地结合”或“特异地结合”或其衍生术语表示经由由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的结构域结合至感兴趣的蛋白质的一个或多个表位，而不优先结合含有混合分子群的样本中的其它分子。通常，抗体以如通过表面等离振子共振测定或细胞结合测定来测量的小于约1×10^-8M的K_d结合至同源抗原。在一个优选的实施方案中，结合特异性使用生物层干涉测量法进行测量。短语诸如“[抗原]特异性”抗体意在表达所述抗体特异性地结合所述抗原。

同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或者是单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括如通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。

“载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，其中可以可操作地插入另一核酸区段以便引起该区段的复制或表达。

如本文所用，术语“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在具体的实施方案中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的后代或潜在后代。此类细胞的后代可与用核酸分子转染的亲本细胞不同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。术语“表达”和“产生”在本文中同义使用，并且是指基因产物的生物合成。这些术语涵盖基因到RNA的转录。这些术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。抗体或其抗原结合片段的表达或产生可以在细胞的细胞质内，或者在胞外环境中诸如细胞培养物的生长培养基中。“基本上相同”的含义可根据使用该术语的上下文而不同。由于重链和轻链以及编码它们的基因之间可能存在的天然序列变异，预期在氨基酸序列或编码本文所述的抗体或抗原结合片段的基因中发现一定程度的变异，而对其独特的结合特性(例如，特异性和亲和力)产生的影响很小或没有影响。此类预期部分归因于遗传密码的简并性以及保守氨基酸序列变异的成功进化，但这不会明显改变所编码蛋白质的性质。因此，在核酸序列的上下文中，“基本上相同”意指两个或更多个序列之间具有至少65％同一性。优选地，该术语是指两个或更多个序列之间具有至少70％同一性，更优选地至少75％同一性，更优选地至少80％同一性，更优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少91％同一性，更优选地至少92％同一性，更优选地至少93％同一性，更优选地至少94％同一性，更优选地至少95％同一性，更优选地至少96％同一性，更优选地至少97％同一性，更优选地至少98％同一性，并且更优选地至少99％或更大同一性。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目/位置总数×100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性可以例如使用E.Meyers和W.Miller，Comput.Appl.Biosci 4，11-17(1988)的算法(该算法已经并入ALIGN程序(版本2.0)中)，使用PAM120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48,444-453(1970)的算法来确定。

在蛋白质的氨基酸序列内可能发生的对蛋白质功能没有实质性影响的变异程度远低于核酸序列的变异程度，因为相同的简并性原则不适用于氨基酸序列。因此，在抗体或抗原结合片段的上下文中，“基本上相同”意指与所述抗体或抗原结合片段具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的抗体或抗原结合片段。其它实施方案包括具有框架、支架或其它非结合区的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段，其不与本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段具有显著的同一性，但确实并入一个或多个CDR或赋予与本文所述的此类序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结合所需的其它序列。

“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(K_D)表示。亲和力可以本领域已知的多种方式测量和/或表达，这些方式包括但不限于平衡解离常数(K_D)和平衡缔合常数(KA)。K_D由k_解离/k_缔合的商来计算，而K_A由k_缔合/k_解离的商来计算。k_缔合是指例如抗体对抗原的缔合速率常数，并且k_解离是指例如抗体对抗原的解离。k_缔合和k_解离可通过本领域普通技术人员已知的技术来确定，诸如生物层干涉测量法。

术语“受治疗者”是指人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物诸如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的许多实施方案中，受治疗者是人。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段

本文描述了作为proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体的分离的单克隆抗体或抗原结合片段。如本文所用，术语“proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体”是指具有独特的亲和力、特异性和活性的抗体。proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体可具有：(1)当proTGFβ1在溶液中与人GARP复合时，对人proTGFβ1而言小于或等于1nM的解离常数(Kd)(如使用无细胞测定测量的)；(2)对于抑制TGFβ1生长因子从细胞相关联的proTGFβ1-GARP复合物释放具有小于或等于10nM的抑制浓度(IC50)；(3)相对于TGFβ1生长因子结构域、TGFβ2生长因子结构域、TGFβ3生长因子结构域、与LTBP1共价缔合的proTGFβ1、与LTBP3共价缔合的proTGFβ1、以及与LRRC33共价缔合的proTGFβ1中的每者，对proTGFβ1-GARP复合物具有大于100倍的选择性(如通过结合亲和力测量的，即Kd值)。以及(4)当proTGFβ1不与GARP复合时，对proTGFβ1没有亲和力。在一些情况下，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体还相对于与LTBP2和/或LTBP4共价缔合的proTGFβ1，对proTGFβ1-GARP复合物具有大于100倍的选择性。抗体分子的一般结构包括抗原结合结构域，该结构域包含重链和轻链以及Fc结构域，并发挥多种功能(包括补体固定和结合抗体受体)。

所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段包括所有同种型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，以及四链免疫球蛋白结构的合成多聚体。所述抗体或抗原结合片段也包括通常存在于母鸡或火鸡血清和母鸡或火鸡蛋黄中的IgY同种型。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段可通过重组方式来源于任何物种。例如，抗体或抗原结合片段可以是小鼠、大鼠、山羊、马、猪、牛、鸡、兔、羊驼、驴、人或其嵌合型式。为适于施用于人，非人源抗体或抗原结合片段可以在施用于人类患者时被基因或结构改变成抗原性较低。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是嵌合的。如本文所用，术语“嵌合”是指抗体或其抗原结合片段的至少一个可变结构域的至少某些部分来源于非人哺乳动物、啮齿动物或爬行动物的抗体氨基酸序列，而抗体或其抗原结合片段的其余部分来源于人。

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。人源化抗体可以是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合亚序列)。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)中的残基由具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR中的残基替换。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，且一般是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。人源化抗体可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。

本文所述的抗体或抗原结合片段可以多种形式存在，但将包含表1所示的抗体CDR中的一者或多者。

在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段为人IgG或其衍生物。虽然本文例示的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段是人的，但是所例示的抗体或抗原结合片段也可以是嵌合的。

在一些实施方案中，提供了proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体，其包含含有表1所述抗体中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的重链以及含有表1所述抗体中的任一种的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。

在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:4的重链CDR1、含有SEQ ID NO:5的重链CDR2、含有SEQ ID NO:6的重链CDR3、含有SEQ ID NO:7的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:8的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:9的轻链CDR3。该proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段能够以880pM或更小的亲和力结合proTGFβ1-GARP复合物的proTGFβ1，能够在体外抑制Treg功能，并且能够抑制TGFβ1的激活。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:17基本上相同或相同的轻链。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列1至118基本上相同或相同的重链可变区以及与SEQ ID NO:17的氨基酸序列1至107基本上相同或相同的轻链可变区。本段中所讨论的抗体的重链和轻链可变区适用于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体臂。

在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:10的重链CDR1、含有SEQ ID NO:11的重链CDR2、含有SEQ ID NO:12的重链CDR3、含有SEQ ID NO:13的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:14的轻链CDR2以及含有SEQ ID NO:15的轻链CDR3。该proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段可包含人框架序列。该proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段能够以880pM或更小的亲和力结合proTGFβ1-GARP复合物的proTGFβ1，能够在体外抑制Treg功能，并且能够抑制TGFβ1的激活。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:18基本上相同或相同的重链以及与SEQ ID NO:19基本上相同或相同的轻链。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列1至121基本上相同或相同的重链可变区以及与SEQ ID NO:19的氨基酸序列1至110基本上相同或相同的轻链可变区。本段中所讨论的抗体的重链和轻链可变区适用于包含在双特异性构建体中，其中一个臂为proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体臂。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段可具有与SEQ ID NO:4至15的CDR氨基酸序列和SEQ ID NO:16至19的可变区氨基酸序列有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性，至少97％同一性、至少98％同一性、以及至少99％或更大同一性的氨基酸序列。

本发明还公开了编码本公开的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的分离的多核苷酸。能够编码本文提供的可变结构域区段的分离的多核苷酸可包括在相同或不同的载体上以产生抗体或抗原结合片段。

编码重组抗原结合蛋白质的多核苷酸也在本公开的范围内。在一些实施方案中，所述多核苷酸(及其编码的肽)包含前导序列。可以采用本领域已知的任何前导序列。前导序列可包含但不限于限制性位点或翻译起始位点。

本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段包括这样的变体：其具有保留所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的生物特性(例如，结合亲和力或免疫效应活性)的单个或多个氨基酸置换、缺失或添加。这些变体可包括：(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸置换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸添加到多肽或从多肽缺失的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基的变体，以及(d)其中多肽与另一种肽或多肽(诸如融合配偶体、蛋白质标签或其它化学部分)融合的变体，其可赋予多肽有用的特性，诸如例如抗体的表位、多组氨酸序列、生物素部分等。本文所述的抗体或抗原结合片段可包括这样的变体：其中来自一个物种的氨基酸残基在保守位置或非保守位置处置换为另一物种中的对应残基。在其它实施方案中，非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基置换。得到这些变体的技术，包括基因技术(缺失、突变等)、化学技术和酶技术，是本领域普通技术人员已知的。

本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段可包括若干抗体同种型，诸如IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在一些实施方案中，抗体同种型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，优选地IgG1同种型。抗体或其抗原结合片段的特异性主要是由CDR的氨基酸序列和排列决定的。因此，一种同种型的CDR可转变为另一种同种型而不改变抗原特异性。另选地，已经建立技术使杂交瘤从产生一种抗体同种型转换到产生另一种同种型(同种型转换)而不改变抗原特异性。因此，此类抗体同种型在所述抗体或抗原结合片段的范围内。

本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段对proTGFβ1-GARP复合物的proTGFβ1具有包括小于约880pM的解离常数(K_D)的结合亲和力。所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的亲和力可通过本领域已知的多种方法诸如生物层干涉测量法、表面等离振子共振或基于ELISA的方法来确定。通过生物层干涉测量法测量亲和力的测定包括使用OctetRed 384所进行的测定，其中该测定在室温(例如25℃或接近25℃)下进行，其中能够结合proTGFβ1-GARP复合物的proTGFβ1的抗体被捕集在装载有生物素酰化proTGFβ1-GARP复合物的链霉抗生物素蛋白生物传感器上。

还提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。载体可以是表达载体。因此，预期含有编码感兴趣多肽的序列的重组表达载体也在本公开的范围内。表达载体可含有一个或多个附加的序列，诸如但不限于调控序列(例如启动子、增强子)、选择标记和聚腺苷酸化信号。用于转化多种宿主细胞的载体是熟知的，并且包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、杆状病毒、杆粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)以及其它细菌、酵母和病毒载体。

本说明书范围内的重组表达载体包括合成的、基因组或cDNA衍生的核酸片段，这些片段编码可以可操作地连接至合适的调控元件的至少一种重组蛋白。此类调控元件可包含转录启动子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体，特别是哺乳动物表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接至待表达的基因的合适启动子和增强子、其它5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。

用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可以由病毒源提供。示例性载体可如Okayama和Berg，3Mol.Cell.Biol.280(1983)所述那样构建。

在一些实施方案中，将抗体编码序列或抗原结合片段编码序列置于强效组成型启动子(诸如用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等)的控制下。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。这类病毒启动子包括但不限于细胞巨化病毒(CMV)立即早期启动子、SV40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒(EBV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)和其它逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。在一个实施方案中，将proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段编码序列置于诱导型启动子(诸如金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、多西环素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的应答元件(ISRE)(诸如蛋白激酶R 2',5'-寡腺苷酸合成酶、Mx基因、ADAR1等)的启动子)的控制下。

本文所述的载体可含有一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。IRES序列包含在融合载体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在一些实施方案中，载体系统将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，SV40)，这些位点可在上述核酸序列中的任一个的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在ORF之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如IRES基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。

载体可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性和阴性选择标记，例如，抗生素抗性基因(例如，新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因)、谷氨酸合酶基因、HSV-TK、用于更昔洛韦选择的HSV-TK衍生物或用于6-甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(Gadi等人，7Gene Ther.1738-1743(2000))。编码选择标记或克隆位点的核酸序列可以在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。

本文所述的载体可用于用编码所述抗体或抗原结合片段的基因转化各种细胞。例如，载体可用于生成proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或产生抗原结合片段的细胞。因此，另一方面的特征是用包含编码特异性地结合proTGFβ1-GARP复合物的proTGFβ1的抗体或其抗原结合片段(诸如本文所描述和例示的抗体或抗原结合片段)的核酸序列的载体转化的宿主细胞。

本领域已知用于将外来基因引入细胞中的多种技术，并且出于实施所述方法的目的，这些技术可用于根据本文所描述和例示的各种实施方案构建重组细胞。所使用的技术应当使异源基因序列向宿主细胞稳定转移，使得异源基因序列是可遗传的并且可由细胞子代表达，并且使得受体细胞的必要发育和生理功能不被破坏。可以使用的技术包括但不限于染色体转移(例如细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移)、物理方法(例如转染、原生质球融合、显微注射、电穿孔、脂质体载体)、病毒载体转移(例如，重组DNA病毒、重组RNA病毒)等(描述于Cline,29Pharmac.Ther.69-92(1985))。也可以使用磷酸钙沉淀和聚乙二醇(PEG)诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合来转化细胞。

适用于表达本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段的细胞优选地为真核细胞，更优选地为植物、啮齿动物或人来源的细胞，例如但不限于NSO、CHO、CHOK1、perC.6、Tk-ts13、BHK、HEK293细胞、COS-7、T98G、CV-1/EBNA、L细胞、C127、3T3、HeLa、NS1、Sp2/0骨髓瘤细胞和BHK细胞系等。此外，可使用杂交瘤细胞完成抗体的表达。用于产生杂交瘤的方法是本领域中已良好建立的。

可以选择或筛选用本文所述的表达载体转化的细胞用于本文所述的抗体或抗原结合片段的重组表达。扩增和筛选重组阳性细胞，并且筛选表现出所需表型(诸如高水平表达、增强的生长特性或例如由于蛋白质修饰或改变的翻译后修饰产生具有所需生化特征的蛋白质的能力)的亚克隆。这些表型可能是由于给定亚克隆的固有特性或由于突变造成的。突变可通过使用化学品、UV波长光、辐射、病毒、插入诱变剂、DNA错配修复的抑制或此类方法的组合来实现。

使用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体用于治疗的方法

本文提供了在治疗中使用的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段。具体地，这些抗体或抗原结合片段可用于治疗癌症。如上所述，从Treg释放的活性TGFβ1抑制其它T细胞的作用。因此，抑制TGFβ1介导的免疫抑制功能提供了一种用于加强针对多种癌症的免疫应答的引人注目的方法。proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体可用于治疗实体瘤以及包括白血病的血液学癌症。

用于这些方法的抗体包括上文所述的那些抗体，例如，具有表1所述特征的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段，例如在这些抗体的进一步论述中的CDR或可变结构域序列。

在本文所述的一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体的免疫效应特性可通过本领域技术人员已知的技术通过Fc修饰来调节。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等，可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后致使靶细胞裂解。

单克隆抗体诱导ADCC的能力可通过工程化其寡糖组分来增强。人IgG1或IgG3在Asn297处被熟知的双分枝G0、G0F、G1、G1F、G2或G2F形式的大多数聚糖N-糖基化。未工程化的CHO细胞所产生的抗体通常具有约至少85％的聚糖岩藻糖含量。从连接至Fc区的双分枝复合物型寡糖去除核心岩藻糖，可经由改善的Fc.γ.RIIIa结合来增强抗体的ADCC，而不会改变抗原结合或CDC活性。此类mAb可使用据报道能引起具有双分枝复合物型Fc寡糖的相对高去岩藻糖基化抗体的成功表达的不同方法实现，诸如控制培养物渗透压(Konno等人，Cytotechnology 64:249-65,2012)，应用变体CHO细胞系Lec13作为宿主细胞系(Shields等人，J Biol Chem 277:26733-26740,2002)，应用变体CHO细胞系EB66作为宿主细胞系(Olivier等人，MAbs；2(4),2010；Epub ahead of print；PMID:20562582)，应用大鼠杂交瘤细胞系YB2/0作为宿主细胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278:3466-3473,2003)，引入特异性针对α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的小干扰RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng88:901-908,2004)，或共表达β-1,4-N-乙酰胺基葡萄糖转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II或强效α-甘露糖苷酶I抑制剂，几夫碱(Ferrara等人，J Biol Chem281:5032-5036,2006；Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93:851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng99:652-65,2008)。

在本文所述的一些实施方案中，也可通过抗体Fc中的某些置换来增强由proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体引发的ADCC。示例性置换为例如在氨基酸位置256、290、298、312、356、330、333、334、360、378或430(根据EU索引对残基进行编号)处的置换，如美国专利6,737,056中有所描述。

药物组合物和施用

本文提供的药物组合物包含：a)有效量的本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段，以及b)药学上可接受的载体，其可以是惰性或生理活性载体。在优选的实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体为如本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的示例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等、以及它们的任何组合中的一者或多者。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。具体地，合适的载体的相关示例包括：(1)pH为约7.4、含或不含约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白的杜氏磷酸盐缓冲盐水，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，以及(3)5％(w/v)右旋糖；并且还可含有抗氧化剂诸如色胺和稳定剂诸如Tween

本文的组合物还可含有对所治疗的特定障碍必需的另外的治疗剂。优选地，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段和补充活性化合物将具有不会对彼此产生不利影响的互补活性。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为阿糖胞苷、蒽环霉素、组胺二盐酸盐或白介素2。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂。

本发明的组合物可具有多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，但优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式。优选的施用模式为肠胃外施用(例如静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、皮下施用)。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物通过推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注施用。在另一个优选的实施方案中，这些组合物通过肌内、皮下、关节内、滑膜内、肿瘤内、肿瘤周围、病灶内或病灶周围途径注射，以发挥局部以及全身治疗效果。

用于肠胃外施用的无菌组合物可通过以下方式制备：将所需量的本发明的抗体、抗体片段或抗体缀合物掺入适当的溶剂中，然后通过微滤技术进行灭菌。可使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等、以及它们的组合作为溶剂或媒介物。在许多情况下，优选的是组合物中包含等渗剂，诸如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物还可含有辅助剂，具体地润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。用于肠胃外施用的无菌组合物也可制备成无菌固体组合物的形式，其在使用时可溶解于无菌水或任何其它可注射的无菌介质中。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段也可口服施用。作为用于口服施用的固体组合物，可使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、小药囊)或颗粒剂。在这些组合物中，根据本发明的活性成分与一种或多种惰性稀释剂(诸如淀粉、纤维素、蔗糖、乳糖或二氧化硅)在氩气流下混合。这些组合物还可包含除稀释剂之外的物质，例如一种或多种润滑剂(诸如硬脂酸镁或滑石)、着色剂、包衣(糖衣片)或釉料。

作为用于口服施用的液体组合物，可使用含有惰性稀释剂(诸如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油)的药学上可接受的溶液、混悬剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。这些组合物可包含除稀释剂之外的物质，例如润湿、增甜、增稠、矫味或稳定产品。

这些物质的剂量取决于期望的效应、治疗持续时间和所用的施用途径；对于成人来说，通常每日口服介于5mg和1000mg之间的这些物质，单位剂量在1mg至250mg活性物质范围内。一般来讲，医生将根据年龄、体重和待治疗的受治疗者特有的任何其它因素来确定适当的剂量。

在一个优选的实施方案中，本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个更优选的实施方案中，含有本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段的上文所公开的药物组合物中的一种用于治疗哺乳动物中的过度增殖性障碍。在一个实施方案中，该障碍是癌症。多种不同的癌性肿瘤，诸如对于肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、脑肿瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、尤文氏肿瘤、颅外生殖细胞瘤、眼癌、胆囊癌、胃癌、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、肾癌、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、梅克尔细胞癌、头颈部转移性鳞癌、骨髓瘤、赘生物、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘生物、前列腺癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾细胞癌、唾液腺癌、皮肤癌、卡波济氏肉瘤、T细胞淋巴瘤、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌、或韦尔姆斯氏瘤可用本文所述的抗体进行治疗。

在前述癌症中的任一种的治疗中，所提供的治疗方法可用于抑制肿瘤的进一步生长、诱导肿瘤消退、增长无进展存活期和/或延长患有肿瘤的个体的总体存活期。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体还可延迟或预防癌细胞转移的发作。可使用各种方法监测治疗进展。例如，抑制可导致肿瘤尺寸的减小和/或肿瘤内代谢活性的降低。可通过例如MRI或PET扫描来测量这两个参数。还可通过活检来监测抑制，以探知肿瘤内的坏死程度、肿瘤细胞死亡和血管分布水平。可使用已知方法来监测癌细胞转移的程度。因此，本发明的药物组合物可用于治疗或预防多种癌症的转移，这些癌症包括(但不限于)以下癌症：黑素瘤、肺癌、头颈癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、食道癌、睾丸癌、卵巢癌、鳞状细胞癌(例如，头颈鳞状细胞癌—SCCHN)、葡萄膜黑素瘤、滤泡性淋巴瘤、宫颈癌、脑癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤、何杰金氏病、多发性骨髓瘤、胃癌和星状细胞癌。

类似地，本文还提供了用于抑制所选细胞群生长的方法，该方法包括仅使表达TGFβ1的免疫细胞接触有效量的本公开的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段，或者与其它治疗剂组合，使表达TGFβ1的免疫细胞接触有效量的本公开的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗体片段。在优选的实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体为如本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，另外的治疗剂为免疫疗法，即，诱导或增强免疫应答的免疫刺激剂。此类物质可包括例如：1)树突细胞的激活剂，2)疫苗辅助剂，3)T细胞刺激物，4)免疫检查点的抑制剂，以及5)抑制性细胞、细胞因子和/或酶的抑制剂。因此，在一个实施方案中，抗体与疫苗一同施用。

对于临床使用，将治疗有效量的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段施用于对其有需要的受治疗者。例如，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体及其抗原结合片段可用于治疗含有TGFβ1阳性免疫细胞的癌性肿瘤。在优选的实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体为如本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，受治疗者是哺乳动物，优选地人。在一些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段将以经无菌性测试的溶液形式施用。

调节上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可施用单次推注，可随着时间推移施用若干分份剂量，或如由治疗情况的紧急指示可按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可被配制成易于施用且剂量一致的剂量单位形式。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和片段的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。本发明的化合物的治疗有效量的示例性、非限制性范围为约0.001mg/kg至10mg/kg，诸如约0.001mg/kg至5mg/kg(例如约0.001mg/kg至2mg/kg)，诸如约0.001mg/kg至1mg/kg(例如约0.001mg/kg、约0.01mg/kg、约0.1mg/kg、约1mg/kg或约10mg/kg)。

本领域中具有普通技能的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医开始在药物组合物中使用的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段的剂量的水平可低于为了达到期望的治疗效果所需的水平，然后逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常，本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用方式可为例如肠胃外施用，诸如静脉内、肌内或皮下。在一个实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段可通过以mg/m²计算的每周剂量输注来施用。根据下式：剂量(mg/kg)×70，此类剂量可例如基于上文提供的mg/kg剂量。此类施用可重复例如1至8次，诸如3至5次。可通过在2至24小时(诸如2至12小时)的时间段内连续输注进行施用。在一个实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段可通过长时间(诸如多于24小时)的缓慢连续输注来施用，以便减少毒副作用。

在一个实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段可以作为固定剂量计算的每周剂量施用多达八次，诸如当每周施用一次时为四至六次。此类方案可根据需要例如在六个月或十二个月后重复一次或多次。此类固定剂量可例如基于以上提供的mg/kg剂量，其中体重估计为70kg。可通过测量本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体在通过例如取出生物样本施用时在血液中的量并且使用靶向本发明的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体的抗原结合区的抗独特型抗体来确定或调节剂量。

在一个实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段可通过维持疗法施用，诸如例如，每周一次，持续六个月或更长时间。

还可预防性地施用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或片段，以便降低罹患癌症的风险、延迟癌症进展中事件的发作和/或在癌症缓解后降低复发的风险。

如本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体及其片段还可组合疗法施用，即与待治疗的疾病或病症相关的其它治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含抗体的药物用于与一种或多种另外的治疗剂(诸如化学治疗剂)组合。在一些实施方案中，其它治疗剂包括但不限于包括烷基化剂的抗肿瘤剂，该烷基化剂包括：氮芥类，诸如双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU)；Temodal^TM(替莫唑胺)、乙撑亚胺/甲基蜜胺类，诸如三乙撑蜜胺(TEM)、三乙烯、三胺硫磷(噻替哌)、六甲基蜜胺(HMM，六甲蜜胺)；烷基磺酸盐类，诸如白消安；三嗪类，诸如达卡巴嗪(DTIC)；抗代谢物，其包括：叶酸类似物，诸如甲氨蝶呤和三甲曲沙；嘧啶类似物，诸如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟脱氧尿苷、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖胞苷)、5-阿扎胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷；嘌呤类似物，诸如6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁)、红羟基壬基腺嘌呤(EHNA)、磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA)；包括抗有丝分裂药物的天然产品，诸如紫杉醇、长春花生物碱(包括长春碱(VLB)、长春新碱和长春瑞滨)、泰索帝、雌莫司汀和磷酸雌莫司汀；鬼臼毒素，诸如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，诸如放线菌素D、道诺霉素(红比霉素)、多柔比星、米托蒽醌、伊达比星、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素)、丝裂霉素C和放线菌素；酶，诸如L-天冬酰胺酶；生物应答调节剂，诸如α干扰素、IL-2、G-CSF和GM-CSF；各种物质，包括铂配位复合物(诸如顺铂和卡铂)、蒽醌类药物(诸如米托蒽醌)、取代脲(诸如羟基脲)、N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼的甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂(诸如米托坦(o,p-DDD)和氨鲁米特)；激素和拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如泼尼松以及等效物、地塞米松和氨鲁米特；Gemzar^TM(吉西他滨)、孕激素，诸如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，诸如己烯雌酚和炔雌醇等效物；抗雌激素药，诸如他莫昔芬；雄激素，包括丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素药，诸如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾类抗雄激素药，诸如氟他胺。靶向表观遗传机制的疗法包括但不限于组蛋白脱乙酰酶抑制剂疗法、脱甲基化剂(例如，Vidaza)疗法和转录抑制(ATRA)释放疗法，其可与proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体组合。

化学治疗剂的附加具体示例包括紫杉酚、紫杉烷类(例如，多西紫杉醇和泰索帝)、改性紫杉醇(例如，Abraxane和Opaxio)、多柔比星、Sutent、Nexavar以及其它多重激酶抑制剂，顺铂和卡铂、依托泊苷、吉西他滨和长春碱。其它激酶的特异性抑制剂还可与proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体组合使用，这些特异性抑制剂包括但不限于MAPK通路抑制剂(例如，ERK、JNK和p38的抑制剂)、PI3激酶/AKT抑制剂和Pim抑制剂。其它抑制剂包括Hsp90抑制剂、蛋白酶体抑制剂(例如，Velcade)和多重机制作用抑制剂诸如Trisenox。

此类组合施用可以任何顺序同时、分开或顺序进行。对于同时施用，这些物质可作为一种组合物施用或作为单独的组合物施用，视情况而定。

在一个实施方案中，将proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段与刺激抗原递呈细胞的物质组合。此类物质的示例包括各种CD40激动剂，诸如激动剂抗CD40抗体或CD40L。

一些方法涉及与疫苗辅助剂一起施用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段。此类辅助剂包括例如IL-12和各种Toll样受体(TLR)激动剂，这些激动剂包括CpG(TLR9激动剂)、单磷酰脂质A(MPL-αTLR4激动剂)、PolyI:C或PolyICLC(TLR3激动剂)以及瑞喹莫德和852A(TLR7/8激动剂)。

在其它治疗方法中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体与T细胞生长因子诸如IL-15和/或IL-17或者这些分子的激活剂组合施用。在相关方法中，T细胞刺激物与proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体组合。此类刺激物包括4-1BB的激动剂，诸如激动剂抗4-1BB抗体和4-1BBL。

在一个实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段与T细胞检查点抑制剂一起施用，例如，向免疫系统发送抑制信号的分子。此类物质的示例包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，诸如抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体，该抗PD-1抗体包括纳武单抗(Bristol-Myers Squibb)和派姆单抗，也被称为MK-3475(Merck)、皮地利珠单抗(Curetech)、AMP-224(Amplimmune)；该抗PD-L1抗体包括MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Bristol Myer Squibb)、MEDI-4736(AstraZeneca)和MSB-0010718C(Merck)。其它检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂，诸如抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA4抗体为由Bristol-Myers Squibb出售的(伊匹单抗)。其它示例性CTLA-4抗体包括曲美目单抗(Pfizer)、替西木单抗(AstraZeneca)和AMGP-224(Glaxo Smith Kline)。

在其它方法中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段与具有免疫抑制作用的酶抑制剂组合施用。示例是1-甲基色氨酸(1MT)，其为吲哚胺2,3-双加氧酶的小分子抑制剂。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段也可与Amgen的T-VEC(talimogenelaherparepvec)组合使用。

在某些实施方案中，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段与双特异性抗体组合施用。双特异性抗体可引导宿主针对癌细胞的免疫系统，具体地T细胞的细胞毒活性。

proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段也可与多种靶向疗法组合施用。靶向疗法的示例包括但不限于使用治疗性抗体。示例性抗体包括但不限于与肿瘤细胞上呈现的细胞表面蛋白质(Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白类和表皮生长因子受体(EGFR))、OX40、PD-1、CTLA-4结合的抗体，并且任选地诱导表达这些蛋白质的肿瘤细胞上的细胞抑制和/或细胞毒性作用。示例性抗体还包括可用于治疗乳腺癌和其它形式的癌症的(曲妥珠单抗)以及可用于治疗非何杰金氏淋巴瘤和其它形式的癌症的(利妥昔单抗)、ZEVALIN^TM(替伊莫单抗)和LYMPHOCIDE^TM(依帕珠单抗)。某些示例性抗体还包括帕尼单抗(IMC-C225)；BEXXAR^TM(碘131托西莫单抗)；KDR(激酶结构域受体)抑制剂；抗VEGF抗体和拮抗剂(例如，和VEGAF-TRAP)；抗VEGF受体抗体和抗原结合区；抗Ang-1抗体和抗Ang-2抗体以及抗原结合区；针对Tie-2以及其它Ang-1和Ang-2受体的抗体；Tie-2配体；针对Tie-2激酶抑制剂的抗体；Hif-1a的抑制剂和Campath^TM(阿仑单抗)。在某些实施方案中，癌症治疗剂为选择性诱导肿瘤细胞凋亡的多肽，包括但不限于TNF相关多肽TRAIL。

在一个实施方案中，如本文所提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段与减少血管生成的一种或多种抗血管生成剂组合使用。某些此类物质包括但不限于IL-8拮抗剂；Campath，B-FGF；FGF拮抗剂；Tek拮抗剂(Cerretti等人，美国公布2003/0162712；Cerretti等人，美国专利6,413,932和Cerretti等人，美国专利6,521,424)；抗TWEAK剂(其包括但不限于抗体和抗原结合区)；可溶性TWEAK受体拮抗剂(Wiley，美国专利6,727,225)；用于拮抗整联蛋白与其配体的结合的ADAM解整合蛋白结构域(Fanslow等人，美国公布2002/0042368)；抗eph受体和抗ephrin抗体；抗原结合区或拮抗剂(美国专利5,981,245；5,728,813；5,969,110；6,596,852；6,232,447；6,057,124)；抗VEGF剂(例如，特异性地结合VEGF或可溶性VEGF受体或其配体结合区的抗体或抗原结合区)，诸如或VEGF-TRAP^TM以及抗VEGF受体剂(例如，与其特异性地结合的抗体或抗原结合区)，EGFR抑制剂(例如，与其特异性地结合的抗体或抗原结合区)，诸如帕尼单抗、IRESSA^TM(吉非替尼)、TARCEVA^TM(厄洛替尼)、抗Ang-1和抗Ang-2剂(例如，与其特异性地结合或者与其受体特异性地结合的抗体或抗原结合区，例如Tie-2/TEK)以及抗Tie-2激酶抑制剂(例如，特异性地结合并抑制生长因子的活性的抗体或抗原结合区，诸如肝细胞生长因子(HGF，也称为ScatterFactor)的拮抗剂和特异性地结合其受体“c-met”的抗体或抗原结合区(例如，利妥木单抗和AMG 337，Amgen))；抗PDGF-BB拮抗剂；抗体和PDGF-BB配体的抗原结合区；以及PDGFR激酶抑制剂。

可与proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段组合使用的其它抗血管生成剂包括物质诸如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环氧合酶II)抑制剂。可用的COX-II抑制剂的示例包括CELEBREX^TM(塞来昔布)、伐地昔布和罗非昔布。

如本文所提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段也可与生长因子抑制剂组合使用。此类物质的示例包括但不限于可抑制EGF-R(表皮生长因子受体)应答的物质，诸如EGF-R抗体(例如，帕尼单抗)、EGF抗体和EGF-R抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，诸如VEGF受体和可抑制VEGF的分子；以及erbB2受体抑制剂，诸如与erbB2受体结合的有机分子或抗体，例如(Genentech,Inc.)。EGF-R抑制剂在例如美国专利5,747,498、WO 98/14451、WO 95/19970和WO 98/02434中有所描述。

在一些治疗应用中，特别是当癌症已转移到骨骼使得骨骼受到不利影响时，与抑制进一步的骨质流失或有助于恢复已流失的骨质的治疗剂一起施用proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段可能是有用的。因此，proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其片段可与治疗有效量的骨生长促进(合成代谢)剂或抗骨质再吸收剂一起施用，该抗骨质再吸收剂包括但不限于：名为BMP-1至BMP-12的骨形态发生因子；转化生长因子-β和TGF-β家族成员；成纤维细胞生长因子FGF-1至FGF-10；白介素-1抑制剂(包括IL-1ra、IL-1抗体和IL-1受体抗体)；TNFα抑制剂(包括依那西普、阿达木单抗和英夫利昔单抗)；RANK配体抑制剂(包括特异性地结合RANK或RANK配体的可溶性RANK、骨保护素和拮抗性抗体，诸如地诺单抗)、Dkk-1抑制剂(例如，抗Dkk-1抗体)、甲状旁腺激素、E系列前列腺素、双膦酸盐以及骨骼增强矿物质诸如氟化物和钙。可与proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体及其功能片段组合使用的合成代谢剂包括甲状旁腺激素和胰岛素样生长因子(IGF)，其中后一种物质优选地与IGF结合蛋白质络合。适用于此类组合治疗的IL-1受体拮抗剂在WO89/11540中有所描述，并且合适的可溶性TNF受体-1在WO98/01555中有所描述。示例性RANK配体拮抗剂在例如WO 03/086289、WO 03/002713、美国专利6,740,511和美国专利6,479,635中公开。

在一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括与放射疗法一起向对其有需要的受治疗者施用治疗有效量的如本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体。放射疗法可包括辐射或向患者施用相关联的放射性药物。辐射源可以在被治疗患者的外部或内部(辐射治疗可以是例如体外放射治疗(EBRT)或短距离放射治疗(BT)的形式)。可用于实施此类方法的放射性元素包括例如镭、铯-137、铱-192、镅-241、金-198、钴-57、铜-67、锝-99、碘-123、碘-131和铟-111。

检测proTGFβ1-GARP复合物的方法

本文提供了用于通过使样本与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触来检测生物样本中的proTGFβ1-GARP复合物的方法。如本文所述，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。在一些实施方案中，所述方法包括通过使样本与本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段中的任一种接触来检测生物样本中的proTGFβ1-GARP复合物。

在一些实施方案中，样本可与本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段中的多于一种接触。例如，样本可与第一proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段接触，并且然后与第二proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段接触，其中第一抗体或抗原结合片段和第二抗体或抗原结合片段不是相同的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前可以附连至表面，诸如多孔板、芯片或类似的底物。在其它实施方案中，第一抗体或其抗原结合片段在接触样本之前完全可以不附连或连接至任何物体。

可对所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段进行可检测地标记。在一些实施方案中，经由本文所述的方法，标记的抗体和抗原结合片段可有利于检测proTGFβ1-GARP复合物。许多此类标记是本领域技术人员容易知晓的。例如，合适的标记包括但不应当认为其限于放射标记、荧光标记、表位标签、生物素、发色团标记、ECL标记或酶。更具体地，所述标记包括钌、¹¹¹In-DOTA、¹¹¹In-二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶、聚组氨酸(HIS标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料、染料等。

所述proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体和抗原结合片段可用于多种测定中，以检测生物样本中的proTGFβ1-GARP复合物。一些合适的测定包括但不应当认为其限于蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(FACS)或ELISA测定。

用于检测proTGFβ1-GARP复合物的试剂盒

本文提供了用于检测生物样本中的proTGFβ1-GARP复合物的试剂盒。这些试剂盒包括本文所述的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，以及试剂盒的使用说明。

所提供的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体或抗原结合片段可在溶液中；被冻干；附连至底物、载体或板；或被可检测地标记。

所述试剂盒还可包括用于实施本文所述方法的附加组分。举例来说，试剂盒可包括用于从受治疗者获得样本的装置、对照或参照样本(例如来自患有进展缓慢的癌症的受治疗者和/或不患癌症的受治疗者的样本)、一个或多个样本室和/或描述本发明方法的性能的说明材料、以及组织特异性对照或标准品。

用于确定proTGFβ1-GARP复合物的水平的装置还可包括例如在用于确定proTGFβ1-GARP复合物水平的测定中使用的缓冲液或其它试剂。说明书可为例如用于执行测定的印刷说明书和/或用于评价proTGFβ1-GARP复合物的表达水平的说明书。

所述试剂盒还可包括用于从受治疗者分离出样本的装置。这些装置可包括可用于从受治疗者中获得流体或组织的设备或试剂中的一项或多项。用于从受治疗者中获得样本的装置还可包括用于从血液样本中分离出血液组分诸如血清的装置。优选地，试剂盒被设计用于与人类受治疗者一起使用。

实施例

提供了以下实施例以补充现有公开并提供对本文所述主题的更好理解。不应将这些实施例视为限制所描述的主题。而应当理解，本文所述的实施例和实施方案只是为了进行示意性的说明，根据其的各种变型或改变对于本领域技术人员将是显而易见的并且包括在本发明真实范围内，并可在不脱离本发明真实范围的情况下进行各种变型或改变。

实施例1：使用噬菌体展示技术发现proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体：

采取抗体研发活动，以研发出proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体。ChemPartner专有的完全人原始噬菌体展示文库(Chempartner,Shanghai,China)用作人抗体片段的来源。该文库首先针对生物素酰化sGARP(SEQ ID NO:1)和LTBP1-proTGFβ1(SEQ ID NO 2和3)的组合混合物进行负淘选，以去除结合不期望的LTBP1-proTGFb1复合物或未复合的sGARP蛋白质的scFv片段。取消选定的文库的输出随后针对sGARP-proTGFβ1进行几轮淘选。基于独特的HCDR3序列、期望的复合物选择性、以及序列可能性，对特异性结合sGARP-proTGFβ1的二十五种scFv进行选择。将独特的重链V区克隆到人IgG4表达载体中，将独特的轻链克隆到人κ表达载体中，并且在ELISA中再次测试所得proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选的结合活性。选择来自该测定的优异结合物，以用于进一步的表征。

实施例2：4B1C1和4B16B9在体外对人Treg功能的抑制

在体外抑制测定中，测定先前实施例中制备的proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选对人Treg功能的抑制。将激活的CD4⁺CD25Hi抑制细胞用作Treg的来源，并且将CFSE-标记的CD4+CD25-效应T细胞(Teff细胞)用作增殖被抑制的靶标。在存在或不存在proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选的情况下，将细胞以1Treg/1Teff的比率与板结合的抗CD3、可溶性抗CD28一起温育。相比于仅T效应子，Treg使Teff细胞的增殖抑制约50％。当相比于Treg/Teff对照或hIgG4组时，Teff(与Treg一起温育)的增殖水平在4B1C1存在下恢复，并且通过4B16B9部分地恢复(图1)。这些结果证实了人Treg免疫抑制TGF-β1的活性，并且指示4B1C1和4B16B9可在体外部分地阻断该活性，类似于阳性对照中和TGFβ抗体1D11(R&DSystems，目录号MAB-1835)。

表2：示出针对proTGFβ1-GARP复合物结合且在体外抑制人Treg功能的两种proTGF β1-GARP复合物选择性抗体候选的CDR序列

(SEQ ID NO:)

两种proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选的VH和VL示于下表3中。

表3：示出针对proTGFβ1-GARP复合物结合且在体外抑制人Treg功能的两种proTGF β1-GARP复合物选择性抗体候选的重链和轻链序列。可变区标有下划线。

实施例3：TGFβ1生物测定

采用整合TGFβ/Smad3-反应性荧光素酶表达单元，使用TMLC报告细胞测量proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选调控活性TGFβ1的水平的能力。简而言之，用人proTGFβ1和LTBP1或人proTGFβ1和GARP表达质粒对HEK293或Sw480细胞进行瞬时转染。允许细胞从转染中恢复，并且在37℃下表达24小时的与LTBP1或GARP复合的proTGFβ1，此时可进行测定。为了建立测定，将瞬时转染子与稳定表达TGFβ1-激活的整联蛋白αVβ6的SW480β6细胞进行共培养。为了确认该测定可按设想进行，将含有已知浓度的TGF-β1生长因子的培养基样本添加至TMLC报告细胞培养物，以生成标准曲线。

使ProTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选(10μg/mL)与转染细胞组合并添加至TMLC报告细胞培养物中。然后将板在37℃下温育16小时。成功的TGFβ1信号转导有望激活SMAD2/3通路，随后激活荧光素酶表达，该荧光素酶表达可通过添加如由制造商(Promega)所指示的Bright-Glo并测量Biotek SynergyH1读板仪(Biotek)中所得的发光来检测。

相比于用对照组处理，4B1C1和4B16B9抗体诱导的荧光素酶表达显著地减少，这指示这些抗体调控活性TGFβ1生长因子的水平并使细胞中TGFβ1介导的信号转导下降。该效应类似于阳性对照中和TGFβ抗体1D11的影响。

实施例4：通过生物层干涉测量法进行亲和力测量

通过生物层干涉测量法，在OctetRed 384(Fortebio,Menlo Park,Calif.)上测量proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选对proTGFβ1-GARP复合物的结合亲和力。链霉抗生物素蛋白生物传感器(Fortebio，目录号18-5020)装载有20μg/ml生物素酰化sGARP-proTGFβ1复合物的醋酸钠缓冲液(pH 5)，用相同的缓冲液洗涤并转移至含有溶于相同缓冲液中的10μg/mL proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选的孔中。使用Octet软件，通过使响应对稳定状态算法进行非线性拟合，获得解离常数(表4)。通过动力学拟合获得类似的亲和力。

表4：proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选结合人proTGFβ1-GARP复合物的Octet 亲和力结果。

mAb	proTGFβ1-GARP复合物	K<sub>D</sub>(nM)
			4B1C1	人	0.114+/-0.004
4B16B9	人	0.880+/-0.036

为探知结合特异性，如上筛选结合TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、proTGFβ1-LTBP1、proTGFβ1-LTBP3和proTGFβ1-LRRC33的4B1C1和4B16B9。如上所述，抗体以10δμg/ml测试并且抗原以20μg/ml测试，并且在以下条件下测试。这些研究表明抗体对除proTGFβ1-GARP复合物之外的任何抗原均无可识别的结合并且在图4中示出。

表5：用于测定抗体结合特异性的测定条件

实施例5：剂量应答测定

如实施例3所述采用整合TGFβ/Smad3-反应性荧光素酶表达单元，使用TMLC报告细胞来测量proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选调控活性TGFβ1水平的浓度依赖性，仅有的差异在于proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体以各种浓度添加至实验孔中。

4B1C1和4B16B9表明，它们能够以剂量依赖性方式抑制TGFβ1激活，IC50分别为0.178nM和1.9nM(图3)。

实施例6：抗体表征

通过生物层干涉测量法，在OctetRed 384(Fortebio,Menlo Park,Calif.)上，测量proTGFβ1-GARP复合物选择性抗体候选对proTGFβ1-GARP复合物相比于其它蛋白质复合物的选择性(图4)。4B1C1和4B16B9表现出对proTGFβ1-GARP复合物小于1nM的解离常数(Kd)，但是并未表现出可检测的结合proTGFβ1-LTBP1或proTGFβ1-LTBP3复合物。4B1C1和4B16B9也并未表现出结合TGFβ1、TGFβ2、或TGFβ3生长因子。

还对结合proTGFβ1-LRRC33复合物的抗体进行了测试。proTGFβ1-LRRC33复合物被表达并通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化，并且通过分析性SEC证实非聚集复合物的形成。随后通过OctetRed 384(Fortebio,Menlo Park,Calif.)分析来测试4B1C1和4B16B9与经纯化的proTGFβ1-LRRC33复合物的结合，如实施例4所述。为此，4B1C1或4B16B9被捕集在抗人Fc末端，并且通过Octet检测proTGFβ1-GARP或proTGFβ1-LRRC33的结合。与proTGFβ1-GARP相反，并未检测到4B1C1或4B16B9与proTGFβ1-LRRC33复合物的结合。

序列表简述

Claims

1.一种分离抗体或其抗原结合片段，其中在具有人糖蛋白A为主的重复序列的复合物(proTGFβ1-GARP复合物)处于溶液中时，所述抗体或抗原结合片段特异性地结合所述复合物中的人proTGFβ1，并且使用实施例4所述的实验设计根据生物层干涉测量分析法，所述抗体或其抗原结合片段与以下物质中的任一种没有可检测的结合：

TGFβ1生长因子结构域，

TGFβ2生长因子结构域，

TGFβ3生长因子结构域，

与LTBP1共价缔合的proTGFβ1，

与LTBP3共价缔合的proTGFβ1，

与LRRC33共价缔合的proTGFβ1，以及

未与人GARP缔合的proTGFβ1，

如在实施例4和6所示的条件下通过OctetRed 384测量的，并且进一步地，其中所述抗体或其抗原结合片段在实施例5所示的条件下对于抑制TGFβ1生长因子从细胞相关联的proTGFβ1-GARP复合物释放具有小于或等于10nM的抑制浓度(IC₅₀)。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在体外抑制Treg功能。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制TGFβ1的激活。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至作为与人GARP形成复合物的结果而被修饰的人proTGFβ1的表位。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的存在下结合具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以如使用实施例4所述的实验设计通过生物层干涉测量分析法测量的至少880pM的结合亲和力特异性地结合人proTGFβ1。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段以在实施例7所示的条件下对具有人糖蛋白A为主的重复序列的复合物(proTGFβ1-GARP复合物)中的人proTGFβ1而言小于或等于1nM的解离常数(Kd)结合人proTGFβ1，并且其中所述proTGFβ1-GARP复合物处于溶液中。

8.一种分离抗体或其抗原结合片段，包含：

a.具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链互补决定区(CDR)1、具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR3；或

b.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR2、以及具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2、以及具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR3。

9.一种分离抗体或其抗原结合片段，包含选自SEQ ID NO:16和18的氨基酸序列的重链序列。

10.根据权利要求9所述的抗体，包含选自SEQ ID NO:17和19的氨基酸序列的轻链序列。

11.根据权利要求10所述的抗体，其中

a.重链序列包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链序列配对；或

b.重链序列包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列，与包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链序列配对。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段为Fab片段、Fab2片段或单链抗体。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段为重组的。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体为IgG4同种型。

16.一种分离抗体或其抗原结合片段，包含：

a.与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链CDR1序列、与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链CDR2序列、以及与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链CDR3序列、与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链CDR1序列、与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链CDR2序列、以及与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链CDR3序列；或

b.与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链CDR1序列、与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链CDR2序列、以及与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链CDR3序列、与SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链CDR1序列、与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链CDR2序列、以及与SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链CDR3序列。

17.一种分离抗体或其抗原结合片段，包含：

a.同与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链序列配对的与SEQ IDNO:16的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链序列；或

b.同与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少80％同一性的轻链序列配对的与SEQ IDNO:18的氨基酸序列具有至少80％同一性的重链序列。

18.一种分离抗体或其抗原结合片段，包含选自SEQ ID NO:16的氨基酸序列的氨基酸1至118以及SEQ ID NO:18的氨基酸序列的氨基酸1至121的重链可变区序列。

19.根据权利要求18所述的抗体，包含选自SEQ ID NO:17的氨基酸序列的氨基酸1至107以及SEQ ID NO:19的氨基酸序列的氨基酸1至110的轻链可变区序列。

20.根据权利要求19所述的抗体，包含：

a.与包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的氨基酸1至107的轻链可变区序列配对的包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的氨基酸1至118的重链可变区序列；或

b.与包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的氨基酸1至110的轻链可变区序列配对的包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的氨基酸1至121的重链可变区序列。

21.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

22.一种载体，包含权利要求21所述的多核苷酸。

23.一种宿主细胞，包含权利要求22所述的载体。

24.一种用于制备抗体或抗原结合片段的方法，包括：

在允许表达所述抗体或抗原结合片段的条件下，培养如权利要求23中所定义的宿主细胞，以及从培养物中回收所述抗体或抗原结合分子。

25.一种药物组合物，包含权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。

26.一种试剂盒，包括权利要求1至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及它们的包装。