KR20190034560A

KR20190034560A - TGFβ 항체, 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20190034560A
Application number: KR1020197004053A
Authority: KR
Inventors: 그레고리 제이. 까르뱅; 토마스 슈르프; 캐서린 터너
Original assignee: 스칼러 락, 인크.
Priority date: 2016-07-14
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2019-04-02
Also published as: JP7128801B2; IL264161A; US20190292254A1; SG11201900200XA; JP2019524094A; JP2022153406A; MA45690A; WO2018013939A1; CA3030862A1; BR112019000621A2; CN110049773A; AU2017294772A1; US20210277100A1; KR102577551B1; MX2019000514A; AU2017294772B2; EP3484499A4; EP3484499A1

Abstract

ProTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 세포 뿐만 아니라, 관련 벡터 및 검출가능하게 표지된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 대상에서, 예를 들어 암에 대한 면역 반응을 향상시키는데 사용될 수 있다.

Description

TGFβ 항체, 방법 및 용도

서열 목록

본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2017년 7월 10일자로 작성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 JBI5093_SL.txt이며, 크기가 27,577 바이트이다.

기술분야

본 발명은 성장 인자 활성을 억제하는 단클론 항체, 및 상기 항체의 생산 및 사용 방법에 관한 것이다.

조절 T 세포 또는 Treg는 면역 반응의 억제에 특수화된 CD4+ T 림프구의 서브세트이다. 불충분한 Treg 기능은 자가면역 병상을 야기하는 반면, 과도한 Treg 기능은 암 환자에서 항종양 면역 반응을 억제할 수 있다. Treg가 면역 반응을 억제하는 정확한 메커니즘은 충분히 이해되지 않는다.

이들의 면역 억제 기능으로 인해, Treg는 자발적 또는 백신 유도된 항종양 면역 반응의 잠재적 억제제를 나타낸다. 뮤린 모델에서, Treg의 고갈은 실험 종양에 대한 면역 반응을 개선할 수 있다(문헌[Colombo et al. Nat. Rev. Cancer 2007, 7:880-887]). 따라서, 인간에서의 Treg의 표적화는 암에 대한 면역요법의 효능을 개선시킬 수도 있다.

인간 Treg를 활성화시키는데 관여하지만, 다른 종류의 인간 T 림프구의 활성화에는 관여하지 않는 TGF-β1(문헌[Stockis, J. et al. Eur. J. Immunol. 2009, 39:869-882])은 대상 표적이 될 수 있다. 그러나, hTGF-β1에 대한 항체는 유망하지 않는 것으로 밝혀졌다. 제1상 임상시험은 국소성 분절성 사구체경화증(FSGS), 특발성 폐섬유증(IPF) 및 진행성 악성 흑색종 또는 신장 세포암(RCC)에서 수행되었다(문헌[Lonning S et al. Current Pharmaceutical Biotechnology 2011, 12:2176-2189]). 임상시험에 따라, 일부 환자에서 유해사상(adverse event)이 관찰되었다. 보고된 주요 부작용은 흑색종 환자에서의 각화극 세포종(KA)및 편평상피암(SCC)의 발생에 있었다. 흑색종 환자의 KA 또는 SCC 병변이 내인성 TGF-β1에 의해 증식이 억제된 전암성(pre-cancerous) 세포로부터 발생되었을 가능성이 있다(문헌[Lonning S et al. Current Pharmaceutical Biotechnology 2011, 12:2176-2189]). 따라서, 암과 관련하여 항 TGF-β1 항체의 사용에 관한 주요 관심사는 이들이 전암성 세포 상에서의 내인성 TGF-β1에 의한 종양 억제 작용의 억제로 인해 새로운 종양성 병변의 출현에 유리할 수 있다는 것이다. 따라서, Treg로부터의 TGF-β1 방출을 방지함으로써 암 치료를 개선하기 위한 새로운 전략이 바람직하다.

본 발명은 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 또한, 제공된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편을 인코딩할 수 있는 관련 폴리뉴클레오티드, 제공된 항체 및 항원 결합 단편을 발현하는 세포 뿐만 아니라, 관련 벡터 및 검출가능하게 표지된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편도 기재되어 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실시예 4 내지 실시예 6에 나타낸 조건 하에서 옥텟레드(OctetRed) 384에 의해 측정된 것으로서, TGFβ1 성장 인자 도메인, TGFβ2 성장 인자 도메인, TGFβ3 성장 인자 도메인, LTBP1과 공유결합된 proTGFβ1, LTBP3과 공유결합된 proTGFβ1, LRRC33과 공유결합된 proTGFβ1 및 인간 GARP와 결합되지 않은 proTGFβ1에 선택적으로 결합하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 (1) 인간 proTGFβ1과 우세한 인간 당단백질 A 반복체(human glycoprotein A repetitions predominant)와의 용액 상태의 복합체(proTGFβ1-GARP 복합체)의 인간 proTGFβ1에 대한 1 nM 이하의 해리 상수(Kd); (2) 세포 결합 proTGFβ1-GARP 복합체로부터의 TGFβ1 성장 인자 방출의 억제를 위한 10 nM 이하의 억제 농도(IC50); 및 (3) TGFβ1 성장 인자 도메인, TGFβ2 성장 인자 도메인, TGFβ3 성장 인자 도메인, LTBP1과 공유결합된 proTGFβ1, LTBP3과 공유결합된 proTGFβ1 및 LRRC33과 공유결합된 proTGFβ1에 비해 proTGFβ1-GARP 복합체에 대한 선택성이 100배보다 큼 - 여기서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 GARP 와 결합되지 않은 proTGFβ1에 결합하지 않음 - 을 나타낼 수 있다.

게다가, 제공된 proTGFβ1-GARP 복합체 석택적 항체 및 항원 결합 단편의 사용 방법이 기재되어 있다. 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 다양한 면역요법 적용과 같은 면역 반응을 조절하는 것이 바람직한 각종 TGFβ1 관련 질환 또는 장애, 예를 들어 암, 백신 및 감염성 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 발명은 단리된 항체 및 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 proTGFβ1과 우세한 인간 당단백질 A 반복체와의 복합체(proTGFβ1-GARP 복합체)가 용액 상태로 있는 동안에 상기 복합체의 인간 proTGFβ1에 특이적으로 결합한다. 이러한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시험관 내(in vitro)에서의 Treg 기능을 억제할 수 있다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 TGFβ1의 활성화를 억제한다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 인간 GARP와의 복합체 형성의 결과로서 변형된 인간 proTGFβ1의 에피토프에 결합한다. 이러한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 880 pM 이하의 결합 친화도로 proTGFβ1-GARP 복합체의 proTGFβ1에 결합할 수 있다.

[표 1]

일부 실시 형태에서는, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함한다. 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 서열 번호 16 및 18의 중쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있으며, 서열 번호 17 및 19의 경쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 상이한 이펙터 기능들을 달성하도록 Fc 서열이 변형되어 있는 변형된 버전을 포함한, IgG 동종형 중 어느 하나와 조합된 CDR 및 가변 도메인의 기재된 특징을 갖는 항체를 포함한다.

기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편 이외에도, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편을 인코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이 또한 제공된다. 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공되며, 마찬가지로 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 세포도 본 명세서에 제공된다. 개시된 벡터를 발현할 수 있는 세포가 또한 기재된다. 이러한 세포는 포유류 세포(예컨대, 293F 세포, CHO 세포), 곤충 세포(예컨대, Sf9 세포), 효모 세포, 식물 세포 또는 세균 세포(예컨대, 대장균)일 수 있다. proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편의 생산 방법이 또한 제공된다.

본 발명은 또한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하는 방법을 포함한다. 본 섹션에서 논의되는 방법에 사용하기 위한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 표 1의 항체에 대해 기재된 CDR 세트를 갖는 것들을 포함한다. 예를 들어, TGFβ1이 면역 반응에서 작용하는 중요한 역할은 종양 항원을 비롯한 임의의 약면역원성(weakly immunogenic) 항원에 대한 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 것을 포함하여, 면역요법의 매력적인 표적이 되게 한다. 이와 같이, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 각종 암 및 감염성 질환의 치료에 유용하다.

일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 Treg로부터의 TGFβ1 의 방출을 차단하여, 조절 T 세포에 의한 이펙터 T 세포 활성의 억제를 방지하도록 투여된다. 이러한 억제는 예를 들어, T 세포 증식, 기지의 활성화 마커의 발현 또는 사이토카인 분비를 모니터링하는 것을 비롯하여, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. 다른 실시 형태에서, ProTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 조절 T 세포의 수준, 예를 들어 종양 조절 T 세포의 수준을 감소시키기 위해 대상에게 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 이펙터 T 세포의 활성은 본 명세서에 제공된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체를 투여함으로써 유도되거나 증강된다.

개시된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키트가 본 발명의 범주 내에 있다. 기재된 키트는 본 명세서에 제공된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하는 방법 또는 당업자에게 알려진 다른 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편 및 생체 샘플에서 proTGFβ1-GARP 복합체의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 시약, 및 임의로, 미사용 시의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편의 사용설명서, 고체 지지체에 부착된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편, 및/또는 검출가능하게 표지된 형태의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편을 담기 위한 용기를 포함할 수 있다.

도 1은 T 세포 공배양물에 4B1C1 및 4B16B9를 첨가하면, T 이펙터 세포의 성장 촉진을 통해 T 조절 세포 활성이 억제된다는 것을 나타낸다.
도 2는 4B1C1 및 4B16B9가 SMAD 신호전달에 의해 평가된 바와 같이 TGFβ1 활성화를 억제함을 나타낸다.
도 3은 4B1C1 및 4B16B9에 의한 TGFβ1 활성의 용량 의존적 억제를 나타낸다.
도 4는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보에 대한 옥텟 친화도 결과로부터, 인간 proTGFβ1-GARP 복합체에 결합하지만 다른 proTGFβ1 복합체 또는 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3의 가용성 형태에는 결합하지 않음으로써 특이성을 나타냄을 보여준다.

정의

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용의 측면과 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어는 본 기술 분야에서의 이의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 측정가능한 값, 예컨대 양, 시간적 지속기간 등을 지칭할 때 용어 "약"은 지정된 값으로부터 최대 ±10%의 변동을 포함함을 의미하는데, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적절하기 때문이다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 근사치로, 이는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변동될 수 있다. 적어도, 그리고 청구범위의 범주와 동등한 원칙의 응용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도, 보고된 유효 숫자의 개수를 고려하여 그리고 통상적인 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.

본 발명의 넓은 범주를 나타내는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 실시예에 기재된 수치들은 가능한 한 정확하게 기록하였다. 그러나, 임의의 수치는 그들 각자의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 반드시 유래하는 소정의 오차를 본질적으로 포함한다.

"단리된"은 생물학적 성분(예컨대, 핵산, 펩티드 또는 단백질)이, 그러한 성분이 천연 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분들, 즉 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 따로 생성되거나, 또는 따로 정제되었음을 의미한다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물이 핵산, 펩티드, 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" 항체 또는 항원 결합 단편은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항원 결합 단편이 실질적으로 없는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭하고자 한다(예를 들어, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체인 단리된 항체에는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체가 아닌 항체가 실질적으로 없다).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환 성장 인자 베타-1" 및 "TGFβ1"은 특히 인간 TGFβ1 단백질을 포함한다. TGFβ1은 또한 TGFbeta1 및 TGFB1로서 과학 문헌에 알려져 있다. TGFβ1 성장 인자는 예를 들어, 젠뱅크(GenBank)™ 수탁 번호 AK291907, NCBI 참조 서열: NP_000651.3.1 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 P01137.2에 기재에 바와 같이, 프로도메인(prodomain)과 함께 합성된다(또한, 문헌[Derynck et al. 1985, Nature 316, 701-705] 참조). 특정 실시 형태에서, TGFβ1 번역된 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 단백질이다. 프로도메인 및 성장 인자 요소를 모두 포함하는 TGFβ1은 본 명세서에서 "proTGFβ1"로 지칭된다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1은 단백질 분해적으로 분리되었지만, 하나 이상의 화학적 상호작용을 통해 결합된 상태로 있는 프로도메인 및 성장 인자 요소를 포함한다. 이러한 화학적 상호작용은 소수성 결합, 판데르발스 힘에 의해 영향을 받는 상호작용, 극성 및 이온 상호작용, 수소 결합, 및 비공유 결합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "우세한 당단백질 A 반복체" 및 "GARP"는 인간 GARP를 지칭한다. GARP는 류신이 풍부한 반복체 함유 단백질 32(leucine-rich repeat-containing protein 32; LRRC32) 및 가핀(garpin)으로도 알려져 있다. NCBI 참조 서열 NP_001122394.1 및 NP_005503.1은 예시적인 인간 GARP 아미노산 서열을 제공한다. 특정 실시 형태에서, GARP는 서열 번호 1의 인간 GARP이다.

달리 명시되지 않는 한, "항체"는 다양한 단량체형, 중합체형 및 키메라형을 포함하는 면역글로불린의 모든 동종형(IgG, IgA, IgE, IgM, IgD 및 IgY)을 지칭한다. 구체적으로, 용어 "항체"에는 다중클론 항체, 단일클론 항체(mAb) 및 항체-유사 폴리펩티드, 예컨대 키메라 항체 및 인간화 항체가 포함된다.

"항원 결합 단편"은 특정 항원에 대해 결합 친화도를 나타낼 수 있는 임의의 단백질성 구조(proteinaceous structure)이다. 항원 결합 단편에는 임의의 알려진 기법, 예컨대 효소에 의한 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기법에 의해 제공된 것들이 포함된다. 일부 항원 결합 단편은 모 항체 분자의 항원 결합 특이성을 보유하는 손상되지 않은(intact) 항체 부분으로 구성된다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 특정 항원과 결합하는 것으로 알려진 항체의 적어도 하나의 가변 영역(중쇄 또는 경쇄 가변 영역) 또는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 적절한 항원 결합 단편의 예에는, 제한 없이, 다이아바디(diabody) 및 단일쇄 분자뿐만 아니라 Fab, F(ab')2, Fc, Fabc 및 Fv 분자, 단일쇄(Sc) 항체, 개별 항체 경쇄, 개별 항체 중쇄, 항체 쇄 또는 CDR과 다른 단백질 사이의 키메라 융합체, 단백질 스캐폴드, 중쇄 단량체 또는 이량체, 경쇄 단량체 또는 이량체, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄로 이루어진 이량체, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, 또는 국제특허 공개 WO2007059782 호에 기재된 1가 항체, 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, 기본적으로 V_H 및 C_H1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 기본적으로 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, dAb 단편(문헌[Ward et al., Nature 341, 544-546(1989)]), 이는 기본적으로 VH 도메인으로 이루어지고 도메인 항체로도 불림(문헌[Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21(11):484-90]); 낙타과의 동물 또는 나노바디(nanobody)(문헌[Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan.; 5(1):111-24]); 단리된 상보성 결정 영역(CDR)등이 포함된다. 모든 항체 동종형이 항원 결합 단편을 생성하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 항원 결합 단편은 주어진 관심 항원에 대해 친화도를 부여하는 배향으로 폴리펩티드 세그먼트를 성공적으로 도입할 수 있는 비항체 단백질성 프레임워크, 예컨대 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 항원 결합 단편은 재조합적으로 생성되거나 손상되지 않은 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 어구 "항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 주어진 항원 결합 단편이 이 어구에 언급된 항체의 하나 이상의 아미노산 세그먼트를 포함함을 나타내기 위해 사용될 수 있다.

용어 "CDR" 및 이의 복수 "CDRs"는 3개가 경쇄 가변 영역(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)의 결합 특성을 구성하고, 3개가 중쇄 가변 영역(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)의 결합 특성을 구성하는 상보성 결정 영역(CDR)을 나타낸다. CDR은 항체 분자의 기능적 활성에 기여하며, 스캐폴딩 또는 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산 서열에 의해 분리된다. 정확한 정의의 CDR 경계 및 길이는 다양한 분류 및 넘버링 시스템에 따른다. 따라서, CDR은 카밧(Kabat), 초티아(Chothia)에 의해, 접촉 또는 임의의 다른 경계 정의로 지칭될 수 있다. 상이한 경계에도 불구하고, 이들 시스템 각각은 가변 서열 내에서 소위 "초가변 영역"을 구성하는 부분에서 어느 정도 중첩된다. 따라서, 이들 시스템에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역에 대하여 길이 및 경계 영역이 상이할 수 있다. 예를 들어, 각각 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. NIH Publication No. 91-3242 (1991)]; 문헌[Chothia et al., "Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins," J. Mol . Biol . 196:901 (1987)]; 및 문헌[MacCallum et al., "Antibody-Antigen Interactions: Contact Analysis and Binding Site Topography," J. Mol. Biol. 262:732 (1996)]을 참조한다.

전형적으로, CDR은 표준 구조(canonical structure)로서 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "표준 구조"는 항원 결합(CDR) 루프에 의해 채택되는 주쇄 형태를 지칭한다. 비교 구조 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개가 이용가능한 형태의 제한된 레퍼토리만을 갖는 것으로 밝혀졌다. 각각의 표준 구조는 폴리펩티드 골격의 비틀림각으로 특징지어질 수 있다. 따라서, 항체 사이의 상응하는 루프는 대부분의 루프 부분에서 높은 아미노산 서열 변화에도 불구하고, 매우 유사한 3차원 구조를 가질 수 있다(문헌[Chothia et al., "Canonical Structures For the Hypervariable Regions of Immunoglobulins," J. Mol . Biol . 196:901 (1987)]; 문헌[Chothia et al., "Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions," I 342:877 (1989)]; 문헌[Martin and Thornton, "Structural Families in Loops of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling and Application to Antibodies," J. Mol . Biol . 263:800 (1996)], 각각 전체적으로 참고로 포함됨). 또한, 채택된 루프 구조와 이를 둘러싸는 아미노산 서열 사이에는 관계가 있다. 특정 표준 클래스의 형태는 루프의 길이와, 루프 내 뿐만 아니라 보존된 프레임워크(즉, 루프 외부) 내의 주요 위치에 존재하는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 따라서, 특정 표준 클래스에 대한 할당은 이러한 주요 아미노산 잔기의 존재에 기초하여 이루어질 수 있다.

용어 "폴리펩티드"는 용어 "단백질"과 상호교환적으로 사용되며, 이의 가장 넓은 의미에서는 둘 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드 모방체(peptidomimetic)의 화합물을 말한다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신과 D 및 L 광학 이성질체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 지칭한다. 3개 이상의 아미노산의 펩티드는 펩티드 쇄가 짧은 경우 올리고펩티드로 통상 불린다. 펩티드 쇄가 긴 경우, 펩티드는 통상 폴리펩티드 또는 단백질로 불린다.

항체 또는 항체 단편과 관련하여 사용될 때, "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 이들의 파생어는, 혼합된 분자 집단을 함유하는 샘플 중의 다른 분자에 우선적으로 결합하지 않고서, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 인코딩된 도메인을 통한 관심 단백질의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합을 나타낸다. 전형적으로, 항체는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정에 의해 측정될 때 약 1x10^-8 M 미만의 K_d로 동종 항원에 결합한다. 바람직한 실시 형태에서, 결합 특이성은 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)을 사용하여 측정된다. "[항원] 특이적" 항체와 같은 어구는 언급된 항체가 언급된 항원에 특이적으로 결합함을 나타내고자 한다.

"폴리뉴클레오티드" - 동의어로 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"으로 지칭됨 - 는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더 전형적으로는 이중-가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하거나 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 포함하는 혼성(hybrid) 분자를 포함한다. 게다가, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화(tritylated) 염기 및 통상이 아닌 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있으며; 이에 따라, "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 전형적으로 발견되는 바와 같은 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 바이러스 및 세포에 특징적인 화학적 형태의 DNA 및 RNA도 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는, 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 쇄를 또한 포함한다.

"벡터"는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 코스미드, 또는 바이러스이며, 이것 내에 다른 핵산 절편이 작동가능하게 삽입되어 절편의 복제 또는 발현을 일으키도록 할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어 초대 세포, 배양 세포 또는 세포주 유래 세포일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 트랜스펙션된 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은 예를 들어, 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈으로의 핵산 분자의 통합으로 인해 핵산 분자로 트랜스펙션된 모세포와 동일하지 않을 수 있다. 용어 "발현" 및 "생성"은 본 명세서에서 동의어로 사용되고, 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이들 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이들 용어는 또한 하나 이상의 폴리펩티드로의 RNA의 번역을 포함하고, 모든 천연 발생 전사 후 및 번역 후 변형을 추가로 포함한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현 또는 생성은 세포의 세포질 내에서 행해지거나, 또는 세포외 환경, 예컨대 세포 배양의 성장 배지 내로 행해질 수 있다. "실질적으로 동일한"이라는 의미는 그 용어가 사용되는 문맥에 따라 상이할 수 있다. 중쇄 및 경쇄, 그리고 그들을 인코딩하는 유전자 중에서 존재할 가능성이 높은 천연 서열 변이로 인해, 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 아미노산 서열 또는 유전자 내에는 약간의 수준의 변이가 발견될 것으로 예측될 것인데, 이때 이러한 변이는 그들의 고유 결합 특성(예를 들어, 특이성 및 친화도)에 대해 거의 또는 전혀 영향을 주지 않는다. 그러한 예측은 유전자 코드의 축퇴성뿐만 아니라, 보존적 아미노산 서열 변이의 진화적 성공에도 부분적으로 기인되는데, 이때 이는 인코딩된 단백질의 성질을 크게 변경시키지 않는다. 따라서, 핵산 서열과 관련하여, "실질적으로 동일한"은 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 65% 동일성을 의미한다. 바람직하게는, 이 용어는 2개 이상의 서열들 사이의 적어도 70% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 75% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 80% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 91% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 92% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 93% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 94% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 96% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 97% 동일성, 더 바람직하게는 적어도 98% 동일성, 그리고 더 바람직하게는 적어도 99% 또는 그 이상의 동일성을 지칭한다. 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총수 × 100)이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은, 예를 들어, PAM120 가중치 잔기(weight residue) 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하여, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 포함된 문헌[E. Meyers and W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 게다가, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

단백질 기능에 대해 실질적인 영향을 주지 않고서 단백질의 아미노산 서열 내에서 일어날 수 있는 변이의 정도는 핵산 서열의 변이의 정도보다 훨씬 더 낮은데, 동일한 축퇴성 원리가 아미노산 서열에는 적용되지 않기 때문이다. 따라서, 항체 또는 항원 결합 단편과 관련하여, "실질적으로 동일한"은 기재된 항체 또는 항원 결합 단편과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 의미한다. 다른 실시 형태는, 프레임워크, 스캐폴드, 또는 본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편과 상당한 동일성을 공유하지 않고, 본 명세서에 기재된 그러한 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 결합을 제공하는데 필요한 하나 이상의 CDR 또는 다른 서열을 포함하는 다른 비결합 영역을 갖는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원)사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 "결합 친화도"는 결합 쌍(예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(K_D)로 나타낼 수 있다. 친화도는 평형 해리 상수(K_D) 및 평형 결합 상수(K_A)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 당업계에 공지된 다수의 방법으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. K_D는 k_off/k_on의 몫으로부터 계산되는 반면, K_A는 k_on/k_off의 몫으로부터 계산된다. k_on은 예를 들어, 항원에 대한 항체의 결합 속도 상수를 지칭하고, k_off는 예를 들어, 항원에 대한 항체의 해리를 지칭한다. k_on 및 k_off는 바이오층 간섭법과 같은 당업자에게 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.

용어 "대상"은 인간 및 비인간 동물을 지칭하며, 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 마우스, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 및 파충류가 포함된다. 기재된 방법의 많은 실시 형태에서, 대상은 인간이다.

proTGFβ1 - GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체인 단리된 단클론 항체 또는 항원 결합 단편이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체"는 별개의 친화도, 특이성 및 활성을 갖는 항체를 말한다. proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 (1) proTGFβ1이 용액 상태의 인간 GARP와의 복합체인 경우, 인간 proTGFβ1에 대한 1 nM 이하의 해리 상수(Kd) (예를 들어, 무세포 검정을 사용하여 측정됨); (2) 세포 결합 proTGFβ1-GARP 복합체로부터의 TGFβ1 성장 인자 방출의 억제를 위한 10 nM 이하의 억제 농도(IC50); (3) TGFβ1 성장 인자 도메인, TGFβ2 성장 인자 도메인, TGFβ3 성장 인자 도메인, LTBP1과 공유결합된 proTGFβ1, LTBP3와 공유결합된 proTGFβ1 및 LRRC33과 공유결합된 proTGFβ1 각각에 비해 proTGFβ1-GARP 복합체에 대한 선택성이 100배보다 큼(결합 친화도, 즉 Kd 값에 의해 측정됨); 및 (4) GARP와의 복합체가 아닌 경우 proTGFβ1에 대한 친화도의 결여를 나타낼 수 있다. 일부 경우에, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 또한 LTBP2 및/또는 LTBP4와 공유결합된 proTGFβ1에 비해 proTGFβ1-GARP 복합체에 대해 100배보다 큰 선택성을 갖는다. 항체 분자의 일반적 구조는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항원 결합 도메인, 및 보체 결합(complement fixation) 및 항체 수용체에 대한 결합을 포함한 다양한 기능을 제공하는 Fc 도메인을 포함한다.

기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 모든 동종형, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 및 4쇄 면역글로불린 구조의 합성 다량체를 포함한다. 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 암탉 또는 터키 혈청 및 암탉 또는 터키 난황에서 일반적으로 발견되는 IgY 동종형을 포함한다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 재조합 수단에 의해 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 마우스, 래트, 염소, 말, 돼지, 소, 닭, 토끼, 낙타과의 동물, 당나귀, 인간, 또는 이들의 키메라 버전일 수 있다. 인간에 대한 투여에 사용하기 위하여, 비인간 유래 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 환자에게 투여 시 더 적은 항원성을 나타내도록 유전자적으로 또는 구조적으로 변경될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 키메라 항체 또는 항원 결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "키메라"는 인간 이외의 포유동물, 설치류 또는 파충류의 항체 아미노산 서열로부터 유래되는 적어도 하나의 가변 도메인의 적어도 일부분을 가지면서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 나머지 부분은 인간으로부터 유래되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 인간 이외의 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)일 수 있다. 대개, 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력(capacity)을 갖는 비인간 종(공여체 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 이때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 인간 이외의 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 다양한 형태로 존재할 수 있지만, 표 1에 나타낸 항체 CDR들 중 하나 이상을 포함할 것이다.

일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 IgG 또는 이의 유도체이다. 본 명세서에 예시된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 항원 결합 단편이지만, 예시된 항체 또는 항원 결합 단편은 키메라화될 수 있다.

일부 실시 형태에서는, 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 및 표 1에 기재된 항체들 중 어느 하나의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체가 제공된다.

일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 4를 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 5를 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 6을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 7을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 8을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 번호 9를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 880 pM 이하의 친화도로 proTGFβ1-GARP 복합체의 proTGFβ1에 결합할 수 있고, 시험관 내에서의 Treg 기능을 억제할 수 있으며, TGFβ1의 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 16과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 17과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 16의 아미노산 서열 1-118과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 17의 아미노산 서열 1-107과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하나의 아암이 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.

일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 10을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열 번호 12를 포함하는 중쇄 CDR3, 서열 번호 13을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 14를 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열 번호 15를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 이러한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 이러한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 880 pM 이하의 친화도로 proTGFβ1-GARP 복합체의 proTGFβ1에 결합할 수 있고, 시험관 내에서의 Treg 기능을 억제할 수 있으며, TGFβ1의 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 18과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 및 서열 번호 19와 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄를 포함한다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 18의 아미노산 서열 1-121과 실질적으로 동일하거나 동일한 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 아미노산 서열 1-110과 실질적으로 동일하거나 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이 단락에서 논의된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 하나의 아암이 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 아암인 이중특이성 작제물에 포함시키기에 적합하다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 서열 번호 4 내지 15의 CDR 아미노산 서열 및 서열 번호 16 내지 19의 가변 영역 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성, 75% 이상의 동일성, 80% 이상의 동일성, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 91% 이상의 동일성, 92% 이상의 동일성, 93% 이상의 동일성, 94% 이상의 동일성, 95% 이상의 동일성, 96% 이상의 동일성, 97% 이상의 동일성, 98% 이상의 동일성 및 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드도 개시되어 있다. 본 명세서에 제공된 가변 도메인 세그먼트를 인코딩할 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 벡터 상에 포함되어 항체 또는 항원 결합 단편을 생성할 수 있다.

재조합 항원-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 폴리뉴클레오티드(및 이것이 인코딩하는 펩티드)는 리더(leader) 서열을 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 리더 서열은 제한 부위 또는 번역 개시 부위를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편의 생물학적 특성(예를 들어, 결합 친화도 또는 면역 이펙터 활성)을 보유하는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 하기를 포함할 수 있다: (a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비보존적 아미노산으로 치환된 변이체, (b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드에 첨가되거나 그로부터 결실된 변이체, (c) 하나 이상의 아미노산이 치환기를 포함하는 변이체 및 (d) 폴리펩티드가, 그 폴리펩티드에 유용한 특성을 부여할 수 있는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 융합 파트너, 단백질 태그 또는 다른 화학적 모이어티, 예컨대 항체에 대한 에피토프, 폴리히스티딘 서열, 비오틴 모이어티(moiety) 등과 융합된 변이체. 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은, 하나의 종으로부터의 아미노산 잔기가, 보존 또는 비보존된 위치에서, 다른 종에서의 상응하는 잔기 대신에 치환된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 비보존된 위치에서의 아미노산 잔기가 보존 또는 비보존된 잔기로 치환된다. 유전자적(결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기법을 포함한 이들 변이체를 얻기 위한 기법은 당업자에게 알려져 있다.

본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 몇몇 항체 동종형, 예컨대 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 구현할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체 동종형은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형, 바람직하게는 IgG1 동종형이다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편 특이성은 주로 CDR의 아미노산 서열 및 배열에 의해 결정된다. 따라서, 하나의 동종형의 CDR은 항원 특이성을 변경시키지 않고서 다른 동종형으로 전달될 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마가 항원 특이성을 변경시키지 않고서 하나의 항체 동종형을 생성하는 것으로부터 다른 항체 동종형으로 전환(동종형 전환)되게 하기 위한 기법이 확립되어 왔다. 따라서, 그러한 항체 동종형들은 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 범주 내에 있다.

본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 약 880 pM 미만의 해리 상수(K_D)를 포함하는 proTGFβ1-GARP 복합체의 proTGFβ1에 대한 결합 친화도를 갖는다. 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편의 친화도는 당업계에 알려진 다양한 방법, 예컨대 바이오층 간섭법, 표면 플라즈몬 공명 또는 ELISA 기반 방법에 의해 측정될 수 있다. 바이오층 간섭법에 의한 친화도를 측정하기 위한 검정은 옥텟레드 384를 사용하여 수행된 검정을 포함하며, 여기서 분석은 실온(예를 들어, 25℃ 또는 그 부근)에서 수행되고, proTGFβ1-GARP 복합체의 proTGFβ1에 결합할 수 있는 항체는 비오틴화 proTGFβ1-GARP 복합체로 로딩된 스트렙타비딘 바이오센서 상에 포획된다.

본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 따라서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다. 발현 벡터는 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선택 마커, 및 폴리아데닐화 신호와 같은 그러나 이로 한정되지 않는 하나 이상의 추가의 서열을 함유할 수 있다. 매우 다양한 숙주 세포를 형질전환시키기 위한 벡터는 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 배큘로바이러스, 박미드(bacmid), 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC)뿐만 아니라, 다른 세균, 효모 및 바이러스 벡터를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

본 발명의 범주 내의 재조합 발현 벡터는 적합한 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 적어도 하나의 재조합 단백질을 인코딩하는 합성, 게놈, 또는 cDNA-유래 핵산 단편을 포함한다. 그러한 조절 요소는 전사 프로모터, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터, 특히 포유류 발현 벡터는 또한 하나 이상의 비전사 요소, 예컨대 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 다른 5' 또는 3' 플랭킹(flanking) 비전사 서열, 5' 또는 3' 비번역 서열(예컨대, 필요한 리보솜 결합 부위), 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위, 또는 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 숙주에서 복제하는 능력을 부여하는 복제 기점이 또한 포함될 수 있다.

척추동물 세포를 형질전환시키는 데 사용되는 발현 벡터에서의 전사 및 번역 제어 서열은 바이러스 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예시적인 벡터가 문헌[Okayama and Berg, 3 Mol . Cell. Biol. 280 (1983)]에 의해 기재된 바와 같이 작제될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 항체 코딩 서열 또는 항원 결합 단편 코딩 서열은 강력한 구성적 프로모터, 예컨대 하기 유전자에 대한 프로모터의 제어 하에 놓여 있다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 기타. 게다가, 많은 바이러스성 프로모터가 진핵 세포에서 구성적으로 기능하고, 기재된 실시 형태와 함께 사용하기에 적합하다. 그러한 바이러스성 프로모터는, 제한 없이, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, SV40의 초기 및 후기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 말로니(Maloney) 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)(EBV), 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus)(RSV), 및 다른 레트로바이러스, 및 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편 코딩 서열은 유도성 프로모터, 예컨대 메탈로티오네인 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 독시사이클린 유도성 프로모터, 하나 이상의 인터페론-자극 반응 요소(ISRE)를 함유하는 프로모터, 예컨대 단백질 키나제 R 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제, Mx 유전자, ADAR1 등의 제어 하에 놓여 있다.

본 명세서에 기재된 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 침입 부위(들)(IRES)를 함유할 수 있다. 융합 벡터 내로의 IRES 서열의 포함은 일부 단백질의 발현을 향상시키는 데 유익할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터 시스템은 하나 이상의 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40)를 포함할 것이며, 이는 상기 언급된 핵산 서열들 중 임의의 것의 상류 또는 하류에 있을 수 있다. 벡터 성분들은 (즉, ORF들 사이에의 "스페이서" 뉴클레오티드의 도입에 의해) 유전자 산물을 발현시키기 위한 최적의 간격을 제공하는 방식으로 인접하게 연결 또는 배열될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 위치될 수 있다. 조절 요소, 예컨대 IRES 모티프는 또한 발현을 위한 최적의 간격을 제공하도록 배열될 수 있다.

벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 선택 마커는 당업계에 잘 알려져 있다. 선택 마커는 양성 및 음성 선택 마커, 예를 들어 항생제 저항성 유전자(예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 테트라사이클린 저항성 유전자, 페니실린 저항성 유전자), 글루타메이트 신타제 유전자, 간시클로비르 선택을 위한 HSV-TK, HSV-TK 유도체, 또는 6-메틸푸린 선택을 위한 세균성 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 유전자를 포함한다(문헌[Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)]). 선택 마커 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드 또는 클로닝 부위를 인코딩하는 핵산 서열의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.

본 명세서에 기재된 벡터는 다양한 세포를 기재된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 유전자로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편 생성 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다른 태양은 proTGFβ1-GARP의 proTGFβ1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 본 명세서에 기재되고 예시된 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포를 특징으로 한다.

세포 내로의 외래 유전자의 도입을 위한 다수의 기법이 당업계에 알려져 있고, 본 명세서에 기재되고 예시된 다양한 실시 형태에 따라, 기재된 방법을 수행하려는 목적을 위하여 재조합 세포를 작제하는데 사용될 수 있다. 사용되는 기법은 숙주 세포로의 이종 유전자 서열의 안정한 전달을 제공하여, 이종 유전자 서열이 세포의 자손에 의해 상속가능하고 발현가능하도록, 그리고 수령 세포의 필요한 발달 및 생리학적 기능이 파괴되지 않도록 해야 한다. 사용될 수 있는 기법은 염색체 전달(예를 들어, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로 세포 매개 유전자 전달), 물리적 방법(예를 들어, 형질감염, 스페로플라스트 융합, 현미주사(microinjection), 전기천공, 리포솜 담체), 바이러스성 벡터 전달(예를 들어, 재조합 DNA 바이러스, 재조합 RNA 바이러스) 등(문헌[Cline, 29 Pharmac . Ther. 69-92 (1985)]에 기재됨)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 인산칼슘 침전 및 세균 프로토플라스트(bacterial protoplast)와 포유류 세포의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-유도 융합이 또한 세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편의 발현에 사용하기에 적합한 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 더 바람직하게는 식물, 설치류, 또는 인간 기원의 세포, 예를 들어, 그러나 제한 없이, 특히 NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 세포, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L 세포, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 골수종 세포, 및 BHK 세포주이다. 게다가, 항체의 발현은 하이브리도마 세포를 사용하여 달성될 수 있다. 하이브리도마를 생성하기 위한 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다.

본 명세서에 기재된 발현 벡터로 형질전환된 세포는 본 명세서에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 재조합 발현을 위해 선택되거나 스크리닝될 수 있다. 재조합-양성 세포는 원하는 표현형, 예컨대 고수준 발현, 향상된 성장 특성, 또는, 예를 들어 단백질 변형 또는 변경된 번역 후 변형으로 인해 원하는 생화학적 특성을 갖는 단백질을 산출하는 능력을 나타내는 하위클론을 위해 증폭 및 스크리닝된다. 이들 표현형은 주어진 하위클론의 고유 특성에 기인하거나 돌연변이에 기인할 수 있다. 돌연변이는 화학물질, UV-파장 광, 방사선, 바이러스, 삽입 돌연변이원, DNA 불일치 수복의 억제, 또는 그러한 방법들의 조합의 사용을 통해 달성될 수 있다.

치료를 위해 proTGFβ1 - GARP 복합체 선택적 항체를 사용하는 방법

요법에 사용하기 위한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 본 명세서에 제공된다. 특히, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 상술한 바와 같이, Treg로부터 방출된 활성 TGFβ1은 다른 T 세포의 작용을 억제한다. 따라서, TGFβ1 매개 면역억제 기능의 저해는 각종 암에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 매력적인 접근법을 나타낸다. proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 백혈병을 포함한 혈액암뿐만 아니라, 고형 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.

이러한 방법에 사용하기 위한 항체는 본 명세서에서 전술된 것들, 예를 들어 표 1에 기재된 특징부, 예를 들어 CDR 또는 가변 도메인 서열을 갖는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편, 및 이러한 항체의 추가의 논의에 기재된 것들을 포함한다.

본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체의 면역 이펙터 특성이 당업자에게 알려진 기법에 의해 Fc 변형을 통해 조절될 수 있다. 예를 들어, Fc 이펙터 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개 식작용(ADCP), 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등이, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써 제공 및/또는 제어될 수 있다.

"항체 의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 천연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 지칭한다.

ADCC를 유도하는 단클론 항체의 능력은 그의 올리고당 성분을 조작함으로써 향상될 수 있다. 인간 IgG1 또는 IgG3은 잘 알려진 바이안테나리(biantennary) G0, G0F, G1, G1F, G2 또는 G2F 형태의 글리칸의 대부분에 의해 Asn297에서 N-글리코실화된다. 조작되지 않은 CHO 세포에 의해 생성된 항체는 전형적으로 약 85% 이상의 글리칸 푸코스 함량을 갖는다. Fc 영역에 부착된 바이안테나리 복합형(complex-type) 올리고당으로부터의 코어(core) 푸코스의 제거는, 항원 결합 또는 CDC 활성을 변경시키지 않고서, 개선된 FcγRIIIa 결합을 통해 항체의 ADCC를 향상시킨다. 그러한 mAb는 바이안테나리 복합형의 Fc 올리고당을 보유하는 비교적 높은 탈푸코실화 항체의 성공적인 발현을 유발하는 것으로 보고된 상이한 방법, 예컨대 배양 삼투압의 제어(문헌[Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 Lec13의 적용(문헌[Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002]), 숙주 세포주로서의 변이체 CHO 세포주 EB66의 적용(문헌[Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Epub ahead of print; PMID:20562582]), 숙주 세포주로서의 래트 하이브리도마 세포주 YB2/0의 적용(문헌[Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003]), 특히 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 유전자에 대한 저분자 간섭 RNA의 도입(문헌[Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004]), 또는 베타-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III 및 골지(Golgi) 알파-만노시다제 II 또는 강력한 알파-만노시다제 I 억제제인 키푸넨신의 동시 발현(문헌[Ferrara et al., J Biol Chem 281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008])을 사용하여 달성될 수 있다.

본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체에 의해 유발되는 ADCC는 또한 항체 Fc의 특정 치환에 의해 향상될 수 있다. 예시적인 치환은, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호에 기재된 바와 같은 아미노산 위치 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 또는 430(EU 인덱스에 따른 잔기 넘버링)에서의 치환이다.

약제학적 조성물 및 투여

본 명세서에 제공된 약제학적 조성물은 a) 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항체 단편의 유효량 및 b) 약제학적으로 허용되는 담체 - 이는 불활성이거나 생리적으로 활성일 수 있음 - 를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 적합한 모든 용매, 분산매, 코팅, 항세균제 및 항진균제 등을 포함한다. 적절한 담체, 희석제 및/또는 부형제의 예에는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라, 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장제, 예컨대 당, 다가 알코올 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 특히, 적절한 담체의 관련 예에는 (1) 약 1 mg/mL 내지 25 mg/mL의 인간 혈청 알부민을 함유하거나 함유하지 않는 둘베코(Dulbecco) 인산염 완충 식염수, pH 약 7.4, (2) 0.9% 식염수(0.9% w/v 염화나트륨(NaCl)), 및 (3) 5% (w/v) 덱스트로스가 포함되고; 또한 산화방지제, 예컨대 트립타민 및 안정제, 예컨대 트윈(Tween) 20®을 함유할 수 있다.

본 발명에서의 조성물은 또한, 치료되는 특정 장애를 위하여, 필요하다면 추가의 치료제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항체 단편과 보충 활성 화합물은 서로에게 불리한 영향을 주지 않는 보체 활성을 가질 것이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 시타라빈, 안트라사이클린, 히스타민 다이하이드로클로라이드, 또는 인터류킨 2이다. 바람직한 실시 형태에서, 추가의 치료제는 화학요법제이다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어 액체, 반고체, 및 고체 투여 형태를 포함하지만, 바람직한 형태는 의도된 투여 방법 및 치료 용도에 좌우된다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사가능 또는 주입가능 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복막내, 피하) 투여이다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 일정 시간에 걸쳐 연속 주입에 의해 또는 볼루스(bolus)로서 정맥내 투여된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 이들은 국부뿐만 아니라 전신 치료적 효과를 발휘하도록 근육내, 피하, 관절내, 골액낭내, 종양내, 종양 주변, 병변내, 또는 병변 주변 경로에 의해 주사된다.

본 발명의 항체, 항체 단편 또는 항체 접합체를 적절한 용매 중에 필요한 양으로 혼입시킨 후, 미세여과에 의해 멸균함으로써 비경구 투여를 위한 멸균 조성물이 제조될 수 있다. 용매 또는 비히클로서, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이들의 조합도 사용될 수 있다. 많은 경우에, 조성물 중에 등장화제, 예컨대 당류, 다가알코올 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 조성물은 또한 애쥬번트(adjuvant), 특히 습윤제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 비경구 투여용 멸균 조성물은 또한 멸균 고체 조성물 형태로 제조될 수 있는데, 이것은 멸균수 또는 임의의 다른 주사가능한 멸균 매체 중에서 사용 시에 용해될 수 있다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항체 단편은 또한 경구 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 정제, 환제, 분말(젤라틴 캡슐, 샤세(sachet)) 또는 과립이 사용될 수 있다. 이들 조성물에서, 본 발명에 따른 활성 성분은 아르곤 스트림 하에서 하나 이상의 불활성 희석제, 예컨대 전분, 셀룰로스, 수크로스, 락토스 또는 실리카와 혼합된다. 이러한 조성물은 또한 희석제 이외의 물질, 예를 들어 하나 이상의 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 활석, 착색제, 코팅(당-코팅된 정제) 또는 글레이즈를 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 조성물로서, 불활성 희석제, 예컨대 물, 에탄올, 글리세롤, 식물성 오일 또는 파라핀유를 함유하는 약제학적으로 허용되는 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 엘릭서(elixir)가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 희석제 이외의 물질, 예를 들어 습윤, 감미, 증점, 향미 또는 안정화 제품을 포함할 수 있다.

용량은 원하는 효과, 치료 기간 및 사용되는 투여 경로에 따라 좌우되며; 일반적으로 성인의 경우 경구로 1일 5 mg 내지 1000 mg의 용량으로, 단위 용량이 활성 물질 1 mg 내지 250 mg 범위이다. 일반적으로, 의사는 치료를 받는 대상의 연령, 체중 및 그에 특이적인 임의의 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 것이다.

바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항체 단편은 포유동물에서의 과다증식성 질환의 치료에 사용된다. 더 바람직한 실시 형태에서, 상기에 개시되고 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항체 단편을 함유하는 약제학적 조성물들 중 하나가 포유동물의 과다증식성 질환의 치료에 사용된다. 일 실시 형태에서, 상기 질환은 암이다. 부신피질암, 항문암, 방광암, 뇌종양, 신경교종, 유방암, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 간외담관암, 유잉 종양(Ewing's tumor), 두개외 생식세포 종양, 안암, 담낭암, 위암, 생식세포 종양, 임신성 융모성 종양, 두경부암, 하인두암, 섬세포암, 신장암, 후두암, 백혈병, 구순 구강암(lip and oral cavity cancer), 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 머켈세포암, 전이성 편평상피 두경부암(metastatic squamous head and neck cancer), 골수종, 신생물, 비인두암, 신경아세포종, 구강암, 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 갈색세포종, 뇌하수체암, 형질세포종, 전립선암, 횡문근육종, 직장암, 신세포암, 타액선암, 피부암, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), T 세포 림프종, 연부조직 육종, 위암, 고환암, 흉선종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 질암, 외음부암 또는 빌름스 종양(Wilms' tumor)과 같은 각종 다양한 암성 종양이 본 명세서에 기재된 항체로 치료될 수 있다.

상술한 암 중 어느 하나를 치료함에 있어서, 제공되는 치료 방법은 종양이 있는 개체에서 추가의 종양 성장을 억제하고, 종양 퇴축을 유도하고, 무진행 생존을 증가시키고/시키거나 전체 생존을 연장시키는데 이용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 또한 전이 개시를 지연시키거나 방지할 수 있다. 치료 진행은 다양한 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 억제는 종양 크기 감소 및/또는 종양 내의 대사 활성의 감소를 가져올 수 있다. 이들 두 파라미터는 예를 들어, MRI 또는 PET 스캔에 의해 측정될 수 있다. 억제는 또한 괴사 레벨, 종양 세포 사멸 및 종양 내의 혈관분포 레벨을 확인하기 위해 생검에 의해 모니터링될 수 있다. 전이의 정도는 알려진 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 흑색종, 폐암, 두경부암, 신세포암, 대장암, 유방방, 전립선암, 자궁내막암, 방광암, 신장암, 식도암, 고환암, 난소암, 편평상피세포암(예를 들어, 두경부 편평상피암 - SCCHN), 포도막 흑색종, 여포성 림프종, 자궁경부암, 뇌종양, 췌장암, 간암, 림프종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 다발성 골수종, 위암 및 성상세포종을 포함한(그러나, 이에 한정되지 않음) 각종 암의 전이를 치료 또는 예방하는데 유용하다.

유사하게, TGFβ1 발현 면역 세포를 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여, 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항체 단편의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 선택된 세포 집단의 성장을 억제하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 바람직한 실시형태에서, 추가의 치료제는 면역요법, 즉 면역 반응을 유도하거나 증강시키는 면역자극제이다. 이러한 제제는 예를 들어, 1) 수지상 세포의 활성화제, 2) 백신 애쥬번트, 3) T 세포 자극제, 4) 면역 체크포인트의 억제제 및 5) 억제 세포, 사이토카인 및/또는 효소의 억제제를 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 항체는 백신과 함께 투여된다.

임상적 사용을 위해, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편의 치료적 유효량이 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다. 예를 들어, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 이의 항원 결합 단편은 TGFβ1 양성 면역 세포를 함유하는 암성 종양의 치료에 유용할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, 대상은 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 일부 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 무균 테스트를 한 용액으로서 투여될 것이다.

상기의 치료 및 사용 방법에서의 투여 계획은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단회 볼루스가 투여될 수 있거나, 수회 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 투여 단위 형태로 제형화할 수 있다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 단편에 대한 효율적인 투여량 및 투여 계획은 치료하고자 하는 질환 또는 상태에 좌우되고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료적 유효량에 대한 예시적인 비제한적인 범위는 약 0.001 내지 10 mg/㎏, 예컨대 약 0.001 내지 5 mg/㎏, 예를 들어 약 0.001 내지 2 mg/㎏, 예컨대 약 0.001 내지 1 mg/㎏, 예를 들어 약 0.001, 약 0.01, 약 0.1, 약 1 또는 약 10 mg/㎏이다.

본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 약제학적 조성물에 사용되는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편의 용량을 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 시작해서 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체의 적합한 일일 용량은 치료적 효과를 가져오기에 효과적인 최저 용량인 화합물의 양일 것이다. 투여는, 예를 들어 비경구, 예컨대 정맥내, 근육내 또는 피하 투여일 수 있다. 일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편은 mg/m²로 계산된 주 1회의 투여량으로 주입에 의해 투여될 수 있다. 그러한 투여량은, 예를 들어, 하기에 따라 상기에 제공된 mg/㎏ 투여량을 기준으로 할 수 있다: 용량(mg/㎏)x70. 그러한 투여는, 예를 들어 1 내지 8회, 예컨대 3 내지 5회 반복될 수 있다. 투여는 2 내지 24시간, 예컨대 2 내지 12시간의 기간에 걸쳐 지속 주입에 의해 수행될 수 있다. 일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편은 중독성 부작용을 감소시키기 위해 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸쳐 느린 지속 주입에 의해 투여될 수 있다.

일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편은 주 1회 제공될 때 최대 8회, 예컨대 4 내지 6회 동안 고정 용량으로서 계산된 주 1회의 투여량으로 투여될 수 있다. 그러한 계획은, 예를 들어 6개월 또는 12개월 후에, 필요하다면 1회 이상 반복될 수 있다. 그러한 고정 투여량은, 예를 들어, 70 ㎏의 체중 추정치로, 상기에 제공된 mg/㎏ 투여량을 기준으로 할 수 있다. 투여량은 예를 들어, 생물학적 샘플을 취하고, 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체의 항원 결합 영역을 표적으로 하는 항이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 사용함으로써 투여 시에 혈액 중의 본 발명의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체의 양을 측정함으로써 결정 또는 조정될 수 있다.

일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편은 유지 요법(maintenance therapy)에 의해, 예를 들어 6개월 이상의 기간 동안 주 1회 투여될 수 있다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 단편은 또한 암 발생 위험을 감소시키고/시키거나, 암 진행에서의 사건의 발생의 개시를 지연시키고/시키거나, 암이 관해기에 있을 때 재발 위험을 감소시키기 위하여 예방적으로 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 이의 단편은 또한 병용 요법으로 투여될 수 있는데, 즉, 치료하고자 하는 질환 또는 상태에 대해 관련된 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 항체 함유 약제는 하나 이상의 추가의 치료제, 예컨대 화학요법제와의 병용을 위한 것이다. 일부 실시 형태에서, 다른 치료제는 하기를 포함하는 알킬화제를 포함하는 항신생물제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 질소 머스타드, 예를 들어, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실; 니트로소우레아, 예를 들어 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU) 및 세무스틴(메틸 -CCNU); 테모달(Temodal)™ (테모졸로마이드), 에틸렌이민/메틸멜라민, 예를 들어, 트라이에틸렌멜라민(TEM), 트라이에틸렌, 티오포스포르아미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판; 트라이아진, 예를 들어, 다카르바진(DTIC); 엽산 유사체, 예를 들어 메토트렉세이트 및 트라이메트렉세이트, 피리미딘 유사체, 에를 들어 5-플루오로우라실(5FU), 플루오로데옥시우리딘, 젬시타빈, 시토신 아라비노사이드(AraC, 시타라빈), 5-아자시티딘, 2,2'-다이플루오로데옥시시티딘, 푸린 유사체, 예를 들어 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 아자티오프린, 2'-데옥시코포르마이신(펜토스타틴), 에리트로하이드록시노닐아데닌(EHNA), 플루다라빈 포스페이트 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA)을 비롯한 대사길항제; 세포분열 억제제, 예를 들어 파클리탁셀, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함한 빈카 알칼로이드, 탁소티어, 에스트라무스틴 및 에스트라무스틴 포스페이트를 비롯한 천연 산물; 에피포도필로톡신, 예를 들어 에토포시드 및 테니포시드; 항생제, 예를 들어 악티모마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 독소루비신, 미톡산트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 미토마이신 C 및 악티노마이신; 효소, 예컨대 L-아스파라기나제; 생물학적 반응 조절제, 예를 들어 인터페론-알파, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF; 백금 배위 착물, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴, 안트라센다이온, 예를 들어 미톡산트론, 치환 우레아, 예컨대 하이드록시우레아, N-메틸하이드라진(MIH) 및 프로카르바진을 포함하는 메틸하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 예컨대 미토탄(o,p-DDD)및 아미노글루테티마이드를 비롯한 기타 제제; 부신피질 스테로이드 길항제, 예를 들어 프레드니손 및 등가물, 덱사메타손 및 아미노글루테티마이드를 포함하는 길항제 및 호르몬; 젬자르((Gemzar)™ (젬시타빈), 프로게스틴, 예를 들어, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트 및 메게스트롤 아세테이트; 에스트로겐, 예를 들어 다이에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라다이올 등가물; 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜; 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로겐; 항안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 고나도트로핀 방출 호르몬 유사체 및 류프롤라이드; 및 비스테로이드성 항안드로겐, 예를 들어 플루타미드. 히스톤 데아세틸라제 억제제, 탈메틸화제(예를 들어, 비다자(Vidaza)) 및 전사 억제(ATRA) 요법제의 방출을 포함하지만 이에 한정되지 않는 후성적 기작을 표적으로 하는 요법은 또한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체와 조합될 수 있다.

화학요법제의 추가의 구체적인 예에는 탁솔, 탁산(예를 들어, 도세탁셀 및 탁소티어), 변형된 파클리탁셀(예를 들어, 아브락산 및 오팍시오), 독소루비신, 아바스틴(Avastin)®, 수텐트(Sutent), 넥사바(Nexavar), 및 다른 멀티키나제 억제제, 시스플라틴 및 카르보플라틴, 에토포시드, 젬시타빈 및 빈블라스틴이 포함된다. 다른 키나제의 특이적 억제제는 또한 MAPK 경로 억제제(예를 들어, ERK, JNK 및 p38의 억제제), PI3키나제/AKT 억제제 및 Pim 억제제를 포함하지만 이에 한정되지 않으며, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 다른 억제제는 Hsp90 억제제, 프로테아좀 억제제(예를 들어, 벨케이드(Velcade))및 트리세녹스(Trisenox)와 같은 작용 억제제의 다수의 기전을 포함한다.

그러한 병용 투여는 동시적, 개별적 또는 순차적 - 임의의 순서임 - 일 수 있다. 동시적 투여의 경우, 작용제들은, 필요에 따라, 하나의 조성물로서 또는 개별 조성물들로서 투여될 수 있다.

일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 항원 제시 세포를 자극하는 제제와 배합된다. 이러한 제제의 예에는 다양한 CD40 작용제, 예를 들어, 작용제 항 CD40 항체 또는 CD40L이 포함된다.

일부 방법은 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편을 백신 애쥬번트와 함께 투여하는 것을 포함한다. 이러한 애쥬번트에는 예를 들어, IL-12, 및 CpG(TLR 9 작용제), 모노포스포릴 지질 A(MPL - TLR4 작용제), 폴리(Poly)I:C 또는 폴리ICLC(TLR3 작용제), 및 레지퀴모드(resiquimod) 및 852 A(TLR 7/8 작용제)가 포함된다.

다른 치료적 접근법에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체는 T 세포 성장 인자, 예를 들어 IL-15 및/또는 IL-17, 또는 이들 분자의 활성화제와 병용하여 투여된다. 관련 방법에서, T 세포 자극제는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체와 배합된다. 그러한 자극제에는 4-1BB의 작용제, 예를 들어 작용제 항 4-1BB 항체 및 4-1BBL이 포함된다.

일 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 T 세포 체크포인트 억제제, 예를 들어, 억제 신호를 면역계에 보내는 분자와 함께 투여된다. 이러한 제제의 예에는 PD-1 또는 PD-L1(B7-H1)의 억제제, 예를 들어 니볼루맙(브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)) 및 MK-3475(머크(Merck))로도 알려진 펨브롤리주맙, 피딜리주맙(큐레테크(Curetech)), AMP-224(앰플리뮨(Amplimmune))를 비롯한 항 PD-1 항체, 및 MPDL3280A(로슈(Roche)), MDX-1105(브리스톨-마이어스 스큅), MEDI-4736 (아스트라제네카(AstraZeneca)) 및 MSB-0010718C(머크)를 비롯한 항 PD-L1 항체를 포함한다. 다른 체크포인트 억제제는 항 CTLA-4 항체와 같은 CTLA-4 길항제를 포함한다. 예시적인 항 CTLA4 항체는 브리스톨-마이어스 스큅에 의해 시판되는 예르보이(Yervoy)® (이필리무맙)이다. 다른 예시적인 CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(파이저(Pfizer)), 티실리무맙(아스트라제네카) 및 AMGP-224(글락소스미스클라인(Glaxo Smith Kline))를 포함한다.

또 다른 방법에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 면역억제 효과를 갖는 효소의 억제제와 병용하여 투여된다. 일례는 인돌아민 2,3-다이옥시게나제의 소분자 억제제인 1-메틸 트립토판(1MT)이다.

또한, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 또한 암젠(Amgen) 제의 T-VEC(탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec))와 조합하여 사용될 수 있다.

특정 실시 형태에서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 이중특이성 항체와 병용하여 투여된다. 이중 특이성 항체는 숙주의 면역계, 특히 암세포에 대한 T 세포의 세포 독성을 유도할 수 있다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 또한 다양한 표적 요법과 병용하여 투여될 수 있다. 표적 요법의 예에는 치료용 항체의 사용이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 예시적인 항체는 세포 표면 단백질 Her2, CDC20, CDC33, 뮤신 유사 당단백질, 및 종양 세포 상에 존재하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR), OX40, PD-1, CTLA-4에 결합하고, 임의로 이러한 단백질을 표시하는 종양 세포에 세포증식억제 및/또는 세포독성 효과를 유도하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 항체는 또한 유방암 및 다른 형태의 암을 치료하는데 사용될 수 있는 헤르셉틴(HERCEPTIN)® (트라스투주맙), 및 비호지킨 림프종 및 다른 형태의 암을 치료하는데 사용될 수 있는 리툭산(RITUXAN)® (리툭시맙), 제발린(ZEVALIN)™ (이브리투모맙 튜세탄), 및 림포사이드(LYMPHOCIDE)™ (에프라투주맙)을 포함한다. 특정한 예시적인 항체는 또한 파니투무맙(벡티빅스(VECTIBIX)®), 에르비툭스(ERBITUX)® (IMC-C225); 벡사르(BEXXAR)™(요오드 131 토시투모맙); KDR(키나제 도메인 수용체) 억제제; 항 VEGF 항체 및 길항제(예를 들어, 아바스틴® 및 VEGAF-TRAP); 항 VEGF 수용체 항체 및 항원 결합 영역; 항 Ang-1 및 Ang-2 항체 및 항원 결합 영역; Tie-2 및 다른 Ang-1 및 Ang-2 수용체에 대한 항체; Tie-2 리간드; Tie-2 키나제 억제제에 대한 항체; Hif-1a 및 캄파쓰(Campath)™ (알렘투주맙)의 억제제를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 암 치료제는 종양 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하는 폴리펩티드이며, TNF 관련 폴리펩티드 TRAIL을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

일 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 혈관 형성을 감소시키는 하나 이상의 혈관신생 억제제와 조합하여 사용된다. 특정한 이러한 제제는 IL-8 길항제; 캄파쓰, B-FGF; FGF 길항제; Tek 길항제(세레티(Cerretti) 등의 미국 특허 공개 제2003/0162712호; 세레티 등의 미국 특허 제6,413,932호 및 세레티 등의 미국 특허 제6,521,424호); 항 TWEAK 제제(항체 및 항원 결합 영역을 포함하나 이에 한정되지 않음); 가용성 TWEAK 수용체 길항제(와일리(Wiley)의 미국 특허 제6,727,225호); 인테그린의 이의 리간드에 대한 결합을 길항하는 ADAM 디스인테그린(distintegrin) 도메인(판슬로(Fanslow) 등의 미국 특허 공개 제2002/0042368호); 항 Eph 수용체 및 항 에프린 항체; 항원 결합 영역 또는 길항제(미국 특허 제5,981,245호; 제5,728,813호; 제5,969,110호; 제6,596,852호; 제6,232,447호; 제6,057,124호); 항 VEGF 제제(예를 들어, VEGF, 또는 가용성 VEGF 수용체 또는 이의 리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), 예컨대 아바스틴® 또는 VEGF-TRAP™, 및 항 VEGF 수용체 제제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), EGFR 억제제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), 예를 들어, 파니투무맙, 이레사(IRESSA)™ (제피티닙), 타세바(TARCEVA)™ (에를로티닙), 항 Ang-1 및 항 Ang-2 제제(예를 들어, 이에 또는 이의 수용체, 예를 들어 Tie-2/TEK에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), 및 항 Tie-2 키나제 억제제(예를 들어, 특이적으로 결합하여, 성장 인자의 활성을 억제하는 항체 또는 항원 결합 영역, 예컨대 간세포 성장 인자(HGF, 스캐터(Scatter) 인자로도 알려짐)의 길항제, 및 이의 수용체 "c-met"에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역(예를 들어, 릴로투무맙 및 AMG 337, 암젠)); 항 PDGF-BB 길항제; PDGF-BB 리간드에 대한 항체 및 항원 결합 영역; 및 PDGFR 키나제 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편과 병용하여 사용될 수 있는 다른 혈관신생 억제제는 MMP-2(매트릭스-메탈로프로테이나아제 2) 억제제, MMP-9(매트릭스-메탈로프로테이나아제 9) 억제제, 및 COX-II(사이클로옥시게나제 II) 억제제와 같은 제제를 포함한다. 유용한 COX-II 억제제의 예에는 셀레브렉스(CELEBREX)™ (셀레콕시브), 발데콕시브 및 로페콕시브가 포함된다.

본 명세서에 제공되는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 또한 성장 인자 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 제제의 예에는 EGF-R(상피 성장 인자 수용체) 반응을 억제할 수 있는 제제, 예를 들어 EGF-R 항체(예를 들어, 파니투무맙(벡티빅스®)), EGF 항체, 및 EGF-R 억제제인 분자; VEGF(혈관 내피 성장 인자) 억제제, 예를 들어 VEGF 수용체 및 VEGF를 억제할 수 있는 분자; 및 erbB2 수용체 억제제, 예컨대 erbB2 수용체에 결합하는 유기 분자 또는 항체, 예를 들어 헤르셉틴® (제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.))을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. EGF-R 억제제는 예를 들어, 미국 특허 제5,747,498호, WO 98/14451, WO 95/19970 및 WO 98/02434에 기재되어 있다.

일부 치료 응도에서, 특히 암이 뼈에 악영향을 미치도록 뼈에 전이된 경우, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편을 추가의 골 손실을 억제하거나 손실된 뼈를 회복시키는데 도움이 되는 치료제와 함께 투여하는 것이 유용할 수 있다. 따라서, proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 골 성장 촉진제(동화제) 또는 골 재흡수 저해제의 치료적 유효량과 함께 투여될 수 있다: BMP-1 내지 BMP-12로 나타낸 골 형태 형성 인자(bone morphogenic factor); 형질전환 성장 인자-β 및 TGF-β 패밀리 구성원; 섬유아세포 성장 인자 FGF-1 내지 FGF-10; 인터류킨-1 억제제(IL-1ra, IL-1에 대한 항체 및 IL-1 수용체에 대한 항체 포함); TNFα 저해제(에타네르셉트, 아달리부맙 및 인플릭시맙 포함); RANK 리간드 억제제(가용성 RANK, 오스테오프로테게린, 및 RANK 또는 RANK 리간드에 특이적으로 결합하는 안타고니스트 항체, 예를 들어 데노수맙(엑스제바(XGEVA)®) 포함), Dkk-1 억제제(예를 들어, 항 Dkk-1 항체), 부갑상선 호르몬, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트 및 골 향상 미네랄(bone-enhancing mineral), 예컨대 플루오라이드 및 칼슘. proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 이의 기능적 단편과 병용하여 사용될 수 있는 동화제는 부갑상선 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF)를 포함하며, 후자의 제제는 바람직하게는 IGF 결합 단백질과 복합체를 형성한다. 이러한 병용 요법에 적합한 IL-1 수용체 길항제는 WO89/11540에 기재되어 있으며, 적절한 가용성 TNF 수용체-1은 WO98/01555에 기재되어 있다. 예시적인 RANK 리간드 길항제는 예를 들어, WO 03/086289, WO 03/002713, 미국 특허 제6,740,511호 및 제6,479,635호에 개시되어 있다.

일 실시 형태에서, 암을 치료하는 방법은 본 명세서에 기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체의 치료적 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상에게 방사선 요법과 함께 투여하는 것을 포함한다. 방사선 요법은 환자에게 방사성 의약품의 방사선 또는 관련 투여를 포함할 수 있다. 방사선원은 치료받는 환자의 외부 또는 내부에 있을 수 있다(예를 들어, 방사선 치료는 외부 빔 방사선 요법(EBRT) 또는 근접방사선요법(brachytherapy, BT)의 형태일 수 있음). 그러한 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 방사성 원소는 예를 들어, 라듐, 세슘-137, 이리듐-192, 아메리슘-241, 금-198, 코발트-57, 구리-67, 테크네튬-99, 아이오다이드-123, 아이오다이드-131 및 인듐-111을 포함한다.

proTGFβ1 - GARP 복합체의 검출 방법

생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시킴으로써, 상기 샘플에서 proTGFβ1-GARP 복합체를 검출하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 샘플은 소변, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 복수, 순환 세포, 순환 종양 세포, 조직과 회합되지 않은 세포(즉, 유리 세포), 조직(예를 들어, 외과적으로 절제된 종양 조직, 생검 - 미세 바늘 흡인물을 포함함), 조직 프레파라트 등으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기재된 방법은 생물학적 샘플을 본 명세서에 기재된 임의의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시킴으로써 상기 샘플에서 proTGFβ1-GARP 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 샘플은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 제1 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉되고, 이어서 제2 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉될 수 있으며, 여기서 제1 항체 또는 항원 결합 단편 및 제2 항체 또는 항원 결합 단편은 동일한 항체 또는 항원 결합 단편이 아니다. 일부 실시 형태에서, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 샘플과 접촉시키기 전에 표면, 예컨대 멀티웰 플레이트, 칩, 또는 유사한 기재에 부착될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 샘플과 접촉시키기 전에 어떠한 것에도 전혀 고정 또는 부착되지 않을 수 있다.

기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 검출가능하게 표지화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표지 항체 및 항원 결합 단편이 본 명세서에 기재된 방법을 통해 proTGFβ1-GARP 복합체의 검출을 촉진시킬 수 있다. 많은 그러한 표지가 당업자에게 용이하게 알려져 있다. 예를 들어, 적절한 표지는 방사선 표지, 형광 표지, 에피토프 태그, 비오틴, 발색단 표지, ECL 표지, 또는 효소를 포함하지만 이로 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다. 더 구체적으로는, 기재된 표지는 루테늄, ¹¹¹In-DOTA, ¹¹¹In-다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 베타-갈락토시다제, 폴리-히스티딘(HIS 태그), 아크리딘 염료, 시아닌 염료, 플루오론 염료, 옥사진 염료, 페난트리딘 염료, 로다민 염료, 알렉사플루오르(Alexafluor)® 염료 등을 포함한다.

기재된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 및 항원 결합 단편은 생물학적 샘플에서 proTGFβ1-GARP 복합체를 검출하기 위한 다양한 검정에 사용될 수 있다. 일부 적절한 검정은 웨스턴 블롯(Western blot) 분석, 방사면역검정, 표면 플라즈몬 공명, 면역형광측정(immunofluorimetry), 면역침강, 평형 투석, 면역확산, 전기화학발광(ECL) 면역검정, 면역조직화학, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 또는 ELISA 검정을 포함하지만 이로 한정되는 것으로 여겨져서는 안 된다.

proTGFβ1 - GARP 복합체를 검출하기 위한 키트

생물학적 샘플에서 proTGFβ1-GARP 복합체를 검출하기 위한 키트가 본 명세서에 제공된다. 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 키트의 사용 설명서를 포함한다.

제공된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 또는 항원 결합 단편은 용액 상태로 있을 수 있거나; 동결건조될 수 있거나; 기재, 캐리어 또는 플레이트에 부착될 수 있거나; 검출가능하게 표지될 수 있다.

기재된 키트는 또한 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기에 유용한 추가 성분을 포함할 수 있다. 예로서, 키트는 대상으로부터 샘플을 획득하기 위한 수단, 대조군 샘플 또는 참조 샘플, 예를 들어 느리게 진행되는 암에 걸린 대상 및/또는 암에 걸리지 않은 대상으로부터의 샘플, 하나 이상의 샘플 구획, 및/또는 본 발명의 방법의 수행 절차 및 조직 특이적 대조물 또는 표준물을 설명한 교육용 자료를 포함할 수 있다.

proTGFβ1-GARP 복합체의 수준을 측정하는 수단은 예를 들어, proTGFβ1-GARP 복합체의 수준을 측정하기 위한 분석에서 사용되는 완충액 또는 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다. 설명서는, 예를 들어, 검정을 수행하기 위한 인쇄된 설명서 및/또는 proTGFβ1-GARP 복합체의 발현 수준을 평가하기 위한 설명서일 수 있다.

기재된 키트는 또한 대상으로부터 샘플을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 수단은 대상으로부터 체액 또는 조직을 획득하기 위해 사용될 수 있는 시약 또는 장비 중 하나 이상의 아이템을 포함할 수 있다. 대상으로부터 샘플을 획득하기 위한 수단은 또한 혈액 샘플로부터 혈액 성분, 예컨대 혈청을 단리하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 인간 대상에서의 사용을 위해 설계된다.

실시예

하기의 실시예는 앞서의 개시내용을 보충하기 위해 그리고 본 명세서에 기재된 발명 요지에 대한 더 우수한 이해를 주기 위해 제공된다. 이들 실시예는 기재된 발명 요지를 한정하는 것으로 여겨져서는 안 된다. 본 명세서에 기재된 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 명백할 것이고, 이는 본 발명의 진정한 범주 내에 포함되어야 하고 그로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 이해된다.

실시예 1: 파지 디스플레이 기술을 사용한 proTGFβ1 - GARP 복합체 선택적 항체의 발견:

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체를 개발하기 위해 항체 개발 캠페인을 행하였다. 켐파트너(ChemPartner) 독점적인 완전 인간 나이브 파아지 디스플레이 라이브러리(중국 상하이 소재의 켐프트너)를 인간 항체 단편의 공급원으로서 사용하였다. 먼저, 상기 라이브러리를 비오틴화 sGARP(서열 번호 1)와 LTBP1-proTGFβ1(서열 번호 2 및 3)의 배합 혼합물에 대하여 음성적으로 패닝하여(negatively panned), 원치 않는 LTBP1-proTGFb1 복합체 또는 비복합체화된 sGARP 단백질에 결합하는 scFv 단편을 제거하였다. 이어서, 제외된 라이브러리의 출력을 여러 라운드 동안 sGARP-proTGFβ1에 대해 패닝시켰다. sGARP-proTGFβ1에 특이적으로 결합된 25개의 scFv를 특이적인 HCDR3 서열, 원하는 복합체 선택성 및 서열 라이어빌러티(sequence liability)에 기초하여 선택하였다. 특이적인 중쇄 V 영역을 인간 IgG4 발현 벡터에 클로닝하고, 특이적인 경쇄를 인간 카파 발현 벡터에 클로닝하여, 얻어진 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보를 ELISA에서 결합 활성에 대해 다시 시험하였다. 이러한 분석으로부터의 상부 결합제를 추가의 특성화를 위해 선택하였다.

실시예 2: 시험관 내 에서의 4B1c1 및 4b16B9에 의한 인간 Treg 기능의 억제

이전 실시예에서 생성된 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보를 시험관 내 억제 분석에서 인간 Treg 기능의 억제에 대해 시험하였다. 활성화된 CD4⁺CD25Hi 억제 세포를 Treg의 공급원으로 사용하고, CFSE 표지된 CD4+CD25- 이펙터 T 세포(Teff 세포)를 증식 억제를 위한 표적으로 사용하였다. 세포를 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보의 존재 또는 부재 하에, 플레이트 결합된 항 CD3, 가용성 항 CD28과 함께 1 Treg/1 Teff 비로 인큐베이션하였다. Treg는 단지 T 이펙터와 비교하여, Teff 세포의 증식을 약 50% 억제하였다. Teff의 증식 레벨(Treg와 함께 인큐베이션됨)은 Treg/Teff 대조군 또는 hIgG4 군과 비교하여, 4B1C1의 존재 하에서 회복되었고, 4B16B9에 의해 부분적으로 회복되었다(도 1). 이러한 결과는 인간 Treg에 의한 면역억제에서의 TGF-β1의 활성을 확인하고, 4B1C1 및 4B16B9가 양성 대조군의 TGFβ 중화 항체 1D11(알앤디 시스템즈(R&D Systems) 카탈로그 번호 MAB-1835)과 유사하게, 시험관 내에서의 이러한 활성을 부분적으로 차단할 수 있음을 나타낸다.

[표 2]

2개의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보의 VH 및 VL이 하기 표 3에 나타나 있다.

[표 3]

실시예 3: TGFβ1 생물학적 검정

활성 TGFβ1의 레벨을 조절하는 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보의 능력을 통합된 TGFβ/Smad3 반응성 루시퍼라아제 발현 단위를 갖는 TMLC 리포터 세포를 사용하여 측정하였다. 간략하게, HEK293 또는 Sw480 세포를 인간 proTGFβ1 및 LTBP1 또는 인간 proTGFβ1 및 GARP 발현 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 트랜스펙션으로부터 회수하고, 37℃에서 24시간 동안 LTBP1 또는 GARP 중 어느 하나와 복합체를 형성하여 proTGFβ1을 발현시켰으며, 이 시점에서 분석을 수행할 수 있었다. 분석을 설정하기 위해, TGFβ1 활성화 인테그린 αVβ6를 안정하게 발현시키는 일시적 트랜스펙턴트를 SW480β6 세포와 공배양하였다. 분석을 의도한 대로 작업하였다는 것을 확인하기 위해, 기지 농도의 TGF-β1 성장 인자를 갖는 배지 샘플을 TMLC 리포터 세포 배양물에 첨가하여 표준 곡선을 생성하였다.

ProTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보(10 ㎍/mL)를 트랜스펙션된 세포와 배합하여, TMLC 리포터 세포 배양물에 첨가하였다. 그 다음에 플레이트를 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 성공적인 TGFβ1 신호전달은 SMAD2/3 경로를 활성화시키고, 이어서 루시퍼라제 발현을 활성화시킬 것으로 예상되었으며, 이는 제조자(프로메가(Promega))가 나타낸 바와 같이 브라이트 글로(Bright-Glo)를 첨가하고, 바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기(Biotek Synergy H1 plate reader)(바이오텍(Biotek))에서 생성된 발광을 측정함으로써 검출될 수 있었다.

4B1C1 및 4B16B9 항체는 대조군 치료와 비교하여, 유의하게 감소된 루시퍼라제 발현을 유도하였으며, 이는 이들 항체가 활성 TGFβ1 성장 인자의 레벨을 조절하고 세포의 TGFβ1 매개 신호전달을 감소시킴을 나타낸다. 이러한 효과는 양성 대조군의 TGFβ 중화 항체 1D11을 중화시키는 효과와 유사하다.

실시예 4: 바이오층 간섭법에 의한 친화도 측정

TGFβ1-GARP 복합체에 대한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보의 결합 친화도를 옥텟레드 384(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 포르테바이오(Fortebio)) 상에서 바이오층 간섭법에 의해 측정하였다. 스트렙타비딘 바이오센서(포르테바이오, 카탈로그 번호 18-5020)에 pH 5의 아세트산나트륨 완충액에서 20 ㎍/ml의 비오틴화 sGARP-proTGFβ1 복합체를 로딩하여, 동일한 완충액으로 세척하고, 동일한 완충액에서 10 ㎍/mL의 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보를 함유하는 웰에 옮겼다. 해리 상수를 옥텟 소프트웨어를 사용하여 정상 상태 알고리즘에 대한 반응의 비선형 피팅(non-linear fitting)에 의해 구하였다(표 4). 유사한 친화도를 동적 피팅에 의해 구하였다.

[표 4]

결합 특이성을 확인하기 위해, 4B1C1 및 4B16B9를 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, proTGFβ1-LTBP1, proTGFβ1-LTBP3 및 proTGFβ1-LRRC33에 대한 결합에 대해 상기와 같이 스크리닝하였다. 상술한 바와 같이, 하기 조건 하에서 항체를 10μg/ml에서 시험하고, 항원을 20 ㎍/ml에서 시험하였다. 이러한 연구는 proTGFβ1-GARP 복합체 이외의 어떤 항원에 대해서도 식별가능한 항체의 결합을 나타내지 않음을 입증하였으며, 도 4에 나타나 있다.

[표 5]

실시예 5: 용량 반응 분석

활성 TGFβ1의 레벨에 대한 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보 조절의 농도 의존성을 실시예 3에 기재된 통합된 TGFβ/Smad3 반응성 루시퍼라제 발현 단위를 갖는 TMLC 리포터 세포를 사용하여 측정하였는데, 유일한 차이점은 proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보가 다양한 농도로 실험 웰에 첨가되었다는 것이다.

4B1C1 및 4B16B9는 이들이 각각 0.178 nM 및 1.9 nM의 IC50으로 용량 의존적으로 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있음을 입증하였다(도 3).

실시예 6: 항체 특성화

proTGFβ1-GARP 복합체 선택적 항체 후보를 다른 단백질 복합체에 비해, proTGFβ1-GARP 복합체에 대한 선택성에 대해 옥텟레드 384(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 포르테바이오) 상에서 바이오층 간섭법에 의해 측정하였다(도 4). 4B1C1 및 4B16B9는 proTGFβ1-GARP 복합체에 대해 1 nM 미만의 해리 상수(Kd)를 나타내었지만, proTGFβ1-LTBP1 또는 proTGFβ1-LTBP3 복합체에 대해 검출가능한 결합을 나타내지 않았다. 4B1C1 및 4B16B9는 또한 TGFβ1, TGFβ2 또는 TGFβ3 성장 인자에 대한 결합을 나타내지 않았다.

proTGFβ1-LRRC33 복합체에 대한 항체 결합도 시험하였다. proTGFβ1-LRRC33 복합체를 발현시키고, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제하고, 비응집 복합체의 형성을 분석 SEC에 의해 확인하였다. 이어서, 정제된 proTGFβ1-LRRC33 복합체에 대한 4B1C1 및 4B16B9의 결합을 실시예 4에 기재된 바와 같이 옥텟레드 384(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 포르테바이오) 분석에 의해 시험하였다. 이를 위해, 4B1C1 또는 4B16B9를 항 인간 Fc 팁 상에 포획하고, proTGFβ1-GARP 또는 proTGFβ1-LRRC33의 결합을 옥텟에 의해 검출하였다. proTGFβ1-GARP와는 대조적으로, proTGFβ1-LRRC33 복합체에 대한 4B1C1 또는 4B16B9의 결합이 검출되지 않았다.

서열 목록의 간단한 설명

SEQUENCE LISTING <110> SCHOLAR ROCK, INC. CARVEN, GREGORY J. SCHURPF, THOMAS TURNER, KATHERINE <120> TGF-BETA ANTIBODIES, METHODS, AND USES <130> JBI5093WOPCT <140> TO BE ASSIGNED <141> 2017-07-14 <150> 62/371,355 <151> 2016-08-05 <150> 62/362,393 <151> 2016-07-14 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Gln Asp Lys Val Pro Cys Lys Met Val Asp Lys Lys Val Ser Cys 1 5 10 15 Gln Val Leu Gly Leu Leu Gln Val Pro Ser Val Leu Pro Pro Asp Thr 20 25 30 Glu Thr Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gln Leu Arg Ser Ile Leu Ala Ser 35 40 45 Pro Leu Gly Phe Tyr Thr Ala Leu Arg His Leu Asp Leu Ser Thr Asn 50 55 60 Glu Ile Ser Phe Leu Gln Pro Gly Ala Phe Gln Ala Leu Thr His Leu 65 70 75 80 Glu His Leu Ser Leu Ala His Asn Arg Leu Ala Met Ala Thr Ala Leu 85 90 95 Ser Ala Gly Gly Leu Gly Pro Leu Pro Arg Val Thr Ser Leu Asp Leu 100 105 110 Ser Gly Asn Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Glu Arg Leu Leu Gly Glu 115 120 125 Ala Pro Ser Leu His Thr Leu Ser Leu Ala Glu Asn Ser Leu Thr Arg 130 135 140 Leu Thr Arg His Thr Phe Arg Asp Met Pro Ala Leu Glu Gln Leu Asp 145 150 155 160 Leu His Ser Asn Val Leu Met Asp Ile Glu Asp Gly Ala Phe Glu Gly 165 170 175 Leu Pro Arg Leu Thr His Leu Asn Leu Ser Arg Asn Ser Leu Thr Cys 180 185 190 Ile Ser Asp Phe Ser Leu Gln Gln Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys 195 200 205 Asn Ser Ile Glu Ala Phe Gln Thr Ala Ser Gln Pro Gln Ala Glu Phe 210 215 220 Gln Leu Thr Trp Leu Asp Leu Arg Glu Asn Lys Leu Leu His Phe Pro 225 230 235 240 Asp Leu Ala Ala Leu Pro Arg Leu Ile Tyr Leu Asn Leu Ser Asn Asn 245 250 255 Leu Ile Arg Leu Pro Thr Gly Pro Pro Gln Asp Ser Lys Gly Ile His 260 265 270 Ala Pro Ser Glu Gly Trp Ser Ala Leu Pro Leu Ser Ala Pro Ser Gly 275 280 285 Asn Ala Ser Gly Arg Pro Leu Ser Gln Leu Leu Asn Leu Asp Leu Ser 290 295 300 Tyr Asn Glu Ile Glu Leu Ile Pro Asp Ser Phe Leu Glu His Leu Thr 305 310 315 320 Ser Leu Cys Phe Leu Asn Leu Ser Arg Asn Cys Leu Arg Thr Phe Glu 325 330 335 Ala Arg Arg Leu Gly Ser Leu Pro Cys Leu Met Leu Leu Asp Leu Ser 340 345 350 His Asn Ala Leu Glu Thr Leu Glu Leu Gly Ala Arg Ala Leu Gly Ser 355 360 365 Leu Arg Thr Leu Leu Leu Gln Gly Asn Ala Leu Arg Asp Leu Pro Pro 370 375 380 Tyr Thr Phe Ala Asn Leu Ala Ser Leu Gln Arg Leu Asn Leu Gln Gly 385 390 395 400 Asn Arg Val Ser Pro Cys Gly Gly Pro Asp Glu Pro Gly Pro Ser Gly 405 410 415 Cys Val Ala Phe Ser Gly Ile Thr Ser Leu Arg Ser Leu Ser Leu Val 420 425 430 Asp Asn Glu Ile Glu Leu Leu Arg Ala Gly Ala Phe Leu His Thr Pro 435 440 445 Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Ser Asn Pro Gly Leu Glu Val Ala Thr 450 455 460 Gly Ala Leu Gly Gly Leu Glu Ala Ser Leu Glu Val Leu Ala Leu Gln 465 470 475 480 Gly Asn Gly Leu Met Val Leu Gln Val Asp Leu Pro Cys Phe Ile Cys 485 490 495 Leu Lys Arg Leu Asn Leu Ala Glu Asn Arg Leu Ser His Leu Pro Ala 500 505 510 Trp Thr Gln Ala Val Ser Leu Glu Val Leu Asp Leu Arg Asn Asn Ser 515 520 525 Phe Ser Leu Leu Pro Gly Ser Ala Met Gly Gly Leu Glu Thr Ser Leu 530 535 540 Arg Arg Leu Tyr Leu Gln Gly Asn Pro Leu Ser Cys Cys Gly Asn Gly 545 550 555 560 Trp Leu Ala Ala Gln Leu His Gln Gly 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Val 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ile Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Ala Tyr Thr Val Ser Ser Thr Trp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ala Asp Asp Ser Thr Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 17 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Val Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 18 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ile Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Glu Trp Glu Pro Ala Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 19 <211> 216 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ile Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Met Tyr Tyr Cys Ser Ala Tyr Thr Val Ser 85 90 95 Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215

Claims

인간 proTGFβ1과 우세한 인간 당단백질 A 반복체(human glycoprotein A repetitions predominant)와의 복합체(proTGFβ1-GARP 복합체)가 용액 상태로 있는 동안에 상기 복합체의 인간 proTGFβ1에 특이적으로 결합하며, 실시예 4 및 실시예 6에 나타낸 조건 하에서 옥텟레드(OctetRed) 384에 의해 측정된 것으로서, 실시예 4에 기재된 실험 설계를 사용하여 하기 작용인자, 즉, TGFβ1 성장 인자 도메인, TGFβ2 성장 인자 도메인, TGFβ3 성장 인자 도메인, LTBP1과 공유결합된 proTGFβ1, LTBP3과 공유결합된 proTGFβ1, LRRC33과 공유결합된 proTGFβ1 및 인간 GARP와 결합되지 않은 proTGFβ1 중 어느 하나에 대해 바이오층 간섭법(biolayer interferometry) 분석에 따른 검출가능한 결합을 갖지 않고, 추가로 실시예 5에 나타낸 조건 하에서 세포 결합 proTGFβ1-GARP 복합체로부터의 TGFβ1 성장 인자 방출의 억제를 위한 10 nM 이하의 억제 농도(IC₅₀)를 갖는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 시험관내에서의 Treg 기능을 억제하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 또는 제2항에 있어서, TGFβ1의 활성화를 억제하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 GARP 와의 복합체 형성의 결과로서 변형된 인간 proTGFβ1의 에피토프에 결합하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 존재 하에 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 실시예 4에 기재된 실험 설계를 사용하여 바이오층 간섭법 분석에 의해 측정된 것으로서, 적어도 880 pM의 결합 친화도로 인간 proTGFβ1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 실시예 7에 나타낸 조건 하에서 인간 proTGFβ1과 우세한 인간 당단백질 A 반복체와의 복합체(proTGFβ1-GARP 복합체)의 인간 proTGFβ1에 대한 1 nM 이하의 해리 상수(Kd)로 인간 proTGFβ1에 결합하며, 상기 proTGFβ1-GARP 복합체가 용액 상태로 있는, 항체 또는 항원 결합 단편.
a. 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3; 또는
b. 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 및 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 갖는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
서열 번호 16 및 18의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제9항에 있어서, 서열 번호 17 및 19의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함하는 항체.
제10항에 있어서,
a. 중쇄 서열은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열과 쌍을 이루는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나;
b. 중쇄 서열은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 서열과 쌍을 이루는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, Fab 단편, Fab2 단편 또는 단일쇄 항체인 항원 결합 단편.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합체인, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 동종형(isotype)을 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgG4 동종형인, 항체 또는 항원 결합 단편.
a. 서열 번호 4의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 CDR1 서열, 서열 번호 5의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 CDR2 서열 및 서열 번호 6의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 CDR3 서열, 서열 번호 7의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 CDR1 서열, 서열 번호 8의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 CDR2 서열 및 서열 번호 9의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 CDR3 서열; 또는
b. 서열 번호 10의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 CDR1 서열, 서열 번호 11의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 CDR2 서열 및 서열 번호 12의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 CDR3 서열, 서열 번호 13의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 CDR1 서열, 서열 번호 14의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 CDR2 서열 및 서열 번호 15의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
a. 서열 번호 17의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 서열과 쌍을 이루는 서열 번호 16의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 서열; 또는
b. 서열 번호 19의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 서열과 쌍을 이루는 서열 번호 18의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
서열 번호 16의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 118 및 서열 번호 18의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 121로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
제18항에 있어서, 서열 번호 17의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 107 및 서열 번호 19의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 110으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
제19항에 있어서,
a. 서열 번호 17의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 107을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열과 쌍을 이루는 서열 번호 16의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 118을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 또는
b. 서열 번호 19의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 110을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열과 쌍을 이루는 서열 번호 18의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 121을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제21항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제22항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제23항에 정의된 숙주 세포를 항체 또는 항원 결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계 및 항체 또는 항원 결합 분자를 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편의 제조 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 위한 패키징을 포함하는 키트.