TW201625301A - 藉由ｆｏｌｒ１標靶藥及葉酸代謝拮抗劑用於癌症患者之治療方法與醫藥 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種利用人類FOLR1標靶藥之癌症之治療方法、包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥、及增強人類FOLR1標靶藥之治療效果之方法，上述利用人類FOLR1標靶藥之癌症之治療方法係使用葉酸代謝拮抗劑而使葉酸受體α(folate receptor α，以下簡寫為FOLR1)之表現增加，藉此利用人類FOLR1標靶藥治療癌症；上述包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥係用以使用葉酸代謝拮抗劑而令FOLR1之表現增加；上述增強人類FOLR1標靶藥之治療效果之方法係使用葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞之FOLR1之表現增加，藉此增強人類FOLR1標靶藥之治療效果。例如，本發明提供一種針對FOLR1之表現量較低且未充分發揮人類FOLR1標靶藥之抗腫瘤活性之癌症患者、或者欲進一步增強表現FOLR1之癌症的治療之癌症患者，藉由併用葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥而更有效之治療方法。

Description

藉由FOLR1標靶藥及葉酸代謝拮抗劑用於癌症患者之治療方法與醫藥
本發明係關於一種使用結合於FOLR1而具有抗腫瘤活性之人類FOLR1標靶藥之癌症之治療方法，其特徵在於：藉由葉酸代謝拮抗劑而使葉酸受體α(以下，記載為FOLR1)之表現增加。又，本發明係關於一種使人類FOLR1標靶藥之治療效果增強之方法，其特徵在於：將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予，藉此使FOLR1之表現增加。進而，本發明係關於一種包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥，其特徵在於：藉由葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1之表現增加，及關於一種包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥，其用以藉由將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予而使FOLR1之表現增加。
FOLR1係對葉酸具有高親和性之GPI錨定型之膜蛋白質，其對細胞之增生或生存具有重要之功能(非專利文獻1)。於正常組織中，FOLR1係於腎臟、肺、腸等中局部表現(非專利文獻2)。又，其表現部位係管腔側。
另一方面，癌組織中之FOLR1表現並不侷限於管腔側，亦於卵巢癌(非專利文獻2、非專利文獻3、非專利文獻4)、腎癌(非專利文獻2)、肺癌(非專利文獻2、非專利文獻3)、乳癌(非專利文獻2)、間皮瘤(非專利文獻4)等多種癌症中高度表現。尤其是於卵巢癌中，報告有FOLR1表現量影響惡性度、進展、預後之情況(非專利文獻5、非專利 文獻6)。進而，亦已知卵巢癌患者之血清中所包含之可溶型FOLR1較健康人顯著增加(非專利文獻7)。
作為人類FOLR1標靶藥，例如可列舉：使LK26(專利文獻1、專利文獻2)人源化而成之抗體、抗人類FOLR1抗體MORAb-003(farletuzumab)、葉酸-毒素複合EC-145等。該等係於非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer；NSCLC)、卵巢癌等中推進開發。另一方面，愛甯達(pemetrexed)係用作間皮瘤、NSCLC之治療藥。又，以卵巢癌為適應症而推進開發。
人類FOLR1標靶藥中，關於抗人類FOLR1抗體MORAb-003報告有如下情況，即於鉑敏感性復發卵巢癌中對一部分患者顯現藥效(非專利文獻8)，但於鉑耐性卵巢癌或NSCLC中未顯現顯著藥效，因此治療之臨床試驗被中止(非專利文獻9、非專利文獻10)。關於葉酸-毒素複合EC-145報告有如下情況，即於限定於FOLR1之表現量充分高且葉酸吸收活性明顯之患者之情形時，藉由於卵巢癌中與Doxil(R)(脂質體化多柔比星)併用，於NSCLC中與歐洲紫杉醇併用而分別顯現效果(非專利文獻11、非專利文獻12)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：歐州專利申請公開第0197435號說明書
專利文獻2：美國專利第5952484號說明書
[非專利文獻]
非專利文獻1：Int J Cancer, 2006. 119 (2)：p. 243 - 50.
非專利文獻2：Anal Biochem, 2005. 338 (2)：p. 284 - 93.
非專利文獻3：J Thorac Oncol, 2012. 7 (5)：p. 833 - 840.
非專利文獻4：J Thorac Cardiovasc Surg, 2001. 121 (2)：p. 225 - 33.
非專利文獻5：Int J Cancer, 1997. 74 (2)：p. 193 - 8.
非專利文獻6：Int J Cancer, 1998. 79 (2)：p. 121 - 6.
非專利文獻7：PLoS One, 2009.4 (7)：p. e6292.
非專利文獻8：News Release, No.13 - 05, Jan 11, 2013, Eisai Co., Ltd. (http：//www.eisai.com/news/news201305.html)
非專利文獻9：News Release, December 2, 2011, Morphotek Inc. (http：//www.morphotek.com/news-events/News-Archive/2011-News/Morphotek-Terminates-Farletuzumab-Study-(FAR-122)-.aspx)
非專利文獻10：Maltzman, J. D. et al. 15th World Conf Lung Cancer (Oct 27 - 30, Sydney) 2013, Abst P1. 11 - 019
非專利文獻11：J Clin Oncol 31：4400 - 4406 (2013)
非專利文獻12：PRESS RELEASES, Mar 21, 2014, Endocyte, Inc. (http：//investor.endocyte.com/releasedetail.cfm？ReleaseID=834444)
對實體癌之治療法與預後之改善日新月異。然而關於卵巢癌，不能說1980年代利用鉑製劑之治療法出現以後，預後得到明顯改善[Nat Rev Cancer,2011.11(10)：p.719-25.]，卵巢癌依然為婦科癌症之死亡之主要原因。可認為其原因在於：卵巢癌產生對鉑製劑之耐性而復發，結果治療變困難。即，卵巢癌治療之課題在於：延長自鉑製劑等化學療法之奏效直至復發之時間；抑制卵巢癌之對鉑製劑之耐性化；及確立針對已對鉑製劑耐性化之卵巢癌之治療法。
嘗試使用人類FOLR1標靶藥作為卵巢癌之治療藥，但可認為為了發揮作為抗腫瘤藥之人類FOLR1標靶藥之藥效，重要的是於癌細胞充分表現FOLR1。即，要求有使癌細胞中之FOLR1之表現增加，而使人類FOLR1標靶藥之抗腫瘤效果更為提高之方法。
本發明提供一種使人類FOLR1標靶藥之抗腫瘤效果提高之方法，其係利用葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞中之FOLR1之表現增加，藉此使人類FOLR1標靶藥之抗腫瘤效果提高。例如，對於FOLR1之表現量較低且未充分發揮人類FOLR1標靶藥之抗腫瘤活性之癌症而言，將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予而使FOLR1之表現增加，而可帶來人類FOLR1標靶藥之更高之治療效果。
本發明係關於(1)~(18)。
(1)一種使用人類FOLR1標靶藥而治療癌症之方法，其使用葉酸代謝拮抗劑而使葉酸受體α(folate receptor α，以下簡寫為FOLR1)之表現增加。
(2)如(1)記載之方法，其將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予。
(3)如(1)或(2)記載之方法，其中癌症為表現FOLR1之癌症。
(4)如(1)至(3)中任一項記載之方法，其中人類FOLR1標靶藥為選自FOLR1抑制劑、抗人類FOLR1抗體及抗人類FOLR1抗體片段中之任一種。
(5)如(4)記載之方法，其中FOLR1抑制劑為葉酸衍生物。
(6)如(4)記載之方法，其中抗人類FOLR1抗體及抗體片段為結合於序列編號1所記載之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列所包含之抗原決定位的抗體及該抗體片段。
(7)一種使人類FOLR1標靶藥之治療效果增強之方法，其使用葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞中之FOLR1之表現增加，而增強人類FOLR1標靶藥之治療效果。
(8)如(7)記載之方法，其將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予。
(9)如(7)或(8)記載之方法，其中癌症為表現FOLR1之癌症。
(10)如(7)至(9)中任一項記載之方法，其中人類FOLR1標靶藥為 選自FOLR1抑制劑、抗人類FOLR1抗體及抗人類FOLR1抗體片段中之任一種。
(11)如(10)記載之方法，其中FOLR1抑制劑為葉酸衍生物。
(12)如(10)記載之方法，其中抗人類FOLR1抗體及抗體片段為結合於序列編號1所記載之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列所包含之抗原決定位的抗體及該抗體片段。
(13)一種包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥，其用以投予葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞中之FOLR1之表現增加。
(14)如(13)記載之醫藥，其將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予。
(15)如(13)或(14)記載之醫藥，其中癌症為表現FOLR1之癌症。
(16)如(13)至(15)中任一項記載之醫藥，其中人類FOLR1標靶藥為選自FOLR1抑制劑、抗人類FOLR1抗體及抗人類FOLR1抗體片段中之任一種。
(17)如(16)記載之醫藥，其中FOLR1抑制劑為葉酸衍生物。
(18)如(16)記載之醫藥，其中抗人類FOLR1抗體及抗體片段為結合於序列編號1所記載之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列所包含之抗原決定位的抗體及該抗體片段。
圖1(A)~圖1(D)係表示NSCLC細胞株[NCI-H1437[圖1(A)]、NCI-H2228[圖1(B)]、NCI-H522[圖1(C)]、及NCI-H838[図1(D)]]中之愛甯達添加培養後之FOLR1表現量。縱軸係表示將於低葉酸培養基(0nmol/L愛甯達)中進行培養之條件設為100時之FOLR1表現量相對值。橫軸係表示低葉酸培養基之愛甯達濃度(10、1000nmol/L)。
圖2(A)~圖2(D)係表示卵巢癌細胞株[IGR-OV1[圖2(A)]、SKOV-3[圖2(B)]、OVCAR-3[圖2(C)]、及MCAS[圖2(D)]]中之愛甯達添加培養後之FOLR1表現量。縱軸係表示將於潛伏期培養基(NC)中進行培養 之條件設為100時之FOLR1表現量相對值。橫軸係表示培養條件，且表示潛伏期培養基(NC)、或低葉酸培養基之愛甯達濃度(0、10、1000nmol/L)。
圖3(A)及圖3(B)係分別表示使用源自健康人供體1[圖3(A)]及供體2[圖3(B)]之PBMC之對MCAS之ADCC活性。黑圈、白圈、黑三角、及白三角係分別表示對於20nmol/L愛甯達存在下所培養之MCAS之HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性、對於愛甯達不存在下所培養之MCAS之HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性、對於20nmol/L愛甯達存在下所培養之MCAS之MORAb-003抗體之ADCC活性、及對於愛甯達不存在下所培養之MCAS之MORAb-003抗體之ADCC活性。縱軸係表示ADCC活性(%)，橫軸係表示抗體濃度(ng/mL)。星號(＊)係表示相對於白圈之黑圈於各抗體濃度中為顯著之值，又，2個星號(＊＊)係表示相對於白三角之黑三角於各抗體濃度中為顯著之值(P<0.05)。顯著差異檢定係使用1-way ANOVA-Dunnett test。
圖4(A)~圖4(D)係表示針對SCID小鼠卵巢癌細胞株MCAS皮下移植模型之愛甯達與抗人類FOLR1抗體之併用試驗結果。圖4(A)~圖4(D)之縱軸係分別表示腫瘤體積(mm3)、V/V0、T/C、體重(g)。圖4(A)~圖4(D)之橫軸係表示自試驗開始日之經過天數。白圈、黑圈、白三角、黑菱形、及白四邊形係分別表示溶劑投予群、HuRA15-7CTAcc抗體單獨投予群、愛甯達單獨投予群、同時併用群、及sequential併用群。
圖5(A)~圖5(C)係表示子宮體癌細胞株[MES-SA[圖5(A)]、HEC-1-A[圖5(B)]、及HEC-1-B[圖5(C)]]中之愛甯達添加培養後之FOLR1表現量。縱軸係表示將於潛伏期培養基(NC)中進行培養之條件設為100時之FOLR1表現量相對值。橫軸係表示培養條件，且表示潛伏期培養基(NC)、或低葉酸培養基之愛甯達濃度(0、10、1000nmol/L)。
圖6(A)及圖6(B)係表示使用源自健康人供體之PBMC之對NSCLC細胞株NCI-H2228之HuRA15-7CTAcc抗體[圖6(A)]及MORAb-003[圖6(B)]抗體之ADCC活性。白三角‧虛線、白圈‧實線、及黑圈‧實線係分別表示對於0、20、及1000nmol/L愛甯達存在下所培養之NCI-H2228之ADCC活性。縱軸係表示ADCC活性(%)，橫軸係表示抗體濃度(ng/mL)。星號(＊)係表示相對於白三角‧虛線之黑圈‧實線於各抗體濃度中為顯著之值(P<0.05)。顯著差異檢定係使用1-way ANOVA-Dunnett test。
作為本發明之治療方法，可列舉：使用葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1之表現增加之使用人類FOLR1標靶藥之癌症之治療方法；特徵在於將葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥同時或逐次投予，藉此使FOLR1之表現增加之癌症的治療方法等。
作為使本發明之治療效果增強之方法，可列舉：使用葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞中之FOLR1之表現增加，藉此使人類FOLR1標靶藥之治療效果增強之方法；特徵在於將葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥同時或逐次投予，藉此使癌細胞中之FOLR1之表現增加的使人類FOLR1標靶藥之治療效果增強之方法等。
又，作為本發明之醫藥，可列舉：用以使用葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1之表現增加之包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥；用以藉由將葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥同時或逐次投予而使FOLR1之表現增加之包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥等。
於本發明中，暴露於葉酸代謝拮抗劑中之癌細胞因葉酸代謝功能降低，故而葉酸需求性增加。同樣地，處於葉酸之濃度降低，或缺乏之環境中之癌細胞為了維持細胞內葉酸濃度而葉酸需求性增加。因此，於暴露於葉酸代謝拮抗劑、或低濃度葉酸或葉酸缺乏環境中之癌 細胞中，藉由欲增加葉酸吸收性之代償性反應，而引導FOLR1之mRNA轉錄、及伴隨著蛋白質轉譯量增加之FOLR1表現之增加、或者由細胞內動態變化引起之細胞膜上之FOLR1表現量之增加。其結果為，人類FOLR1標靶藥結合於癌細胞膜上表現增加之FOLR1，而可發揮高於葉酸代謝拮抗劑之曝露前之治療效果。
葉酸受體(FR)係glycophosphatidyl inositol(GPI，糖基磷脂醯肌醇)錨定型之膜結合型糖蛋白質，形成有包含FOLR1、FOLR2、FOLR3及FOLR4(亦稱為FRα、FRβ、FRγ及FRδ)之家族，且參與氧化型葉酸之細胞內吸收。已知較同樣地作為葉酸受體之參與還原型葉酸之吸收的reduced folate carrier(RFC，還原葉酸載體)高之親和性結合於葉酸。
作為本發明中之人類FOLR1，可列舉：包含序列編號1或GenBank寄存編號NP_057937.1所示之胺基酸序列，且具有人類FOLR1之功能之多肽；包含於序列編號1或GenBank寄存編號NP_057937.1所示之胺基酸序列中缺失、取代或添加有1個以上之胺基酸之胺基酸序列，且具有人類FOLR1之功能之多肽；及具有與序列編號1或GenBank寄存編號NP_057937.1所示之胺基酸序列具有60%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上之相同性之胺基酸序列之多肽；包含具有最佳為95%以上之相同性之胺基酸序列，且具有人類FOLR1之功能之多肽；含有包含序列編號1或GenBank寄存編號NP_057937.1所示之胺基酸序列之部分序列之胺基酸序列，且具有人類FOLR1之功能之多肽等。
作為編碼人類FOLR1之基因，可列舉：序列編號12或GenBank寄存編號NM_016725所示之鹼基序列。於本發明之編碼人類FOLR1之基因中亦包含：包含編碼包含於序列編號12或GenBank寄存編號NM_016725所示之鹼基序列中缺失、取代或添加有1個以上之鹼基之 鹼基序列，且具有人類FOLR1之功能之多肽之DNA的基因；包含編碼包含與序列編號12或GenBank寄存編號NM_016725所示之鹼基序列具有至少60%以上之相同性之鹼基序列、較佳為具有80%以上之相同性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之相同性之鹼基序列，且具有人類FOLR1之功能之多肽之DNA的基因；以及包含編碼包含與具有序列編號12或GenBank寄存編號NM_016725所示之鹼基序列之DNA於嚴格條件下進行雜交之DNA，且具有人類FOLR1之功能之多肽之DNA的基因等。
本發明中，作為人類FOLR1之功能，可列舉如下功能，即藉由與配位子(例如，葉酸)之結合，而引起內噬作用而於細胞內吸收葉酸。
本發明中，所謂FOLR1之表現增加，意指如下情況：於FOLR1之表現量較低或實質上未表現之癌細胞中，藉由暴露於葉酸代謝拮抗劑中而FOLR1之表現量增加之情況；於原本表現FOLR1之癌細胞中，藉由暴露於葉酸代謝拮抗劑中而FOLR1之表現量進一步增加之情況；及於上述FOLR1表現細胞中，藉由暴露於葉酸代謝拮抗劑中而FOLR1之表現量增加，而促進葉酸傳輸功能之情況等。
上述FOLR1之表現之增加係由如下情形引起，即編碼FOLR1蛋白質之基因之表現增加之情形；藉由FOLR1蛋白質之表現增加而FOLR1蛋白質於細胞膜上之表現增加之情形；及藉由伴隨著添加、缺失、取代等之高功能性FOLR1蛋白質之表現增加而促進FOLR1功能之情形。
本發明中，FOLR1之表現、及表現之增加例如可藉由如下方式進行確認：使標記化之葉酸、或抗FOLR1抗體與自病變組織、或癌組織分離、摘取之細胞進行反應，並利用流式細胞儀(FCM)等進行測定。
又，可藉由免疫組織染色法(IHC)等而確認組織中之FOLR1之表現、及表現之增加。又，將放射性同位素複合而成之葉酸等向患者體內進行投予，確認葉酸向組織之滲入，藉此可確認組織中之FOLR1之 表現、表現之增加、及FOLR1功能之促進。
本發明中所使用之葉酸代謝拮抗劑係經由reduced folate carrier(RFC)、葉酸受體家族(FOLR1、FOLR2、FOLR3、及FOLR4)、及proton-coupled folate transporter(PCFT，質子偶聯葉酸轉運體)等而被吸收於細胞內。
於細胞內，藉由抑制dihydrofolate reductase(DHFR，二氫葉酸還原酶)、thymidylate synthase(TS，胸苷酸合成酶)、及glycineamide ribonucleotide transformylase(GARTF，甘氨醯胺核苷酸甲醯轉移酶)等而阻礙細胞之葉酸代謝系統，而發揮細胞增生抑制活性、細胞毒殺活性、細胞凋亡促進活性及/或抗腫瘤活性(Cancer Metastasis Rev (2007)26：153-181)。因此，作為本發明之治療方法及醫藥所使用之葉酸代謝拮抗劑，只要為作用於上述葉酸代謝機制者，則可為任一種藥劑，並無限定。
作為本發明中所使用之葉酸代謝拮抗劑，具體而言，例如可列舉：作為CAS No.357166-29-1所示之化合物之愛甯達(Pemetrexed)[Drug Metab Dispos.1997 Jun；25(6)：693-700.]、甲胺喋呤(Methotrexate)、雷替曲塞(Raltirexed)、依達曲沙(Edatorexate)、曲美沙特(Trimetrexate)、普拉曲沙(Pralatrexate)、胺喋呤(Aminopterin)、洛美曲索(Lometrexol)、諾拉曲塞(Nolatrexed)及PT523等。
作為本發明中所使用之人類FOLR1標靶藥，只要為結合於人類FOLR1，且具有細胞增生抑制活性、細胞毒殺活性、細胞凋亡促進活性及/或抗腫瘤活性等之藥劑即可，亦可為低分子、高分子中之任一種。
本發明中所謂人類FOLR1標靶藥結合於人類FOLR1，意指人類FOLR1標靶藥識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構並進行結 合。即，人類FOLR1標靶藥係藉由識別於癌細胞之細胞膜上表現之具有天然之立體結構的人類FOLR1並進行結合而發揮作用。
作為低分子之人類FOLR1標靶藥，可列舉：FOLR1抑制劑。作為FOLR1抑制劑，只要為葉酸、具有FOLR1結合活性之葉酸衍生物、葉酸-毒素複合體、葉酸-放射性同位素複合體等具有FOLR1結合活性且具有細胞增生抑制活性、細胞毒殺活性、細胞凋亡促進活性及/或抗腫瘤活性者，則可為任一種。
例如可列舉：vintafolide(EC-145)、99mTc(CO)3-folate、99mTc-EC20(etarfolatide)、111In-DTPA-folate、111In/177Lu-DOTA-click-folate、67Ga-DOTA-Bz-folate(67Ga-EC0800)及67Ga-NODAGA-folate等。
EC-145係使微管蛋白聚合抑制劑(desacetylvinblastine monohydrazide)結合於葉酸而成之化合物[Curr Opin Investig Drugs.2010 Dec；11(12)：1424-33.]，且結合於人類FOLR1而具有細胞增生抑制活性及抗腫瘤活性。
所謂細胞增生抑制活性，係指抑制FOLR1陽性細胞之細胞增生之活性，且由如下各種機制引起，即藉由葉酸、葉酸衍生物、及葉酸複合體特異性地結合於FOLR1而直接抑制細胞增生；誘導細胞凋亡促進活性；及由複合而成之毒素或放射性同位素等引起之細胞毒殺活性等。
所謂抗腫瘤活性，係指抑制FOLR1陽性腫瘤細胞之增生之活性，且由上述所記載之機制引起。
所謂細胞凋亡促進活性，係指如下情況，即葉酸、葉酸衍生物、及葉酸複合物結合於FOLR1陽性細胞，藉此卡斯蛋白酶(caspase)活性增加，結果引起漸進式細胞死亡(programmed cell death)。
作為高分子之人類FOLR1標靶藥，例如可列舉：抗人類FOLR1抗 體及抗人類FOLR1抗體片段。
作為本發明之治療方法及醫藥所使用之抗人類FOLR1抗體，只要為識別人類FOLR1之胺基酸序列或包含胺基酸序列之立體結構且進行結合之抗體，則亦可為多株抗體、寡株(oligoclonal)抗體、單株抗體中之任一種，但較佳為單株抗體。
所謂單株抗體，係單株之抗體產生細胞所分泌之抗體，其特徵在於：識別僅1個之抗原決定位(亦稱為抗原決定基)，且構成單株抗體之胺基酸序列(1次結構)均勻。寡株抗體係含有複數個單株抗體之抗體組合物，且係包含數個~10個左右之單株抗體之抗體。多株抗體係由複數個單株抗體所構成之抗體組合物，且係結合於抗原上之複數個抗原決定位之抗體之混合物。
本發明中所謂抗原決定位，可列舉：單株抗體所識別並進行結合之單一之胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有糖鏈之胺基酸序列及包含結合有糖鏈之胺基酸序列之立體結構等。因此，只要為於癌細胞之細胞膜上表現之人類FOLR1分子上所存在之抗原決定位，則可為任一種抗原決定位，較佳為可列舉：序列編號1所表示之人類FOLR1之胺基酸序列(NCBI Reference Sequence：NP_057937.1)中第55號~第62號之胺基酸序列。
作為本發明中抗人類FOLR1抗體所結合之抗原決定位，更佳為可列舉：包含選自序列編號1所表示之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列中之至少1個胺基酸殘基之抗原決定位，更佳為可列舉：包含選自人類FOLR1之胺基酸序列中序列編號1所表示之胺基酸序列中的第55號~第62號之胺基酸序列中之至少連續2個以上之胺基酸殘基的抗原決定位。
作為本發明中之人類FOLR1之立體結構，只要具有與包含序列編號1所表示之胺基酸序列之第1號至第257號之胺基酸序列的人類 FOLR1於天然狀態可取之結構同等之結構，則亦可為任一種結構。所謂人類FOLR1於天然狀態下可取之立體結構，係指於細胞膜上表現之人類FOLR1所具有之天然型立體結構。
作為本發明中所使用之單株抗體，可列舉：自融合瘤產生之抗體、或自由包含抗體基因之表現載體所轉形而成之轉形體產生之基因重組抗體。
關於融合瘤，例如，製備人類FOLR1蛋白質、人類FOLR1蛋白質片段、人類FOLR1之寡肽、或表現有人類FOLR1之細胞等作為抗原，自已使該抗原免疫之動物誘導具有抗原特異性之抗體生產細胞，進而使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞進行融合，藉此可進行製備。對該融合瘤進行培養，或者將該融合瘤細胞向動物進行投予而使該動物腹水癌化，將該培養液或腹水進行分離、精製，藉此可取得抗FOLR1單株抗體。
作為本發明中所使用之基因重組抗體，包含人類型嵌合抗體、人類型CDR移植抗體(亦稱為人源化抗體)、人類抗體或該等之抗體片段等藉由基因重組而製造之抗體。於基因重組抗體中，具有單株抗體之特徵，且抗原性較低，血漿半衰期得到延長者係作為治療藥較佳。關於基因重組抗體，例如可列舉：使用基因重組技術而改變了自上述融合瘤產生之單株抗體者。
人類型嵌合抗體係指包含人類以外之動物之抗體之VH及VL、與人類抗體之重鏈(以下，簡寫為H鏈)恆定區(以下，記載為CH)及輕鏈(以下，簡寫為L鏈)恆定區(以下，記載為CL)之抗體。關於本發明之人類型嵌合抗體，係自產生特異性地識別人類FOLR1之胺基酸序列、或其立體結構且進行結合之單株抗體之融合瘤取得編碼VH及VL之cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因之動物細胞用表現載體而構建人類型嵌合抗體表現載體，並向動物細胞導入，藉此 可進行表現而進行製造。
作為人類型嵌合抗體之CH，只要屬於人類免疫球蛋白(以下，記載為hIg)，則可為任意者，較佳為使用hIgG類者，進而可使用屬於hIgG類之hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4等亞型中之任一者。又，作為人類型嵌合抗體之CL，只要屬於hIg，則可為任意者，可使用κ類或λ類者。
作為本發明中所使用之人類型嵌合抗體，具體而言，可列舉：包含含有序列編號10所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且包含含有序列編號11所表示之胺基酸序列之抗體之VL的嵌合抗體。
進而，作為本發明中所使用之嵌合抗體，可列舉：與上述單株抗體競爭，且特異性地識別人類FOLR1之胺基酸序列、或其立體結構且進行結合之嵌合抗體；結合於與存在於上述單株抗體所結合之人類FOLR1之抗原決定位相同之抗原決定位之嵌合抗體。
作為本發明中所使用之人類型互補性決定區域(complementarity determining region，以下簡寫為CDR)移植抗體(亦稱為人源化抗體)，係指將人類以外之動物之抗體之VH及VL的CDR之胺基酸序列移植至人類抗體之VH及VL之適當位置而成之抗體。
關於本發明中所使用之人類型CDR移植抗體，係構建編碼將特異性地識別人類FOLR1之胺基酸序列、或其立體結構且進行結合之人類以外之動物的單株抗體之VH及VL之CDR之胺基酸序列移植至任意的人類抗體之VH及VL之構架區(以下，記載為FR)之V區域的cDNA，分別插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之基因之動物細胞用表現載體而構建人類型CDR移植抗體表現載體，向動物細胞進行導入，藉此可進行表現而進行製造。
作為人類型CDR移植抗體之CH，只要屬於hIg，則可為任意者，較佳為使用hIgG類者，進而可使用屬於hIgG類之hIgG1、hIgG2、 hIgG3或hIgG4等亞型中之任一者。又，作為人類型CDR移植抗體之CL，只要屬於hIg，則可為任意者，可使用κ類或λ類者。
人類抗體原本指天然存在於人體內之抗體，但亦包含自藉由最近之基因工程、細胞工程、發育工程之技術進步而製作之人類抗體噬菌體基因庫及人類抗體產生基因轉殖動物獲得之抗體等。
作為本發明中所使用之人類型CDR移植抗體或人類抗體，具體而言，可列舉：包含CDR1~3分別包含序列編號2~4所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且包含CDR1~3分別包含序列編號5~7所表示之胺基酸序列之抗體之VL的人源化抗體；以及包含CDR1~3分別包含序列編號2~4所表示之胺基酸序列之抗體之H鏈，並且包含CDR1~3分別包含序列編號5~7所表示之胺基酸序列之抗體之L鏈，且序列編號4(抗體H鏈之CDR3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸被取代為蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、或麩胺酸之人源化抗體；及包含CDR1~3分別包含序列編號2、3、13所表示之胺基酸序列之抗體之VH，且包含CDR1~3分別包含序列編號5、6、7所表示之胺基酸序列之抗體之VL的人源化抗體。
又，作為本發明中所使用之人源化抗體，更具體而言，可列舉：抗體之VH包含序列編號8及/或抗體之VL包含序列編號9所表示之胺基酸序列之人源化抗體(HuRA15-7CTAcc抗體)。
於本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體中，亦包含：與上述之單株抗體、基因重組抗體等中之任一種抗體競爭，且特異性地識別人類FOLR1之胺基酸序列、或其立體結構並進行結合之抗體及該抗體片段；結合於與存在於上述單株抗體所結合之人類FOLR1之抗原決定位相同之抗原決定位之單株抗體及該抗體片段等。
所謂本發明中所使用之「與單株抗體競爭之抗體」，係指於人類FOLR1具有與本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體相同或部分相同之 抗原決定位(亦指抗原決定基)，且結合於該抗原決定位之抗體。所謂本發明中所使用之「結合於與抗人類FOLR1抗體所結合之抗原決定位相同之抗原決定位之抗體」，係指識別與本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體所識別之人類FOLR1之胺基酸序列相同之序列並進行結合的抗體。
作為本發明中所使用之抗體片段，可列舉：Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚物化V區域(diabody)、雙硫穩定化V區域(dsFv)、包含單株抗體之H鏈之CDR1-3及L鏈之CDR1-3之肽、以及包含CDR之肽等。
又，作為本發明中所使用之抗體片段，只要為包含抗體片段之雙特異性抗體、三特異性抗體、四特異性抗體、Fc融合肽、包含Fc融合L鏈與H鏈之一價抗體等具有FOLR1結合活性之抗體片段，則可包含任意者。
即，作為本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體，可列舉：以下之(i)~(viii)之抗FOLR1抗體及該抗體片段。
(i)結合於序列編號1所表示之胺基酸序列之第55號至第62號之胺基酸序列所包含的抗原決定位之抗體
(ii)結合於序列編號1所表示之胺基酸序列之第55號至第62號之胺基酸序列所包含的至少連續2個以上之胺基酸殘基之抗體
(iii)結合於包含序列編號1所表示之胺基酸序列之第55號至第62號之胺基酸序列之抗原決定位之抗體
(iv)包含CDR1~3分別包含序列編號2、3、4所表示之胺基酸序列之抗體之H鏈，且包含CDR1~3分別包含序列編號5、6、7所表示之胺基酸序列之抗體之L鏈的抗體
(v)包含CDR1~3分別包含序列編號2、3、4所表示之胺基酸序列之抗體之H鏈，且包含CDR1~3分別包含序列編號5、6、7所表示之 胺基酸序列之抗體之L鏈的抗體，且序列編號4(抗體H鏈之CDR3)所表示之胺基酸序列中之半胱胺酸被取代為蘇胺酸、甲硫胺酸、異白胺酸、纈胺酸、苯丙胺酸、或麩胺酸之抗體
(vi)包含CDR1~3分別包含序列編號2、3、13所表示之胺基酸序列之抗體之H鏈，且包含CDR1~3分別包含序列編號5、6、7所表示之胺基酸序列之抗體之L鏈的抗體
(vii)與(i)~(vi)之抗體或該抗體片段競爭並結合於人類FOLR1之抗體
(viii)結合於與(i)~(vii)之抗體或該抗體片段所識別之抗原決定位相同之抗原決定位之抗體
除上述以外，作為本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體，可列舉：farletuzumab(MORAb-003)等。MORAb-003係抗人類FOLR1人源化IgG1抗體，且主要藉由抗體依賴性細胞毒殺活性(以下，簡寫為ADCC活性)及補體依賴性細胞毒殺活性(以下，簡寫為CDC活性)而具有對FOLR1陽性癌症之抗腫瘤活性(Cancer Immun.2007 Mar 9；7：6.)。
於本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體中，亦包含於構成上述之抗體或抗體片段之胺基酸序列中缺失、添加、取代或插入有1個以上之胺基酸，且具有與上述之抗體或該抗體片段相同之活性之抗體或該抗體片段。
進而，作為本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體，亦可使用使64Cu、67Ga、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu及211At等放射性同位素、抗癌劑、毒素等低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質、或抗體醫藥等藉由化學或基因工程結合於特異性地識別人類FOLR1之胺基酸序列或其立體結構且進行結合之單株抗體或該抗體片段而成的抗人類FOLR1抗體之衍生物。
本發明中，人類FOLR1標靶藥識別人類FOLR1之胺基酸序列、或其立體結構並進行結合之情況可藉由如下方法進行確認，即使用使人類FOLR1固相化而成者之酵素免疫測定法(ELISA)、西方點墨法、免疫組織染色(IHC)法、針對表現人類FOLR1之細胞之公知之免疫學檢測法、螢光細胞染色法等對特定之抗原與對特定抗原之低分子化合物或抗體等高分子化合物之結合性進行調查之方法。具體而言，可列舉：使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之螢光抗體染色法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]、使用流式細胞儀之螢光細胞染色法、使用Biacore系統(GE healthcare公司製造)等之表面電漿子共振(SPR)、使用ITC(DKSH公司製造)等之等溫滴定量熱法(Isothermal Titration Calorimetry)等方法。
例如，關於抗人類FOLR1抗體結合於人類FOLR1之胺基酸序列、或其立體結構之情況，可藉由使用Biacore系統(GE healthcare公司製造)等之表面電漿子共振而進行確認。具體而言，利用胺偶合法而將抗IgG抗體固定於感測片CM5後，使該抗體或該抗體片段通過，使適當量結合，進而使已知濃度之複數種濃度之FOLR1或其融合體通過，而對結合、解離進行測定。
作為本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體，可列舉：具有細胞增生抑制活性、抗腫瘤活性、細胞凋亡促進活性、以及ADCC活性、CDC活性、及抗體依賴性巨噬活性(以下，簡寫為ADP活性)等效應活性等之抗體。
所謂細胞增生抑制活性，係指抑制FOLR1陽性細胞之細胞增生之活性，且由如下各種機制引起，即藉由抗人類FOLR1抗體特異性地結合於FOLR1而直接抑制細胞增生；及ADCC活性、CDC活性、ADP活性、細胞凋亡促進活性、利用抗體複合之細胞毒殺活性等。
所謂抗腫瘤活性，係指抑制FOLR1陽性腫瘤細胞之增生之活性， 且由上述所記載之機制而引起。
所謂細胞凋亡促進活性，係指抗人類FOLR1抗體、抗體片段、或該抗體複合體結合於FOLR1陽性細胞，藉此卡斯蛋白酶活性增加，結果引起漸進式細胞死亡之情況。
所謂ADCC活性，係結合於細胞表面之人類FOLR1之抗體經由Fc部分而主要結合於自然殺手細胞(以下記載為NK細胞)表面之FcγRIIIa，其結果自NK細胞釋出穿孔蛋白(perforin)或顆粒酶(granzyme)等細胞毒殺性分子，藉由該等細胞毒殺性分子而產生之細胞融解反應[Clark M、Chemical Immunology,65,88(1997)；Gorter A等人，Immunol.Today,20,576(1999)]。
所謂CDC活性，係如下反應[Immunol Today.1999 Dec；20(12)：576-82.]：結合於細胞表面之人類FOLR1之抗體經由Fc部分而結合於補體系之C1之一成分即C1q，其結果為，C1至C9之各補體成分活化，最終C5至C9將稱為膜攻擊複合體之孔形成聚合物形成於細胞膜上而引起細胞之溶解。
本發明中所使用之抗人類FOLR1抗體可控制效應活性。作為其方法，可列舉：控制α1,6結合於存在於與抗體之Fc區域之第297號之天冬醯胺(Asn)結合的N結合複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)的海藻糖(亦稱為fucose)之量之方法(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號、國際公開第00/61739號)；或者藉由改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基而進行控制之方法等。
作為使抗體之效應活性增加或降低之方法，例如可列舉：控制抗體之Fc之N結合複合型糖鏈之海藻糖之含量的方法。
作為使結合於與抗體之Fc結合之N結合複合型糖鏈之海藻糖的含量降低之方法，例如可列舉如下方法：使用缺損α1,6-海藻糖轉移酵素基因之CHO細胞而使抗體表現，藉此取得未結合有海藻糖之抗體。 未結合有海藻糖之抗體具有較高之ADCC活性。
另一方面，作為使結合於與抗體之Fc結合之N結合複合型糖鏈之海藻糖的含量增加之方法，例如可列舉如下方法：使用導入有α1,6-海藻糖轉移酵素基因之宿主細胞而使抗體表現，藉此取得結合有海藻糖之抗體。結合有海藻糖之抗體具有較未結合有海藻糖之抗體更低之ADCC活性。
又，改變抗體之Fc區域之胺基酸殘基，藉此可使ADCC活性或CDC活性增加或降低。例如，使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書所記載之Fc區域之胺基酸序列，藉此可增加抗體之CDC活性。又，進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書所記載之胺基酸改變，藉此可使ADCC活性或CDC活性增加，亦可使ADCC活性或CDC活性降低。進而，組合上述方法併用於一個抗體，藉此可取得抗體之效應活性受到控制之抗體。
作為使本發明之人類FOLR1標靶藥之治療效果增強之方法，可列舉如下方法：將葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥同時或逐次投予，結果增強利用人類FOLR1標靶藥之治療效果。於暴露於葉酸代謝拮抗劑中之癌細胞之細胞膜上FOLR1之表現增加，結果人類FOLR1標靶藥結合於癌細胞膜上之增加之FOLR1而顯現藥效。暴露葉酸代謝拮抗劑時之人類FOLR1標靶藥之治療效果變得高於未暴露葉酸代謝拮抗劑時之人類FLOR1標靶藥之治療效果。
又，作為本發明之併用方法，可列舉：特徵在於使用葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1之表現增加之葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥的併用方法；特徵在於與葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予而使FOLR1之表現增加之葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥之併用方法。
又，本發明包含使抗人類FLOR1抗體之ADCC活性及/或抗腫瘤活 性增加之方法。於暴露於葉酸代謝拮抗劑中之癌細胞之細胞膜上FOLR1之表現增加，結果抗人類FOLR1抗體結合於癌細胞膜上之增加之FOLR1，而發揮較高之ADCC活性及/或較高之抗腫瘤活性。暴露葉酸代謝拮抗劑時之人類FOLR1標靶藥之ADCC活性及/抗腫瘤活性變得高於未暴露葉酸代謝拮抗劑時之人類FLOR1標靶藥的ADCC活性及/抗腫瘤活性。
作為本發明之包含人類FOLR1標靶藥之醫藥，可列舉：特徵在於使用葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1之表現增加之包含人類FOLR1標靶藥之癌症的醫藥；用以藉由將葉酸代謝拮抗劑與人類FOLR1標靶藥同時或逐次投予而使FOLR1之表現增加之包含人類FOLR1標靶藥之癌症的醫藥等。
因此，本發明之醫藥係使用葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1之表現增加，藉此提高人類FOLR1標靶藥之效果之癌症的醫藥，只要可增加FOLR1之表現，則可為用以同時投予葉酸代謝拮抗劑、及人類FOLR1標靶藥者，亦可為用以逐次投予葉酸代謝拮抗劑、及人類FOLR1標靶藥者。
又，本發明之醫藥可為將葉酸代謝拮抗劑、及人類FOLR1標靶藥製成複數個製劑而含於不同製劑中者，亦可為將葉酸代謝拮抗劑、及人類FOLR1標靶藥製成1個製劑而含於同一製劑中者。
進而，本發明之醫藥除含有葉酸代謝拮抗劑、及/或人類FOLR1標靶藥、或其衍生物外，亦可含有藥理學所容許之1種以上之載體。
於本發明之治療方法、治療效果之增強方法、及醫藥中，所謂同時使用，係表示如下狀態，即將人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑實質上同時向患者投予。具體而言，可列舉：將人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑製成1個製劑；及將2個以上之製劑順次投予等，藉此實質上同時投予之情形等。
本發明中所謂逐次使用，係表示如下狀態，即將人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑以任意順序向患者投予，人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑各自之投予可為相同之次數，亦可為不同之次數。具體而言，可列舉：向患者先投予一者後，間隔一定時間僅將另一者投予複數次之情形等。
作為本發明之治療方法、治療效果之增強方法、及醫藥之標靶之疾病，只要為與FOLR1陽性細胞相關之疾病，則可為良性腫瘤、惡性腫瘤、伴隨著癌症以及原發癌之連續性轉移、血源性轉移、淋巴轉移及彌漫性轉移中之任一者。
作為與FOLR1陽性細胞相關之疾病，只要為與表現FOLR1之細胞相關，且與葉酸代謝異常、及/或葉酸受體異常相關之疾病，則可為任意者，例如可列舉的是癌症。
作為癌症，例如可列舉：血癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌、間皮瘤或胰腺癌等，較易治療者可列舉：卵巢癌、腎癌、肺癌、乳癌、胰腺癌或間皮瘤。又，對於該等癌中之轉移、惡病體質、癌性疼痛、癌性神經症狀等相關症候群之症狀改善而言，亦可使用本發明之治療法及醫藥。
本發明中，關於FOLR1陽性細胞是否與疾病相關，可藉由確認病變組織中之FOLR1陽性細胞而明確。使標記化之葉酸、或抗FOLR1抗體與自病變組織、或癌組織分離、摘取之細胞進行反應，並利用流式細胞儀(FCM)等進行測定，藉此可觀察FOLR1陽性細胞。又，藉由免疫組織染色法(IHC)，亦可觀察組織中之FOLR1之表現。又，將放射性同位素複合而成之葉酸99mTc-EC20(etarfolatide)等向患者體內進行投予，對葉酸向組織之滲入進行觀察，藉此亦可確認組織中之FOLR1之表現或功能。
關於上述之方法，於實施本發明之治療方法、及本發明之治療效果之增強方法之情形、或使用本發明之醫藥之情形時，可用於投予前後之藥效學效果之評價，並可有效且有效率地進行治療。
供使用本發明之治療方法、治療效果之增強方法、或醫藥之人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑之投予路徑較佳為使用於治療時最有效果者，可列舉：經口投予、或口腔內、氣管內、直腸內、皮下、肌內、腹腔內、或靜脈內等非經口投予，較佳為可列舉靜脈內投予。
於本發明之醫藥包含單獨含有人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑之2個以上之製劑的情形時，作為其投予路徑，可為相同之投予路徑，亦可為不同之投予路徑。
作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、或貼劑等。
於本發明之併用劑包含單獨含有人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑之2個以上之製劑的情形時，作為其投予形態，可為相同之投予形態，亦可為不同之投予形態。
關於本發明之醫藥之投予量或投予次數，係視目標之治療效果、投予方法、治療時間、年齡、及體重等而有所不同，通常成人每天，人類FOLR1標靶藥、及葉酸代謝拮抗劑分別為1μg/kg~1000mg/kg。
以下，藉由實施例而對本發明具體地進行說明，但本發明並不限定於下述實施例。
實施例 [實施例1] (1)對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株之愛甯達添加培養
將作為源自NSCLC之細胞株之NCI-H522[American Type Culture Collection(以下，記載為ATCC)編號：CRL-5810]、NCI-H838(ATCC編號：CRL-5844)、NCI-H1437(ATCC編號：CRL-5872)、及NCI-H2228(ATCC編號：CRL-5935)於潛伏期培養基[RPMI1640(GIBCO)、10%已滅活牛血清(FCS，GIBCO)]中進行培養。
繼而，自培養燒瓶利用TrypLE Express(GIBCO)剝離細胞，並使之懸浮於不含葉酸之培養基[RPMI 1640 folate-free(GIBCO)、10%已滅活透析FCS(dFCS，GIBCO)]。針對25cm2之組織培養用(TC)燒瓶，於2.5×105cells/4mL之條件下播種細胞。
培養24小時後，添加3×低葉酸培養基(向不含葉酸之培養基添加33分之1量之潛伏期培養基而成者)2mL，而更換為於最終葉酸濃度為約22.7nmol/L之低葉酸培養基中之培養。進而，以最終濃度成為0、10、或1000nmol/L之方式添加愛甯達(pemetrexed，Eli Lilly)並培養72小時。
(2)NSCLC細胞株之FOLR1表現量解析
將各細胞株於上述條件下進行培養後，利用TrypLE Express進行剝離，利用磷酸鹽緩衝液(PBS，phosphate buffur saline)洗淨後，使之懸浮於FCM緩衝液(1mmol/L EDTA，0.05%迭氮化鈉，包含5%已滅活FCS，PBS)。
繼而，將細胞以每孔成為1×105個之方式播種於96孔板，以1700rpm進行1分鐘之離心分離。將上清液除去後，向細胞添加利用FCM緩衝液製備為10μg/mL之抗人類FOLR1人源化抗體(HuRA15-7CTAcc抗體)(國際公開第2014/087863號)，於4℃下反應30分鐘。
將細胞洗淨後，添加利用FCM緩衝液稀釋成100倍之Anti-Human IgG-FITC(Jackson)，於4℃下反應30分鐘。再次將細胞洗淨後，利用FCM緩衝液使細胞懸浮，利用流式細胞儀(Beckman Coulter公司製造，FC500MPL)對螢光強度進行解析，而求出各細胞之平均螢光強度 (MFI)值。
關於HuRA15-7CTAcc抗體，係以國際公開第2007/011041號及國際公開第2011/108502號之報告為參考而改變pKANTEX93之抗體重鏈恆定區，向該載體導入編碼序列編號8及序列編號9所表示之胺基酸序列之基因，使用剔除了岩藻糖基轉移酶-8(FUT8，fucosyltransferase-8)基因之中國倉鼠卵巢細胞(CHO/DG44)而進行表現。所表現之抗體係於精製後供於實驗。
其結果為，於NCI-H1437及NCI-H2228中，與於愛甯達之最終濃度為0nmol/L之條件下進行培養之情形相比，於愛甯達之最終濃度為10、1000nmol/L之條件下進行培養之情形時，FOLR1之表現量分別增加至約1.5倍、2倍[圖1(A)及圖1(B)]。於NCI-H522及NCI-H838中亦發現如下傾向：愛甯達之最終濃度越高，FOLR1表現量越增加[圖1(C)及圖1(D)]。
自上述情況表示，若向NSCLC細胞添加作為葉酸代謝拮抗劑之愛甯達並進行培養，則FOLR1表現量上升。因此，明確葉酸代謝拮抗劑使NSCLC細胞之FOLR1表現量增加。
[實施例2] 對卵巢癌細胞株之愛甯達添加培養及FOLR1表現量解析
以與實施例1相同之方式，進行對卵巢癌細胞株之愛甯達添加培養及FOLR1表現量解析。首先，將作為源自卵巢癌之細胞株之SKOV-3[American Type Culture Collection(以下，記載為ATCC)編號：HTB-77]、MCAS(JCRB細胞編號：JCRB0240)、NIH：OVCAR-3(ATCC編號：HTB-161)、及IGR-OV1(National Cancer Institute)於潛伏期培養基中進行培養。其後，使剝離之細胞懸浮於不含葉酸之培養基，針對25cm2之TC燒瓶，於5×105cells/4mL之條件下播種細胞。
以與實施例1相同之方式進行愛甯達添加培養、及FOLR1表現量 解析，結果於IGR-OV1、SKOV-3及MCAS中發現如下傾向：所添加之愛甯達濃度越高，FOLR1表現量越增加[圖2(A)、圖2(B)、及圖2(D)]。
與於潛伏期培養基中進行培養(NC)之情形相比，於低葉酸培養基中且於愛甯達之最終濃度為1000nmol/L之條件下進行培養之情形時，FOLR1之表現量分別於IGR-OV1中成為約2.5倍[圖2(A)]，於SKOV-3中成為約2.5倍[圖2(B)]，於MCAS中成為約7倍[圖2(D)]。
進而，於SKOV-3及MCAS中，與於潛伏期培養基中進行培養之情形相比，於低葉酸培養基中且於愛甯達之最終濃度為0nmol/L之條件下進行培養之情形時，亦發現FOLR1表現量之增加[圖2(B)及圖2(D)]。
另一方面，與於潛伏期培養基中進行培養之情形相比，於低葉酸培養基中進行培養之情形時，不管愛甯達之最終濃度之條件如何，亦存在FOLR1表現量未增加之細胞株[圖2(C)]。
自上述情況表示，若將卵巢癌細胞於愛甯達存在下進行培養、或於低葉酸培養基中進行培養，則有FOLR1表現量上升之細胞株。若進而與實施例1之結果合併，則表示如下情況：利用愛甯達之FOLR1表現量之增加效果於卵巢癌細胞中較NSCLC細胞更顯著。因此，明確不僅於NSCLC中，於卵巢癌中，葉酸代謝拮抗劑亦使FOLR1之表現量增加。
[實施例3] 對愛甯達添加培養細胞之ADCC活性評價
以與實施例2相同之方式，首先將卵巢癌細胞株MCAS於潛伏期培養基中進行培養。其後，使所剝離之細胞懸浮於不含葉酸之培養基，針對175cm2之TC燒瓶，於25×105cells/28mL之條件下播種細胞。培養24小時後，添加3×低葉酸培養基14mL，將最終葉酸濃度設 為約22.7nmol/L。進而，以最終濃度成為0或20nmol/L之方式添加愛甯達並培養72小時。
將培養後之細胞自培養燒瓶利用0.02% EDTA溶液(Nacalai)進行剝離，利用Vi-CELL XR 2.01(Beckman Coulter)對細胞數及生存率進行測量。其結果為，添加有0及20nmol/L愛甯達之MCAS細胞之細胞生存率分別為98.0%及96.6%。
將該等細胞分別於ADCC測定培養基[不含酚紅之RPMI1640(GIBCO)、5%已滅活dFCS(GIBCO)]中製備為1×104cells/50μL而製成目標細胞溶液。
繼而，將經肝素處理之健康人末梢血液重疊於填充有Lymphoprep(Cosmobio)之LeucoSep淋巴球分離管(Greiner)，以1000×g且於室溫下進行20分鐘離心分離。
離心分離後，將血清組分去除，回收末梢血液單細胞(PBMC)層，於ADCC測定培養基中將細胞洗淨。將PBMC於ADCC測定培養基中製備為2.5×105cells/50μL而製成效應細胞溶液。
抗人類FOLR1抗體係使用HuRA15-7CTAcc抗體及抗人類FOLR1人源化抗體MORAb-003(farletuzumab)。抗體溶液係於ADCC測定培養基中製備為0.1、1、10、100、1000ng/mL，並使檢定之最終濃度成為0.033、0.33、3.3、33、333ng/mL。
MORAb-003係使用國際公開第2005/080431號所記載之導入有整合有編碼重鏈及輕鏈之序列之基因之載體的中國倉鼠卵巢細胞(CHO/DG44)細胞而表現。所表現之抗體係進行精製後供於實驗。
將如上述般製備之目標細胞溶液、效應細胞溶液、以及抗體溶液於U字底之96孔板中以各自50μL/孔之方式進行混合，並以總量計設為150μL/孔。將各孔充分混合後，以50×g進行室溫下之離心分離5分鐘，藉此使細胞沈澱，並於37℃下反應4小時。
繼而，將各孔充分攪拌，再次利用離心分離而使細胞沈澱後，將各孔之上清液以各自50μL之方式分取至新之96孔板。使用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega)，對所分取之上清液中之乳酸脫氫酶(LDH)活性進行測定。操作係依據隨附說明而進行。
關於ADCC活性之算出，首先，自各孔之LDH活性測定值減去僅ADCC測定培養基之孔之LDH活性測定值，設為各孔之LDH活性測定修正值後，利用下式進行計算。
此處，Exp表示各樣品之LDH活性測定修正值，ET spo表示效應細胞溶液及目標細胞溶液之混合孔之LDH活性測定修正值，T total表示混合有目標細胞與隨附有CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay之Lysis Solution之孔之LDH活性測定修正值，D表示Lysis Solution之LDH活性測定修正值，T spo表示僅目標細胞之孔之LDH活性測定修正值。
使用健康人2名之PBMC，進行HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性試驗，結果伴隨著抗體濃度之上升，發現細胞毒殺活性[圖3(A)及圖3(B)]。於使用源自健康人供體1之PBMC之結果[圖3(A)]之全部抗體濃度、及使用源自健康人供體2之PBMC之結果[圖3(B)]之0.033、0.33ng/mL之抗體濃度下，對於愛甯達存在下培養之MCAS之HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性顯著高於對於愛甯達非存在下培養之MCAS的HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性。
另一方面，於既有之抗人類FOLR1抗體即MORAb-003抗體之ADCC活性試驗中，於使用源自健康人供體2之PBMC之結果[圖3(B)]中，於0.33、3.3、33、333ng/mL之抗體濃度下，對於愛甯達存在下 培養之MCAS之MORAb-003抗體之ADCC活性顯著高於對於愛甯達存在下培養之MCAS的MORAb-003抗體之ADCC活性[圖3(B)]。
自上述情況表示，藉由將於愛甯達存在下培養之卵巢癌細胞株設為標靶而增強抗人類FOLR1抗體之ADCC活性。因此，明確於藉由葉酸代謝拮抗劑而FOLR1表現增加之癌症中，作為人類FOLR1標靶藥之抗人類FOLR1抗體之ADCC活性增加。
[實施例4] 對SCID小鼠卵巢癌細胞株MCAS皮下移植模型之愛甯達與抗人類FOLR1抗體之併用試驗
將懸浮於PBS之約2.5×106cells之卵巢癌細胞株MCAS移植至雌性SCID小鼠之腹部側皮下。移植11天後，對體重及腫瘤徑進行測定，利用下述式而算出腫瘤體積後，以各群之平均腫瘤體積變同等之方式對5個群(N=5)實施群分。群分係使用E-workbook software(ID Business Solutions)。
[腫瘤體積(mm3)]=[腫瘤之長徑(mm)]×[腫瘤之短徑(mm)]2×0.5
試驗係以溶劑投予群、抗人類FOLR1抗體(HuRA15-7CTAcc抗體)單獨投予群、愛甯達單獨投予群、同時併用群、sequential併用群之5個群進行。向溶劑群投予溶劑(生理鹽水)。針對抗人類FOLR1抗體投予群，以生理鹽水為稀釋液，將1mg/kg以1週2次之方式進行尾靜脈投予2週。愛甯達投予群係以生理鹽水為稀釋液，將100mg/kg/day於投予開始後進行5天腹腔內投予。針對同時併用群，將兩藥劑以與單劑群相同之方式進行投予。針對sequential併用群，於愛甯達之5天腹腔內投予結束3天後，將抗人類FOLR1抗體1mg/kg以1週2次之方式投予1週。
試驗開始後，對體重及腫瘤徑1週測定2次。各測定日之腫瘤體積係利用上述式算出。腫瘤增生率(以下，記載為V/V0)係藉由用各測 定日之腫瘤體積V除以試驗開始日(day0)之腫瘤體積V0而算出。T/C係藉由用各群之V/V0之平均值(T)除以溶劑投予群之平均值(C)而算出。
其結果為，抗人類FOLR1抗體與愛甯達同時併用群及sequential併用群中之腫瘤體積、腫瘤增生率及T/C係小於抗人類FOLR1抗體單獨及愛甯達單獨投予群[圖4(A)、圖4(B)及圖4(C)]。
即，暗示如下情況：抗人類FOLR1抗體與愛甯達之併用之抗腫瘤活性係較抗人類FOLR1抗體或愛甯達單獨之抗腫瘤活性增強。另一方面，未發現由抗人類FOLR1抗體與愛甯達之併用引起之體重減少[圖4(D)]。
因此，明確藉由將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予，而增強人類FOLR1標靶藥之抗腫瘤活性，而更有效地抑制腫瘤體積及腫瘤增生率。
[實施例5] 對子宮體癌細胞株之愛甯達添加培養及FOLR1表現量解析
將作為源自子宮體癌之細胞株之MES-SA(ATCC編號：CRL-1976)及HEC-1-A(ATCC編號：HTB-112)於添加有10% FCS(GIBCO)之McCoy's5A培養基(ATCC)中進行培養，將HEC-1-B(ATCC編號：HTB-113)於添加有10% FCS(GIBCO)之Eagle's Minimum Essential Medium(ATCC)中進行培養。其後，利用與實施例1相同之方法，使所剝離之細胞懸浮於不含葉酸之培養基，針對25cm2之TC燒瓶，於2.5×105cells/4mL之條件下播種細胞。
培養24小時後，添加3×低葉酸培養基(向不含葉酸之培養基添加33分之1量之潛伏期培養基而成者)2mL，而改換為於最終葉酸濃度為約22.7nmol/L之低葉酸培養基下之培養。進而，以最終濃度成為0、10、或1000nmol/L之方式添加愛甯達(pemetrexed，Eli Lilly)並培養72小時。
繼而，利用與實施例1相同之方法進行FOLR1表現量解析。其中，作為標記抗體，使用利用FCM緩衝液稀釋為10倍之Anti-Human IgG-PE(BD)代替利用FCM緩衝液稀釋為100倍之Anti-Human IgG-FITC(Jackson)。又，流式細胞儀係使用Becton Dickinson公司製造(FACSVerse)代替Beckman Coulter公司製造(FC500MPL)。
其結果為，於MES-SA、HEC-1-A及HEC-1-B中，發現如下傾向：所添加之愛甯達濃度越高，FOLR1表現量越增加[圖5(A)、圖5(B)、及圖5(C)]。與於潛伏期培養基中培養(NC)之情形相比，於低葉酸培養基中且於愛甯達之最終濃度為1000nmol/L之條件下培養之情形時，FOLR1之表現量分別於MES-SA中成為約3.5倍[圖5(A)]，於HEC-1-A中成為約3倍[圖5(B)]，於HEC-1-B中成為約2倍[圖5(C)]。
自上述情況表示，若將子宮體癌細胞於愛甯達存在下進行培養，則FOLR1表現量上升。因此，明確不僅於NSCLC及卵巢癌中，於子宮體癌中，葉酸代謝拮抗劑亦使FOLR1之表現量增加。
[實施例6] 對愛甯達添加培養細胞(NSCLC細胞株)之ADCC活性評價
利用與實施例3相同之方法進行對NSCLC細胞株NCI-H2228之ADCC活性評價。其中，培養時所添加之愛甯達係以最終濃度成為0、20、或1000nmol/L之方式進行製備。又，關於細胞數及生存率，並非利用Vi-CELL XR 2.01進行測量，而是使用Countess(Life Technologies)進行測量。
使用健康人之PBMC，進行HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性試驗，結果伴隨著抗體濃度之上升，發現細胞毒殺活性。又，於全部抗體濃度下，對於1000nmol/L愛甯達存在下培養之NCI-H2228之HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性顯著高於對於愛甯達非存在下培養之NCI-H2228的HuRA15-7CTAcc抗體之ADCC活性[圖6(A)]。
於作為既有之抗人類FOLR1抗體之MORAb-003抗體之ADCC活性試驗中，於0.0033、3.3、33、333ng/mL之抗體濃度下，對於1000nmol/L愛甯達存在下培養之NCI-H2228之MORAb-003抗體之ADCC活性顯著高於對於愛甯達非存在下培養之NCI-H2228的MORAb-003抗體之ADCC活性[圖6(B)]。
自上述情況表示，藉由將於愛甯達存在下培養之NSCLC細胞株設為標靶，而增強抗人類FOLR1抗體之ADCC活性。因此，明確於利用葉酸代謝拮抗劑而使FOLR1表現增加之癌症中，作為人類FOLR1標靶藥之抗人類FOLR1抗體之ADCC活性增加。
已使用特定之態樣對本發明詳細地進行了說明，但對從業者而言很明確，可不脫離本發明之意圖與範圍而進行各種變更及變化。再者，本申請案係基於2014年6月6日提出之美國臨時申請案(62/008,726號)，且藉由引用而將其整體進行援用。
[序列表非關鍵文字]
序列編號1：FOLR1之胺基酸序列
序列編號2：RA15-7VHCDR1_AA之胺基酸序列
序列編號3：RA15-7VHCDR2_AA之胺基酸序列
序列編號4：RA15-7VHCDR3_AA之胺基酸序列
序列編號5：RA15-7VLCDR1_AA之胺基酸序列
序列編號6：RA15-7VLCDR2_AA之胺基酸序列
序列編號7：RA15-7VLCDR3_AA之胺基酸序列
序列編號8：nonS_HuRA15-7CTVH_AA之胺基酸序列
序列編號9：nonS_HuRA15-7LV3_AA之胺基酸序列
序列編號10：nonS_RA15-7VH_AA之胺基酸序列
序列編號11：nonS_RA15-7VL_AA之胺基酸序列
序列編號12：FOLR1 DNA之鹼基序列
序列編號13：HuRA15-7CTAccVHCDR3_AA之胺基酸序列
<110> 協和醱酵麒麟有限公司
<120> 藉由FOLR1標靶藥及葉酸代謝拮抗劑用於癌症患者之 治療方法與醫藥
<130> W518541
<150> US62/008726
<151> 2014-06-06
<160> 13
<170> 申請專利版本3.3
<210> 1
<211> 257
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 人工
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<212> PRT
<213> 人工
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<212> DNA
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<213> 人工
<220>
<223> HuRA15-7CTAccVHCDR3_AA
<400> 13

Claims (18)

  1. 一種使用人類FOLR1標靶藥而治療癌症之方法，其使用葉酸代謝拮抗劑而使葉酸受體α(folate receptor α，以下簡寫為FOLR1)之表現增加。
  2. 如請求項1之方法，其將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予。
  3. 如請求項1或2之方法，其中癌症為表現FOLR1之癌症。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中人類FOLR1標靶藥為選自FOLR1抑制劑、抗人類FOLR1抗體及抗人類FOLR1抗體片段中之任一種。
  5. 如請求項4之方法，其中FOLR1抑制劑為葉酸衍生物。
  6. 如請求項4之方法，其中抗人類FOLR1抗體及抗體片段為結合於序列編號1所記載之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列所包含之抗原決定位的抗體及該抗體片段。
  7. 一種使人類FOLR1標靶藥之治療效果增強之方法，其使用葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞中之FOLR1之表現增加以增強人類FOLR1標靶藥之治療效果。
  8. 如請求項7之方法，其將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予。
  9. 如請求項7或8之方法，其中癌症為表現FOLR1之癌症。
  10. 如請求項7至9中任一項之方法，其中人類FOLR1標靶藥為選自FOLR1抑制劑、抗人類FOLR1抗體及抗人類FOLR1抗體片段中之任一種。
  11. 如請求項10之方法，其中FOLR1抑制劑為葉酸衍生物。
  12. 如請求項10之方法，其中抗人類FOLR1抗體及抗體片段為結合於序列編號1所記載之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列所包含之抗原決定位的抗體及該抗體片段。
  13. 一種包含人類FOLR1標靶藥之癌症之醫藥，其用以投予葉酸代謝拮抗劑而使癌細胞中之FOLR1之表現增加。
  14. 如請求項13之醫藥，其將葉酸代謝拮抗劑同時或逐次投予。
  15. 如請求項13或14之醫藥，其中癌症為表現FOLR1之癌症。
  16. 如請求項13至15中任一項之醫藥，其中人類FOLR1標靶藥為選自FOLR1抑制劑、抗人類FOLR1抗體及抗人類FOLR1抗體片段中之任一種。
  17. 如請求項16之醫藥，其中FOLR1抑制劑為葉酸衍生物。
  18. 如請求項16之醫藥，其中抗人類FOLR1抗體及抗體片段為結合於序列編號1所記載之胺基酸序列中之第55號~第62號之胺基酸序列所包含之抗原決定位的抗體及該抗體片段。
TW104118390A 2014-06-06 2015-06-05 藉由ｆｏｌｒ１標靶藥及葉酸代謝拮抗劑用於癌症患者之治療方法與醫藥 TW201625301A (zh)

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