CN108779497A - 足糖萼蛋白和tra-相关抗体、制备方法和作为抗癌治疗剂的用途 - Google Patents

足糖萼蛋白和tra-相关抗体、制备方法和作为抗癌治疗剂的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其中重链互补决定区1‑3分别具有SEQ ID NOS.1‑3的氨基酸序列，并且轻链互补决定区1‑3分别具有SEQ ID NOS.4‑6的氨基酸序列。此外，本发明涉及抗癌治疗剂，其包括抗体或其抗原结合片段。

Description

足糖萼蛋白和TRA-相关抗体、制备方法和作为抗癌治疗剂的 用途
相关申请的交叉引用
本申请在35U.S.C.§119(e)下要求来自美国临时专利申请号62/307,690的2016年3月14日提交的“足糖萼蛋白(podocalyxin)和TRA-相关抗体、制备方法和在治疗进攻性性和/或转移性癌症中的用途”(“PODOCALYXIN AND TRA-RELATED ANTIBODY,METHODS FORPREPARATION AND USES FOR TREATMENTOF AGGRESSIVE AND/OR METASTATIC CANCER”)的优先权，其内容作为引用完整地并入本文。
发明领域
本发明涉及多能-和胚胎干细胞特异性抗体。本发明还涉及为反应性的并且具有与足糖萼蛋白的胚胎形式的结合活性的抗体。本发明还涉及癌症治疗剂，其包括所述抗体或其抗体片段作为活性成分以使癌细胞退化、减少或消除。
发明背景
正常人胚胎干细胞是分化成构成人体的200种不同类型的细胞的多能干细胞。胚胎癌是源自人生殖细胞肿瘤的人癌多能干细胞，并且被称为正常胚胎干细胞的恶性等效物。正常胚胎干细胞和胚胎癌均在其质膜表面上表达多能相关抗原。已知至少一些多能相关抗原在分化期间丢失并且在正常细胞和组织中不表达或低表达。
众所周知，许多人类癌症具有胚胎干细胞基因特征并且重新表达多能和胚胎抗原，这些抗原在正常分化细胞中不存在或较低地存在。癌症起源的细胞重编程理论指出，癌症的原因是由于正常细胞重编程和经历朝向具有干细胞特性的原始胚胎样癌细胞向后(backward)去分化。认为这些原始的胚胎样癌症干细胞是癌症的起源，并且是疾病进展的驱动因素，并且抗病性几乎普遍与常规疗法一起发生。此外，认为治疗性靶向和消除这些原始胚胎样癌症干细胞将导致有意义且持久的癌症治疗。
足糖萼蛋白是一种在人胚胎干细胞和多能癌干细胞上高表达的细胞表面糖蛋白。在胚胎和多能细胞上表达的足糖萼蛋白的蛋白质具有与足糖萼蛋白的蛋白质连接的额外的碳水化合物基团(TRA-1-60和TRA-1-81，其在本文中称为TRA)。TRA碳水化合物基团是胚胎和多能特异性的并且不存在于体细胞或分化细胞上。足糖萼蛋白的多能和胚胎版本(version)称为TRA-足糖萼蛋白。众所周知，胚胎和多能形式的TRA-足糖萼蛋白在许多类型的癌症中重新表达。
可以产生对在癌细胞和正常胚胎细胞表面上、但不能在身体的正常分化细胞上表达的多能抗原具有特异性和反应性的单克隆抗体。此外，可以产生对TRA-足糖萼蛋白具有反应性并且对TRA-足糖萼蛋白具有特异性结合活性的单克隆抗体。这些抗体可用作癌症的抗癌治疗剂，其在疾病的发病和进展期间重新表达胚胎和多能抗原，例如TRA-足糖萼蛋白。
本发明的一个目的是研发多能-和胚胎干细胞特异性抗体。此外，本发明的目的是研发TRA-足糖萼蛋白特异性抗体。此外，一个目的在于研发包括抗体或其片段作为活性成分的治疗剂或组合物。此外，一个目的在于向癌症患者导入或施用治疗剂或组合物以使患者中的癌细胞退化、减少或消除。
发明内容
本发明的单克隆抗体包括6个特异性氨基酸序列，其具有3个重链互补决定区和3个轻链互补决定区。
单克隆抗体可以对人胚胎干细胞和恶性胚胎癌多能干细胞的细胞表面质膜具有特异性和反应性。此外，单克隆抗体可以对TRA-足糖萼蛋白具有特异性和反应性。
单克隆抗体可以对选自口腔、卵巢、前列腺、乳腺、胰腺、结肠、胃和食道的多种人癌具有特异性和反应性。
在一个方面，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列，且轻链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列。
抗体或其片段可以是重组抗体。重组抗体选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
在某些实施方案中，片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双抗体、dsFv和包含CDR的肽。
另一方面，本发明提供了单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链和轻链，其中重链互补决定区1-3与SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列分别具有至少80％的氨基酸序列相似性，且轻链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列。
此外，轻链互补决定区1-3可以分别具有与SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性。
抗体或其片段可以是重组抗体。重组抗体选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
在某些实施方案中，片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双抗体、dsFv和包含CDR的肽。
在还另一方面，本发明包括抗癌治疗剂，包括上述单克隆抗体或抗原结合片段。
所述药剂可以是组合物形式，其还包含选自药学上可接受的接头(linker)，有效负载(payload)及其组合的组分。所述药剂可以是组合物形式，其还包含药物以形成抗体-药物-缀合物。所述药剂可以靶向、选择和消除来自来源于(derived from)胚胎干细胞的分化细胞的胚胎干细胞。所述药剂可靶向选自胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌细胞的癌细胞。
所述组合物可以通过静脉内递送抗体(以其裸人嵌合形式)施用于患者，以引发抗肿瘤抗体依赖性细胞的细胞毒性。或者，可以通过静脉内递送将组合物施用于患者，其中所述组合物还包含用于特异性递送至癌细胞的细胞毒性药物。
序列表
使用标准字母缩写显示附带序列表中列出的氨基酸序列并且将序列表作为引用并入本文。
发明详述
本发明涉及多能-和胚胎干细胞特异性抗体。所述抗体显示出抗肿瘤活性。所述抗体对于正常细胞是非反应性的(unreactive)或难以反应(poorly reactive)，并且对多种癌细胞具有高度特异性和反应性。所述抗体可通过其抗体依赖性细胞的细胞毒性、补体依赖性细胞毒性和抗体-药物缀合物用作抗癌治疗剂。例如，与毒素缀合的抗体对癌细胞具有细胞毒活性。抗体对多种癌症有效，包括但不限于口腔癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌。
本发明的抗体是单克隆的并且在本文中称作Bstrongomab-9A或CM-918。单克隆抗体是使用标准杂交瘤技术生产的。本文描述了单克隆抗体CM-918的重链和轻链可变区的DNA和氨基酸序列。使用VBASE2定义互补决定区(CDR)的氨基酸序列。
单克隆抗体CM-918包括如下重链互补决定区(hcCDR)1-3的氨基酸序列：
单克隆抗体CM-918包括如下轻链互补决定区(lcCDR)1-3的氨基酸序列：
单克隆抗体CM-918可以是包含非人和人抗体的重组抗体。在备选实施方案中，重组抗体可以是非人动物来源的抗体(例如小鼠或大鼠)，人来源的抗体(human-derivedantibody)，人嵌合抗体或人源化抗体。抗体优选是抗人抗体，其特异性结合人细胞例如多能和胚胎干细胞。更具体地，抗体是哺乳动物来源的单克隆抗体，其包括由杂交瘤产生的那些。在某些实施方案中，抗体是使用常规杂交瘤技术小鼠来源的。抗体也可以用各种分子修饰，例如但不限于聚乙二醇(PEG)。抗体也可以用具有细胞毒活性的化学治疗剂、放射性化学物质等进行修饰。
在某些实施方案中，单克隆抗体CM-918具有反应性和选择性，其结合细胞粘附蛋白足糖萼蛋白(也称作足糖萼蛋白样蛋白1)上的表位。足糖萼蛋白是膜内在蛋白质，在人类中，由PODXL基因编码。足糖萼蛋白是在一些正常细胞中表达的高度糖基化的类型-1跨膜蛋白。足糖萼蛋白在多种癌症中高度表达并且是肿瘤标志物，其中其表达水平与各种癌症中的肿瘤进攻性相关。足糖萼蛋白在正常细胞中具有约为160-164kDa的分子量。足糖萼蛋白也在正常胚胎干细胞和恶性多能胚胎癌干细胞中大量表达。足糖萼蛋白是正常胚胎干细胞的细胞表面标志物。足糖萼蛋白在所有胚胎和多能干细胞中以胚胎或多能特异性变体形式表达，其具有在非多能和胚胎干细胞中不存在的额外翻译后修饰。足糖萼蛋白的一种已知的胚胎干细胞特异性翻译后修饰是足糖萼蛋白的蛋白质骨架的额外糖基化，称为TRA-1-60和TRA-1-81(本文称为TRA表位)。不意欲受任何特定理论的束缚，认为TRA表位是多能的和胚胎特异性的延伸(extended)四糖粘蛋白类型O-聚糖结构。当胚胎干细胞和多能癌细胞分化成体细胞时，TRA表位从足糖萼蛋白中丢失。TRA不在正常体细胞和分化细胞上表达。具有TRA表位的足糖萼蛋白的胚胎变体(本文称为TRA-足糖萼蛋白)的表观分子量约为200-240kDa。众所周知，TRA-足糖萼蛋白在许多类型的癌症中表达，包括口腔癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌、卵巢癌和肺癌。
在本发明的某些实施方案中，单克隆抗体CM-918是反应性的并且具有选择性，其结合足糖萼蛋白的胚胎和多能变体TRA-足糖萼蛋白上存在的TRA表位。
在其它实施方案中，单克隆抗体CM-918对TRA-足糖萼蛋白上的未知表位具有选择性结合和反应性。在其它实施方案中，单克隆抗体CM-918对未知表位具有选择性结合和反应性，所述未知表位在胚胎干细胞和多能胚胎癌细胞(carcinoma cancer cells)的细胞质膜上表达。根据本发明可以理解和设想，存在CM-918抗体的氨基酸序列变体，其中重链CDRs序列(SEQ ID NO.1-3)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一种氨基酸替代。优选地，这些CM-918变体具有反应性和选择性结合TRA-足糖萼蛋白，或反应性和选择性结合胚胎干细胞的细胞表面质膜。
根据本发明也理解和设想CM-918抗体的氨基酸序列变体，其中轻链CDRs序列(SEQID NOS.4-6)的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸替代。优选地，这些CM-918变体具有反应性和选择性结合TRA-足糖萼蛋白或反应性和选择性结合胚胎干细胞的细胞表面质膜。
在某些方面，本发明提供了抗体，其包括分别具有SEQ.ID NO.1中所示氨基酸序列的重链CDR1以及具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列的CDR2和CDR3。此外，抗体包括分别具有SEQ ID NO.4中所示氨基酸序列的轻链CDR1以及具有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6中所示氨基酸序列的CDR2和CDR3。此外，在某些方面，本发明通过替换、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸并入来源自和功能等同于本文所述抗体的抗体。在某些方面，本发明包括单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链互补决定区1-3分别具有与SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性，且轻链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列。在某些其它方面，本发明包括单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列，且轻链互补决定区1-3分别具有与SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性。在某些其它方面，本发明包括单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中重链互补决定区1-3分别具有与SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性，且轻链互补决定区1-3分别具有与SEQ ID NO.4-6的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性。
本发明的抗体不限于整个抗体分子，并且可以是低分子抗体或其修饰形式，只要抗体与细胞表面结合即可。低分子抗体包括在整个抗体的一部分中缺乏的抗体片段。只要所得抗体片段能够结合细胞表面，抗体分子的这种部分缺乏是可接受的。优选抗体片段含有SEQ ID NO.1、2和3中所示的重链(hc)CDR和SEQ ID NO：4、5和6中所示的轻链(lc)CDR。低分子抗体和抗体片段的具体实例可包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fv，scFv(单链Fv)，dsFv双抗体，sc(Fv)2或包括CDR的肽。
双抗体是指通过基因融合构建的二价抗体片段。双抗体是包含两条多肽链的二聚体。通过连接抗体的重链和轻链区域获得scFv。在scFv中，重链和轻链区通过接头(例如肽接头)连接。连接可变区的肽接头不受特别限制。例如，可以使用约3至25个残基的任意单链肽作为接头。scFv-Fc是包含与scFv融合的Fc区的低分子抗体。scFv-Fc中使用的scFv的来源没有特别限制，例如，可以使用来源于IgM的scFv。此外，Fc的来源没有特别限制，例如，可以使用来源于人IgG(人IgG1等)的Fc。sc(Fv)2是低分子抗体，其具有包含通过接头等连接的重链区和轻链区的单链。sc(Fv)2可以例如通过接头连接scFv来制备。
抗体的片段可通过使用本领域已知的各种技术获得，例如但不限于酶促处理抗体以形成其片段。
对于例如癌症的细胞增殖性疾病的治疗，优选抗体维持其效应子(effector)活性。具体地，根据本发明的抗体可以具有对细胞表面和效应子功能的结合亲和力。抗体的效应子功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。本发明的治疗性抗体可特别具有ADCC活性作为效应子功能。用于治疗目的的本发明的抗体可以是具有细胞毒活性的抗体。本发明的细胞毒活性的实例可包括ADCC和CDC活性。在本发明中，ADCC活性是指通过经Fcγ受体使携带Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)与特异性附着于靶细胞的细胞表面抗原的抗体的Fc结构域结合来破坏靶细胞的活性。CDC活性是指由补体系统介导的细胞毒活性。
抗体可以与细胞毒性物质缀合。适合的细胞毒性物质的非限制性实例包括化学治疗剂、毒性肽、放射性化学物质(chemical)或其它有效负载，例如药物。这种修饰的抗体(下文称为抗体缀合物)可通过化学修饰所得抗体而获得。在某些实施方案中，修饰的抗体包括药学上可接受的接头，有效负载或其组合。其中有效载荷是药物，形成抗体-药物-缀合物。用于抗体修饰的各种方法在本领域中是已知的，并且这些方法适用于本发明。
本发明提供药物组合物，其包括与细胞，例如多能和胚胎干细胞表面结合的抗体作为活性成分。所述药物组合物包括治疗有效量的抗体。术语“治疗有效量”表示抗体的量，其使抗体能够发挥所需的治疗效果或预防效果。在一个实施方案中，药物组合物是细胞生长抑制剂，特别是抗癌治疗剂。将本发明的细胞生长抑制剂和抗癌剂施用于患有癌症或可能患有癌症的受试者，并且可以有效地从来自来源于胚胎干细胞的分化细胞中靶向、选择和消除胚胎干细胞。
本发明的药物组合物可包含细胞毒性物质缀合的抗体作为活性成分。当本发明的药物组合物靶向的疾病是癌症时，靶向癌症没有特别限制并且可以特别是口腔癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌。
本发明的药物组合物可以口服或胃肠外施用于患者。肠胃外施用可能是优选的。这种施用方法的具体实例包括注射、经鼻、肺和透皮施用。注射施用的实例包括静脉内、肌内、腹膜内和皮下注射，通过它们可以全身或局部施用本发明的药物组合物。此外，可以根据患者的年龄或症状适当选择施用方法。本发明的药物组合物的剂量可以选自剂量范围，例如，每剂量(dosing)每千克体重0.0001mg至1000mg/kg。或者，剂量可以选自例如每个身体(body)0.001至100000mg的范围。然而，本发明的药物组合物不限于这些剂量。本发明的药物组合物可以根据本领域已知的标准常规方法配制，并且可以另外含有药学上可接受的载体或添加剂。其实例包括但不限于表面活性剂、赋形剂、着色剂、矫味剂、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、张度剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂和矫正剂。常规使用的其它载体可以被适当地并入。与癌细胞接触后，本发明的抗体可破坏癌细胞或抑制其生长。抗体结合的细胞没有特别限制。在本发明中，细胞优选是癌细胞。
本领域技术人员将理解，在不脱离其广泛的发明构思的情况下，可以对上述实施方案进行改变。因此，应理解，本发明不限于所公开的具体实施方案和所完成的以下实施例，而是旨在涵盖在本发明的精神和范围内的变型。
实施例
实施例1–单克隆抗体CM-918的制备
使用标准小鼠杂交瘤技术产生本发明的单克隆抗体，在本文中称作Bstrongomab或CM-918。给小鼠腹膜内注射悬浮在无菌PBS中的新鲜收获的NCCIT细胞。每只小鼠每次注射接受10e6个细胞。在每两周(2)间隔(spaced every 2two weeks)四次注射后，在ELISA和蛋白质印迹试验(Western Blot assay)中测试免疫接种(immunized)小鼠的血清以鉴定具有阳性滴度的小鼠。具有最高滴度的小鼠然后在从脾脏收获B细胞和融合至NS0或P3X63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞之前2-7天接受灌注加强免疫接种。
将杂交瘤接种到96孔板(每个融合960个孔)中并用含有20％胎牛血清，20％NCTC-109(Gibco)，1％v/v青霉素-链霉素，2mM L-谷氨酰胺，0.4％v/v杂交瘤融合体和克隆补充剂(Sigma-Aldrich)，1x非必需氨基酸(Gibco)，1x HAT-补充剂(Gibco)，20mM HEPES和RPMI1640培养基(mod.)1x与L-谷氨酰胺的杂交瘤融合培养基繁殖14天。收集杂交瘤上清液并通过针对NCCIT裂解物的蛋白质印迹筛选以鉴定产生与TRA结合的IgG抗体的杂交瘤。将阳性克隆按比例调整(scale)并在96孔板中进行至少两轮有限稀释亚克隆以分离单克隆杂交瘤。通过ELISA筛选亚克隆板，并且将阳性单克隆杂交瘤在包含10％胎牛血清，10％NCTC-109(Gibco)，1％v/v青霉素-链霉素，2mML-谷氨酰胺，0.4％v/v杂交瘤融合和克隆补充物(Sigma-Aldrich)，1x非必需氨基酸(Gibco)，1x HT-补充物(Gibco)，20mM HEPES，和RPMI1640培养基(mod.)与1x L-谷氨酰胺的杂交瘤培养基中按比例调整。在蛋白质印迹试验中确认杂交瘤活性后，将单克隆杂交瘤在补充有10％DMSO的杂交瘤培养基中冷冻。从含有10％超低IgG FBS的杂交瘤培养基中培养至耗尽的单克隆杂交瘤的上清液中纯化CM-918抗体。将上清液离心，然后通过45um过滤器以除去细胞和细胞碎片。使用来自GELifeSciences的HiTrap Protein G HP柱通过亲和层析纯化IgG抗体。使用Zeba SpinDesalting Columns(Thermo Scientific)将纯化的mAb脱盐。重链和轻链可变区是DNA测序和抗体CDR区的氨基酸序列是通过使用VBASE2定义的，VBASE2是来自人和小鼠的免疫球蛋白基因座(loci)的种系可变基因的整合数据库。
实施例2-使用CM-918抗体对多能细胞的蛋白质印迹分析
使用CM-918抗体，来自多能胚胎癌细胞NCCIT(ATCC#CRL2073)和人胚胎干细胞(ESI-017)的膜蛋白样品的蛋白质印迹显示在两个蛋白质膜制备物(preps)中分子量为200-240kDa的单一扩散条带，但在不表达TRA-足糖萼蛋白的非多能细胞系PC3(ATCC#CRL1435)或A172(ATCC#CRL1620)中未检测到反应性。在相同的蛋白质印迹上使用商购的IgM抗体，抗TRA-1-60(abcam 16288)获得相同的印迹结果。结果证实CM-918抗体和抗TRA-1-60抗体结合相似的表位。通过标准方法学进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。在磷酸盐缓冲液中的1％Chaps去污剂(Sigma)中的细胞膜制备物在8％凝胶上运行并转移到硝化纤维素上。将印迹与CM-918或抗TRA-1-60抗体以1：1000(1ug/ml浓度)温育，然后以1-5000(.2ug/ml)温育第二抗IGG-HRP或抗IGM-HRP抗体(Millipore)，且通过ECL检测使条带可视化(Amersham Biosciences)。
实施例3-胚胎干细胞和多能胚胎癌细胞的CM-918抗体质膜染色
胚胎干细胞(ESL-017)和多能NCCIT胚胎癌细胞用下述染色：CM-918抗体，其缀合Alexa 647(Sigma)(0.5ug/ml)，和抗TRA-1-60抗体(0.5ug/ml)和抗IgM-Alexa F488抗体(Millipore)(0.5ug/ml)。具有红色通道的荧光显微镜检查图像显示CM-918抗体与胚胎干细胞和多能胚胎癌细胞的质膜强烈结合，但不能控制不表达TRA-足糖萼蛋白的细胞系PC3(ATCC#CRL1435)或A172(ATCC#CRL1620)。来自红色和绿色通道的叠加荧光图像显示CM-918和抗TRA-1-60抗体的相同染色重叠，显示两种抗体结合干细胞表面上的相同表位。
实施例4-正常人组织和人癌上CM-918抗体的免疫组织化学(IHC)染色
如下所述进行用CM-918对正常组织和癌症的免疫组织化学染色。使用0至3的分级系统：0表示未观察到染色，1表示局部染色(<5％)；2为中度染色(<50％)；3为强染色(>50％)。由病理学家对染色的组织切片进行评分。在以下癌组织中观察到2或3的染色评分：胰腺癌38个样品中的22个；前列腺癌41个样本中的19个；乳腺癌145个样本中的45个；卵巢癌30个样本中的18个；胃癌8个样本中的8个；结肠癌30个样本中的15个；和肺癌66个样本中的32个。正常人组织中的表达非常有限，几乎所有正常组织中的零表达，包括骨髓和一些胰腺，食道和结肠的轻微局部表达。肾脏在所有样本中具有阳性评分，其中在肾小管中具有约1％的CM-918染色。评分为2的唯一正常组织是甲状旁腺，其中9个样本中的2个具有2-染色评分。结果表明，CM-918在许多不同的癌症中具有膜染色，并且在正常组织中具有非常有限的染色(straining)。
将所有组织在10％缓冲的福尔马林中固定24小时，以5微米切片并置于带正电荷的载玻片上。染色前，将载玻片在60℃下干燥过夜。在二甲苯(Fisher Scientific，Cat#X3P-1GAL)中脱蜡后，将切片通过100％乙醇(Eki-Chem，Cat#4085-1GL)，95％乙醇和70％乙醇(Eki-Chem，Cat#4089-1GL)再水合。然后将切片浸入1X Diva Decloaker(BiocareMedical，Cat#DV2004LX)中，并用Decloaking室(Biocare Medical，型号：NxGen)加热。然后，通过BLOXALL(Vector labs，Cat#SP-6000)和PowerVision Universal IHC Blocking/Dilution(Leica，Cat#BD09-15)阻断切片。将初级抗体以在PBS中2ug/ml的浓度涂布于每个载玻片，在室温下放置1小时。用PBS洗涤后，在室温下施加PowerVision Post Blocking(Leica，Cat#DPVO+15Post)20min。然后将载玻片与PowerVision Poly-HRP抗小鼠/家兔IgG(Leica，Cat#DPVO-15HRP)在室温下温育30min，然后进行DAB(Vector labs，Cat#SK4105)显色反应。将载玻片用苏木精复染(Vector labs，Cat#H-3404)。在不同试剂或抗体的温育之间，用PBS洗涤载玻片。将染色中包括胚胎癌切片以确保组织中靶蛋白表达的技术准确性。在所有平行的测定中，在同种型对照抗体(Biolegend，Cat#401401)存在下进行阴性对照实验。
实施例5-CM-918-抗体-药物-缀合物的细胞生存力(cell viability)剂量响应曲 线
制备CM-919-vc-MMAE抗体药物缀合物：用TCEP在37℃处理CM-918在PBS中的溶液以减少链间二硫键。向反应混合物中加入MC-vc-PAB-MMAE(马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基-单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatine E))的溶液，以使MC-vc-PAB-MMAE的马来酰亚胺部分与CM-918连接。将得到的抗体药物缀合物(ADC)在Sephadex G50柱上脱盐以除去残留的未反应的毒素，并缓冲交换到PBS(pH7.2)中。药物抗体比(DAR)由在248和280nm处的UV吸光度之比确定。进行HIC(疏水相互作用色谱)和SEC(尺寸排阻色谱)分析以确定DAR种类分布。
用不能表达TRA-足糖萼蛋白的多能NCCIT细胞、胚胎干细胞(ESL-017)和对照PCS细胞进行细胞生存力测定：将靶细胞接种入96孔板中，密度为3×103至1×104个细胞/孔(90ul)，并且在5％CO2培养箱中温育24小时。用抗体(每孔10ul)处理细胞如下：开始浓度为100nM，向下半对数稀释，每个浓度6个重复，并且没有抗体处理的最后的孔用作阴性对照。将细胞在5％CO2培养箱中温育24小时至7天。使用前将发光细胞生存力检测试剂(Promega，目录号7572)平衡至室温。在每个孔中加入100ul 试剂，并且在轨道振荡器上混合内容物2分钟，以诱导细胞裂解。使板在室温下温育10分钟以稳定发光信号。在微孔板读数器(Filtermax F5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上记录发光。
细胞生存力测定的结果显示，对于NCCIT细胞，CM-918-vc-MMAE抗体药物缀合物对细胞的IC50杀伤为2.7nM，对于胚胎干细胞为5.6nM，对于对照PC3细胞浓度高达100nM的CM-918-vc MMAE没有观察到影响。与MMAE相同缀合的同种型对照抗体在浓度高达100nM时对所有三种细胞系均无影响。结果表明，CM-918抗体药物缀合物非常有效地杀伤多能胚胎癌细胞和人胚胎干细胞，而不是不表达TRA-足糖萼蛋白的细胞。
实施例6-用药物缀合的CM-919抗体处理的多能NCCIT癌细胞/小鼠异种移植物模 型
向15只裸小鼠皮下注射2×106NCCIT多能癌干细胞，使肿瘤发育成200mm3大小，此时将小鼠分成3组，每组5只小鼠：用盐水注射处理5只小鼠4次；用CM-vc-MMAE以3mg/kg，Q4Dx4处理5只小鼠；用同种型抗体对照-vc-MMAE以3mg/kg，Q4Dx4处理最后5只。结果显示，在35天结束时，注射盐水和同种型对照注射的小鼠均具有平均大小为1000mm3的肿瘤。在药物缀合的CM-918抗体处理小鼠中，5只小鼠中的4只没有可检测到的肿瘤，1只小鼠具有约25mm3的肿瘤。如同CM-918一样，与MMAE缀合的同种型对照抗体显示出与平均肿瘤大小为1000mm3的盐水处理小鼠相似的结果。结果表明，CM-919-vc-MMAE抗体药物缀合物在治疗小鼠多能癌干细胞瘤方面是有效的(effective)和有效力的(potent)。
实施例7-使用CM-918抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性测定(ADCC)
使用CM-918抗体对多能癌NCCIT细胞的ADCC测定显示12-15％的细胞毒性，且CM-918ADCC活性对不表达TRA-足糖萼蛋白的对照细胞具有2％的细胞毒性。对照IgG抗体对NCCIT细胞具有2％的细胞毒性。结果表明，CM-918抗体对表达TRA-足糖萼蛋白的多能癌细胞具有ADCC活性。
通过使用Ficoll梯度从健康供体的血液中纯化人PBMC。将靶细胞以1×104/孔接种到96孔板中，并与新鲜分离的PBMC以E：T＝25：1或50：1在37℃温育4h。将测试抗体和IgG-Fc对照抗体的浓度固定在190nM。共温育后，用LDH测定法测量细胞的细胞毒性。通过背景减去效应子和靶细胞(无抗体)对照的吸光度值，并且仅将靶细胞(自发裂解)按比例调整为0％并且仅裂解靶细胞(最大裂解)按比例调整为100％来计算靶细胞的细胞毒性百分比。
实施例#8–使用CM-918抗体的补体依赖性细胞毒性测定(CDC)
进行CDC测定，且使用100nM CM-918抗体显示NCCIT多能癌干细胞具有18％的细胞毒性，而使用10nM CM-918抗体具有10％细胞毒性。使用100nM对照抗体的CDC测定中NCCIT细胞的细胞毒性的结果具有<1％的细胞毒性。这些结果表明，CM-918抗体可以对质膜细胞表面表达TRA-足糖萼蛋白的多能癌干细胞引发CDC活性。
将人补体与104个靶细胞以1：4体积比以96孔形式温育。从190nM开始，以10-点半对数稀释系列加载测试抗体。IgG-Fc对照抗体仅加入190nM。将抗体与靶细胞和补体在37℃共温育4h。共温育后，用LDH测定法(Roche)测量细胞的细胞毒性。通过背景减去补体和靶细胞(无抗体)对照的吸光度值，并且仅将靶细胞(自发裂解)按比例调整为0％并且仅裂解靶细胞(最大裂解)按比例调整为100％来计算靶细胞细胞毒性百分比。
序列表
<110> SCHOPPERLE, WILLIAM MICHAEL
TAN, EDWIN SAAVEDRA
JU, YAWEN
HOLMQVIST, MATS HARALD
TAK, YOUNGBIN
HOLMQVIST, AN MARY
<120> 足糖萼蛋白和TRA-相关抗体、制备方法和作为抗癌治疗剂的用途
<130> 302977-00042-1
<140>
<141>
<150> 62/307,690
<151> 2016-03-14
<160> 6
<170> MICROSOFT WORD
<210> SEQ ID NO 1
<211> 长度: 8
<212> 类型: PRT
<213> 生物: 小鼠
<400> 序列: 1
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr
1 5
<210> SEQ ID NO 2
<211> 长度: 10
<212> 类型: PRT
<213> 生物: 小鼠
<400> 序列: 2
Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Tyr Thr Thr
1 5 10
<210> SEQ ID NO 3
<211> 长度: 11
<212> 类型: PRT
<213> 生物: 小鼠
<400> 序列: 3
Ala Arg Asp Gly Trp Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> SEQ ID NO 4
<211> 长度: 11
<212> 类型: PRT
<213> 生物: 小鼠
<400> 序列: 11
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> SEQ ID NO 5
<211> 长度: 3
<212> 类型: PRT
<213> 生物: 小鼠
<400> 序列: 3
Lys Val Ser
1
<210> SEQ ID NO 6
<211> 长度: 9
<212> 类型: PRT
<213> 生物: 小鼠
<400> 序列: 9
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5

Claims (14)

1.单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链和轻链，其中重链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NOS.1-3的氨基酸序列，并且轻链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NOS.4-6的氨基酸序列。
2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段是重组抗体。
3.权利要求2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重组抗体选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
4.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双抗体、dsFv和包含CDR的肽。
5.单克隆抗体或其抗原结合片段，包含重链和轻链，其中重链互补决定区1-3分别具有与SEQ ID NOS.1-3的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性，并且轻链互补决定区1-3分别具有SEQ ID NOS.4-6的氨基酸序列。
6.权利要求5的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中轻链互补决定区1-3分别具有与SEQ ID NOS.4-6的氨基酸序列至少80％的氨基酸序列相似性。
7.权利要求5的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段是重组抗体。
8.权利要求7的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重组抗体选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
9.权利要求5的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双抗体、dsFv和包含CDR的肽。
10.抗癌治疗剂，包含权利要求1的单克隆抗体或抗原结合片段。
11.权利要求10的抗癌治疗剂，其中所述治疗剂是组合物形式，所述组合物形式还包含选自药学上可接受的接头、有效负载及其组合的组分。
12.权利要求10的抗癌治疗剂，其中所述治疗剂是组合物形式，所述组合物形式还包含药物以形成抗体-药物-缀合物。
13.权利要求10的抗癌治疗剂，其中所述治疗剂靶向、选择和消除来自来源于胚胎干细胞的分化细胞的胚胎干细胞。
14.权利要求10的抗癌治疗剂，其中所述治疗剂靶向癌细胞，所述癌细胞选自胃癌、胰腺癌、食道癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的细胞。
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