TW202207992A - 靶向egfr及muc1之雙特異性抗體藥物結合物及其用途 - Google Patents

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曉凡 李
萊恩 斯塔福德
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Abstract

本發明提供包含雙特異性抗MUC1/EGFR抗體經由可裂解連接子與基於哈米特林(hemiasterlin)之部分結合之免疫結合物，及其醫藥組合物。本發明亦提供使用此類免疫結合物及醫藥組合物治療癌症之方法。

Description

靶向EGFR及MUC1之雙特異性抗體藥物結合物及其用途
本發明之領域係分子生物學、免疫學及腫瘤學。更特定而言，該領域係治療性抗體藥物結合物。
表皮生長因子受體(EGFR；亦稱為ErbB1)係若干上皮癌中過度表現之跨膜蛋白質。包括缺失突變、點突變、插入突變及基因擴增之一些EGFR突變已與癌症相關。一些EGFR突變以及EGFR過度表現係與不良預後及/或針對靶向EGFR抑制劑及其他受體酪胺酸激酶抑制劑之抗性相關。最近已報導若干導致抗EGFR療法失敗之新穎途徑，突出顯示了抗EGFR療法之挑戰。
此外，EGFR基本表現於全身之正常組織中。因此，靶向EGFR之抗體療法可導致非所需脫靶效應及提高之毒性。
儘管目前取得成就，但仍需要改良之抗癌療法。
本發明提供新穎雙特異性抗體藥物結合物，其解決使用一些抗EGFR療法時所觀測到之效用缺失及腫瘤選擇性缺失之問題。
在一個態樣中，提供包含以下之結合物：(a)與EGFR及MUC1結合之雙特異性抗體及(b)複數個哈米特林(hemiasterlin)部分。雙特異性抗體包含：(i)包含第一工程改造Fc域及單鏈Fv (scFv)之第一多肽，其中scFv與MUC1結合，(ii)包含第二工程改造Fc域及Fab片段之重鏈之第二多肽，及(iii)包含Fab片段之輕鏈之第三多肽；其中第二及第三多肽鏈共同界定結合EGFR之Fab片段。第一多肽與第二多肽係藉由第一工程改造Fc域與第二工程改造Fc域之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接。第二多肽與第三多肽係藉由第二多肽之重鏈與第三多肽之輕鏈之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接。免疫結合物亦包含(b)複數個哈米特林部分，例如，四個哈米特林部分。第一多肽及第二多肽各自包含至少一個非天然胺基酸殘基，且各哈米特林部分係經由連接子獨立地與第一多肽或第二多肽之非天然胺基酸殘基中之一者結合。
在特定實施例中，第一工程改造Fc域不同於第二工程改造Fc域。舉例而言，第一及第二工程改造Fc域各自包含股交換工程改造域，其可例如包含人類IgA及IgG恆定重鏈-3 (CH 3)序列之交替區段。
在特定實施例中，第一工程改造Fc域包含兩個非天然胺基酸殘基，其例如根據EU索引位於重鏈位置F241及F404處。在一些實施例中，第一工程改造Fc域包含不超過兩個非天然胺基酸殘基。
在特定實施例中，第二工程改造Fc域包含例如根據EU索引位於重鏈位置F241處之非天然胺基酸殘基。在一些實施例中，第二工程改造Fc域包含不超過一個非天然胺基酸殘基。
在特定實施例中，Fab片段包含非天然胺基酸殘基。在一些實施例中，第二多肽內之Fab片段之重鏈包含例如根據EU索引位於重鏈位置Y180處之非天然殘基。在一些實施例中，Fab片段包含不超過一個非天然胺基酸殘基。在一些實施例中，第二多肽內之Fab片段之重鏈包含根據EU索引位於重鏈位置Y180處之非天然胺基酸殘基。
在特定實施例中，至少一個非天然胺基酸殘基中之各者係選自由以下組成之群：對乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對碘苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對丙炔基氧基苯丙胺酸及對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸。在特定實施例中，至少一個非天然胺基酸殘基中之各者係對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)。
在特定實施例中，雙特異性抗體經無醣基化。
在特定實施例中，第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:7中所列出之胺基酸序列之CDR-L1； 包含SEQ ID NO:8中所列出之胺基酸序列之CDR-L2；及 包含SEQ ID NO:9中所列出之胺基酸序列之CDR-L3。
在特定實施例中，第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:4中所列出之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO:5中所列出之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO:6中所列出之胺基酸序列之CDR-H3。
在特定實施例中，第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： (a) (i)包含SEQ ID NO:29中所列出之胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:30中所列出之胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:31中所列出之胺基酸序列之CDR-H3；或 (b) (i)包含SEQ ID NO:32中所列出之胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:33中所列出之胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:34中所列出之胺基酸序列之CDR-H3。
在特定實施例中，第一多肽包含：(a)包含SEQ ID NO:41中所列出之胺基酸序列之重鏈可變(VH)區；及(b)包含SEQ ID NO:43中所列出之胺基酸序列之輕鏈可變(VL)區。
在特定實施例中，第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： (a) (i)包含SEQ ID NO:35中所列出之胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:36中所列出之胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:37中所列出之胺基酸序列之CDR-H3；或 (b) (i)包含SEQ ID NO:38中所列出之胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:39中所列出之胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:40中所列出之胺基酸序列之CDR-H3。
在特定實施例中，第一多肽包含： (a)包含SEQ ID NO:42中所列出之胺基酸序列之重鏈可變(VH)區；及(b)包含SEQ ID NO:43中所列出之胺基酸序列之輕鏈可變(VL)區。
在特定實施例中，第二多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:13中所列出之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO:14中所列出之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO:15中所列出之胺基酸序列之CDR-H3。
在特定實施例中，第三多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:16中所列出之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO:17中所列出之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO:18中所列出之胺基酸序列之CDR-L3。
在一些實施例中，第一多肽具有與SEQ ID NO:1中所列出之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽具有如SEQ ID NO:11中所列出之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽具有與SEQ ID NO:2中所列出之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽具有如SEQ ID NO:12中所列出之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽具有與SEQ ID NO:3中所列出之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽具有如SEQ ID NO:3中所列出之胺基酸序列。
在特定實施例中，連接子係例如纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄醇(PABA)之可裂解連接子。
在特定實施例中，哈米特林部分係例如3-胺基苯基-哈米特林之哈米特林衍生物。
在特定實施例中，免疫結合物包含以下結構：
Figure 02_image003
，
其中n係4。
在特定實施例中，提供包含以下之免疫結合物： (a)與EGFR及MUC1結合之雙特異性抗體，雙特異性抗體包含： (i)包含第一工程改造Fc域及單鏈Fv片段(scFv)之第一多肽，其中scFv與MUC1結合，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，該序列包含根據EU索引位於重鏈位置F241及F404處之非天然胺基酸殘基， (ii)包含第二工程改造Fc域及Fab片段之重鏈之第二多肽，第二多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，該序列包含根據EU索引位於位置Y180及F241處之非天然胺基酸殘基，及 (iii)包含Fab片段之輕鏈之第三多肽，第三多肽包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列； 其中第二及第三多肽鏈共同界定結合EGFR之Fab片段， 其中第一多肽與第二多肽係藉由第一工程改造Fc域與第二工程改造Fc域之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接，及 其中第二多肽與第三多肽係藉由第二多肽之重鏈與第三多肽之輕鏈之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接；及 (b)複數個3-胺基苯基哈米特林部分，其各自獨立地經由可裂解纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄醇連接子與非天然胺基酸殘基中之一者結合。
在特定實施例中，免疫結合物包含四個3-胺基苯基哈米特林部分。在特定實施例中，各非天然胺基酸係對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)。
在另一態樣中，提供包含如本文所揭示之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在另一態樣中，提供治療癌症之方法，其包含以下步驟：將治療有效量之本文所揭示之免疫結合物或醫藥組合物投與至有需要之哺乳動物個體，例如人類哺乳動物個體及/或診斷患有癌症之個體。
在特定實施例中，癌症包含實性瘤。舉例而言，癌症可選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、食道癌、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，癌症係乳癌，例如三陰性乳癌。在一些實施例中，癌症係肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)，諸如包含腺癌及/或鱗狀細胞癌之NSCLC。在一些實施例中，癌症係食道癌，例如鱗狀食道癌。在一些實施例中，癌症係頭頸癌，例如頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。在一些實施例中，癌症係卵巢癌。在一些實施例中，癌症係胃癌。在一些實施例中，癌症係間皮瘤。在一些實施例中，實性瘤係轉移性的。
在特定實施例中，癌症包含非實性瘤，例如多發性骨髓瘤。
在特定實施例中，癌症包含EGFR之野生型細胞。舉例而言，癌症可主要包含EGFR之野生型細胞。在特定實施例中，癌症包含EGFR之變體細胞。舉例而言，癌症可主要包含EGFR之變體細胞。在特定實施例中，癌症包含表現高量之EGFR之細胞。舉例而言，癌症可主要包含表現高量之EGFR之細胞。在特定實施例中，癌症包含表現低量或中等量之EGFR之細胞。舉例而言，癌症可主要包含表現低量或中等量之EGFR之細胞。在特定實施例中，癌症包含表現高量之MUC1之細胞。舉例而言，癌症可主要包含表現高量之MUC1之細胞。在特定實施例中，癌症包含表現低量或中等量之MUC1之細胞。舉例而言，癌症可主要包含表現低量或中等量之MUC1之細胞。
在特定實施例中，向哺乳動物個體投與免疫結合物之步驟包含藉由例如靜脈內途徑或皮下途徑之全身途徑投與。
視情況，在向哺乳動物個體投與免疫結合物後，腫瘤生長相對於參考水準消減。舉例而言，在向哺乳動物個體投與免疫結合物後，腫瘤生長可部分或完全消退。
在特定實施例中，投與步驟包含投與至少兩個劑量的免疫結合物，其中至少兩個劑量共同包含治療有效量。在特定實施例中，投與步驟包含投與包含治療有效量之單劑量的免疫結合物。
在前述實施例中之任一者中，第一多肽之scFv可與序列包含TRPAP (SEQ ID NO:27)之MUC1表位結合。
相關申請案之交叉引用
本申請案要求2020年6月3日申請之美國臨時專利申請案第63/034,296號之權益及優先權，該文獻之全部內容係出於所有目的以其全文引用方式併入於此。
I型跨膜醣蛋白MUC1表現於許多癌細胞上，且亦表現於一些正常細胞中。在腫瘤細胞中，MUC1與EGFR集中在一起並相互作用，且其相互作用阻礙配體激活之EGFR分解。本文揭示之雙特異性抗體藥物結合物同時靶向MUC1及EGFR。藉由使用相同抗體同時靶向MUC1及EGFR，本文揭示之免疫結合物不僅提昇抗體內化及腫瘤生長抑制或腫瘤生長消減，其亦實現針對癌細胞之更高結合特異性，其可由此減小對正常細胞之影響。
本文揭示之雙特異性抗MUC1/EGFR抗體藥物結合物(ADC)在一系列癌症中呈現治療效用，效用隨組織類型、MUC1及EGFR之表現模式及EGFR突變狀態而變化。此外，在各種來自非小細胞肺癌(NSCLC)患者之異種移植物模型中，相較於單特異性ADC，本文揭示之雙特異性抗MUC1/EGFR ADC呈現更佳腫瘤生長抑制或消減作用。
定義 如本文所用，在關於數值在本文中使用術語「約」、「大約」及「接近」時，該等術語係指在該提及之數值的情況下與提及之數值相似的值。一般而言，熟習情況之一般技術者應理解由該情況下之「約」、「大約」及「接近」所涵蓋之相關差異度。舉例而言，在一些實施例中，術語「約」、「大約」及「接近」可涵蓋25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或所提及之數值的更小值內的一系列值。
如本文所用，「抗體」係指多肽，其胺基酸序列包括與指定抗原或其片段特異性結合之免疫球蛋白及其片段。本發明之抗體可屬於任何類型(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或亞型(例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。一般熟習此項技術者應理解抗體之特徵序列或部分可包括存在於抗體之一或多個區(例如，可變區、高變區、恆定區、重鏈、輕鏈及其組合)中的胺基酸。此外，一般熟習此項技術者應理解抗體之特徵序列或部分可包括一或多個多肽鏈，且可包括存在於同一多肽鏈中或不同多肽鏈中之序列要素。
抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」包含完整抗體之一部分，該部分仍能夠結合抗原。通常，該部分包含抗體之可變區。抗體消化木瓜酶，產生兩種稱為「Fab」片段及剩餘「Fc」片段之相同抗原結合片段，該名稱反映迅速結晶之能力。Fab片段係由整條輕鏈以及重鏈之可變區域(VH )及一條重鏈之第一恆定域(CH 1)組成。各Fab片段就抗原結合而言係單價的，亦即，其具有單一抗原結合位點。抗體處理胃蛋白酶，產生單個較大F(ab')2 片段，該片段大致相當於兩個經二硫化物連接之具有不同抗原結合活性且仍能夠與抗原交聯之Fab片段。Fab'片段因在CH 1域之羧基末端處具有幾個額外殘基而不同於Fab片段，殘基包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH表示其中恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基之Fab'。F(ab')2 抗體片段起初係其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對。亦已知抗體片段之其他化學偶合。
Fc片段包含由二硫化物結合在一起之兩個重鏈之羧基末端部分。抗體之效應物功能係由Fc區中之序列決定，該區亦由在某些類型之細胞上所發現之Fc受體(FcR)識別。
如本文所用，「多肽」係指一串藉由肽鍵互相附接之至少兩個胺基酸。在一些實施例中，多肽可以包括至少3-5個胺基酸，該等胺基酸各自藉助於至少一個肽鍵與其他胺基酸連接。一般熟習此項技術者應理解，多肽可包括一或多個能夠整合至多肽鏈中之「非天然」胺基酸或其他實體。在一些實施例中，多肽可經糖基化，例如，多肽可含有一或多個共價連接糖部分。在一些實施例中，單一「多肽」 (例如，抗體多肽)可包含兩個或更多個個別多肽鏈，其可在一些情況下例如藉由一或多個雙硫鍵或其他方式彼此間連接。
如本文所用，短語「參考水準」一般指代出於比較目的稱為「正常」之水準，例如，合適對照物之水準。舉例而言，在腫瘤生長抑制或消減之情況下，「參考水準」可指代不接受相關治療劑之個體中所預期之腫瘤生長水準(例如，在向個體投與相關治療劑前，個體中之腫瘤生長水準，或不接受相關治療劑之另一個體中之腫瘤生長水準)或接受治療(例如，當前標準護理)而非相關治療劑之個體中所預期之腫瘤生長水準。可同時測定或可預測參考水準，例如，自先前觀察結果得知或推導。
如本文所用，短語「治療有效量」與「有效量」可互換使用，且指代給藥且持續必要時間段以實現所需治療結果之有效量。治療有效量可隨諸如以下之因素而改變：疾病之類型(例如，癌症)、疾病狀態、個體之年齡、性別及/或重量及免疫結合物(或其醫藥組合物)在個體中引發所需反應之能力。有效量亦可為治療有益效果超過免疫結合物或其醫藥組合物之任何毒性或有害效果之量。
如本文所用，「治療」病況或病況之「治療」 (例如，本文所述之病況，諸如癌症)係用於獲得諸如臨床結果之有益或所需結果之途徑。有益或所需結果可包括(但不限於)減輕或改善一或多種症狀或病況；減小疾病、病症或病況之程度；穩定疾病、病症或病況之狀態(亦即，不惡化)；防止疾病、病症或病況(例如，原發性癌症及/或次發性轉移)之擴散；延遲或減緩疾病、病症或病況之進展；改善或緩和疾病、病症或病況；及緩解(部分或完全)，不論可偵測或不可偵測。「緩和」疾病、病症或病況意謂相較於不存在治療下的程度或時程，疾病、病症或病況之程度及/或非所需臨床表現減輕及/或進展之時程減緩或拉長。
免疫結合物 雙特異性抗 MUC1/EGFR 抗體 包含本發明之雙特異性抗MUC1/EGFR抗體之免疫結合物通常包含(i)包含第一工程改造Fc域及單鏈Fv (scFv)之第一多肽，其中scFv與MUC1結合；(ii)包含第二工程改造Fc域及Fab片段之重鏈之第二多肽，及(iii)包含Fab片段之輕鏈之第三多肽，其中第二及第三多肽鏈共同界定結合EGFR之Fab片段。
如本文所用，術語「Fc域」係指免疫球蛋白之CH 2域及CH 3域。因此，兩個Fc域之同二聚體或異二聚體係Fc片段。可就以下意義對本發明所用之Fc域進行工程改造：其(1)包含工程改造之CH 3域(如本文所述)及/或(2)包含一或多個非天然胺基酸。
如本文所用，術語「scFv」係根據本領域中該術語之一般用途使用以指代其中來自抗體之VH 域與VL 域通常經由連接子連接之單鏈。
如本文所用，術語「Fab片段」係根據本領域中該術語之一般用途使用。Fab片段通常包含整條輕鏈(VL 及CL 1域)、重鏈之可變區域(VH )及一條重鏈之第一恆定域(CH 1)。
通常，第一及第二多肽各自包含至少一個位於預定位點或欲用於結合之位點處之非天然胺基酸。非天然胺基酸可位於例如Fc域中、位於Fab域之重鏈中或位於二者中。合適非天然胺基酸之非限制性實例包括對乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對碘苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對丙炔基氧基苯丙胺酸及對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(參見例如，美國專利第9,732,161號)。在一些實施例中，非天然胺基酸係對疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)。
在第一多肽中，工程改造Fc域可融合至scFv，例如，在工程改造Fc域之CH 2域與scFv之VH 域之間插入鉸鏈區。在一些實施例中，第一多肽具有與SEQ ID NO:1中所列出之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。舉例而言，第一多肽可具有與SEQ ID NO:11中所列出之胺基酸序列100%相同之胺基酸序列。
在第二多肽中，工程改造Fc域可融合至Fab之重鏈，例如，在工程改造Fc域之CH2域與Fab片段之CH1域之間插入鉸鏈區。在一些實施例中，第二多肽具有與SEQ ID NO:2中所列出之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。舉例而言，第二多肽可具有與SEQ ID NO:12中所列出之胺基酸序列100%相同之胺基酸序列。
在一些實施例中，第三多肽具有與SEQ ID NO:3中所列出之胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽具有與SEQ ID NO:3中所列出之胺基酸序列100%相同之胺基酸序列。
通常，第一多肽與第二多肽係藉由第一工程改造Fc域與第二工程改造Fc域之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接。第二多肽與第三多肽通常亦藉由第二多肽之重鏈與第三多肽之輕鏈之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接。
在一些實施例中，第一多肽之scFv與序列包含TRPAP (SEQ ID NO:27)之MUC1表位結合。
在一些實施例中，雙特異性抗體係使用如(例如)美國專利第8,891,912號及第9,505,848號中所述之基於股交換工程改造域(SEED)之CH 3異二聚體平台製造。在此平台中，各SEED-CH 3域包含人類IgA及IgG序列之交替區段。「AG SEED」係指在N末端具有IgA1序列區段之CH 3域，而「GA seed」係指在N末端具有IgG1序列區段之CH 3。SEED體抗體之各Fc異二聚體包含與GA SEED配對之AG SEED。
在針對雙特異性抗MUC1/EGFR抗體之各鏈(例如，第一多肽、第二多肽及第三多肽)設計結構物時，亦可出於在待用作結合位點之特定位點處引入(如本文所論述之)非天然胺基酸之目的對結構物進行誘變處理。可使用本領域中已知的各種表現系統中之任一者表現此等結構物。
在一些實施例中，使用無細胞系統製造雙特異性抗MUC1/EGFR抗體。雙特異性抗MUC1/EGFR抗體可具有反映其製造方法之某些特徵。舉例而言，無細胞系統中所製造之抗體可經無醣基化且可缺乏效應物功能。
在經歷諸如結合之其他步驟前，可視情況純化雙特異性抗MUC1/EGFR抗體。
哈米特林 (Hemiasterlin) 部分及分子 哈米特林係分離自與微管蛋白上之長春花結合位點結合之海綿體的三肽。哈米特林可由此抑制或減少微管蛋白聚合，該聚合可引發有絲分裂停滯及細胞凋亡。如本文所用，術語「哈米特林分子」係指哈米特林或保留哈米特林之至少一些功能(例如，結合微管蛋白)的哈米特林衍生物。術語「哈米特林部分」係指已與另一分子結合之哈米特林分子。在一些實施例中，哈米特林衍生物係3-胺基苯基-哈米特林。
如本文進一步所述，每免疫結合物之哈米特林部分之數目可藉由使用位點特異性結合方法控制，在該方法中，哈米特林部分係與在雙特異性抗體之鏈內的特定位點處插入之非天然胺基酸結合(參見例如，國際專利申請案WO 2019/055931)。
在一些實施例中，各免疫結合物具有複數個哈米特林部分，例如2個、3個、4個、5個、6個哈米特林部分。在特定實施例中，免疫結合物含有四個哈米特林部分。
結合及連接子 可使用官能化連接子-藥物分子進行結合反應，其中連接子係可裂解連接子。可用特定官能化基團使用無銅點擊化學反應。在一些實施例中，藉由使雙特異性抗MUC1/EGFR抗體與結構繪示於圖1A中之SC239連接子-藥物分子反應以生成免疫結合物。SC239包含3-胺基苯基-哈米特林及可裂解纈胺酸瓜胺酸對胺基苄醇(Val-Cit-PABA)連接子，該連接子係使用二苯并環辛炔(DBCO)官能化(參見例如，WO 2019/0055931 A1)。
結合位點 通常，在可用於結合一或多個例如哈米特林部分之部分之位點處將非天然胺基酸殘基併入第一、第二或第三多肽中。因此，非天然胺基酸殘基之位置可與結合位點對應。
在一些實施例中，第一工程改造Fc域包含兩個非天然胺基酸殘基，其例如根據EU索引位於重鏈位置F241及F404處。在一些實施例中，第一工程改造Fc域包含不超過兩個非天然胺基酸殘基。
在一些實施例中，第一多肽上之單鏈scFv包含例如根據EU索引位於位置S7、T22或其組合處之重鏈可變域內的非天然胺基酸殘基。
在一些實施例中，第二工程改造Fc域包含例如根據EU索引位於重鏈位置F241處之非天然胺基酸殘基。在一些實施例中，第二工程改造Fc域包含不超過一個非天然胺基酸殘基。
在一些實施例中，Fab片段包含非天然胺基酸殘基。在一些實施例中，第二多肽內之Fab片段之重鏈包含例如根據EU索引位於重鏈位置S136、Y180、S190或其組合處之非天然殘基。在一些實施例中，Fab片段包含不超過一個非天然胺基酸殘基。在一些實施例中，第二多肽內之Fab片段之重鏈包含根據EU索引位於重鏈位置Y180處之非天然胺基酸殘基。
例示性結合物 在特定實施例中，結合物具有式II中所示之結構：
Figure 02_image005
，式 II 其中n大於1。在一些實施例中，n係至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或更大。在一些實施例中，n係2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，n係4。
醫藥組合物 在特定實施例中，所提供之免疫結合物係與一或多種醫藥學上可接受之載劑一同併入適用於投與至個體之醫藥組合物中。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」係指生理上可兼容之各種溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、張力劑及吸收延遲劑及類似試劑中之任一者。醫藥學上可接受之載劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物，以及其組合。
在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種張力劑或穩定劑。該等張力劑或穩定劑之非限制性實例包括糖(例如，蔗糖)、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。
在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種增積劑及/或凍乾保護劑(例如，甘露醇或甘胺酸)、緩衝劑(例如，磷酸鹽、乙酸鹽或組胺酸緩衝劑)、界面活性劑(例如，聚山梨醇酯)、抗氧化劑(例如，甲硫胺酸)及/或金屬離子或螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))。
在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑(例如，苄醇)或緩衝劑，其可提昇本文揭示之免疫結合物之儲存壽命及/或效用。
醫藥組合物可以各種形式中之任一者存在。此等形式包括例如，液體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如，可注射溶液及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。特定形式之適用性可取決於投與及治療應用之所需模式。
在一些實施例中，醫藥組合物係呈可注射溶液或可輸注溶液形式。
醫藥組合物通常在製造、運輸及儲存條件下係無菌且穩定的。可將醫藥組合物調配為例如溶液、微乳劑、懸浮液、脂質體或其他有序結構。在一些實施例中，將醫藥組合物調配為尤其適用於高藥物濃度之結構。舉例而言，可藉由以下製備無菌可注射溶液：將治療劑(例如免疫結合物)以所需量併入具有一種本文列出之成分或該等成分組合的合適溶劑中，隨後視情況殺菌(例如過濾殺菌)。通常，可藉由以下製備分散液：將免疫結合物併入無菌媒劑中，該媒劑含有鹼性分散介質及其他成分，諸如本文提及之該等其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑的情況下，製備方法之實例包括真空乾燥及冷凍-乾燥，以例如自其先前殺菌-過濾之溶液生成免疫結合物與任何其他所需成分之粉劑。
溶液之合適流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由維持特定粒徑(例如在分散液之情況下)及/或藉由使用界面活性劑維持。可注射組合物之延長吸收可例如藉由將延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及/或明膠)包括於組合物中而達成。
治療之方法 本文揭示之治療癌症之方法通常包含向有需要之哺乳動物個體(例如人類個體)投與治療有效量之本發明之免疫結合物(或其醫藥組合物)的步驟。在一些實施例中，個體經診斷患有癌症。
可經由單劑或經由多劑(例如，至少兩劑、至少三劑、至少四劑、至少五劑、至少六劑、至少七劑、至少八劑、至少九劑或至少十劑)投與治療有效量。當經由多劑投與時，可使用各種合適治療方案中之任一者，包括以規律間隔投與(例如，每兩日一次、每三日一次、每四日一次、每五日一次、每週三次、每週兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次等)。
治療方法中有效之劑量方案(例如，各治療劑之量、相對治療時機等)可取決於疾病或病況之嚴重度及個體之重量及總體狀態。舉例而言，可考慮哺乳動物之年齡、重量及病況之個別差異藉由一般技術者決定施用於哺乳動物(例如，人類)之包含治療劑之治療有效量的特定組合物。亦可由熟習此項技術者憑藉經驗確定治療有效量及/或最佳量。在一些實施例中，向個體投與每3日0.4 mg/kg與每3日20 mg/kg之間的劑量。可藉由各種合適途徑中之任一者投與免疫結合物及其醫藥組合物，該等途徑包括(但不限於)諸如非經腸之全身途徑(例如，靜脈內或皮下)或腸內途徑。
在特定實施例中，個體經診斷患有癌症。
癌症 在一些實施例中，癌症包含實性瘤。舉例而言，癌症可選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、食道癌、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌及胃癌。在一些實施例中，癌症係乳癌，例如三陰性乳癌。在一些實施例中，癌症係肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)，諸如包含腺癌及/或鱗狀細胞癌之NSCLC。在一些實施例中，癌症係食道癌，例如鱗狀食道癌。在一些實施例中，癌症係頭頸癌，例如頭頸鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。在一些實施例中，癌症係卵巢癌。在一些實施例中，癌症係胃癌。在一些實施例中，癌症係間皮瘤。在一些實施例中，實性瘤係轉移性的。
在一些實施例中，癌症包含非實性瘤，例如多發性骨髓瘤。
在一些實施例中，癌症包含EGFR之野生型基因型之細胞。
在一些實施例中，癌症包含表現EGFR之突變形式的細胞。與癌症相關之EGFR突變之實例包括(但不限於)缺失突變(例如，外顯子19缺失)、點突變(例如，L858R突變)、插入突變(例如，外顯子20插入)及基因擴增。一些EGFR突變導致EGFR表現量改變，例如，EGFR之過度表現。一些EGFR突變係與不良預後及/或針對靶向EGFR抑制劑之抗性相關。
在一些實施例中，癌症包含MUC1之野生型基因型之細胞。
在一些實施例中，癌症包含表現MUC1之突變形式的細胞。與癌症相關之MUC1突變之實例包括(但不限於)點突變(例如，T112P)。一些MUC1突變導致MUC1表現量改變，例如，MUC1之過度表現，其已與一些癌症之不良預後相關。
癌細胞之特徵可為具有低/中等或高EGFR表現量以及低/中等或高MUC1表現量(例如，低/中等量之EGFR及低/中等量之MUC1；高量之EGFR及低/中等量之MUC1；低/中等量之EGFR及高量之MUC1；及高量之EGFR及高量之MUC1)。與基因產物之低、中等或高量(包括過度表現)對應之數值量可視特定基因產物而改變且可藉由各種方式中之任一者評估，諸如表面表現之評估(例如，藉由FACS之細胞表面染色)、藉由IHC之蛋白質表現、轉錄量(例如，藉由RNASeq或qPCR)等。
在一些實施例中，表現「高量之MUC1」之癌細胞係以特徵係以下中之一或多者之量表現MUC1之癌細胞：(1)中值螢光強度(MFI)比(MFI抗MUC1抗體/MFI同型)大於200 (例如，如藉由FACS所測定，例如，如實例7中所述)；(2)與在WISH細胞之標準細胞培養條件下生長之WISH (子宮頸癌)細胞所表現之量相近或更高；及(3)高於OVCAR-3 (卵巢癌)細胞之標準細胞培養條件下生長之OVCAR-3細胞所表現之量。
在一些實施例中，表現「中等量之MUC1」之癌細胞係以特徵係以下中之一或多者之量表現MUC1之癌細胞：(1)中值螢光強度(MFI)比(MFI抗MUC1抗體/MFI同型)大於100但不超過200 (例如，如藉由FACS所測定，例如，如實例7中所述)；(2)與在OVCAR-3細胞之標準細胞培養條件下生長之OVCAR-3細胞所表現之量相近；及(3) (i)高於MDA-MD-468 (乳癌)細胞之標準細胞培養條件下生長之MDA-MD-468細胞所表現之量，及(ii)低於WISH細胞之標準細胞培養條件下生長之WISH細胞所表現之量。
在一些實施例中，表現「低量之MUC1」之癌細胞係以特徵係以下中之一或多者之量表現MUC1之癌細胞：(1)中值螢光強度(MFI)比(MFI抗MUC1抗體/MFI同型)至多係100 (例如，如藉由FACS所測定，例如，如實例7中所述)；(2)與在MDA-MD-468細胞之標準細胞培養條件下生長之MDA-MD-468細胞所表現之量相近或更低；(3)低於在OVCAR-3細胞之標準細胞培養條件下生長之OVCAR-3細胞所表現之量；(4)與NCI-H292 (非小細胞肺癌)細胞所表現之量相近或更低；(5)與HCC827 (非小細胞肺癌)細胞所表現之量相近或更低；及(6)與NCI-H1975 (非小細胞肺癌)細胞所表現之量相近或更低。
在一些實施例中，表現「高量之EGFR」之癌細胞係以特徵係以下中之一或多者之量表現EGFR之癌細胞：(1)中值螢光強度(MFI)比(MFI抗EGFR抗體/MFI同型)大於200 (例如，如藉由FACS所測定，例如，如實例7中所述)；(2)與在MDA-MD-468細胞之標準細胞培養條件下生長之MDA-MD-468細胞所表現之量相近或更高；(3)與在HCC827 (非小細胞肺癌)細胞之標準細胞培養條件下生長之HCC827細胞所表現之量相近或更高；及(4)高於在NCI-H292 (非小細胞肺癌)細胞之標準細胞培養條件下生長之NCI-H292細胞所表現之量。
在一些實施例中，表現「中等量之EGFR」之癌細胞係以特徵係以下中之一或多者之量表現EGFR之癌細胞：(1)中值螢光強度(MFI)比(MFI抗EGFR抗體/MFI同型)大於100但不超過200 (例如，如藉由FACS所測定，例如，如實例7中所述)；(2)與在NCI-H292細胞之標準細胞培養條件下生長之NCI-H292細胞所表現之量相近；(3) (i)高於在WISH細胞之標準細胞培養條件下生長之WISH細胞所表現之量，及(ii)低於在MDA-MD-468細胞之標準細胞培養條件下生長之MDA-MD-468細胞所表現之量；(4) (i)高於在OVCAR-3細胞之標準細胞培養條件下生長之OVCAR-3細胞所表現之量，及(ii)低於在MDA-MD-468細胞之標準細胞培養條件下生長之MDA-MD-468細胞所表現之量；及(5) (i)高於在NCI-H1975 (非小細胞肺癌)細胞之標準細胞培養條件下生長之NCI-H1975細胞所表現之量，及(ii)低於在HCC827細胞之標準細胞培養條件下生長之HCC827細胞所表現之量。
在一些實施例中，表現「低量之EGFR」之癌細胞係以特徵係以下中之一或多者之量表現EGFR之癌細胞：(1)中值螢光強度(MFI)比(MFI抗EGFR抗體/MFI同型)至多係100 (例如，如藉由FACS所測定，例如，如實例7中所述)；(2)與在WISH細胞之標準細胞培養條件下生長之WISH細胞所表現之量相近或更低；(3)與在OVCAR-3細胞之標準細胞培養條件下生長之OVCAR-3細胞所表現之量相近或更低；(4)與在NCI-H1975細胞之標準細胞培養條件下生長之NCI-H1975細胞所表現之量相近或更低；及(5)低於在NCI-H292細胞之標準細胞培養條件下生長之NCI-H292細胞所表現之量。
在一些實施例中，就以下中之一或多者而言，癌症係異質的：EGFR突變狀態、EGFR表現量及MUC1表現量。在一些此類異質癌症中，癌症可主要包含一種或另一種細胞類型(關於EGFR突變狀態、EGFR表現量及/或MUC1表現量)。如本文所用，當至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之癌細胞係一種細胞類型時，將癌症描述為「主要」包含該細胞類型。
在一些實施例中，投與導致個體中可量測之改良情況。舉例而言，此改良可包括以下中之任一者或任何組合：腫瘤生長抑制(TGI)、腫瘤生長消減、腫瘤消退、轉移之抑制或消退、提高之生存率或任何指示癌症狀態或進展之臨床症狀之改良。可藉由例如預估或量測之腫瘤體積的量度評估腫瘤生長。在一些實施例中，腫瘤生長抑制或消減係至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95% (例如，以相對於參考值之較低腫瘤體積計，諸如代表不接受治療之個體中之腫瘤體積的參考值)。在一些實施例中，投與導致腫瘤之消退，亦即，相對於開始涉及免疫結合物之治療方案時的尺寸，身體中腫瘤之尺寸或癌症之程度減小。此腫瘤可部分消退(亦即，遺留一些腫瘤或癌症)或完全消退(例如，腫瘤體積到達約零及/或腫瘤不再可量測或可偵測)。
實例 以下特定實例將解釋為僅係闡釋性的，且無論如何不以任何方式限制本發明之其餘部分。
實例 1. 研發抗 MUC1 scFv 序列之序列最佳化及親和力成熟 藉由使用核糖體展示選擇之抗MUC1抗體HT186-D11 (參見Thie H.等人. PLoS One 201, 6, 1, e15921)之親和力成熟研發抗MUC1 scFv (H02)。對於scFv庫，靶向CDR H1、H2、H3及L3 (SEQ ID NO: 4、5、6及9)。隨後，針對MUC之生物素化合成VNTR肽(APDTRPAPGSTAPPAC-生物素) (SEQ ID NO:10)進行scFv核糖體展示選擇。
抗體變體尤其基於以下篩選及表徵：與表現MUC1之細胞(WISH、MDA-MB-468及OVCAR-3癌細胞，HepG2細胞作為MUC1陰性對照物) (其他細節參見實例4)之結合、與MUC1之生物素化合成VNTR肽(APDTRPAPGSTAPPAC-生物素；SEQ ID NO:10)之結合、結合動力學、儲存穩定性及抗體變體之藥物結合物(ADC)對MUC-1陽性細胞之細胞滅殺。
藉由使用無細胞表現系統之位點特異性結合及與SC239 (可裂解連接子-哈米特林衍生物) (參見實例3關於SC239之細節)之結合生成ADC。
圖20繪示來自親代抗體HT186-D11與來自親和力成熟期間所獲得之抗體的重鏈可變序列之序列對準。與喬西亞(Chothia)互補性決定區(CDR)對應之胺基酸殘基係劃分於黑框中。與卡巴特(Kabat) CDR對應之胺基酸殘基顯示為灰色陰影。
基於此等研究，選擇變體「1993-H02」 (此後係H02)並將其研發為scFv。H02序列之結合特徵之綜述係提供與表1A中；來自細胞滅殺分析之結果的綜述係提供於表1B中。表 1A ：具有 HT186-D11 輕鏈之 1993-H02 之 H02 特徵
Biacore，人類MUC1-VNTR肽 WISH，細胞結合
KD (M)： kd (1/2) Bmax Kd (nM)
9.01E-10 2.14E-04 128920 23.9
濁度 熱穩定性 Biacore，人類MUC1-VNTR
A600 Tm1 (℃) Tm2 (℃) ka1 (1/Ms) kd1 (1/s)
0.15 62 ND 1.26E+05 1.70E-03
表 1B ：與 SC239 結合之 1993-H02 之 ADC 細胞滅殺分析結果 (DAR = 4)
WISH MDA-MB-468 OVCAR-3 HepG2
IC50 (nM) 跨度(%) IC50 (nM) 跨度(%) IC50 (nM) 跨度(%) IC50 (nM) 跨度(%)
1.1 94 1.7 92 1.9 93 NK NK
NK = 無滅殺
實例 2. 雙特異性抗 MUC1/EGFR 抗體之建構 使用基於股交換工程改造域(SEED)之CH 3異二聚體平台研發雙特異性抗MUC1/EGFR抗體(參見例如，如美國專利第8,891,912號及第9,505,848號中所述)。
雙特異性抗體(此後係「分子10」)經設計為以下異二聚體： -與人類IgG1 Fc (AG SEED)融合之抗MUC1 scFv (H02)；及 -與人類IgG1 Fc (GA SEED)融合之抗EGFR Fab (衍生自人源化西妥昔單抗(cetuximab))。
建構編碼抗MUC1 scFvFc (AG SEED)、與IgG1 Fc (GA SEED)融合之抗EGFR Fab之重鏈及抗EGFR Fab之輕鏈的表現構築體。在蛋白質表現及異二聚體形成後，所得產物係雙特異性抗MUC1/EGFR抗體(H02/hC225 SEED或「Molecule 10」)。
出於實例3中所述之結合位點最佳化研究之目的，使用相似方法建構相似雙特異性抗MUC1/EGFR抗體(D11/hC225)。在D11/hC225中，抗MUC1臂係基於與人類IgG1 Fc (AG SEED)融合之HT186-D11 scFv (研發H02之親代序列；參見實例1)，且抗EGFR臂係基於與IgG1 Fc (GA seed)融合之人源化西妥昔單抗(hC225)之Fab。
實例 3. 分子 1 、與 3- 胺基苯基 - 哈米特林結合之雙特異性抗 MUC1/EGFR 抗體 ( 「雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 」 ) 之合成 使用XpressCF+™ (Sutro Biopharma)無細胞表現系統及位點特異性結合方法(參見例如，美國專利第9,732,161號及國際專利申請案第WO 2019/055931 A1號)生成基於實例1中所述之雙特異性抗MUC1/EGFR抗體H02/hC225 SEED (分子10)之抗體藥物結合物。
對於使結合位點最佳化之初始實驗，藉由在TAG位點(琥珀終止密碼子)處併入非天然胺基酸對疊氮基甲基L-苯丙胺酸(pAMF)以使D11/hC225 (AG SEED)之抗MUC1臂及D11/hC225 (GA SEED)之抗EGFR臂之重鏈(參見實例1)突變。各臂(抗MUC1 scFvFc (AG SEED)臂或抗EGFR Fab(重鏈)Fc (GA SEED)臂)生成一系列突變，各突變僅具有一個併入之pAMF殘基。各突變臂中之pAMF殘基係藉由使用SC239之無銅點擊化學與哈米特林衍生物結合，SC239包含靶向微管蛋白之3-胺基苯基哈米特林及經二苯并環辛炔(DBCO)官能化之可裂解纈胺酸瓜胺酸對胺基苄醇(Val-Cit-PABA)連接子(參見例如，WO 2019/0055931 A1)。
SC239具有式I中所示之結構：
Figure 02_image007
式 I
分別針對與MUC1及EGFR之結合且針對MDA-MB-468 (人類乳癌)細胞滅殺對結合之抗MUC1 scFvFc (AG)及抗EGFR Fab(重鏈)Fc (GA)臂單獨進行體外測試。亦針對與EGFR之結合、與MUC1之結合及MDA-MB-468細胞滅殺對抗MUC1 scFvFc (AG)與抗EGFR Fab(重鏈)Fc (GA)臂之組合進行體外測試。亦考慮影響諸如蛋白質表現、產率及熱穩定性之可製造性的因素。
基於來自結合位點最佳化研究之結果，選擇以下結合位點，根據EU索引對所有位置進行編號： -抗MUC1 scFv上之重鏈位置F404； -抗MUC1 scFv上之重鏈位置F241； -抗EGFR Fab上之重鏈位置F241；及 -抗EGFR Fab上之重鏈位置Y180。
使用此等結合位點，ADC具有以下式II之結構：
Figure 02_image009
式 II
使用實例2中所述之H02/hC225 SEED雙特異性抗體(分子10)之序列進行合成(亦顯示於圖1B中) (其中n = 4)。此ADC (此後係「分子1」)具有約4之藥物抗體比且包含具有抗MUC1 scFvFc (AG SEED)、抗EGFR Fab(重鏈)Fc (GA SEED)及抗EGFR Fab (輕鏈)之雙特異性抗體，H02/hC225 SEED雙特異性抗體係經由Val-Cit-PABA可裂解連接子在上文提及之結合位點中之各者處與3-胺基苯基-哈米特林分子結合。
使用分子之實例 4-20 表2概述實例4-20中所述實驗中所用之分子。
特定而言，分子1、2及3係如實例2中所述生成之抗體藥物結合物。分子10係如實例2中所述生成之雙特異性抗體。分子9及11係單特異性抗體。分子12-15係本領域中已知的小分子EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI) (參見例如，Hirano等人,In vitro modeling to determine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors against clinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer. Oncotarget 2015, 6, 38789-38803)。表 2 ：實例 4-16 中所用之分子
抗體藥物結合物
分子# 縮寫名/描述 藥物抗體比 完整描述及/或其他名稱
1 抗MUC1/EGFR ADC DAR：4 經由DBCO Val Cit PABA連接子與3-胺基苯基-哈米特林結合之雙特異性抗MUC1/EGFR抗體(H02/hC225-SC239)
2 抗MUC1 ADC DAR：4 經由DBCO Val Cit PABA連接子與3-胺基苯基-哈米特林結合之抗MUC1抗體(1993-H02-SC239)
3 抗EGFR ADC DAR：4 經由DBCO Val Cit PABA連接子與3-胺基苯基-哈米特林結合之抗EGFR抗體(hC225-SC239)
4 抗GFP ADC DAR：4 經由DBCO Val Cit PABA連接子與3-胺基苯基-哈米特林結合之抗GFP (aGFP-SC239)
抗體
分子# 縮寫名/描述 完整描述及/或其他名稱
9 西妥昔單抗(抗EGFR抗體) -
10 雙特異性抗MUC1/EGFR抗體 H02/hC225
11 抗MUC1抗體 H02 IgG1
小分子 EGFR 酪胺酸激酶抑制劑 (TKI)
分子# 抑制劑
12 埃羅替尼(erlotinib)
13 吉非替尼(gefitinib)
14 阿法替尼(afatinib)
15 奧希替尼(osimertinib)
*根據EU索引編號系統
實例 4. 雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 在體外有效滅殺癌細胞 為了評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC對癌細胞之影響，使用以下表現不同量之MUC1及EGFR之各種人類癌細胞對分子1進行細胞滅殺分析：MDA-MD-468 (乳癌；MUC1+/EGFR+++)、WISH (子宮頸癌；MUC1+++/EGFR+)、OVCAR-3 (卵巢癌；MUC1++/EGFR+)及HepG2 (肝癌；表現低量但非零量之MUC1及EGFR)細胞。亦在非癌症CHO-k (中國倉鼠卵巢；MUC1-/EGFR-)細胞上測試雙特異性抗MUC1/EGFR ADC。
方法 自ATCC (美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection))購買WISH、OVCAR-3、HepG2、MDA-MB-468及CHO-k細胞，且使細胞維持於DMEM/F12 (1:1)、輔以10%熱失活胎牛血清(Thermo Fisher Scientific®)之高葡萄糖(Corning®)、2 mM glutamax (Thermo Fisher Scientific®)及1×青黴素/鏈黴素(Corning®)。
使用細胞增殖分析量測ADC對癌細胞之細胞毒性影響。在實際分析開始前一日，將25 µL體積之總計625個細胞接種於384孔平底白色聚苯乙烯盤中。在細胞培養基中以2×起始濃度調配ADC及游離藥物，且使其濾過經SpinX 0.22 μm乙酸纖維素過濾之2 ml離心管(Corning® Costar®)。在無菌條件下連續稀釋(1:3)經過濾器殺菌之樣本，且一式三份地將25 µL各稀釋液添加至細胞上。在37℃下於CO2 培育器中培養該等盤120小時。針對細胞生存力量測，將30 µLCell Titer-Glo®試劑(Promega™ Corp, Madison, WI)添加至各孔中，且根據產品說明書處理培養盤。在ENVISION®讀盤器(Perkin-Elmer; Waltham, MA)上量測相對螢光。使用未處理之細胞作為對照物將相對螢光讀數轉化為存活力%。使用非線性回歸分析擬合資料，該分析使用對數(抑制劑)對比反應、可變斜率、使用GraphPad Prism之4-參數擬合方程。資料表示為相對細胞生存力%對比以奈米莫耳為單位之ADC劑量，誤差槓表示三份資料之標準差(SD)。
結果 在具有不同表現量之EGFR及MUC1抗原之細胞上評估如實例2中所述產生之雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)的細胞滅殺活性。將以下包含相同藥物(3-胺基苯基-哈米特林)以及抗EGFR抗體之單特異性ADC用作對照物： -抗MUC1 ADC (分子2) -抗EGFR ADC (分子3) -商業級西妥昔單抗(抗EGFR抗體) (分子9) -抗GFP ADC (分子4)。 細胞滅殺曲線(圖2)及結果係報導為(表3)中之IC50 (曲線之中點或觀測到最大抑制之50%時的濃度)以及滅殺跨度(相對於測試物之最大效應水準下之未處理之對照物，不再具有活力之細胞的總百分比，功效%)。表 3 ： ADC 及對照分子之 IC50 值及滅殺跨度
分子編號 樣本 DAR MDA-MB-468 WISH
IC50 (nM) 跨度(%) IC50 (nM) 跨度(%)
分子1 抗MUC1/EGFR ADC 3.7 0.09 85 1.4 98
分子2 抗MUC1 ADC 3.84 2.7 90 0.65 99
分子3 抗EGFR ADC 3.83 0.15 87 NK NK
分子4 抗GFP ADC 3.58 NK NK NK NK
分子9 西妥昔單抗 (抗EGFR抗體) NA NK NK NK NK
  
分子編號 樣本 DAR OVCAR-3
IC50 (nM) 跨度(%)
分子1 抗MUC1/EGFR ADC 3.7 0.41 88      
分子2 抗MUC1 ADC 3.84 3.6 89      
分子3 抗EGFR ADC 3.83 0.13 65      
分子4 抗GFP ADC 3.58 NC NC      
分子9 西妥昔單抗 (抗EGFR抗體) NA NK NK      
                    
分子編號 樣本 DAR HepG2 CHO-K
IC50 (nM) 跨度(%) IC50 (nM) 跨度(%)
分子1 抗MUC1/EGFR ADC 3.7 NK NK NK NK
分子2 抗MUC1 ADC 3.84 NK NK NK NK
分子3 抗EGFR ADC 3.83 NK NK NK NK
分子4 抗GFP ADC 3.58 NK NK NK NK
分子9 西妥昔單抗 (抗EGFR抗體) NA NK NK NK NK
DAR = 藥物抗體比 *預估 NC = 因不完全稀釋曲線而無法計算 NK = 無滅殺
在共同表現MUC1及EGFR之全部三種癌細胞株中，分子1在不依賴MUC1及EGFR表現量之情況下高效地抑制細胞生存力。
對於MDA-MB-468細胞，抗EGFR ADC (分子3)顯示遠高於抗Muc1 ADC (分子2)之細胞滅殺力(圖2)，其與MDA-MB-468細胞在細胞表面上具有比MUC1更高之EGFR表現量的先前結果密切相關。雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)之細胞滅殺活性與抗EGFR ADC (分子3)之活性相似(圖2)，其可反映此細胞株中之高EGFR表現。
對於WISH細胞，抗EGFR ADC (分子3)不顯示細胞滅殺活性，而抗MUC1 ADC (分子2)及雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)顯示強效細胞滅殺活性(圖2)，其與WISH細胞在細胞表面上具有比EGFR更高之MUC1表現量的先前結果相關。
對於OVCAR-3細胞，抗EGFR ADC (分子3)及雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)顯示比抗MUC1 ADC (分子2)更強效之細胞滅殺力，但抗EGFR ADC (分子3)之功效(細胞滅殺跨度) (65%)低於抗MUC1/EGFR ADC (分子1) (88%)及抗MUC1 ADC (分子2) (89%)之功效(圖2)。
在受測細胞中之任一者上，未從抗GFP ADC上觀測到非特異性細胞滅殺活性，但在OVCAR-3細胞上於最高濃度下觀測到活性(圖2)。在CHO-k細胞上，受測ADC未顯示任何細胞滅殺活性(圖2)。
總之，此等結果表示，在多數濃度下，分子1特定滅殺表現MUC1及EGFR之癌細胞。
實例 5. 雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 對正常細胞之體外影響 為了確定雙特異性抗MUC1/EGFR ADC對正常(非癌症)細胞之影響，在HeKn細胞(原發性正常人類表皮角質形成細胞，新生)及MCF-10a細胞(非致瘤乳房上皮細胞)上使用分子1進行細胞滅殺分析。在MDA-MB-468細胞(人類轉移性乳癌)及OVCAR-3細胞上使用分子1進行相同分析以用於對比。
方法 在RPMI1640中培養MDA-MB-468細胞，RPMI1640具有穩定300 mg/L L-麩醯胺酸及2.0 g/L NaHCO3 (Millipore® Sigma, Billerica, MA, USA)輔以10%胎牛血清(FBS) (Millipore® Sigma)及1 mM丙酮酸鈉(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®或Millipore® Sigma)。
在RPMI1640中培養OVCAR-3細胞，RPMI1640具有穩定300 mg/L L-麩醯胺酸及2.0 g/L NaHCO3 輔以20% FBS、1 mM丙酮酸鈉(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®或Millipore® Sigma)、10 µg/ml胰島素(Millipore® Sigma)。
在基底EpiLifeTM 培養基中培養原發性人類表皮角質形成細胞，新生(HeKn)，該培養基包括人類角質形成細胞生長補充物(HKGS)於塗有塗佈基質之燒瓶上(均係Gibco®，購自Thermo Fisher Scientific®, Waltham, MA, USA)。
亦使非致瘤乳房上皮細胞MCF-10A細胞生長並用於測試。將MCF 10A細胞培養於具有穩定麩醯胺酸之1:2杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM) (Millipore® Sigma/Biochrom)及具有穩定麩醯胺酸之Ham's F12 (Biochrom)，培養基包括10%馬血清(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®)及20 ng表皮生長因子(EGF) (Sigma)以及500 ng氫皮質酮(Millipore® Sigma)。
使用細胞增殖分析量測分子1對細胞之細胞毒性影響。用Gibco® D-PBS (Thermo Fisher Scientific®)洗滌細胞單層一次，且使用ACCUTASE® (Millipore® Sigma)或Gibco®胰朊酶/EDTA (#R-001-100)及胰朊酶中和劑(Gibco® #R-002-100)分離細胞。使用0.4% Gibco®台盼藍溶液(trypan blue solution，Thermo Fisher Scientific®)採用自動化細胞計數器LUNA或LUNA-FL™ (Logos Biosystems, Annandale, Virginia, USA)計算可存活細胞數目。在96孔平底細胞培養盤(Thermo Fisher Scientific®)之每孔上將總計2,000個細胞接種於100 µl細胞培養基(Hekn或MDA-MB-468細胞)或90 µl細胞培養基(OVCAR-3或MCF-10 a細胞)中，在37℃下於CO2 培育器中培育隔夜。隔日，對於Hekn及MDA-MB-468細胞，用具有減少量之FBS (3%)之90 µl新鮮細胞培養基替換該培養基。使用相同培養基製備10倍起始濃度之ADC及各別連續稀釋液(1:4)。對於MCF-10a細胞或OVCAR-3細胞，不改變培養基。使用各別細胞培養基製備10倍起始濃度之ADC及1:4之各別連續稀釋液。向各別培養孔供應10 µl ADC溶液(一式三份地進行所有處理)，且在37℃下於CO2 培育器中培養該等盤144小時。此後，將100 µl Cell Titer-Glo®試劑(Promega Corp, Madison, WI, USA)移吸至各孔中，且進一步處理培養盤以根據製造商之指示量測細胞生存力。在Varioskan®閃爍讀盤器或Lux讀盤器(Thermo Fisher Scientific®)上量測螢光訊號。在Microsoft® Excel (16.0版本，Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA)中藉由減去背景值(無細胞對照物，僅培養基)且藉由轉化為生存力% (未經處理之對照細胞 = 100%)或效果% (生存力% - 100%)處理相對螢光單元之原始資料。藉由以下獲得劑量-反應曲線及IC50 值：轉換資料且在Windows® Graph Pad Prism (8.2.0版本) (GraphPad軟體, La Jolla California USA，www.graphpad.com)中使用非線性回歸分析函數(log(抑制劑)對比反應-可變斜率(MDA-MB-468細胞或Hekn細胞之三參數；OVCAR-3及MCF-10a細胞之四參數)進行後續資料擬合。資料表示為效果%對比ADC濃度[nM]，誤差槓表示三份技術資料之SD。
結果 雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)對角質形成細胞生存力及非腫瘤上皮細胞顯示最小影響(圖3及表4)。表 4 ：腫瘤及非腫瘤細胞上分子 1 之 IC50 及幾何平均跨度 ( 功效 %)
腫瘤細胞 非腫瘤細胞
MDA-MB-468 乳癌 OVCAR-3卵巢癌 HeKn 角質形成細胞 MCF-10A 乳腺
MUC1 + ++ (+) +
EGFR +++ + + (+)
IC50 [nM] 0.05 0.2 82 NC
跨度(%*) 99 96 54 12
n = 3-4；NC = IC50 不可計算 *在分子1之最高受測濃度下
相較於MDA-MB-468細胞(功效%：最高濃度下係-99)，分子1對Hekn (功效%：最高濃度下係-54)及MCF-10A (功效%：最高濃度下係-12)顯示出減小之細胞滅殺功效。此外，相較於角質形成細胞(IC50 ：82 nM)，分子1對MDA-MB-468癌細胞(IC50 ：0.05 nM)顯示出高＞ 1000×倍之效力。
因此，如圖3中所示，在特定濃度範圍內，分子1有效滅殺MDA-MB-468乳癌細胞，同時對正常細胞具有最小影響。
實例 6. 雙特異性抗 MUC1/EGFR 抗體經癌細胞之內化 方法 在癌細胞株MDA-MB-468及OVCAR-3 (均購自ATCC，Manassas, VA, USA)上於體外評估雙特異性抗MUC1/EGFR抗體(分子10)、西妥昔單抗(抗EGFR抗體) (分子9)及H02 IgG1 (抗MUC1抗體) (分子11)之內化。在RPMI1640中培養MDA-MB-468細胞，RPMI1640具有穩定300 mg/L L-麩醯胺酸及2.0 g/L NaHCO3 輔以10% FBS及1 mM丙酮酸鈉(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®或Millipore® Sigma)。在RPMI1640中培養OVCAR-3細胞，RPMI1640具有穩定300 mg/L L-麩醯胺酸及2.0 g/L NaHCO3 輔以20% FBS、1 mM丙酮酸鈉(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®或Millipore® Sigma)、10 µg/ml胰島素(Millipore® Sigma)。對於繼代培養，用Gibco® D-PBS (Thermo Fisher Scientific®)洗滌細胞單層一次，且使用Accutase®分離細胞。使用0.4% Gibco®台盼藍溶液採用自動化細胞計數器LUNA-FL™計算可存活細胞數目。在96孔盤(Corning®, NY, USA)之每孔上將總計6,000個MDA-MB-468細胞或10000個OVCAR-3細胞接種於90 µl細胞培養基中。在培育器中於37℃及5% CO2 下培育該等盤隔夜。隔日，在0.5 µg/ml之最終濃度下使用Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific®)進行細胞核染色。向每孔添加十微升製備於PBS中之10×儲備溶液。在培育器中於37℃及5% CO2 下培育該等盤30分鐘。隨後移除培養基，且向該等孔供應90 µl新鮮細胞培養基。在黑暗中使用Zenon™ pHrodo™ iFL紅色人類IgG標記試劑(Thermo Fisher Scientific®)培育用於測試之各抗體5分鐘(所用蛋白質:染料莫耳比：1:3)。向每孔添加與100 nM最終濃度之抗體混合之抗體-pHrodo™混合物(進行技術性重複)，隨後在37℃及5% CO2 下培育25分鐘以引發內化。在添加抗體-pHrodo™混合物後，進行量測30分鐘、150分鐘、390分鐘、24小時及48小時。使用以下造影條件使用共焦量化圖像細胞計量器CQ1 (Yokogawa® Electric Corporation, Tokyo, Japan)形成細胞圖像：20×物鏡，405 nM雷射(Hoechst)，561 nM雷射(pHrodo™ iFL紅色)。每孔收集五張z-堆疊圖像(z-堆疊範圍：20 µm，切片：1 µm)，且CQ1軟體(1.04.02.04版本，橫河)係用於藉由量化衍生自細胞核周圍特定區域之pHrodo™紅色訊號的平均強度而測定朝向酸性細胞小室之內化。使用Microsoft® Excel (16.0版本，Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA)及Graph Pad Prism (Windows®係8.2.0版本，GraphPad軟體，La Jolla California USA)進行資料處理。內化資料係表現為平均強度對比時間[小時]，誤差槓表示兩份資料之標準差(SD)。
結果 關於內化研究，使用在酸性環境下變為螢光之Zenon™ pHrodo™ iFL紅色染料(Thermo Fisher Scientific®)標記雙特異性抗MUC1/EGFR抗體(分子10)以及單特異性對照抗體H02 IgG1 (抗MUC1抗體) (分子11)及西妥昔單抗(抗EGFR抗體) (分子9)。藉由使用CQ1裝置之活細胞造影且藉由量測對pH敏感之染料的平均螢光強度評估OVCAR-3及MDA-MB-468細胞中經pHrodo™-iFL標記之抗體隨時間推移向酸性細胞小室之內化(參見圖4A及4B)。
在MDA-MB-468及OVCAR-3細胞上，雙特異性抗MUC1/EGFR抗體H02/hC225 (分子10)顯示向酸性小室快速內化及轉移。如藉由平均螢光強度隨時間推移提高所測定，在培育時間之48小時內，分子10繼續內化(圖4A及4B)。在兩種細胞株中，相較於單特異性對照抗體H02 IgG1 (分子11)及西妥昔單抗(分子9)所獲得之平均螢光強度，分子10所獲得之平均螢光強度更強。
實例 7. 雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 在體外滅殺野生型及突變 EGFR 癌細胞 為了確定雙特異性抗MUC1/EGFR ADC對具有不同EGFR突變狀態之癌細胞的影響，在EGFR野生型(wt)細胞、EGFR外顯子缺失突變細胞及EGFR雙取代突變細胞上使用分子1進行細胞滅殺分析。
方法 NSCLC細胞NCI-H292 (EGFR野生型(wt))、HCC827 (EGFR del E746-A750)及NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M)均購自ATCC。在RPMI1640培養基中培養NCI-H292及NCI-H1975，RPMI1640具有穩定L-麩醯胺酸(Millipore® Sigma)、10% FBS (Millipore® Sigma)及1 mM丙酮酸鈉(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®或Millipore® Sigma)。在RPMI1640培養基中培養HCC827細胞，RPMI1640具有穩定2 mM L-麩醯胺酸、2.5 g/L D-(+)-葡萄糖溶液(Millipore® Sigma)、10 mM HEPES (Millipore® Sigma)、10% FBS及1 mM丙酮酸鈉(Gibco®，Thermo Fisher Scientific®或Millipore® Sigma)。
藉由FACS分別使用H02 IgG1 (抗MUC1抗體)或西妥昔單抗(抗EGFR抗體)且藉由計算中值螢光強度(MFI)比(MFI目標特異性抗體/MFI同型)評估NSCLC細胞上MUC1或EGFR之表現量。確定表現量，對於MFI比多至100為+，對於MFI比＞100為++，或對於MFI比＞200為+++。據此，NSCLC細胞之表現量係定義為MUC1+/EGFR++ (NCI-H292細胞)、MUC1+/EGFR+++ (HCC827細胞)或MUC1+/EGFR+ (NCI-H1975)。
對於細胞毒性測試，用Gibco® D-PBS (Thermo Fisher Scientific®)洗細胞單層一次，且使用Accutase® (Millipore® Sigma)自細胞培養燒瓶中分離。使用0.4% Gibco®台盼藍溶液(Thermo Fisher Scientific®)以自動化細胞計數器LUNA-FL™ (Logos Biosystems)計算活細胞數目。將總計625個細胞(NCI-H292)、1250個細胞(NCI-H1975)或3000個細胞(HCC827)平板接種於96孔黑色/透明平底TC處理之造影微孔盤(Corning®)之每孔90 µl細胞培養基中並培養隔夜。在使用前，於細胞培養基中簡單製備十倍初始濃度之ADC或化合物及各別連續稀釋液(1:4)。向該等孔供應10 µl ADC或化合物溶液。以技術性三份進行處理。隨後，該等盤在37℃及5% CO2 下培育144小時。ADC或EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI)未處理的對照細胞分別接受相應量之稀釋培養基或二甲亞碸(DMSO；Millipore Sigma)。對於後續細胞生存力量測，將100 µl Cell Titer-Glo®試劑(Promega™ Corp, Madison, WI, USA)以吸移管移至各孔中，且根據製造商之指示進一步處理培養盤。在Varioskan®閃爍讀盤器(Thermo Fisher Scientific®)上量測發光訊號。在Microsoft® Excel (16.0版本，Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA)中藉由減去背景值(無細胞對照物，僅培養基)且藉由計算生存力% (未經處理之對照細胞 = 100%)或效果% (生存力% - 100%)處理相對發光單元之原始資料。劑量-反應曲線及IC50 值係藉由在Graph Pad Prism (Windows® 8.2.0版本，GraphPad軟體, La Jolla California USA)中轉換資料及使用非線性回歸分析函數(log(抑制劑)相對於反應-可變斜率(四參數))進行後續資料擬合獲得。資料係以效果%相對於化合物之劑量濃度[M]表示，誤差槓指示技術性三份之SD。
結果 在具有不同EGFR突變狀態之NSCLC細胞(NCI-H292：EGFR wt；HCC827：EGFR del E746_A750；及NCI-H1975：EGFR L858R/T790M)上評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)之細胞滅殺活性。單特異性ADC抗MUC1 ADC (分子2)及抗EGFR ADC (分子3)係用作對照分子(圖5，表5)。對於NCI-H292及NCI-H1975細胞，使用分子1及EGFR TKI埃羅替尼(分子12)、吉非替尼(分子13)、阿法替尼(分子14)及奧希替尼(分子15)進行其他細胞滅殺分析(圖6，表6)。在若干獨立實驗中，ADC或EGFR TKI之效力係定為幾何平均IC50 [nM]，即所獲得之細胞滅殺曲線上觀測到最大細胞存活力抑制的50%時的平均濃度。此外，測定幾何平均跨度(%) (在所用最高測試濃度下，相對於未經處理之對照細胞所滅殺之細胞的平均百分比)。幾何平均跨度表示細胞存活力分析中ADC或化合物之功效。
如圖5中所示，分子1在細胞存活力分析中顯示針對NSCLC細胞之高功效及效力，該功效獨立於其MUC1及EGFR表現量及其EGFR突變狀態(EGFR wt、EGFR L858R/T790M或EGFR del E746_A750)。
對於NCI-H292 (EGFR wt)細胞，相較於抗MUC1 ADC (分子2)，抗EGFR ADC (分子3)顯示更高效力(圖5，表5)。此等細胞中EGFR之較高表現量及MUC1之相對較低表現量可導致針對分子3之敏感度高於針對分子2之敏感度。根據此等結果，雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)之細胞滅殺活性係在單特異性ADC (分子2及3)之細胞滅殺活性之間。然而，相較於單特異性ADC中之各者，分子1顯示略高之功效，其可表示協同作用。表 5. 圖 5 之幾何平均 IC50 值 [nM] 及幾何平均跨度 ( 功效 %) (n=1-4)
分子編號 樣本 DAR NCI-H292 HCC827 NCI-H1975
IC50 [nM] 跨度(%) IC50 [nM] 跨度(%) IC50 [nM] 跨度(%)
分子1 雙特異性 抗MUC1/EGFR ADC 4.0 1.1 95 0.23 88 0.83 90
分子2 抗MUC1 ADC 3.8 20 59 4.5 77 310* 54
分子3 抗EGFR ADC 3.7 #1 3.9 #2 0.17 89 0.06 93 0.04 75
DAR = 藥物抗體比 *預估#1 針對NCI-H292及NCI-H1975；#2 針對HCC-827
雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)在EGFR突變細胞HCC827 (EGFR del E746_A750)上顯示次奈米莫耳範圍內之細胞滅殺活性，其滅殺跨度(%)與單特異性抗EGFR ADC (分子3)相近(圖5，表5)。在此等EGFR表現量較高之細胞中，分子3及分子1以相近效力抑制細胞存活力。
在以較低量表現抗原之EGFR雙突變(L858R/T790M) NCI-H1975細胞上，就細胞存活力抑制而言，抗EGFR ADC (分子3)顯示優於抗MUC1 ADC (分子2)之效力及高於雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)之活性(圖5，表5)。然而，相較於分別具有54%及75%之滅殺跨度之分子2及分子3，分子1顯示90%之更佳細胞滅殺功效。此等結果可表示，在具有較低MUC1及EGFR表現量之細胞上，雙特異性ADC之協同活性高於單特異性ADC變體。
圖6及表6顯示來自使用小分子EGFR TKI所進行之實驗的結果。亦顯示來自分子1之結果以供比較。表 6. 圖 6 之最高測試濃度下的幾何平均 IC50 值 [nM] 及幾何平均跨度 ( 功效 %) (n=1-4)
分子編號 樣本 DAR NCI-H292 NCI-H1975
IC50 [nM] 跨度(%) IC50 [nM] 跨度(%)
分子1 雙特異性抗MUC1/EGFR ADC 4.0 0.4 96 1.0 87
分子12 埃羅替尼 NA 280 82 NC NC
分子13 吉非替尼 NA 230 87 NC NC
分子14 阿法替尼 NA 1.9 91 590 100
分子15 奧希替尼 NA 570 100 43 100
NC = 因不完全稀釋曲線而無法計算
所選NSCLC細胞NCI-H292 (EGFR wt)及NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M)對不同EGFR TKI之敏感度係與文獻中所述之結果一致(圖6，表4；參考文獻：Hirano等人, In vitro modeling to determine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors against clinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer, Oncotarget 2015, 6, 38789-38803)。與Hirano等人所述之結果一致，相較於其他TKI抑制劑(分子12、13、15)，阿法替尼(分子14)最有效地抑制野生型EGFR，而奧希替尼(分子15) (選用於靶向T790M抗性突變之EGFR TKI)在NCI-H1975細胞中顯示最高細胞滅殺活性(圖6，表6)。
總之，雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)顯示次奈米莫耳範圍內之抗野生型及突變EGFR細胞之效力，該等細胞之特徵係MUC1及EGFR之表現量不同。
實例 8. 嚙齒動物中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 之藥物動力學特性 在不攜帶腫瘤之雌性CB17 SCID小鼠及史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat)中評估分子1之非分割藥物動力學(PK)參數。
方法 在小鼠中，單次IV投與5 mg/kg丸劑，在不同時間點處取樣，且自不同動物收集(非重複量測)。在大鼠中，經由內置頸靜脈導管單次IV投與5 mg/kg劑量丸劑，且使用重複量測設計在不同時間點處收集血液樣本。
結果 結果之概述係呈現於表7中。表 7. 嚙齒動物中分子1之藥物動力學參數
參數 單位 CB17 SCID 大鼠
劑量 mg/kg 5 5
研究時長 日 21 21
T1/2 日 12.1 9.5
C0 μg/mL 107 147
Cmax ± SE μg/mL 104 ± 5 144 ± 3
AUC(0-all) ± SEM 日*微克/毫升 474 ± 10 636 ± 19
AUC(0- ∞) 日*微克/毫升 698 803
CL 毫升/日/公斤 7.16 6.2
VSS 毫升/公斤 126 82.1
自濃度-時間曲線之對數-線性圖之回歸分析確定消除半衰期(T1/2 )。小鼠及大鼠中包括T1/2 、CL及Vss之分子1的PK參數係相近的(圖7)。此外，分子1呈現似乎與其他FDA批准之單株IgG抗體之PK圖相似之嚙齒動物PK圖。
實例 9. 子宮頸癌 (WISH) 異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 之劑量反應功效研究 在WISH腫瘤中評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之劑量-反應關係，WISH係人類子宮頸細胞株(HeLa污染物)，在兩個獨立研究中，其相對於所有其他受測細胞株表現最高內源量之MUC1 (+++)及較低內源量之EGFR (+)。
方法 以0.1 mg/kg至1.5 mg/kg (研究1)或1.25 mg/kg至5 mg/kg (研究2)之劑量範圍用單次靜脈內(IV)注射分子1處理攜帶確定之WISH腫瘤(~150 mm3 )的雌性無胸腺裸鼠。
結果 在兩個研究中，處理之耐受性良好，且未觀測到毒性及正常增重(圖8A及8B)。用媒劑對照物處理之腫瘤到達研究終點(＞ 1,200 mm3 )之日，治療對WISH腫瘤生長及個別腫瘤尺寸之影響係繪示於圖9A、9B及10中。在研究1中，以0.1、0.3、0.75及1.5 mg/kg投與之分子1顯示劑量依賴性抗腫瘤活性。最低受測劑量0.1及0.3 mg/kg分別顯示0%及12%腫瘤生長抑制(TGI)之較差功效(圖9A及9B)。在第21日，相較於基於腫瘤尺寸之統計分析的媒劑對照物，使用0.75 mg/kg分子1時觀測到中等活性(47% TGI)，而1.5 mg/kg引發81% TGI之顯著活性(p = 0.0009) (圖8B)。最高劑量之分子1 (1.5 mg/kg)最初引發腫瘤消退，處理後大約10日觀測到再次生長(圖9A)。在研究2中，如在所有劑量下均引發腫瘤消退所證實，1.25、2.5及5 mg/kg下單劑量之分子1呈現穩健及明顯功效(圖10)。在研究結束時，在大於50% (4/7)用最低劑量處理之動物及100% (7/7)接受2.5及5 mg/kg分子1之動物中觀測到完全反應。
總之，來自兩個研究之結果獨立地顯示分子1之強效抗腫瘤活性，其產生顯著功效以及導致WISH腫瘤之腫瘤消退。定義為使腫瘤體積自基線降低＞ 20%之最低劑量的最小有效劑量(MED) (開始處理後的任何時間點)在兩個研究中係一致的，且在WISH腫瘤模型中係在大約1.5 mg/kg之分子1下確定。
實例 10. 卵巢癌 (OVCAR-3) 異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 之劑量反應功效研究 在OVCAR-3腫瘤中評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之劑量-反應關係，該等腫瘤係表現較低內源量之MUC1 (++)及EGFR (+)之人類卵巢腺癌。
方法 以2.5 mg/kg至10 mg/kg範圍之劑量用單次IV注射之分子1處理攜帶確定之OVCAR-3腫瘤(~100 mm3 )的雌性CB17 SCID (嚴重複合型免疫缺乏症，C.B-17-IcrHSD-Prkdcscid )小鼠。
結果 處理之耐受性良好，未注意到毒性或臨床症狀，以及在所有受測劑量下未注意到初始重量之3.10%與6.04%之間的明顯(p ≤ 0.05)平均體重增加(圖11)。2.5、5及10 mg/kg下的分子1引發腫瘤消退(＞100% TGI)且抑制生長直至處理後約31日(圖12A)。第28日之腫瘤尺寸分析顯示，相較於媒劑對照物，分子1具有明顯效果(p ＜ 0.0001) (圖12B)。總之，分子1在OVCAR-3腫瘤中顯示較強功效。實例 11. 乳癌 (MDA-MB-468) 異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 之劑量反應功效研究 在MDA-MB-468腫瘤中評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之劑量-反應關係，該等腫瘤係相對於較高EGFR量(+++)，表現較低量之MUC1 (+)的人類乳房轉移性腺癌模型。
方法 以2.5 mg/kg至10 mg/kg範圍之劑量用單次靜脈內注射之分子1處理攜帶確定之MDA-MB-468腫瘤(~130 mm3 )的雌性SCID米色小鼠。結果 處理之耐受性良好，且未觀測到毒性及正常增重(圖12)。所有劑量之分子1 (2.5、5及10 mg/kg)均引發明顯抗腫瘤活性，使腫瘤完全消退且抑制生長直至處理後第63日的研究結束(圖14)。總之，分子1在MDA-MB-468模型中呈現強效活性，其導致腫瘤消退且延長反應之持續時間。
實例 12. 來自非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者之異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 的劑量反應功效研究 在來自NSCLC患者之異種移植(PDX)模型LUX089中評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之劑量-反應關係。此PDX模型表現MUC1及EGFR。
方法 以2 mg/kg至10 mg/kg範圍內之劑量用單次IV注射之分子1處理攜帶確定之LUX089腫瘤(~150 mm3 )的雌性裸鼠(Nu/Nu，維通利華實驗動物技術有限公司(Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.)，北京，中國)。
結果 處理之耐受性良好，且未注意到毒性或臨床症狀，且未觀測到減重(圖15B)。在第0日以2、5及10 mg/kg投與一次之分子1顯示劑量依賴性腫瘤生長抑制，在10 mg/kg劑量組中完全消退(圖15A)。在10 mg/kg劑量組中，在五隻經處理之動物的三隻中，直至第60日實驗結束時，才無法量測到腫瘤。在第38日，當媒劑組腫瘤到達1300 mm3 之平均體積時，2及5 mg/kg劑量分別導致69%及24%消退之TGI (p＜0.001)。總之，分子1在PDX模型LUX089中顯示較強功效。
實例 13. 來自非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者之異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 及單特異性 ADC 之間的比較 以相同劑量在三個不同的來自NSCLC患者的異種移植(PDX)模型中評估雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1與單特異性抗EGFR及抗MUC1 ADC之對比功效。全部三種PDX模型均表現MUC1及EGFR。
方法 以5 mg/kg之劑量使用單次IV注射之分子1及單特異性ADC處理攜帶確定之LUX089、LUX019及LUX003腫瘤(~150 mm3 )之雌性裸鼠(Nu/Nu，維通利華實驗動物技術有限公司，北京，中國)。
結果 在全部三種PDX模型中，分子1顯示最強腫瘤生長抑制，其中模型LUX003及LUX019中完全消退。在LUX089中，處理導致部分消退。第二最有效之處理係抗EGFR ADC，其導致模型LUX019中之腫瘤停滯。5 mg/kg單次處理之抗MUC1 ADC在三個受測PDX模型中未導致腫瘤縮減(圖16)。總之，分子1在三個受測NSCLC PDX模型中顯示最強抗腫瘤功效。
實例 14. 不同癌症適應症之來自患者的異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 之功效 在來自不同癌症適應症之PDX模型中測試雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之功效。基於MUC1及EGFR之已知表現量選擇適應症。
方法 以8 mg/kg之劑量用單次IV注射之分子1處理攜帶來自NSCLC、胃癌、食道癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、子宮頸癌及間皮瘤之PDX模型的雌性裸鼠(Nu/Nu)。使用以下標準在出現最佳反應之日(若腫瘤反應延遲)/在媒劑組腫瘤體積(中值)到達1000 mm3 時，將功效評估為進行性疾病(PD)、穩定疾病(SD)；部分消退(PR)或完全消退(CR)：與PD、SD、PR相對應，腫瘤體積變化＞73%、＜73%及＞ -66%、≤ -66%，且與CR相對應，腫瘤不可量測。
結果 在全部受測適應症中，均觀測到較強抗腫瘤反應(部分或全部消退)。在表現不同量之MUC1或EGFR的模型中觀測到反應。在表8中，用星號標記呈現高EGFR及MUC1表現量(基於＞15之免疫組織化學評分，其使用haloscore軟體)之NSCLC PDX模型。用井號標記具有EGFR突變(LUPF049：EGFR19del (748-753)；LUPF104：EGFR19 del (746-750)、T790M及C797S)之NSCLC PDX模型。總之，在若干表現不同量之MUC1及EGFR的癌症適應症中，分子1顯示廣泛適用性。表 8. 來自不同 適應症之 PDX 模型中之處理反應
適應症 模型 反應
NSCLC (腺1 或鱗狀2 細胞癌) LUX0102 PD
LUX0192 * CR
LUX0342 PD
LUX1061 PD
LUX0032 * SD
LUX1012 PD
LUX1102 PD
CTC1601282 * CR
CTC150081 * CR
LUPF0491 # CR
LUPF1041 # CR
食道鱗狀細胞癌 ESX008 SD
ESX019 CR
ESX005 PR
ESX076 PD
ESX030 CR
ESX006 CR
EC002 CR
ESPF160344 CR
ESPF160802 CR
ESPF160845 CR
ESPF160845 CR
OES13497 CR
ESPF161825 CR
ESPF161498LY CR
胃癌 GAX001 PD
GAX066 SD
GAX031 CR
乳癌(TNBC) CTG-1019 CR
CTG-1018 CR
HBCx-8 PR
HBCx-17 PR
CTG-1018 CR
CTG-1019 CR
HBCx-6 CR
BCX-017-LOP CR
HBCx-28 CR
頭頸鱗狀細胞癌 HNX005 CR
HN12656 SD
HN11218 CR
HN11269B CR
HN11857A CR
HN13194 CR
HN14755 CR
HN10632 CR
HN10309 CR
卵巢癌 OVPF040 PR
OVPF167 PD
OVPF169 SD
OVPF174 SD
OVPF027 PR
OVPF042 CR
OVPF041 CR
OVX046 SD
子宮頸癌 CEPF002 SD
CEPF160042 PR
CEPF012 CR
CEPF101 CR
CEPF161330 CR
CEX009 CR
CER14951 CR
間皮瘤 PNX334 SD
PNX411 SD
PNX392E CR
PD = 進行性疾病 SD = 穩定疾病 PR = 部分消退 CR = 完全消退
實例 15. 使用不同處理方案之來自患者之異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 的功效 在使用不同方案之NSCLC PDX模型中測試雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之功效。
方法 用單次IV注射之8 mg/kg分子1、兩次IV注射之4 mg/kg分子1 (一週或分兩週)或四次IV注射之2 mg/kg分子1 (每週一次)處理攜帶確定之來自患者的NSCLC腫瘤(~150 mm3 )之雌性裸鼠(Nu/Nu，維通利華實驗動物技術有限公司，北京，中國)。
結果 在所有方案中，使用8 mg/kg之相同總劑量引發較強及可持續之腫瘤生長抑制(圖17A及圖17B)。總之，使用不同處理方案之分子1顯示較強抗腫瘤功效。
實例 16. 來自 NSCLC 、食道癌及頭頸鱗狀細胞癌之來自患者的異種移植模型中雙特異性抗 MUC1/EGFR ADC 的功效 在許多來自NSCLC、食道癌及頭頸鱗狀細胞癌之來自患者之異種移植模型中測試單次8 mg/kg劑量之分子1的功效。如圖18A、18B及18C中所示，大部分來自NSCLC、食道癌及頭頸鱗狀細胞癌之來自患者之異種移植模型在單次劑量後呈現完全緩解。腫瘤反應係與靶向表現相關。
實例 17. 抗 MUC1 抗體之表位定位 為了確定分子1之抗MUC1臂之最小結合表位，相對於轉譯為具有14個、11個及9個胺基酸之肽-肽重疊之線性15個、12個及10個胺基酸肽之人類MUC1肽APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS (SEQ ID NO:22)以及相對於15個胺基酸肽APDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO:23)、PAPGSTAPPAHGVTS (SEQ ID NO:24)、TAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO:25)及HGVTSAPDTRPAPGS (SEQ ID NO:26)之序列截段進行人類抗MUC1抗體HT186-D11及H02之PEPperMAP® 表位定位。在培育緩衝液中以1 µg/ml之濃度用抗體樣本培育所得肽微陣列，隨後用第二抗體及對照抗體染色，以及使用LI-COR Odyssey造影系統讀數。使用PepSlide® 分析器量化光點強度及肽標註。
肽微陣列副本之預染色未突出顯示任何第二抗體或對照抗體與會干擾主要分析之野生型肽之肽變體的背景相互作用。相反，用抗體樣本培育產生極相似及極清晰之IgG反應圖。抗體HT186-D11對具有最小共有基序TRPAP (SEQ ID NO:27)之肽顯示最強反應。儘管在中等光點強度下，抗體H02仍識別出相同最小共有基序。在與具有最小共有基序DTRPAP (SEQ ID NO:28)之肽相互作用時，抗體H02亦呈現較強反應。移除C端脯胺酸或N端蘇胺酸導致光點強度顯著降低，且由此導致抗體結合減弱。
實例 18. 分子 1 抗人類及石蟹獼猴 EGFR 之動力相互作用分析 為了評估針對EGFR之結合親和力，將分子1 (抗MUC1/EGFR ADC；參見實例3)及分子10 (未結合之抗MUC1/EGFR；參見實例2)固定於生物傳感器尖端。可溶分析物(人類或石蟹獼猴(食蟹猴(Macaca fascicularis )) EGFR；「食蟹猴EGFR」)之結合及分離係量測為以nm為單位之干擾偏移，該干擾偏移直接導致蛋白質與生物傳感器之尖端的結合。使用1:1相互作用模型及全面曲線擬合處理資料以獲得kon 、kdis 及KD 值。
結果顯示於表9A及9B中。分子1抗人類及食蟹猴EGFR之分離常數(KD )係在較低單數位nM範圍內(1.5 nM)。分子10之動力結合常數極其相似，其係約1.4 nM。
因此，分子1 (抗MUC1/EGFR ADC)以與未結合之抗MUC1/EGFR (分子10)相似之動力學與EGFR結合。此等結果顯示，結合哈米特林衍生物以製造分子1 (參見實例3)未影響與EGFR之結合。表 9A. 包括分子 1 及分子 10 抗人類 EGFR 之所計算之 KD 、 kon 及 kdis 值的結果 分析物：人類EGFR
樣本 KD (nM) kon (1/Ms) ( 誤差；誤差 %/Kon ) kdis (1/s) ( 誤差；誤差 %/Kdis )
分子 1 1.465 6.24E+05 (2.47E+03；0.396%) 9.14E-04 (2.27E-06；0.249%)
分子 10 1.444 6.73E+05 (3.11E+03；0.462%) 9.72E-04 (2.71E-06；0.279%)
表 9B. 包括分子 1 及分子 10 抗 食蟹猴 EGFR 之所計算之 KD 、 kon 及 kdis 值的結果 分析物：食蟹猴EGFR-His
樣本 KD (nM) kon (1/Ms) ( 誤差；誤差 % /Kon ) kdis (1/s) ( 誤差；誤差 %/Kdis )
分子 1 3.5 8.38E+05 (6.51E+03；0.777%) 2.94E-03 (2.67E-05；0.907%)
分子 10 3.4 9.16E+05 (1.12E+04；1.226%) 3.11E-03 (4.23E-05；1.359%)
實例 19. 分子 1 抗人類及石蟹獼猴 MUC1 之動力相互作用分析 為了評估針對MUC1之結合親和力，使用各別胺偶合套組經由在一級胺上共價偶合將分子1 (抗MUC1/EGFR ADC；參見實例3)及分子10 (未結合之抗MUC1/EGFR；參見實例2)固定於C1系列S傳感器晶片上。量測1000 nM分析物(食蟹猴) MUC1肽及人類MUC1肽VHH融合)之結合及分離各持續180秒。
讀數係由蛋白質結合直接產生至傳感器晶片之表面所量測的反應。使用異質相互作用模型及全面曲線擬合處理資料以獲得kon 、kdis 及KD 值。
結果顯示於表10中。分子1之抗人類MUC1肽的所量測之分離常數(KD ) (如與駱駝科VHH之N端融合)係21.5 nM，且分子10係47.2 nM。此等分子中之各者的曲線形狀表示異質結合模式。對於所有受測分子，此第二相互作用似乎明顯更弱。使用食蟹猴MUC1肽時，無法量測相互作用。
因此，分子1 (抗MUC1/EGFR ADC)以與未結合之抗MUC1/EGFR (分子10)相似之動力學與人類MUC1結合。此等結果顯示，結合哈米特林衍生物以製造分子1 (參見實例3)未顯著影響與MUC1之結合。
與食蟹猴MUC1肽之結合的缺失可能係因為胺基酸序列中之物種特異性差異。如實例17中所述，分子1之抗MUC1結合臂經確定具有包含胺基酸序列TRPAP (SEQ ID NO:27)之最小結合表位。不同物種之MUC1之序列對準顯示，此最小表位不存在於食蟹猴及嚙齒動物MUC1中。表 10. 包括分子 1 及分子 10 抗 人類 MUC1 之所計算之 KD 、 kon 及 kdis 值的結果 分析物：人類MUC1-VHH融合
樣本 ka1 (1/Ms) kd1 (1/s) KD1 (M) ka2 (1/Ms) kd2 (1/s) KD2 (M)
分子1 4.55E+04 9.78E-04 2.15E-08 9.89E+05 3.09E-01 3.13E-07
分子10 2.85E+04 1.34E-03 4.72E-08 3.59E+05 4.80E-01 1.34E-06
實例 20. 與 MUC1 之結合模式 為了進一步瞭解H02-scFv之結合模式，解開分子1之MUC1-結合臂，即H02-scFv與人類MUC1免疫顯性核心肽之片段(APDTRPAPGSTAPPA；SEQ ID NO:23)之間的複合物之晶體結構。
在結晶前，在冰上用超過10×莫耳之MUC1肽培育H02-scFv 30分鐘，且隨後在25 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4緩衝液中濃縮至22 mg/ml。藉由混合1.0 µl蛋白質溶液與1.0 µl容器溶液(0.1 M Tris，0.2 M MgCl2 ，28% w/v PEG4000，pH 8.5)使用懸滴氣相擴散技術以277 K使晶體生長。複合物之總體結構顯示於圖19A中。
在晶體結構中，如圖19A所示，MUC1肽鏈係嚴格界定於電子密度圖(2Fo-Fc)中之Asp 3至Ala 15內。Arg 5 [MUC1]之側鏈胍與Glu 99 [H02-scFv]之羧酸基團形成兩齒狀鹽橋，而Arg 5 [MUC1]之主鏈氮與Asp 103 [H02-scFv]之主鏈羰基氧形成氫鍵。在以下觀測到另外兩個氫鍵：1) Gly 9 [MUC1]之主鏈氮與Asp 52 [H02-scFv]之羧酸鹽之間，及2) Thr 11 Oγ [MUC1]與Asp 52 [H02-scFv]之間。藉由范德華接觸(van der Waals contact)、尤其藉由使Pro 8 [MUC1]結合至由H02-scFv之CDR1 Thr 30 - His32補丁及由H02-scFv之CDR2 Asp 52 - Val54補丁所形成之腔中進一步穩定MUC1肽與H02-scFv之間的相互作用。MUC1肽與H02-scFv之間的接觸之其餘者係由水分子介導。同等物
本文所提及之專利文獻及科學論文中之每一者的全部揭示內容均出於所有目的以引用之方式併入。
在不偏離本發明之精神或基本特徵之情況下，本發明可以其他特定形式體現。因此，前述實施例在所有方面中應視為說明性的，而非限制本文所描述之揭示內容。不同實施例及多種所揭示方法步驟之多種結構要素可以多種組合及排列形式加以利用，且所有此類變化形式均視為本發明之形式。因此，本發明之範疇係由所附申請專利範圍而非前述描述指示，且在與申請專利範圍等效之含義及範圍內的所有變化均意欲包括在本文中。
序列 SEQ ID NO:1 (抗MUC1 scFvFc (AG SEED))
Figure 02_image011
SEQ ID NO:2 (抗EGFR Fab(重鏈)Fc (GA SEED))
Figure 02_image013
SEQ ID NO:3 (抗EGFR Fab(輕鏈))
Figure 02_image015
SEQ ID NO:4 (HT186-D11及1993系列抗體之CDRH1基序)
Figure 02_image017
其中 X1 係S (絲胺酸)或P (脯胺酸)， X2 係T (蘇胺酸)或N (天冬醯胺酸)， X3 係G (甘胺酸)、D (天冬胺酸)或S (絲胺酸)， X4 係H (組胺酸)或N (天冬醯胺酸)，及 X5 係Y (酪胺酸)或F (苯丙胺酸)。
SEQ ID NO:5 (HT186-D11及1993系列抗體之CDRH2基序)
Figure 02_image019
其中 X1 係G (甘胺酸)或E (麩胺酸)， X2 係K (賴胺酸)或R (精胺酸)，及 X3 係N (天冬醯胺酸)或D (天冬胺酸)。
SEQ ID NO:6 (HT186-D11及1993系列抗體之CDRH3基序)
Figure 02_image021
其中 X1 係V (纈胺酸)或A (丙胺酸)， X2 係T (蘇胺酸)或R (精胺酸)， X3 係G (甘胺酸)或A (丙胺酸)，及 X4 係D (天冬胺酸)或S (絲胺酸)。
SEQ ID NO:7 (HT186-D11及1993系列抗體之CDRL1)
Figure 02_image023
SEQ ID NO:8 (HT186-D11及1993系列抗體之CDRL2)
Figure 02_image025
SEQ ID NO:9 (HT186-D11及1993系列抗體之CDRL3)
Figure 02_image027
SEQ ID NO:10 (MUC1之VNTR肽)
Figure 02_image029
SEQ ID NO:11 (在*指示之位點處併入之具有非天然胺基酸(例如，pAMF)之抗MUC1 scFvFc (AG SEED))
Figure 02_image031
SEQ ID NO:12 (在*指示之位點處併入之具有非天然胺基酸(例如，pAMF)之(抗EGFR Fab(重鏈)Fc (GA SEED))
Figure 02_image033
SEQ ID NO:13 (hC225之CDRH1)
Figure 02_image035
SEQ ID NO:14 (hC225之CDRH2)
Figure 02_image037
SEQ ID NO:15 (hC225之CDRH3)
Figure 02_image039
SEQ ID NO:16 (hC225之CDRL1)
Figure 02_image041
SEQ ID NO:17 (hC225之CDRL2)
Figure 02_image043
SEQ ID NO:18 (hC225之CDRL3)
Figure 02_image045
SEQ ID NO:19 (hC225重鏈內的CH1)
Figure 02_image047
SEQ ID NO:20 (在*指示之位點處併入之具有非天然胺基酸(例如，pAMF)之hC225重鏈內的CH1)
Figure 02_image049
SEQ ID NO:21 (hC225輕鏈內的CL1)
Figure 02_image051
SEQ ID NO:22 (來自人類MUC1之肽)
Figure 02_image053
SEQ ID NO:23 (人類MUC1截斷肽)
Figure 02_image055
SEQ ID NO:24 (人類MUC1截斷肽)
Figure 02_image057
SEQ ID NO:25 (人類MUC1截斷肽)
Figure 02_image059
SEQ ID NO:26 (人類MUC1截斷肽)
Figure 02_image061
SEQ ID NO:27 (人類MUC1最小共有基序)
Figure 02_image063
SEQ ID NO:28 (人類MUC1最小共有基序)
Figure 02_image065
SEQ ID NO:29 (HT186-D11之CDRH1 - 卡巴特)
Figure 02_image067
SEQ ID NO:30 (HT186-D11之CDRH2 - 卡巴特)
Figure 02_image069
SEQ ID NO:31 (HT186-D11之CDRH3 - 卡巴特)
Figure 02_image071
SEQ ID NO:32 (HT186-D11之CDRH1 - 喬西亞)
Figure 02_image073
SEQ ID NO:33 (HT186-D11之CDRH2 - 喬西亞)
Figure 02_image075
SEQ ID NO:34 (HT186-D11之CDRH3 - 喬西亞)
Figure 02_image077
SEQ ID NO:35 (1993-H02之CDRH1 - 卡巴特)
Figure 02_image079
SEQ ID NO:36 (1993-H02之CDRH2 - 卡巴特)
Figure 02_image081
SEQ ID NO:37 (1993-H02之CDRH3 - 卡巴特)
Figure 02_image083
SEQ ID NO:38 (1993-H02之CDRH1 - 喬西亞)
Figure 02_image085
SEQ ID NO:39 (1993-H02之CDRH2 - 喬西亞)
Figure 02_image087
SEQ ID NO:40 (1993-H02之CDRH3 - 喬西亞)
Figure 02_image089
SEQ ID NO:41 (HT186-D11之VH)
Figure 02_image091
SEQ ID NO:42 (1993-H02之VH)
Figure 02_image093
SEQ ID NO:43 (HT186-D11及1993-H02之VL)
Figure 02_image095
SEQ ID NO:44 (1993-E03之VH)
Figure 02_image097
SEQ ID NO:45 (1993-H08之VH)
Figure 02_image099
SEQ ID NO:46 (1993-G09之VH)
Figure 02_image101
SEQ ID NO:47 (1993-E04之VH)
Figure 02_image103
SEQ ID NO:48 (1993-D01之VH)
Figure 02_image105
圖 1A 顯示SC239之結構，其係分子1 (本發明之雙特異性抗MUC1/EGFR抗體藥物結合物)之合成中所用之連接子-藥物分子。SC239包含DBCO基、Val-Cit-PABA可裂解連接子及3-胺基苯基-哈米特林(3-aminophenyl-hemiasterlin)。圖 1B 顯示描繪本發明之例示性抗體藥物結合物之結構的簡圖。在分子1中，n (SC239部分之數目)係4。
圖 1C 係描繪本發明之例示性MUC1/EGFR雙特異性抗體之結構的簡圖。
圖 2 顯示具有各種組合之MUC1與EGFR表現量之細胞上雙特異性抗MUC1/EGFR ADC (分子1)及對照分子的體外細胞滅殺曲線。分子1係H02/hC225-SC239，一種包含與3-胺基苯基-哈米特林結合之雙特異性抗MUC1/EGFR抗體之ADC。分子2、3及4係具有分子1中所用之相同藥物、藥物抗體比(約4)及連接子之單特異性ADC。分子2係1992-H02-SC239，一種抗MUC1 ADC。分子3係hC225-SC239，一種抗EGFR ADC。分子4係aGFP-SC239，一種抗GFP ADC。分子9係西妥昔單抗(cetuximab)，一種抗EGFR抗體。受測細胞係：(1) MDA-MB-468乳癌細胞(MUC1+/EGFR+++)、WISH子宮頸癌細胞(MUC1+++/EGFR+)、OVCAR-3卵巢癌細胞(MUC1++/EGFR+)、HepG2肝癌細胞(MUC1+/-/EGFR+/-)及CHO-k (中國倉鼠卵巢細胞；MUC1-/EGFR-)。所有圖表均表現為三次值 ± SD之平均數。
圖 3 顯示Hekn細胞(原發性正常人類表皮角質形成細胞，新生)、MDA-MB-468癌細胞、OVCAR-3癌細胞及MCF-10A細胞上雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1之體外細胞滅殺曲線。所有圖表均表現為三次值 ± SD之平均數。
圖 4A 及4B 顯示平均螢光強度之圖表，其表示如兩種癌細胞株中所評估，向諸如經pHrodo™標記之抗體的溶酶體之酸性小室內化及運輸。在MDA-MB-468 (圖4A)及OVCAR-3 (圖4B)細胞中評估pHrodo™標記之(1) H02/hC225 SEED (分子10)，雙特異性抗MUC1/EGFR抗體；(2) H02 IgG1 (分子11)，抗MUC1抗體；(3)西妥昔單抗(分子9)，抗EGFR抗體及(4)利妥昔單抗(rituximab) (對照Ab)之內化。內化至酸性細胞小室表示為pHrodo訊號之平均強度對比量測之時間點。所有圖表均表現為兩次重複值 ± SD之平均數。
圖 5 顯示不同非小細胞肺癌(NSCLC)細胞上雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1以及單特異性對照ADC (分子2及3；參見圖2之描述)之體外細胞滅殺曲線。顯示來自n = 1-4獨立實驗之一個代表性實驗。所有圖表均表現為三次值 ± SD之平均數。
圖 6 顯示NSCLC細胞NCI-H292 (左組)及NCI-H1975 (右組)上雙特異性抗MUC1/EGFR ADC分子1及EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI)之體外細胞滅殺曲線。顯示來自n = 3-4獨立實驗之一個代表性實驗。所有圖表均表現為三次值 ± SD之平均數。分子1係H02/hC225-SC239，分子12係埃羅替尼(erlotinib)，分子13係吉非替尼(gefitinib)，分子14係阿法替尼(afatinib)，且分子15係奧希替尼(osimertinib)。
圖 7 係繪示IV單次投與5 mg/kg劑量後，CB17 SCID小鼠及史-道二氏大鼠(Sprague-Dawley rat)中分子1之血漿濃度-時間曲線之圖表。
圖 8A 及8B 係繪示在兩個獨立研究中以不同劑量單次注射投與分子1後，攜帶WISH腫瘤異種移植物之小鼠之體重變化的圖表。(圖 8A ：研究1，使用媒劑及0.1 mg/kg、0.3 mg/kg、0.75 mg/kg及1.5 mg/kg劑量；圖 8B ：研究2，使用媒劑及1.25 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg劑量)。
圖 9A 及9B 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜載WISH腫瘤異種移植物之小鼠中之腫瘤生長曲線(圖 9A )及顯示第21日最終腫瘤尺寸之散點圖(圖 9B )的圖表(研究1)。
圖 10 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜載WISH腫瘤異種移植物之小鼠中之腫瘤生長曲線的圖表(研究2)。
圖 11 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜帶OVCAR-3腫瘤異種移植物之小鼠中之體重變化的圖表。
圖 12 A 及12B 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜載OVCAR-3腫瘤異種移植物之小鼠中之腫瘤生長曲線(圖 12A )及顯示第28日最終腫瘤尺寸之散點圖(圖 12B )的圖表。
圖 13 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜帶MDA-MB-468腫瘤異種移植物之小鼠中之體重變化的圖表。
圖 14 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜帶MDA-MB-468腫瘤異種移植物之小鼠中之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 15A 及15B 係繪示以不同劑量單次注射投與分子1後，攜帶來自NSCLC患者之異種移植物LUX089之小鼠中之腫瘤生長曲線(圖 15A )及實驗期間之動物重量(圖 15B )的圖表。
圖 16A 係繪示相較於投與單特異性EGFR及MUC1 ADC (分別係分子3及2，如圖2中之描述內容所述)之小鼠，投與雙特異性ADC分子1後，攜帶來自NSCLC患者之異種移植物之小鼠中之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 16B 係繪示相同劑量下來自NSCLC患者之異種移植物模型LUX019、LUX003及LUX089中由雙特異性ADC分子1及單特異性EGFR及MUC1 ADC引發之腫瘤體積百分比(TV%)變化之圖表。
圖 17A 及17B 係繪示投與8 mg/kg之相同總劑量之分子1但使用不同治療方案後，攜帶來自NSCLC患者之異種移植物之小鼠中之腫瘤生長曲線的圖表。
圖 18A 、18B 及18C 係繪示來自NSCLC、食道鱗狀細胞癌及頭頸鱗狀細胞癌之各種來自患者之異種移植物模型中由8 mg/kg單劑量之雙特異性ADC分子1引發之腫瘤體積百分比(TV%)變化的圖表。
圖 19A 繪示與H02-scFv複合之MUC1肽之結構。虛線表示MUC1肽與H02-scFv之間的氫鍵。
圖 19B 繪示MUC1肽-H02-scFv相互作用之細節。虛線表示MUC1肽(複合物之頂部)與H02-scFv分子(複合物之底部)之間的氫鍵。
圖 20 繪示來自親代抗體HT186-D11與來自親和力成熟期間所獲得之抗體的重鏈可變序列之序列對準(參見實例1)。與喬西亞(Chothia)互補性決定區(CDR)對應之胺基酸殘基係劃分於黑框中。與卡巴特(Kabat) CDR對應之胺基酸殘基突出顯示為黃色。
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Claims (83)

  1. 一種免疫結合物，其包含： (a)與EGFR及MUC1結合之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含： (i)包含第一工程改造Fc域及單鏈Fv (scFv)之第一多肽，其中該scFv結合MUC1， (ii)包含第二工程改造Fc域及Fab片段之重鏈之第二多肽，及 (iii)包含該Fab片段之輕鏈之第三多肽； 其中第二及第三多肽鏈一起界定結合EGFR之Fab片段， 其中該第一多肽與該第二多肽係藉由該第一工程改造Fc域與該第二工程改造Fc域之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接； 其中該第二多肽與該第三多肽係藉由該第二多肽之重鏈與該第三多肽之輕鏈之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接；及 其中該第一多肽及該第二多肽各自包含至少一個非天然胺基酸殘基；及 (b)複數個哈米特林(hemiasterlin)部分，其中各哈米特林部分係經由連接子獨立地結合至該第一多肽或該第二多肽之非天然胺基酸殘基中之一者。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中該等複數個哈米特林部分包含四個哈米特林部分。
  3. 如請求項1或2之免疫結合物，其中該第一工程改造Fc域不同於該第二工程改造Fc域。
  4. 如請求項3之免疫結合物，其中該第一工程改造Fc域及該第二工程改造Fc域各自包含股交換工程改造域。
  5. 如請求項4之免疫結合物，其中各股交換工程改造域包含人類IgA及IgG恆定重鏈-3 (CH 3)序列之交替區段。
  6. 如請求項1至5中任一項之免疫結合物，其中該第一工程改造Fc域包含兩個非天然胺基酸殘基。
  7. 如請求項6之免疫結合物，其中該第一工程改造Fc域包含不超過兩個非天然胺基酸殘基。
  8. 如請求項6或7之免疫結合物，其中該第一工程改造Fc域包含非天然胺基酸殘基於重鏈位置F241及F404，根據EU索引。
  9. 如請求項1至8中任一項之免疫結合物，其中該第二工程改造Fc域包含非天然胺基酸殘基。
  10. 如請求項9之免疫結合物，其中該第二工程改造Fc域包含不超過一個非天然胺基酸殘基。
  11. 如請求項9或10之免疫結合物，其中該第二工程改造Fc域包含非天然胺基酸殘基於重鏈位置F241，根據EU索引。
  12. 如請求項1至11中任一項之免疫結合物，其中該Fab片段包含非天然胺基酸殘基。
  13. 如請求項12之免疫結合物，其中該第二多肽內之Fab片段之重鏈包含非天然胺基酸殘基。
  14. 如請求項12或13之免疫結合物，其中該Fab片段包含不超過一個非天然胺基酸殘基。
  15. 如請求項12、13或14之免疫結合物，其中該Fab片段包含非天然胺基酸殘基於重鏈位置Y180，根據EU索引。
  16. 如請求項1至15中任一項之免疫結合物，其中該至少一個非天然胺基酸殘基各選自由以下組成之群：對-乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對-疊氮基-L-苯丙胺酸、對-醯基-L-苯丙胺酸、對-苯甲醯基-L-苯丙胺酸、對-碘苯丙胺酸、對-溴苯丙胺酸、對-胺基-L-苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對-丙炔基氧基苯丙胺酸及對-疊氮基甲基-L-苯丙胺酸。
  17. 如請求項16之免疫結合物，其中該至少一個非天然胺基酸殘基各係對-疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)。
  18. 如請求項1至17中任一項之免疫結合物，其中該雙特異性抗體係無醣基化。
  19. 如請求項1至18中任一項之免疫結合物，其中該第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:7中所列胺基酸序列之CDR-L1； 包含SEQ ID NO:8中所列胺基酸序列之CDR-L2；及 包含SEQ ID NO:9中所列胺基酸序列之CDR-L3。
  20. 如請求項19之免疫結合物，其中該第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:4中所列胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO:5中所列胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO:6中所列胺基酸序列之CDR-H3。
  21. 如請求項19之免疫結合物，其中該第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： (a) (i)包含SEQ ID NO:29中所列胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:30中所列胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:31中所列胺基酸序列之CDR-H3；或 (b) (i)包含SEQ ID NO:32中所列胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:33中所列胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:34中所列胺基酸序列之CDR-H3。
  22. 如請求項21之免疫結合物，其中該第一多肽包含： (a)包含SEQ ID NO:41中所列胺基酸序列之重鏈可變(VH)區；及 (b)包含SEQ ID NO:43中所列胺基酸序列之輕鏈可變(VL)區。
  23. 如請求項19之免疫結合物，其中該第一多肽包含以下互補性決定區(CDR)： (a) (i)包含SEQ ID NO:35中所列胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:36中所列胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:37中所列胺基酸序列之CDR-H3；或 (b) (i)包含SEQ ID NO:38中所列胺基酸序列之CDR-H1， (ii)包含SEQ ID NO:39中所列胺基酸序列之CDR-H2，及 (iii)包含SEQ ID NO:40中所列胺基酸序列之CDR-H3。
  24. 如請求項23之免疫結合物，其中該第一多肽包含： (a)包含SEQ ID NO:42中所列胺基酸序列之重鏈可變(VH)區；及 (b)包含SEQ ID NO:43中所列胺基酸序列之輕鏈可變(VL)區。
  25. 如請求項1至24中任一項之免疫結合物，其中該第二多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:13中所列胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO:14中所列胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO:15中所列胺基酸序列之CDR-H3。
  26. 如請求項1至25中任一項之免疫結合物，其中該第三多肽包含以下互補性決定區(CDR)： 包含SEQ ID NO:16中所列胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO:17中所列胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO:18中所列胺基酸序列之CDR-L3。
  27. 如請求項1至26中任一項之免疫結合物，其中該第一多肽具有與SEQ ID NO:1中所列胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。
  28. 如請求項27之免疫結合物，其中該第一多肽具有如SEQ ID NO:11中所列胺基酸序列。
  29. 如請求項1至28中任一項之免疫結合物，其中該第二多肽具有與SEQ ID NO:2中所列胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。
  30. 如請求項29之免疫結合物，其中該第二多肽具有如SEQ ID NO:12中所列胺基酸序列。
  31. 如請求項1至30中任一項之免疫結合物，其中該第三多肽具有與SEQ ID NO:3中所列胺基酸序列至少99%相同之胺基酸序列。
  32. 如請求項31之免疫結合物，其中該第三多肽具有如SEQ ID NO:3中所列胺基酸序列。
  33. 如請求項1至32中任一項之免疫結合物，其中該連接子係可裂解連接子。
  34. 如請求項33之免疫結合物，其中該可裂解連接子係纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄醇(PABA)。
  35. 如請求項1至34中任一項之免疫結合物，其中該哈米特林部分係哈米特林衍生物。
  36. 如請求項35之免疫結合物，其中該哈米特林衍生物係3-胺基苯基-哈米特林。
  37. 如請求項36之免疫結合物，其中該免疫結合物包含以下結構：
    Figure 03_image107
    ， 其中n係4。
  38. 一種免疫結合物，其包含： (a)與EGFR及MUC1結合之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含： (i)包含第一工程改造Fc域及單鏈Fv片段(scFv)之第一多肽，其中該scFv與MUC1結合，該第一多肽鏈包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，該序列包含非天然胺基酸殘基於重鏈位置F241及F404，根據EU索引， (ii)包含第二工程改造Fc域及Fab片段之重鏈之第二多肽，該第二多肽包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，該序列包含非天然胺基酸殘基於位置Y180及F241，根據EU索引，及 (iii)包含該Fab片段之輕鏈之第三多肽，該第三多肽包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列； 其中第二及第三多肽鏈一起界定結合EGFR之Fab片段， 其中該第一多肽與該第二多肽係藉由該第一工程改造Fc域與該第二工程改造Fc域之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接，及 其中該第二多肽與該第三多肽係藉由該第二多肽之重鏈與該第三多肽之輕鏈之間所形成之一或多個雙硫鍵共價連接；及 (b)複數個3-胺基苯基哈米特林部分，各自獨立地經由可裂解纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄醇連接子結合至該等非天然胺基酸殘基中之一者。
  39. 如請求項38之免疫結合物，其中該免疫結合物包含四個3-胺基苯基哈米特林部分。
  40. 如請求項38或39之免疫結合物，其中各非天然胺基酸係對-疊氮基甲基-L-苯丙胺酸(pAMF)。
  41. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至40中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  42. 一種治療有需要之哺乳動物個體中之癌症的方法，該方法包含以下步驟： 向該個體投與治療有效量之如請求項1至40中任一項之免疫結合物或如請求項41之醫藥組合物。
  43. 如請求項42之方法，其中該哺乳動物個體係人類。
  44. 如請求項42或43之方法，其中該哺乳動物個體經診斷患有癌症。
  45. 如請求項42至44中任一項之方法，其中該癌症包含實性瘤(solid tumor)。
  46. 如請求項45之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、食道癌、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌及間皮瘤。
  47. 如請求項46之方法，其中該癌症係乳癌。
  48. 如請求項47之方法，其中該乳癌係三陰性乳癌。
  49. 如請求項46之方法，其中該癌症係肺癌。
  50. 如請求項49之方法，其中該肺癌係非小細胞肺癌(NSCLC)。
  51. 如請求項50之方法，其中該NSCLC包含腺癌。
  52. 如請求項50或51之方法，其中該NSCLC包含鱗狀細胞癌。
  53. 如請求項46之方法，其中該癌症係食道癌。
  54. 如請求項53之方法，其中該食道癌係鱗狀食道癌。
  55. 如請求項54之方法，其中該癌症係頭頸癌。
  56. 如請求項55之方法，其中該頭頸癌係頭頸鱗狀細胞癌。
  57. 如請求項46之方法，其中該癌症係子宮頸癌。
  58. 如請求項46之方法，其中該癌症係卵巢癌。
  59. 如請求項46之方法，其中該癌症係胃癌。
  60. 如請求項46之方法，其中該癌症係間皮瘤。
  61. 如請求項42至44中任一項之方法，其中該癌症包含非實性瘤。
  62. 如請求項61之方法，其中該癌症係多發性骨髓瘤。
  63. 如請求項42至62中任一項之方法，其中該癌症包含EGFR之野生型細胞。
  64. 如請求項63之方法，其中該癌症主要包含EGFR之野生型細胞。
  65. 如請求項42至63中任一項之方法，其中該癌症包含包括EGFR之突變形式之細胞。
  66. 如請求項65之方法，其中該癌症主要包含包括EGFR之突變形式之細胞。
  67. 如請求項42至66中任一項之方法，其中該癌症包含表現高量EGFR之細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中該癌症主要包含表現高量EGFR之細胞。
  69. 如請求項42至67中任一項之方法，其中該癌症包含表現低量或中等量EGFR之細胞。
  70. 如請求項69之方法，其中該癌症主要包含表現低量或中等量EGFR之細胞。
  71. 如請求項42至70中任一項之方法，其中該癌症包含表現高量MUC1之細胞。
  72. 如請求項71之方法，其中該癌症主要包含表現高量MUC1之細胞。
  73. 如請求項42至71中任一項之方法，其中該癌症包含表現低量或中等量MUC1之細胞。
  74. 如請求項73之方法，其中該癌症主要包含表現低量或中等量MUC1之細胞。
  75. 如請求項42至74中任一項之方法，其中該投與步驟包含藉由全身途徑投與。
  76. 如請求項75之方法，其中該全身途徑係靜脈內途徑。
  77. 如請求項75之方法，其中該全身途徑係皮下途徑。
  78. 如請求項42至77中任一項之方法，其中在向該哺乳動物個體投與該免疫結合物後，腫瘤生長相對於參考水準消減。
  79. 如請求項78之方法，其中該參考水準係向該哺乳動物個體投與該免疫結合物之步驟前腫瘤生長之水準。
  80. 如請求項78或79之方法，其中在向該哺乳動物個體投與該免疫結合物後，腫瘤生長消退。
  81. 如請求項80之方法，其中在向該哺乳動物個體投與該免疫結合物後，腫瘤生長完全消退。
  82. 如請求項42至81中任一項之方法，其中該投與步驟包含投與至少兩個劑量，其中該等至少兩個劑量共同包含治療有效量。
  83. 如請求項42至81中任一項之方法，其中投與該免疫結合物之步驟包含投與包含治療有效量之單劑量。
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