KR20230033648A - Egfr 및 muc1을 표적화하는 이중특이적 항체-약물 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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라르스 톨라이키스
크리슈티아네 아멘트
아힘 되르너
샤오판 리
라이언 스테포드
로버트 헤닝슨
시홍 저우
앨리스 얌
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Abstract

절단가능한 링커를 통해서 헤미아스텔린-기반 모이어티에 접합된 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체를 포함하는 면역접합체, 및 이의 약학 조성물이 제공된다. 또한 이러한 면역접합체 및 약학 조성물을 사용하여 암을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

EGFR 및 MUC1을 표적화하는 이중특이적 항체-약물 접합체 및 이의 용도
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2020년 6월 3일 출원된 미국 가출원 제63/034,296호에 대한 이득 및 우선권을 청구하고, 이의 전체 내용은 모든 목적을 의해 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 서열 목록을 함유한다. 상기 ASCII 사본은 2021년 6월 1일 생성되었고, EMD-016WO_Sequence_Listing.txt로 명명되며, 크기는 38 킬로바이트이다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 분자 생물학, 면역학, 및 종양학이다. 보다 특히 분야는 치료적 항체-약물 접합체이다.
상피 성장 인자 수용체 (EGFR; ErbB1이라고도 함)는 몇몇 상피 암에서 과발현되는 경막 단백질이다. 결실 돌연변이, 점 돌연변이, 삽입 돌연변이, 및 유전자 증폭을 포함한, 일부 EGFR 돌연변이가 암과 연관되었다. 일부 EGFR 돌연변이를 비롯하여, EGFR 과발현은 불량한 예후 및/또는 표적화 EGFR 억제제 및 다른 수용체 티로신 키나제 억제제에 대한 내성과 연관된다. 항-EGFR 요법으로부터 회피를 초래하는 몇몇 신규 경로가 최근에 보고되어서, 항-EGFR 요법의 도전을 강조한다.
추가로, EGFR은 신체 전반에서 정상 조직에서 기본적으로 발현된다. 그러므로, EGFR을 표적화하는 항체 요법은 원치않는 표적외 효과 및 증강된 독성을 일으킬 수 있다.
지금까지의 노력에도 불구하고, 여전히 개선된 항암 요법에 대한 요구가 남아있다.
본 개시는 일부 항-EGFR 치료제에서 관찰되는 효능의 결여 및 종양 선택성의 결여 둘 모두를 해결한 신규한 이중특이적 항체-약물 접합체를 제공한다.
일 양태에서, (a) EGFR 및 MUC1에 결합하는 이중특이적 항체 및 (b) 다수의 헤미아스텔린 모이어티를 포함하는 면역접합체가 제공된다. 이중특이적 항체는 (i) 제1 조작된 Fc 도메인 및 단쇄 Fv (scFv)를 포함하는 제1 폴리펩티드로서, scFv는 MUC1에 결합하는 것인 제1 폴리펩티드, (ii) 제2 조작된 Fc 도메인 및 Fab 단편의 중쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 (iii) Fab 단편의 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하고; 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 함께 EGFR에 결합하는 Fab 단편을 한정한다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 제1 조작된 Fc 도메인 및 제2 조작된 Fc 도메인 사이에 형성된 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 중쇄 및 제3 폴리펩티드의 경쇄 사이에 형성된 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 면역접합체는 (b) 다수의 헤미아스텔린 모이어티, 예를 들어, 4개 헤미아스텔린 모이어티를 포함한다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각이 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기를 포함하고, 각각의 헤미아스텔린 모이어티는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 비천연 아미노산 잔기 중 하나에 링커를 통해서 독립적으로 접합된다.
일정 구현예에서, 제1 조작된 Fc 도메인은 제2 조작된 Fc 도메인과 상이하다. 예를 들어, 제1 및 제2 조작된 Fc 도메인은 각각이 인간 IgA 및 IgG 불변 중쇄-3 (CH3) 서열의 교대 절편을 포함할 수 있는, 가닥-교환 조작된 도메인을 포함한다.
일정 구현예에서, 제1 조작된 Fc 도메인은 예를 들어, EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241 및 F404에, 2개의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조작된 Fc 도메인은 2개 이하의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일정 구현예에서, 제2 조작된 Fc 도메인은 비천연 아미노산 잔기, 예를 들어, EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241에, 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 조작된 Fc 도메인은 1개 이하 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일정 구현예에서, Fab 단편은 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 내 Fab 단편의 중쇄는, 예를 들어, EU 지수에 따른 중쇄 위치 Y180에, 비천연 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 1개 이하 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 내 Fab 단편의 중쇄는 EU 지수에 따른 중쇄 위치 Y180에 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기의 각각은 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-아이오도페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, 및 p-아지도메틸-L-페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기의 각각은 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌 (pAMF)이다.
일정 구현예에서, 이중특이적 항체는 비글리코실화된다.
일정 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다:
SEQ ID NO:7로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
SEQ ID NO:8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
SEQ ID NO:9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
일정 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다:
SEQ ID NO:4로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
SEQ ID NO:5로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
SEQ ID NO:6으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
일정 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다:
(a) (i) SEQ ID NO:29로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) SEQ ID NO:30으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) SEQ ID NO:31로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
또는
(b) (i) SEQ ID NO:32로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) SEQ ID NO:33으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) SEQ ID NO:34로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
일정 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 (a) SEQ ID NO:41로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및 (b) SEQ ID NO:43으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함한다.
일정 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다:
(a) (i) SEQ ID NO:35로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) SEQ ID NO:36으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) SEQ ID NO:37로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
또는
(b) (i) SEQ ID NO:38로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
(ii) SEQ ID NO:39로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
(iii) SEQ ID NO:40으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
일정 구현예에서, 제1 폴리펩티드는
(a) SEQ ID NO:42로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및 (b) SEQ ID NO:43으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역을 포함한다.
일정 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다:
SEQ ID NO:13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
SEQ ID NO:14로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
SEQ ID NO:15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
일정 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함한다:
SEQ ID NO:16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
SEQ ID NO:17로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
SEQ ID NO:18로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11로 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3으로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일정 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커, 예를 들어, 발린-시트룰린-p-아미노벤질알콜 (PABA)이다.
일정 구현예에서, 헤미아스텔린 모이어티는 헤미아스텔린 유도체, 예를 들어, 3-아미노페닐-헤미아스텔린이다.
일정 구현예에서, 면역접합체는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00001
식에서, n은 4이다.
일정 구현예에서, 면역접합체가 제공되고, 면역접합체는
(a) EGFR 및 MUC1에 결합하는 이중특이적 항체로서,
(i) 제1 조작된 Fc 도메인 및 단쇄 Fv 단편 (scFv)을 포함하는 제1 폴리펩티드로서, scFv는 MUC1에 결합하고, 제1 폴리펩티드 사슬은 비천연 아미노산 잔기 EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241 및 F404에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드,
(ii) 제2 조작된 Fc 도메인 및 Fab 단편의 중쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드로서, EU 지수에 따른 위치 Y180 및 F241에, 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제2 폴리펩티드, 및
(iii) Fab 단편의 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩티드로서, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제3 폴리펩티드
를 포함하고,
제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 EGFR에 결합하는 Fab 단편을 함께 한정하고,
제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 제1 조작된 Fc 도메인 및 제2 조작된 Fc 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결되고,
제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 중쇄 및 제3 폴리펩티드의 경쇄 사이에 형성되는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결되는 것인, 이중특이적 항체; 및
(b) 각각이 비천연 아미노산 잔기 중 하나에 절단가능한 발린-시트룰린-p-아미노벤질알콜 링커를 통해서 독립적으로 접합되는, 다수의 3-아미노페닐 헤미아스텔린 모이어티
를 포함한다.
일정 구현예에서, 면역접합체는 4개 3-아미노페닐 헤미아스텔린 모이어티를 포함한다. 일정 구현예에서, 각각의 비천연 아미노산은 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌 (pAMF)이다.
다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
다른 양태에서, 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 포유동물 대상체, 예를 들어, 인간 포유동물 대상체 및/또는 암을 갖는다고 진단된 대상체에게 본 명세서에 개시된 면역접합체 또는 약학 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 제공된다.
일정 구현예에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 예를 들어, 암은 유방암, 폐암, 식도암, 두경부암, 자궁경부암, 난소암, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암이다. 일부 구현예에서, 암은 폐암, 예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 예컨대 선암종 및/또는 편평 세포 암종을 포함하는 NSCLC이다. 일부 구현예에서, 암은 식도암, 예를 들어, 편평 식도암이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암, 예를 들어, 두경부 편평 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 자궁경부암이다. 일부 구현예에서, 암은 난소암이다. 일부 구현예에서, 암은 위암이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 전이성이다.
일정 구현예에서, 암은 비-고형 종양, 예를 들어, 다발성 골수종을 포함한다.
일정 구현예에서, 암은 EGFR에 야생형인 세포를 포함한다. 예를 들어, 암은 EGFR에 야생형인 세포를 주로 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 암은 EGFR에 돌연변이체인 세포를 포함한다. 예를 들어, 암은 EGFR에 돌연변이체인 세포를 주로 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 암은 고 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 암은 고 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 주로 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 암은 저 또는 중간 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 암은 저 또는 중간 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 주로 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 암은 고 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 암은 고 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 주로 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 암은 저 또는 중간 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 포함한다. 예를 들어, 암은 저 또는 중간 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 주로 포함할 수 있다.
일정 구현예에서, 포유동물 대상체에 면역접합체를 투여하는 단계는 전신 경로, 예를 들어, 정맥내 경로 또는 피하 경로를 통한 투여를 포함한다.
상황에 따라서, 종양 성장은 포유동물 대상체에게 면역접합체의 투여 이후 기준 수준에 비해서 감소된다. 예를 들어, 종양 성장은 포유동물 대상체에게 면역접합체의 투여 이후 부분적으로 또는 완전하게 퇴행할 수 있다.
일정 구현예에서, 투여 단계는 적어도 2회 용량의 면역접합체의 투여를 포함하고, 적어도 2회 용량은 집합적으로 치료적 유효량을 포함한다. 일정 구현예에서, 투여 단계는 치료적 유효량을 포함하는 면역접합체의 단일 용량의 투여를 포함한다.
전술한 구현예 중 어느 하나에서, 제1 폴리펩티드의 scFv는 그의 서열이 TRPAP (SEQ ID NO:27)를 포함하는 MUC1 에피토프에 결합할 수 있다.
도 1A 는 SC239, 분자 1의 합성에서 사용되는 링커-약물 분자 (본 개시의 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체-약물 접합체)의 구조를 도시한다. SC239는 DBCO 기, Val-Cit-PABA 절단가능한 링커, 및 3-아미노페닐-헤미아스텔린을 포함한다. 도 1B 는 본 개시의 예시적인 항체-약물 접합체의 구조를 도시한 개략도를 도시한다. 분자 1에서, n (SC239 모이어티의 갯수)은 4이다.
도 1C 는 본 개시에 따른 예시적인 MUC1/EGFR 이중특이적 항체의 구조를 도시하는 개략도이다.
도 2 는 MUC1 및 EGFR 발현 수준의 다양한 조합을 갖는 세포에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1) 및 대조군 분자의 시험관내 세포 사멸 곡선을 도시한다. 분자 1은 H02/hC225-SC239로서, 3-아미노페닐-헤미아스텔린에 접합된 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체를 포함하는 ADC이다. 분자 2, 3, 및 4는 분자 1에서 사용된 동일한 약물, 약물-항체-비율 (대략 4), 및 링커를 갖는 단일특이적 ADC이다. 분자 2는 1992-H02-SC239로서, 항-MUC1 ADC이다. 분자 3은 hC225-SC239로서, 항-EGFR ADC이다. 분자 4는 aGFP-SC239로서, 항-GFP ADC이다. 분자 9는 세툭시맙으로서, 항-EGFR 항체이다. 시험된 세포는 (1) MDA-MB-468 유방 암 세포 (MUC1+/EGFR+++), WISH 자궁경부 암 세포 (MUC1+++/EGFR+), OVCAR-3 난소 암 세포 (MUC1++/EGFR+), HepG2 간 암 세포 (MUC1+/-/EGFR+/-), 및 CHO-k (중국 햄스터 난소 세포; MUC1-/EGFR-)이다. 모든 그래프는 삼중 값의 평균 ± SD로서 표시된다.
도 3 은 Hekn 세포 (원발성 정상 인간 상피 케라티노사이트, 신생), MDA-MB-468 암 세포, OVCAR-3 암 세포 및 MCF-10A 세포에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 시험관내 세포 사멸 곡선을 도시한다. 모든 그래프는 삼중 값의 평균 ± SD로서 표시된다.
도 4A 및 4B 는 2종 암 세포주에서 평가된 산성 구획 예컨대 pHrodo™ 표지된 항체의 리소솜에 내재화 및 그로의 수송을 나타내는 평균 형광 강도의 그래프를 도시한다. pHrodo™ 표지된 (1) H02/hC225 SEED (분자 10), 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체; (2) H02 IgG1 (분자 11), 항-MUC1 항체; (3) 세툭시맙 (분자 9), 항-EGFR 항체, 및 (4) 리툭시맙 (대조군 Ab)의 내재화는 MDA-MB-468 (도 4A) 및 OVCAR-3 (도 4B) 세포에서 평가되었다. 산성 세포 구획으로의 내재화는 pHrodo 신호의 평균 강도 대 측정 시점으로 표시된다. 모든 그래프는 이중 값의 평균 ± SD로 표시된다.
도 5 는 상이한 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포에 대한 단일특이적 대조군 ADC (분자 2 및 3; 도 2 설명 참조)와 함께, 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 시험관내 세포 사멸 곡선을 도시한다. n=1-4 개별 실험 중 하나의 대표적인 실험이 도시된다. 모든 그래프는 삼중 값의 평균 ± SD로 표시된다.
도 6 은 NSCLC 세포 NCI-H292 (좌측 패널) 및 NCI-H1975 (우측 패널)에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1 및 EGFR 티로신 키나제 억제제 (TKI)의 시험관내 세포 사멸 곡선을 도시한다. n=3-4 개별 실험 중 하나의 대표적인 실험을 도시한다. 모든 그래프는 삼중 값의 평균 ± SD로서 표시된다. 분자 1은 H02/hC225-SC239이고, 분자 12는 엘로티닙이고, 분자 13은 제피티닙이고, 분자 14는 아파티닙이고, 분자 15는 오시머티닙이다.
도 7 은 CB17 SCID 마우스 및 스프라그-다우리 래트에서 5 mg/kg 용량의 IV 볼러스 투여 이후 분자 1의 혈장 농도-시간 프로파일을 설명하는 그래프이다.
도 8A 및 8B 는 2회 독립 연구에서 상이한 용량의 분자 1의 단일 주사 투여 이후에 WISH 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 체중 변화를 설명하는 그래프이다 (도 8A: 연구 1, 비히클 사용 및 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.75 mg/kg, 및 1.5 mg/kg 용량; 도 8B: 연구 2, 비히클 사용 및 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 및 5 mg/kg 용량).
도 9A 및 9B 는 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 WISH 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선 (도 9A) 및 21일에 최종 종양 크기의 산포도 (도 9B)를 설명하는 그래프이다 (연구 1).
도 10 은 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 WISH 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선을 설명하는 그래프이다 (연구 2).
도 11 은 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 OVCAR-3 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 체중 변화를 설명하는 그래프이다.
도 12A 및 12B 는 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 OVCAR-3 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선 (도 12A) 및 28일에 최종 종양 크기의 산포도 (도 12B)를 설명하는 그래프이다.
도 13 은 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 MDA-MB-468 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 체중 변화를 설명하는 그래프이다.
도 14 는 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 MDA-MB-468 종양 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선을 설명하는 그래프이다.
도 15A 및 15B 는 상이한 용량으로 분자 1의 단일 주사 투여 이후 NSCLC 환자 유래 이종이식편 LUX089를 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선 (도 15A) 및 실험 동안 동물 체중 (도 15B)을 설명하는 그래프이다.
도 16A 는 단일특이적 EGFR 및 MUC1 ADC (도 2 설명에서 기술된 바와 같이, 각각 분자 3 및 2)가 투여된 마우스와 비교하여 이중특이적 ADC 분자 1이 투여된 이후 NSCLC 환자-유래 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선을 설명하는 그래프이다.
도 16B 는 iNSCLC 환자-유래 이종이식 모델 LUX019, LUX003 및 LUX089에서 동일 용량으로 이중특이적 ADC 분자 1 및 단일특이적 EGFR 및 MUC1 ADC에 의해 유도된 종양 부피 변화율 (TV%)을 설명하는 그래프이다.
도 17A 및 17B 는 8 mg/kg의 동일한 총량의 분자 1이 상이한 치료 일정을 사용해 투여된 이후에 NSCLC 환자 유래 이종이식편을 보유하는 마우스에서 종양 성장 곡선을 설명하는 그래프이다.
도 18A, 18B, 및 18C 는 NSCLC, 식도 편평 세포 암종, 및 두경부 편평 세포 암종으로부터의 다양한 환자-유래 이종이식 모델에서 단일 8 mg/kg 용량의 이중특이적 ADC 분자 1에 의해 유도된 종양 부피 변화율 (TV%)을 설명하는 그래프이다.
도 19A 는 H02-scFv와 복합체로 MUC1 펩티드의 구조를 도시한다. 점선은 MUC1 펩티드 및 H02-scFv 간 수소 결합을 표시한다.
도 19B 는 MUC1 펩티드-H02-scFv 상호작용의 세부사항을 도시한다. 점선은 MUC1 펩티드 (복합체의 상단 부분) 및 H02-scFv 분자 (복합체의 하단 부분) 간 수소 결합을 표시한다.
도 20 은 부모 항체 HT186-D11 및 친화성 성숙화 (실시예 1 참조) 동안 수득된 항체로부터의 중쇄 가변 서열의 서열 정렬을 도시한다. 초티아 (Chothia) 상보성-결정 영역 (CDR)에 상응하는 아미노산 잔기는 검은색 박스로 구분된다. 카밧 (Kabat) CDR에 상응하는 아미노산 잔기는 노란색으로 강조된다.
I형 경막 당단백질인 MUC1은 많은 암 세포 상에서 발현되고 또한 정상 세포에서 일부 발현을 나타낸다. 종양 세포에서, MUC1은 공동-국재하고 EGFR과 상호작용하고, 그들 상호작용은 리간드-활성화된 EGFR 분해를 차단한다. 본 명세서에 개시된 이중특이적 항체-약물 접합체는 MUC1 및 EGFR 둘 모두를 표적화한다. 동일 항체로 MUC1 및 EGFR 둘 모두를 표적화하여서, 본 명세서에 개시된 면역접합체는 항체 내재화 및 종양 성제 억제 또는 종양 성장 감소를 증강시킬뿐만 아니라, 또한 그들은 암 세포에 대해 더 높은 특이성으로 결합할 수 있어서, 정상 세포에 대한 효과를 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체-약물 접합체 (ADC)는 조직 유형, MUC1 및 EGFR에 대한 발현 패턴, 및 EGFR 돌연변이 상태가 다양한, 광범위 암에 걸쳐 치료적 효과가 입증된다. 게다가, 본 명세서에 개시된 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC는 다양한 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자-유래 이종이식 모델에서 단일특이적 ADC와 비교하여 우수한 종양 성장 억제 또는 감소를 입증하였다.
정의
본 명세서에서 사용되는, 용어 "약," "대략," 및 "비슷한"은 값과 관련하여 본 명세서에서 사용할 때 언급된 값의 문맥에서 언급된 값과 유사한 값을 의미한다. 일반적으로, 문맥에 익숙한, 당업자는 그 문맥에서 "약," "대략," 및 "비슷한"에 의해 포괄되는 관련 분산 정도를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용어 "약", "대략" 및 "비슷한"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 이내인 값의 범위를 포괄할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "항체"는 그의 아미노산 서열이 지정된 항원, 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 및 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명에 따른 항체는 임의 유형 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM) 또는 아형 (예를 들어, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 것일 수 있다. 당업자는 항체의 특징적인 서열 또는 부분이 항체의 하나 이상의 영역 (예를 들어, 가변 영역, 초가변 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 및 이의 조합)에서 발견되는 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항체의 특징적인 서열 또는 부분이 하나 이상의 폴리펩티드 사설을 포함할 수 있고, 동일한 폴리펩티드 사슬 또는 상이한 폴리펩티드 사슬에서 발견되는 서열 구성요소를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부분을 포함하고, 이러한 일부분은 여전히 항원 결합할 수 있다. 전형적으로, 이러한 부분은 항체의 가변 영역을 포함한다. 항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편, 및 나머지 "Fc" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생산하고, 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한다. Fab 단편은 중쇄의 가변 영역 도메인 (VH)과 함께 전체 경쇄, 및 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)으로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가이고, 다시 말해서, 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 갖고, 여전히 항원을 가교시킬 수 있는 대체로 2개 디술피드 연결된 Fab 단편에 상응하는 단일 거대 F(ab')2 단편을 산출한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는, CH1 도메인의 카르복시 말단에 소수의 추가 잔기를 가져서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'를 지정한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드에 의해서 함께 유지되는 2개 중쇄의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 일정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해서 역시 인식되는 영역인, Fc 영역 내 서열에 의해 결정된다.
본 명세서에서 사용되는, "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 부착된 적어도 2개 아미노산의 일련의 연속물을 의미한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 3-5개 아미노산을 포함할 수 있고, 이들 각각은 적어도 하나의 펩티드 결합을 통해서 다른 것에 부착된다. 당업자는 폴리펩티드가 하나 이상의 "비천연" 아미노산 또는 그럼에도 불구하고 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있는 다른 독립체를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있고, 예를 들어, 폴리펩티드는 하나 이상의 공유적으로 연결된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 "폴리펩티드" (예를 들어, 항체 폴리펩티드)는 일부 경우에, 예를 들어 하나 이상의 디술피드 결합 또는다른 수단을 통해서 서로 연결될 수 있는, 둘 이상의 개별 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 어구 "기준 수준"은 일반적으로, 비교 목적을 위해 "정상"으로 간주되는 수준, 예를 들어 적절한 대조군의 수준을 의미한다. 예를 들어, 종양 성장 억제 또는 감소의 문맥에서, "기준 수준"은 관심 치료제를 받지 않은 대상체 , 또는 관심 치료제 이외의 치료 (예를 들어, 현행 표준 치료)를 받은 대상체에서 예상되는 종양 성장의 수준 (예를 들어, 대상체에게 관심 치료제가 투여되기 전 종양 성장의 수준, 또는 관심 치료제를 받지 않은 다른 대상체에서 종양 성장의 수준)을 의미할 수 있다. 기준 수준은 동시에 결정될 수 있거나 또는 사전결정될 수 있고, 예를 들어, 과거 관찰로부터 알려져 있거나 또는 추론할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 어구 "치료적 유효량" 및 "유효량"은 상호교환적으로 사용되고, 바람직한 치료 결과를 획득하기 위해서 필요한 시간 기간 동안 및 용량에서 유효한 양을 의미한다. 치료적 유효량은 인자들 예컨대 질환의 유형 (예를 들어, 암), 질환 상태, 개체의 연령, 성별, 및/또는 체중, 및 개체에서 바람직한 반응을 유발시키는 면역접합체 (또는 이의 약학 조성물)의 능력에 따라 다양할 수 있다. 유효량은 또한 면역접합체 또는 이의 약학 조성물의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료적으로 유리한 효과보다 중대한 양일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 병태 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 병태, 예컨대 암)의 "치료" 또는 병태를 "치료하다"는 유리하거나 또는 바람직한 결과, 예컨대 임상적 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 유리하거나 또는 바람직한 결과는 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 개선; 질환, 장애, 또는 병태 정도의 감소; 질환, 장애 또는 병태의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태; (예를 들어, 원발성 암 및/또는 속발성 전이의) 질환, 장애, 또는 병태의 확산 예방; 질환, 장애, 또는 병태의 진행의 지연 또는 둔화; 질환, 장애, 또는 병태의 개선 또는 완화; 및 검출가능 또는 검출불가능 여부와 무관하게, 관해 (부분 또는 전체)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 질환, 장애, 또는 병태의 "완화"는 치료 부재 하에서 정도 또는 시간 경과와 비교하여, 질환, 장애, 또는 병태의 정도 및/또는 비바람직한 임상 증상이 감소되고/되거나, 진행 시간 경과가 둔화되거나 또는 길어지는 것을 의미한다.
면역접합체
이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체
본 개시의 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체를 포함하는 면역접합체는 일반적으로 (i) 제1 조작된 Fc 도메인 및 단쇄 Fv (scFv)를 포함하는 제1 폴리펩티드로서, scFv는 MUC1에 결합하는 것인 제1 폴리펩티드; (ii) 제2 조작된 Fc 도메인 및 Fab 단편의 중쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드, 및 (iii) Fab 단편의 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩티드를 포함하고, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 함께 EGFR에 결합하는 Fab 단편을 한정한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "Fc 도메인"은 면역글로불린의 CH2 도메인 및CH3 도메인을 의미한다. 따라서, 2개 Fc 도메인의 동종이량체 또는 이종이량체는 Fc 단편이다. 본 개시에 따라 사용되는 Fc 도메인은 그들이 (1) 조작된 CH3 도메인 (본 명세서에 기술된 바와 같음)을 포함하고/하거나, (2) 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다는 의미에서 조작될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "scFv"는 항체로부터의 VH 도메인 및 VL 도메인이 전형적으로 링커를 통해서, 연결된 단일 사슬을 의미하는 당분야에서의 이의 일반 용법에 따라 사용된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "Fab 단편"은 당분야에서의 이의 일반 용법에 따라 사용된다. Fab 단편은 전형적으로 전체 경쇄 (VL 및 CL1 도메인), 중쇄의 가변 영역 도메인 (VH), 및 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다.
일반적으로, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 접합체을 위해 사용하고자 의도된 부위들 또는 사전결정된 부위에 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함한다. 비천연 아미노산은 예를 들어, Fc 도메인에, Fab 도메인의 중쇄에, 또는 둘 모두에 위치될 수 있다. 적합한 비천연 아미노산의 비제한적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-아이오도페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, 및 p-아지도메틸-L-페닐알라닌을 포함한다 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제9,732,161호). 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌 (pAMF)이다.
제1 폴리펩티드에서, 조작된 Fc 도메인은 예를 들어, 조작된 Fc 도메인의 CH2 도메인 및 scFv의 VH 도메인 사이에 개재된 힌지 영역과 함께, scFv에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11로 기재된 것과 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
제2 폴리펩티드에서, 조작된 Fc 도메인은 예를 들어, 조작된 Fc 도메인의 CH2 도메인 및 Fab 단편의 CH1 도메인 사이에 개재된 힌지 영역과 함께, Fab의 중쇄에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12로 기재된 것과 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3으로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3으로 기재된 것과 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
전형적으로, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 제1 조작된 Fc 도메인 및 제2 조작된 Fc 도메인 사이에 형성된 하나 이상의 디술피드 결합을 통해서 공유적으로 연결된다. 제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 또한 전형적으로 제2 폴리펩티드의 중쇄 및 제3 폴리펩티드의 경쇄 사이에 형성된 하나 이상의 디술피드 결합을 통해서 공유적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드의 scFv는 그의 서열이 TRPAP (SEQ ID NO:27)을 포함하는 MUC1 에피토프에 결합한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 예를 들어, 미국 특허 제8,891,912호 및 제9,505,848호에 기술된 바와 같이, 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED)-기반 CH3 이종이량체 플랫폼을 사용해 고안된다. 이러한 플랫폼에서, 각각의 SEED-CH3 도메인은 인간 IgA 및 IgG 서열의 교대 절편을 포함한다. "AG SEED"는 N-말단부 상에 IgA1 서열 절편을 갖는 CH3 도메인을 의미하는 한편, "GA seed"는 N-말단부 상에 IgG1 서열 절편을 갖는 CH3을 의미한다. SEEDbody 항체의 각각의 Fc 이종이량체는 GA SEED와 쌍형성된 AG SEED를 포함한다.
구성체가 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체의 각 사슬 (예를 들어, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 및 제3 폴리펩티드)에 대해 디자인되면, 구성체는 또한 접합 부위로서 사용하려는 특별한 부위에 비천연 아미노산 (본 명세서에 논의된 바와 같음)을 도입시키려는 목적을 위해서 돌연변이유발될 수 있다. 이들 구성체는 당분야에 공지된 임의의 다양한 발현 시스템을 사용해 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체는 세포-무함유 시스템을 사용해 생산된다. 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체는 그들이 생산되는 방법을 반영하는 일정 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 세포-무함유 시스템에서 생산되는 항체는 비글리코실화될 수 있고 이펙터 기능이 결여될 수 있다.
이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체는 추가 단계, 예컨대 접합을 겪기 전에 임의로 정제될 수 있다.
헤미아스텔린 모이어티 및 분자
헤미아스텔린은 튜불린 상의 빈카 결합 부위에 결합하는 해양 해면으로부터 단리된 삼중-펩티드이다. 그리하여, 헤미아스텔린은 유사분열 정지 및 아폽토시스를 촉발시킬 수 있는, 튜불린 중합을 억제 또는 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "헤미아스텔린 분자"는 헤미아스텔린의 적어도 일부 기능 (예를 들어, 튜불린-결합)을 보유하는 헤미아스텔린 또는 헤미아스텔린 유도체를 의미한다. 용어 "헤미아스텔린 모이어티"는 다른 분자에 접합된 헤미아스텔린 분자를 의미한다. 일부 구현예에서, 헤미아스텔린 유도체는 3-아미노페닐-헤미아스텔린이다.
본 명세서에서 더욱 기술하는 바와 같이, 면역접합체 당 헤미아스텔린 모이어티의 개수는 헤미아스텔린 모이어티가 이중특이적 항체의 사슬 내 특정 부위에 삽입된 비천연 아미노산에 접합되는 부위-특이적 접합 방법을 통해서 제어될 수 있다 (참조: 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/055931.)
일부 구현예에서, 각각의 면역접합체는 다수의 헤미아스텔린 모이어티, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 헤미아스텔린 모이어티를 갖는다. 일정 구현예에서, 면역접합체는 4개 헤미아스텔린 모이어티를 함유한다.
접합 및 링커
접합 반응은 작용화된 링커-약물 분자를 사용해 수행될 수 있고, 링커는 절단가능한 링커이다. 무구리 클릭 화학 반응이 일정 작용화 기와 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역접합체는 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체를 그의 구조가 도 1A에 도시된 SC239 링커-약물 분자와 반응시켜 생성된다. SC239는 디벤조시클로옥틴 (DBCO)으로 작용화된 절단가능한 발린 시트룰린 p-아미노벤질알콜 (Val-Cit-PABA) 링커 및 3-아미노페닐-헤미아스텔린을 포함한다 (참조: 예를 들어, WO 2019/0055931 A1).
접합 부위
일반적으로, 비천연 아미노산 잔기는 하나 이상의 모이어티, 예를 들어, 헤미아스텔린 모이어티를 접합시키는데 사용될 수 있는 부위에서 제1, 제2, 또는 제3 폴리펩티드에 도입된다. 따라서, 비천연 아미노산 잔기의 위치는 접합 부위에 상응할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 조작된 Fc 도메인은 2개 비천연 아미노산 잔기를, 예를 들어, EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241 및 F404에 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조작된 Fc 도메인은 2개 이하의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 상의 단쇄 scFv는 비천연 아미노산 잔기를, 예를 들어, 중쇄 가변 도메인 내에, EU 지수에 따른 위치 S7, T22, 또는 이의 조합에 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 조작된 Fc 도메인은 비천연 아미노산 잔기를, 예를 들어, EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241에 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 조작된 Fc 도메인은 1개 이하의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, Fab 단편은 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 내 Fab 단편의 중쇄는 비천연 잔기를, 예를 들어, EU 지수에 따른 중쇄 위치 S136, Y180, S190, 또는 이의 조합에 포함한다. 일부 구현예에서, Fab 단편은 1개 이하의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 내 Fab 단편의 중쇄는 비천연 아미노산 잔기를, EU 지수에 따른 중쇄 위치 Y180에 포함한다.
예시적인 접합체
일정 구현예에서, 면역접합체는 하기 화학식 II에 표시된 구조를 갖는다:
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식에서, n은 1 초과이다. 일부 구현예에서, n은 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 구현예에서, n은 4이다.
약학 조성물
일정 구현예에서, 제공되는 면역접합체는 대상체에게 투여에 적합한 약학 조성물로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 도입된다. 본 명세서에서 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리적으로 상용성인 임의의 다양한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 데스트로스, 글리세롤, 에탄올 등을 비롯하여, 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 등장화제 또는 안정화제를 포함한다. 이러한 등장화제 또는 안정화제의 비제한적인 예는 당류 (예를 들어, 수크로스), 다가알콜 (예를 들어, 만니톨 또는 솔비톨), 및 소듐 클로라이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 증량제 및/또는 동결보호제 (예를 들어, 만니톨 또는 글리신), 완충제 (예를 들어, 포스페이트, 아세테이트, 또는 히스티딘 완충제), 계면활성제 (예를 들어, 폴리솔베이트), 항산화제 (예를 들어, 메티오닌), 및/또는 금속 이온 또는 킬레이트화제 (예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA))를 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 본 명세서에 개시된 면역접합체의 저장 수명 및/또는 유효성을 증강시킬 수 있는, 하나 이상의 보조 물질 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 (예를 들어, 벤질 알콜) 또는 완충제를 포함한다.
약학 조성물은 임의의 다양한 형태로 제공될 수 있다. 이들은 예를 들어, 액상, 반고형 및 고형 제형, 예컨대 액상 용액 (예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산물 또는 현탁물, 정제, 알약, 분말, 리포솜, 및 좌제를 포함한다. 일정 형태의 적합성은 의도하는 투여 방식 및 치료적 적용에 의존할 수 있다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 주사용 또는 주입용 용액의 형태이다.
약학 조성물은 전형적으로 제조, 운송, 및 보관 조건 하에서 멸균되고 안정하다. 약학 조성물은 예를 들어, 용액, 미세에멀션, 분산물, 리포솜, 또는 다른 정렬된 구조로서 제제화될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 높은 약물 농도에 특히 접합한 구조로서 제제화된다. 예를 들어, 멸균 주사용 용액은 본 명세서에 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합과 함께 적절한 용맥 중에 바람직한 양의 치료제 (예를 들어, 면역접합체)를 혼입시키고, 임의로 이후 멸균 (예를 들어, 필터 멸균)하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산물은 기본 분산 매질 및 다른 성분(들) 예컨대 본 명세서에 언급된 추가 성분을 함유하는 멸균 비히클에 면역접합체를 혼입시켜서 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법의 예는 예를 들어, 이전에 이의 멸균-여과 용액으로부터의 면역접합체 및 임의의 추가의 바람직한 성분(들)의 분말을 산출하기 위한 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
용액의 적절한 유도성은 예를 들어, 레시틴같은 코팅제의 사용에 의해서, 일정 입자 크기 (예를 들어, 분산물 경우)를 유지시켜서, 및/또는 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 예를 들어, 흡수를 지연시키는 작용제 (예를 들어, 모노스테아레이트 염 및/또는 젤라틴)를 조성물에 포함시켜서 야기시킬 수 있다.
치료 방법
본 명세서에 개시된 암을 치료하는 방법은 일반적으로, 이를 필요로 하는 포유동물 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 본 개시의 면역접합체 (또는 이의 약학 조성물)의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 갖는다고 진단된다.
치료적 유효량은 단일 용량을 통해서 또는 다수 용량 (예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10 용량)을 통해서 투여될 수 있다. 다수 용량을 통해 투여될 때, 정규 간격 (예를 들어, 2일에 1회, 3일에 1회, 4일에 1회, 5일에 1회, 주 3회, 주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 등)을 포함한, 임의의 다양한 적합한 치료 용법이 사용될 수 있다.
치료 방법에 효과적인 용량 용법 (예를 들어, 각 치료제의 양, 요법의 상대적 시기 등)은 질환 또는 병태의 중증도 및 대상체의 체중 및 일반 상태에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간)에 적용되는 치료제를 포함하는 특정 조성물의 치료적 유효량은 포유동물의 연령, 체중, 및 상태의 개별 차이를 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 치료적으로 유효하고/하거나 최적인 양은 또한 당업자가 경험적으로 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 3일마다 0.4 mg/kg 내지 3일마다 20 mg/kg의 용량이 투여된다. 면역접합체 및 이의 약학 조성물은 제한없이, 전신 경로 예컨대 비경구 (예를 들어, 정맥내 또는 피하) 또는 장 경로를 포함한, 임의의 다양한 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
일정 구현예에서, 대상체는 암을 갖는다고 진단된다.
암
일부 구현예에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 예를 들어, 암은 유방암, 폐암, 식도암, 두경부암, 자궁경부암, 난소암, 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암이다. 일부 구현예에서, 암은 폐암, 예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 예컨대, 선암종 및/또는 편평 세포 암종을 포함하는 NSCLC이다. 일부 구현예에서, 암은 식도암, 예를 들어, 편평 식도암이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암, 예를 들어, 두경부 편평 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 암은 자궁경부암이다. 일부 구현예에서, 암은 난소암이다. 일부 구현예에서, 암은 위암이다. 일부 구현예에서, 암은 중피종이다. 일부 구현예에서, 고형 종양은 전이성이다.
일부 구현예에서, 암은 비-고형 종양, 예를 들어, 다발성 골수종을 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 EGFR에 유전형적으로 야생형인 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 EGFR의 돌연변이체 형태를 발현하는 세포를 포함한다. 암과 연관된 EGFR 돌연변이의 예는 결실 돌연변이 (예를 들어, 엑손 19 결실), 점 돌연변이 (예를 들어, L858R 돌연변이), 삽입 돌연변이 (예를 들어, 엑손 20 삽입), 및 유전자 증폭을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 EGFR 돌연변이는 변경된 EGFR 발현 수준, 예를 들어, EGFR의 과발현을 초래한다. 일부 EGFR 돌연변이는 불량한 예후 및/또는 표적화된 EGFR 억제제에 대한 내성과 연관된다.
일부 구현예에서, 암은 MUC1에 대해 유전형적으로 야생형인 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 암은 MUC1의 돌연변이체 형태를 발현하는 세포를 포함한다. 암과 연관된 MUC1 돌연변이의 예는 점 돌연변이 (예를 들어, T112P)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 MUC1 돌연변이는 변경된 MUC1 발현 수준, 예를 들어, MUC1의 과발현을 초래하고, 이것은 일부 암에 대한 불량한 예후과 연관된다.
암 세포는 저/중간 또는 고 수준의 EGFR 발현을 비롯하여, 저/중간 또는 고 수준의 MUC1 발현 (예를 들어, 저/중간 수준의 EGFR 및 저/중간 수준의 MUC1; 고 수준의 EGFR 및 저/중간 수준의 MUC1; 저/중간 수준의 EGFR 및 고 수준의 MUC1; 및 고 수준의 EGFR 및 고 수준의 MUC1)을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 유전자 생산물의 저, 중간, 또는 고 수준 (과발현 포함)에 상응하는 수치 수준은 특정한 유전자 생산물에 따라서 다양할 수 있고 임의의 다양한 수단, 예컨대 표면 발현의 평가 (예를 들어, FACS에 의한 세포 표면 염색), IHC에 의한 단백질 발현, 전사물 수준 (예를 들어, RNASeq 또는 qPCR에 의함) 등에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, "고 수준의 MUC1"을 발현하는 암 세포는 (1) 200 초과의 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 항-MUC1 항체/MFI 이소타입) (예를 들어, 실시예 7에 기술된 바와 같이, FACS를 통해 결정됨); (2) WISH 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 WISH (자궁경부암) 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 고 수준; 및 (3) OVCAR-3 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 OVCAR-3 (난소암) 세포에 의해 발현되는 것에 비해 고 수준 중 하나 이상을 특징으로 하는 수준으로 MUC1을 발현하는 암 세포이다.
일부 구현예에서, "중간 수준의 MUC1"을 발현하는 암 세포는 (1) 100 초과이지만 200 이하인 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 항-MUC1 항체/MFI 이소타입) (예를 들어, 실시예 7에 기술된 바와 같이 FACS에 의해 결정됨); (2) OVCAR-3 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 OVCAR-3 세포에 의해 발현되는 것과 비슷한 수준; 및 (3) (i) MDA-MD-468 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 MDA-MD-468 (유방암) 세포에 의해 발현되는 것에 비해 고 수준 및 (ii) WISH 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 WISH 세포에 의해 발현되는 것에 비해 저 수준 중 하나 이상을 특징으로 하는 수준으로 MUC1을 발현하는 암 세포이다.
일부 구현예에서, "저 수준의 MUC1"을 발현하는 암 세포는 (1) 100 이하의 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 항-MUC1 항체/MFI 이소타입) (예를 들어, 실시예7에 기술된 바와 같이 FACS에 의해 결정됨); (2) MDA-MD-468 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 MDA-MD-468 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준; (3) OVCAR-3 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 OVCAR-3 세포에 의해 발현되는 것에 비해 저 수준; (4) NCI-H292 (비-소세포 폐암) 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준; (5) HCC827 (비-소세포 폐암) 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준; 및 (6) NCI-H1975 (비-소세포 폐암) 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준 중 하나 이상을 특징으로 하는 수준으로 MUC1을 발현하는 암 세포이다.
일부 구현예에서, "고 수준의 EGFR"을 발현하는 암 세포는 (1) 200 초과의 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 항-EGFR 항체/MFI 이소타입) (예를 들어, 실시예7에 기술된 바와 같이 FACS에 의해 결정됨); (2) MDA-MD-468 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 MDA-MD-468 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 고 수준; (3) HCC827 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 HCC827 (비-소세포 폐암) 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 고 수준; 및 (4) NCI-H292 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 NCI-H292 (비-소세포 폐암) 세포에 의해 발현되는 것에 비해 고 수준 중 하나 이상을 특징으로 하는 수준으로 EGFR을 발현하는 암 세포이다.
일부 구현예에서, "중간 수준의 EGFR"을 발현하는 암 세포는 (1) 100 초과지만 200 이하인 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 항-EGFR 항체/MFI 이소타입) (예를 들어, 실시예7에 기술된 바와 같이 FACS에 의해 결정됨); (2) NCI-H292 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 NCI-H292 세포에 의해 발현되는 것과 비슷한 수준; (3) (i) WISH 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 WISH 세포에 의해 발현되는 것에 비해 고 수준, 및 (ii) MDA-MD-468 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 MDA-MD-468 세포에 의해 발현되는 것에 비해 저 수준; (4) (i) OVCAR-3 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 OVCAR-3 세포에 의해 발현되는 것에 비해 고 수준 및 (ii) MDA-MD-468 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 MDA-MD-468 세포에 의해 발현된 것에 비해 저 수준; 및 (5) (i) NCI-H1975 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 NCI-H1975 (비-소세포 폐암) 세포에 의해 발현되는 것에 비해 고 수준 및 (ii) HCC827 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 HCC827 세포에 의해 발현되는 것에 비해 저 수준 중 하나 이상을 특징으로 하는 수준으로 EGFR을 발현하는 암 세포이다.
일부 구현예에서, "저 수준의 EGFR"을 발현하는 암 세포는 (1) 100 이하의 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 항-EGFR 항체/MFI 이소타입) (예를 들어, 실시예7에 기술된 바와 같이 FACS에 의해 결정됨); (2) WISH 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 WISH 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준; (3) OVCAR-3 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 OVCAR-3 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준; (4) NCI-H1975 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 NCI-H1975 세포에 의해 발현되는 것과 비슷하거나 또는 그에 비해 저 수준; 및 (5) NCI-H292 세포에 대한 표준 세포 배양 조건에서 성장된 NCI-H292 세포에 의한 것에 비해 저 수준 중 하나 이상의 수준으로 EGFR을 발현하는 암 세포이다.
일부 구현예에서, 암은 EGFR 돌연변이체 상태, EGFR 발현 수준, 및 MUC1 발현 수준 중 하나 이상에 대해 이종성이다. 일부 이러한 이종성 암에서, 암은 (EGFR 돌연변이체 상태, EGFR 발현 수준, 및/또는 MUC1 발현 수준에 대해서) 하나 또는 다른 세포 유형을 주로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 암은 암 세포의 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 그 세포 유형의 것일 때 세포 유형을 "주로" 포함한다고 기술된다.
일부 구현예에서, 투여는 대상체에서 측정가능한 개선을 일으킨다. 예를 들어, 이러한 개선은 종양 성장 억제 (TGI), 종양 성장 감소, 종양 퇴행, 전이의 억제 또는 감소, 개선된 생존, 또는 암 상태 또는 진행을 의미하는 임의 임상 징후의 개선 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다. 종양 성장은 예컨대, 추정 또는 측정된 종양 부피같은 측정을 통해서 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 종양 성장 억제 또는 감소는 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% (예를 들어, 치료를 받지 않은 대상체에서의 종양 부피를 나타내는 기준 값같은, 기준에 비해 더 낮은 종양 부피 기반)이다. 일부 구현예에서, 투여는 종양의 퇴행, 즉 면역접합체를 포함한 치료 용법의 개시 시 크기에 비해서 체내에서 종양 크기 또는 암 정도의 감소를 일으킨다. 이러한 종양 퇴행은 부분적 (즉, 일부 종양 또는 암이 잔존)일 수 있거나 또는 완전 (예를 들어, 종양 부피가 대략 0에 도달하고/하거나 종양이 더 이상 측정불가 또는 검출불가함)할 수 있다.
실시예
하기 특정 실시예는 단지 예시로서 해석되어야 하고, 임의의 방식으로 본 개시의 나머지를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1. 항-MUC1 scFv 서열을 개발하기 위한 서열 최적화 및 친화성 성숙화
항-MUC1 scFv (H02)는 리보솜 디스플레이 선택을 사용해 항-MUC1 항체 HT186-D11의 친화성 성숙화를 통해 개발되었다 (참조: Thie H. et al. PLoS One 201, 6, 1, e15921). scFv 라이브러리 경우, CDR H1, H2, H3 및 L3 (SEQ ID NO: 4, 5, 6, 및 9)을 표적화하였다. 다음으로 scFv 리보솜 디스플레이 선택이 MUC의 바이오틴화된 합성 VNTR 펩티드 (APDTRPAPGSTAPPAC-바이오틴) (SEQ ID NO:10)에 대해 수행되었다.
항체 변이체는 특히 항체 변이체의 약물 접합체 (ADC)에 의한, MUC1-발현 세포 (WISH, MDA-MB-468, 및 OVCAR-3 암 세포와 MUC1-음성 대조군으로서 HepG2 세포)에 대한 결합 (추가 상세사항에 대해 실시예 4 참조), MUC1의 바이오틴화된 합성 VNTR 펩티드 (APDTRPAPGSTAPPAC-바이오틴; SEQ ID NO:10)에 대한 결합, 결합 동역학, 저장 안정성, 및 MUC-1 양성 세포의 세포 사멸을 기반으로 스크리닝되고 특징규명되었다.
ADC는 무세포 발현 시스템을 사용한 부위-특이적 접합 및 SC239 (절단가능한 링커-헤미아스텔린 유도체)와의 접합 (SC239에 관한 상세사항에 대해 실시예 3 참조)을 통해 생성되었다.
도 20은 부모 항체HT186-D11 및 친화성 성숙화 동안 수득된 항체로부터의 중쇄 가변 서열의 서열 정렬을 도시한다. 초티아 상보성-결정 영역 (CDR)에 상응하는 아미노산 잔기는 검은색 박스로 표시된다. 카밧 CDR에 상응하는 아미노산 잔기는 회색으로 음영표시된다.
이들 연구를 기반으로, 항체 변이체 "1993-H02" (이하 H02)가 선택되었고 scFv로서 개발되었다. H02 서열의 결합 특징의 요약은 표 1A에 제공되고; 세포 사멸 어세이 결과의 요약은 표 1B에 제공된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 2. 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체의 구축
이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체는 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED)-기반 CH3 이종이량체 플랫폼을 사용해 개발되었다 (예를 들어, 미국 특허 제8,891,912호 및 제9,505,848호 참조).
이중특이적 항체 (이하 "분자 10")는
- 인간 IgG1 Fc에 융합된 항-MUC1 scFv (H02) (AG SEED); 및
- 인간 IgG1 Fc에 융합된 항-EGFR Fab (인간화 세툭시맙 유래) (GA SEED)
의 이종이량체로서 디자인되었다.
항-MUC1 scFvFc (AG SEED), IgG1 Fc에 융합된 항-EGFR Fab의 중쇄 (GA SEED), 및 항-EGFR Fab의 경쇄를 코딩하는 발현 구성체를 구축하였다. 단백질 발현 및 이종이량체 형성 시, 최종 생산물은 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체 (H02/hC225 SEED, 또는 "분자 10")이다.
실시예 3에 기술된 접합 부위 최적화 연구의 목적을 위해서, 유사한 방법을 사용하여 유사한 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체 (D11/hC225)를 구축하였다. D11/hC225에서, 항-MUC1 팔부는 인간 IgG1 Fc에 융합된 HT186-D11 scFv (AG SEED) (H02가 개발된 부모 서열; 실시예 1 참조)를 기반으로 하고, 항-EGFR 팔부는 IgG1 Fc에 융합된 인간화 세툭시맙의 Fab (hC225) (GA seed)를 기반으로 하였다.
실시예 3. 3-아미노페닐-헤미아스텔린에 접합된 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체인, 분자 1의 합성 ("이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC")
XpressCF+™ (Sutro Biopharma) 무세포 발현 시스템 및 부위-특이적 접합 방방법 (예를 들어, 미국 특허 제9,732,161호 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2019/055931 A1 참조)을 사용하여 실시예 1에 기술된 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체 H02/hC225 SEED (분자 10)를 기반으로 항체-약물 접합체를 생성시켰다.
접합 부위를 최적화하기 위한 초기 실험을 위해서, D11/hC225 (AG SEED)의 항-MUC1 팔부 및 D11/hC225의 항-EGFR 팔부의 중쇄 (GA SEED) (실시예 1 참조)는 비천연 아미노산 파라-아지도 메틸 L-페닐알라닌 (pAMF)을 TAG 부위 (앰버 중지 코돈)에 도입시켜서 돌연변이유발시켰다. 일련의 돌연변이체가 각각의 팔부 (항-MUC1 scFvFc (AG SEED) 팔부 또는 항-EGFR Fab(중쇄)Fc (GA SEED) 팔부)에 대해 생성되었고, 각각의 돌연변이체는 도입된 오직 하나의 pAMF 잔기를 갖는다. 각 돌연변이체 팔부 내 pAMF 잔기는 튜불린-표적화 3-아미노페닐 헤미아스텔린 및 디벤조시클로옥틴 (DBCO)으로 작용화된 절단가능한 발린 시트룰린 p-아미노벤질알콜 (Val-Cit-PABA) 링커를 포함하는, SC239를 사용한 무-구리 클릭 화학을 통해 헤미아스텔린 유도체에 접합되었다 (예를 들어, WO 2019/0055931 A1 참조).
SC239는 하기 화학식 I로 표시된 구조를 갖는다:
Figure pct00005
접합된 항-MUC1 scFvFc (AG) 및 항-EGFR Fab(중쇄)Fc (GA) 팔부는 MUC1 및 EGFR 각각에 대한 결합, 및 MDA-MB-468 (인간 유방암) 세포 사멸에 대해 시험관내에서 개별적으로 시험되었다. 항-MUC1 scFvFc (AG) 및 항-EGFR Fab(중쇄)Fc (GA) 팔부의 조합을 또한 EGFR에 대한 결합, MUC1에 대한 결합, 및 MDA-MB-468 세포 사멸에 대해 시험관내에서 시험하였다. 제조가능성에 영향을 미치는 인자들, 예컨대 단백질 발현, 수율, 및 열안정성을 또한 고려하였다.
접합 부위 최적화 연구 결과를 기반으로, 하기 접합 부위를 선택하였고, 모든 위치는 EU 지수에 따라 번호매김되었다:
- 항-MUC1 scFv 상의 중쇄 위치 F404;
- 항-MUC1 scFv 상의 중쇄 위치 F241;
- 항-EGFR Fab 상의 중쇄 위치 F241; 및
- 항-EGFR Fab 상의 중쇄 위치 Y180.
이들 접합 부위를 사용하여, 학기 화학식 II의 구조를 갖는 ADC (도 1B에도 도시됨) (n =4)가 실시예 2에 기술된 H02/hC225 SEED 이중특이적 항체 (분자 10)에 대한 서열을 사용해 합성되었다.
Figure pct00006
이러한 ADC (이하 "분자 1")는 대략 4의 약물-항체-비율을 갖고, 항-MUC1 scFvFc (AG SEED), 항-EGFR Fab(중쇄)Fc (GA SEED), 및 항-EGFR Fab (경쇄)를 갖는 이중특이적 항체를 포함하며, H02/hC225 SEED 이중특이적 항체는 Val-Cit-PABA 절단가능한 링커를 통해서 3-아미노페닐-헤미아스텔린 분자에 상기 언급된 접합 부위의 각각에서 접합되었다.
실시예 4-20에서 사용되는 분자
표 2는 실시예 4-20에 기술된 실험에서 사용된 분자를 요약한다.
특히, 분자 1, 2, 및 3은 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된, 항체-약물 접합체이다. 분자 10은 실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 이중특이적 항체이다. 분자 9 및 11은 단일-특이적 항체이다. 분자 12-15는 당분야에 공지된 소형 분자 EGFR 티로신 키나제 억제제 (TKI)이다 (참조: 예를 들어, Hirano et al., In vitro modeling to determine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors against clinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer. Oncotarget 2015, 6, 38789-38803).
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 4. 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC는 시험관내에서 암 세포를 효과적으로 사멸시킨다
암 세포에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효과를 평가하기 위해서, 세포 사멸 어세이가 다양한 수준의 MUC1 및 EGFR을 발현하는 다양한 인간 암 세포: MDA-MD-468 (유방암; MUC1+/EGFR+++), WISH (자궁경부암; MUC1+++/EGFR+), OVCAR-3 (난소암; MUC1++/EGFR+), 및 HepG2 (간 암; MUC1 및 EGFR의 낮지만 0이 아닌 발현을 가짐) 세포를 사용해 분자 1에 대해 수행되었다. 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC는 비-암성 CHO-k (중국 햄스터 난소; MUC1-/EGFR-) 세포에서 시험되었다.
방법
WISH, OVCAR-3, HepG2, MDA-MB-468, 및 CHO-k 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구매하였고, 세포는 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청 (Thermo Fisher Scientific®), 2 mM 글루타맥스 (Thermo Fisher Scientific®), 및 1x 페니실린/스트렙토마이신 (Corning®)이 보충된 DMEM/F12 (1:1), 고포도당 (Corning®)에서 유지시켰다.
암 세포에 대한 ADC의 세포독성 효과는 세포 증식 어세이로 측정되었다. 25 ㎕ 부피 중 총 625 세포를 실제 어세이 시작 전날 384-웰 편평 바닥 백색 폴리스티렌 플레이트에 파종하였다. ADC 및 유리 약물은 세포 배양 배지 중에 2x 출발 농도로 제제화하였고, SpinX 0.22 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 여과하여 2 mL 원심분리 튜브 (Corning® Costar®)에 넣었다. 필터 멸균된 샘플을 멸균 조건 하에서 연속 희석 (1:3)하였고, 25 ㎕의 각 희석물을 삼중으로 세포에 첨가하였다. 플레이트는 37℃의 CO2 인큐베이터에서 120시간 동안 배양하였다. 세포 생존능 측정을 위해서, 30 ㎕의 Cell Titer-Glo® 시약 (Promega™ Corp, Madison, WI)을 각 웰에 첨가하였고, 플레이트는 제품 설명서에 따라 처리하였다. 상대 발광도는 ENVISION® 플레이트 판독기 (Perkin-Elmer; Waltham, MA)에서 측정되었다. 상대 발광도 판독치는 대조군으로서 미처리 세포를 사용해 생존능%로 전환시켰다. 데이터는 GraphPad Prism을 사용하여, log (억제제) 대 반응, 변수 기울기, 4-매개변수 적합 방정식을 사용해, 비-선형 회귀 분석으로 적합화하였다. 데이터는 삼중물의 표준 편차 (SD)를 나타내는 오차 막대와 함께 상대 세포 생존률% 대 ADC의 용량 (나노몰)로서 표시되었다.
결과
실시예 2에 기술된 바와 같이 생성된 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)의 세포 사멸 활성은 EGFR 및 MUC1 항원의 발현 수준이 다양한 세포들에서 평가되었다. 동일 약물 (3-아미노페닐-헤미아스텔린)을 포함하는 하기 단일특이적 ADC가 항-EGFR 항체와 함께, 대조군으로서 사용되었다:
- 항-MUC1 ADC (분자 2)
- 항-EGFR ADC (분자 3)
- 상업 등급 세툭시맙 (항-EGFR 항체) (분자 9)
- 항-GFP ADC (분자 4).
세포 사멸 곡선 (도 2) 및 결과는 (표 3)에서 IC50 (곡선의 중간점, 또는 최대 억제의 50%가 관찰된 농도)을 비롯하여 사멸 범위 (시험 물품의 최대 효과 수준에서 미처리 대조군에 비해 더 이상 생존할 수 없는 세포의 전체 백분율, %효능)로서 기록된다.
Figure pct00009
MUC1 및 EGFR을 공-발현하는 모든 3종 암 세포주에서, 분자 1은 MUC1 및 EGFR 발현 수준과 독립적으로, 높은 효능으로 강력하게 세포 생존능을 억제하였다.
MDA-MB-468 세포에서, 항-EGFR ADC (분자 3)는 항-Muc1 ADC (분자 2)에 비해서 훨씬 더 양호한 세포 사멸을 보였고 (도 2), 이것은 MDA-MB-468 세포가 세포 표면 상에서 MUC1에 비해서 EGFR의 더 높은 발현을 갖는다는 이전 결과와 충분히 상관된다. 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)의 세포 사멸 활성은 항-EGFR ADC (분자 3)의 것과 유사하였고 (도 2), 이 세포주에서 높은 EGFR 발현을 반영할 수 있다.
WISH 세포에서, 항-EGFR ADC (분자 3)는 세포 사멸 활성을 보이지 않았지만 항-MUC1 ADC (분자 2) 및 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)는 강력한 세포 사멸 활성을 보였으며 (도 2), 이것은 WISH 세포가 세포 표면 상에서 EGFR에 비해서 MUC1의 더 높은 발현을 갖는다는 이전 결과와 상관있었다.
OVCAR-3 세포에서, 항-EGFR ADC (분자 3) 및 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)는 항-MUC1 ADC (분자 2)에 비해서 더 강력한 세포 사멸을 보였지만, 항-EGFR ADC (분자 3)의 효능 (세포 사멸 범위) (65%)은 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1) (88%) 및 항-MUC1 ADC (분자 2) (89%)의 것에 비해 더 낮았다 (도 2).
OVCAR-3 세포에 대한 최고 농도를 제외하고, 시험된 임의 세포에 대해 항-GFP ADC로부터 비-특이적 세포 사멸 활성은 관찰되지 않았다 (도 2). CHO-k 세포에서, 시험된 어떠한 ADC도 임의의 세포 사멸 활성을 보이지 않았다 (도 2).
종합적으로, 이들 결과는 대부분의 농도에서, 분자 1이 MUC1 및 EGFR 둘 모두를 발현하는 암 세포를 특이적으로 사멸시킨다는 것을 의미한다.
실시예 5. 시험관내에서 정상 세포에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효과
정상 (비-암성) 세포에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효과를 결정하기 위해서, 세포 사멸 어세이가 분자 1을 사용해 HeKn 세포 (초대 정상 인간 상피 케라티노사이트, 신생) 및 MCF-10a 세포 (비-종양원성 유방 상피 세포)에서 수행되었다. 비교를 위해서, 동일한 어세이가 분자 1을 사용해 MDA-MB-468 세포 (인간 전이성 유방암) 및 OVCAR-3 세포에 대해 수행되었다.
방법
MDA-MB-468 세포는 10% 태아 소 혈청 (FBS) (Millipore® Sigma) 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco®, Thermo Fisher Scientific® 또는 Millipore® Sigma)가 보충된 안정한 300 mg/L L-글루타민 및 2.0 g/L NaHCO3 (Millipore®Sigma, Billerica, MA, USA) 존재의 RPMI1640에서 배양되었다.
OVCAR-3 세포는 20% FBS, 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco® Thermo Fisher Scientific® 또는 Millipore® Sigma), 10 ㎍/mL 인슐린 (Millipore® Sigma)이 보충된 안정한 300 mg/L의 L-글루타민 및 2.0 g/L의 NaHCO3 존재의 RPMI1640에서 배양되었다.
초대 인간 상피 케라티노사이트, 신생 (HeKn)은 코팅 매트릭스로 코팅된 플라스크 상에서 인간 케라티노사이트 성장 보충물 (HKGS)을 포함하는 기초 EpiLife™ 배지 중에 배양되었다 (모두 Thermo Fisher Scientific® Waltham, MA, USA에서 구매된 Gibco®).
비-종양원성 유방 상피 세포인, MCF-10A 세포를 또한 성장시켰고 시험에 사용하였다. MCF 10A 세포는 10% 말 혈청 (Gibco® Thermo Fisher Scientific®) 및 20　ng 상피 성장 인자 (EGF) (Sigma)를 비롯하여 500　ng 히드로코르티손 (Millipore® Sigma)을 포함하는 안정한 글루타민이 존재하는 Ham's F12 (Biochrom) 및 안정한 글루타민이 존재하는 1:2 DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium) (Millipore® Sigma/ Biochrom)에 배양하였다.
세포에 대한 분자 1의 세포독성 효과는 세포 증식 어세이로 측정되었다. 세포 단층을 1회 Gibco® D-PBS (Thermo Fisher Scientific®)로 세척하였고, 세포는 ACCUTASE® (Millipore® Sigma) 또는 Gibco® 트립신/EDTA (#R-001-100) 및 트립신 중화제 (Gibco® #R-002-100)를 사용해 탈착시켰다. 생존 세포는 0.4% Gibco® 트립판 블루 용액 (Thermo Fisher Scientific®)을 사용해 자동화 세포 계측기 LUNA 또는 LUNA-FL™ (Logos Biosystems, Annandale, Virginia, USA)으로 계측하였다. 총 2,000 세포를 96웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트 (Thermo Fisher Scientific®)의 웰 당 100 ㎕ 세포 배양 배지 (Hekn 또는 MDA-MB-468 세포) 또는 90 ㎕ 세포 배양 배지 (OVCAR-3 또는 MCF-10 a 세포)에 파종하였고, 37℃에 CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날에, Hekn 및 MDA-MB-468 세포 경우에, 배지는 FBS 양이 감소된 (3%) 90 ㎕의 신선한 세포 배양 배지로 교체하였다. 동일한 배지를 사용하여 ADC의 10배 출발 농도 및 개별 연속 희석물 (1:4)을 제조하였다. MCF-10a 세포 또는 OVCAR-3 세포 경우에, 배지 변화는 없었다. ADC의 10배 출발 농도 및 1:4의 개별 연속 희석은 개별 세포 배양 배지를 사용해 수행되었다. 개별 웰에 10 ㎕ ADC 용액 (모든 처리는 삼중으로 수행됨)을 공급하였고 플레이트는 37℃에 CO2 인큐베이터에서 144시간 동안 배양되었다. 이후에, 100 ㎕의 Cell Titer-Glo® 시약 (Promega Corp, Madison, WI, USA)을 각 웰에 파이펫팅하여 넣고, 플레이트는 제조사 설명서에 따라서 세포 생존능 측정을 위해 추가로 처리하였다. 발광 신호는 Varioskan® Flash 플레이트 판독기 또는 Lux 플레이트 판독기 (Thermo Fisher Scientific®)에서 측정되었다. 상대 발광 단위의 미가공 데이터는 배경값 (세포 대조군 없음, 배지 단독)을 차감하고 생존능% (미처리 대조군 세포 = 100%) 또는 효과% (생존능% - 100%)로 전환시켜서 Microsoft® Excel (버전 16.0, Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA)에서 처리하였다. 용량-반응 곡선 및 IC50 값은 Graph Pad Prism (버전 8.2.0, Windows®용, GraphPad software, La Jolla California USA, www.graphpad.com)에서 비-선형 회귀 분석 함수 (log(억제제) 대 반응-변수 기울기 (MDA-MB-468 세포 또는 Hekn 세포 경우 3개 매개변수; OVCAR-3 및 MCF-10a 세포 경우 4개 매개변수))를 사용해 데이터 전환 및 후속 데이터 적합화를 통해 수득하였다. 데이터는 기술적 삼중물의 SD를 표시하는 오차 막대와 함께 효과% 대 ADC 농도 [nM]로 표시되었다.
결과
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)는 케라티노사이트 세포 생존능 및 비-종양 상피 세포에 대해 최소 효과를 보였다 (도 3 및 표 4).
Figure pct00010
분자 1은 MDA-MB-468 세포 (효과%: 최고 농도에서 -99)와 비교하여 Hekn (효과%: 최고 농도에서 -54) 및 MCF-10A (효과%: 최고 농도에서 -12)에 대해 감소된 세포 사멸 효능을 보였다. 더 나아가서, 분자 1은 케라티노사이트 (IC50: 82 nM)와 비교하여 MDA-MB-468 암 세포 (IC50: 0.05 nM)에 대해서 >1000x배 더 높은 역가를 보였다.
따라서, 도 3에 도시된 바와 같이, 일정한 농도 범위 상에서, 분자 1은 MDA-MB-468 유방 암 세포를 효과적으로 사멸시킨데 반해서 정상 세포에 대해서는 최소 효과를 가졌다.
실시예 6. 암 세포에 의한 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체의 내재화
방법
이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체 (분자 10), 세툭시맙 (항-EGFR 항체) (분자 9) 및 H02 IgG1 (항-MUC1 항체) (분자 11)의 내재화는 암 세포주 MDA-MB-468 및 OVCAR-3 (둘 모두 ATCC, Manassas, VA, USA에서 구매)에 대해서 시험관내에서 평가되었다. MDA-MB-468 세포는 10% FBS 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco® Thermo Fisher Scientific® 또는 Millipore® Sigma)가 보충된 안정한 300 mg/L의 L-글루타민 및 2.0 g/L의 NaHCO3 존재의 RPMI1640에서 배양하였다. OVCAR-3 세포는 20% FBS, 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco® Thermo Fisher Scientific® 또는 Millipore® Sigma), 10 ㎍/mL 인슐린 (Millipore® Sigma)이 보충된 안정한 300 mg/L의 L-글루타민 및 2.0 g/L의 NaHCO3 존재의 RPMI1640에서 배양하였다. 계대배양을 위해서, 세포 단층은 1회 Gibco® D-PBS (Thermo Fisher Scientific®)로 세척하였고, 세포는 Accutase®를 사용해 탈착시켰다. 생존 세포는 0.4% Gibco® 트립판 블루 용액을 사용해 자동화 세포 계측기 LUNA-FL™ 로 계측하였다. 총 6,000 MDA-MB-468 세포 또는 10000 OVCAR-3 세포를 96웰 플레이트 (Corning® NY, USA)의 웰 당 90 ㎕ 세포 배양 배지에 파종하였다. 플레이트는 밤새 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션되었다. 다음 날에, 핵 염색은 Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific®)를 0.5 ㎍/mL의 최종 농도로 사용해 수행하였다. PBS에 제조된 10x 스톡 용액의 10 마이크로리터를 웰 당 첨가하였다. 플레이트는 30분 동안 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션되었다. 배지를 이후에 제거하였고, 웰은 90 ㎕ 신선한 세포 배양 배지가 공급되었다. 시험에 사용된 각각의 항체는 Zenon™ pHrodo™ iFL 적색 인간 IgG 표지화 시약 (Thermo Fisher Scientific®)과 5분 동안 암실에서 인큐베이션하였다 (사용된 단백질:염료 몰 비율: 1:3). 최종 농도 100 nM 항체로 항체-pHrodo™ 혼합물을 웰 당 첨가하였고 (기술적 중복 수행), 이어서 내재화를 개시시키기 위해서 37℃ 및 5% CO2 에서 25분 인큐베이션하였다. 항체-pHrodo™ 혼합물의 첨가 후 30분, 150분, 390분, 24시간, 및 48시간에 측정을 수행하였다. 세포는 하기 이미지화 조건을 사용해 공초점 정량적 이미지 세포계 CQ1 (Yokogawa® Electric Corporation, Tokyo, Japan)로 이미지화하였다: 20x 대물 렌즈, 405 nM 레이저 (Hoechst), 561 nM 레이저 (pHrodo™ iFL 적색). 웰 당 5개 z-스택 이미지를 수집하였고 (z-스택 범위: 20 ㎛, 슬라이드: 1 ㎛), CQ1 소프트웨어 (버전 1.04.02.04, Yokogawa)를 사용하여 핵 주변 특정 면적으로부터 유래된, pHrodo™ 적색 신호의 평균 강도를 정량하여 산성 세포 구획으로 내재화를 결정하였다. 데이터 처리를 위해서, Microsoft® 엑셀 (버전 16.0, Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA) 및 Graph Pad Prism (버전 8.2.0, Windows® 용 GraphPad software, La Jolla California USA)이 사용되었다. 내재화 데이터는 이중물의 표준 편차 (SD)를 표시하는 오차 막대와 평균 강도 대 시간 [시]으로 표시되었다.
결과
내재화 연구를 위해서, 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체 (분자 10)를 비롯하여 단일특이적 대조군 항체 H02 IgG1 (항-MUC1 항체) (분자 11) 및 세툭시맙 (항-EGFR 항체) (분자 9)은 산성 환경에서 형광으로 변하는 Zenon™pHrodo™ iFL 적색 염료 (Thermo Fisher Scientific®)로 표지하였다. 산성 세포 구획으로 pHrodo™ iFL-표지된 항체의 내재화는 CQ1 장치를 사용해 생존 세포를 이미지화하고 pH-감수성 염료의 평균 형광 강도를 측정하여 OVCAR-3 및 MDA-MB-468 세포에서 시간 경과에 따라 평가하였다 (도 4A 및 4B 참조).
MDA-MB-468 및 OVCAR-3 세포에서, 이중특이적 항-MUC1/EGFR 항체 H02/hC225 (분자 10)는 산성 구획으로 신속한 내재화 및 수송을 보였다. 분자 10은 시간 경과에 따라 증가된 평균 형광 강도를 통해 결정하여, 48시간의 인큐베이션 시간 동안 계속 내재화되었다 (도 4A 및 4B). 양쪽 세포주에서, 분자 10에 대해 수득된 평균 형광 강도는 단일특이적 대조군 항체 H02 IgG1 (분자 11) 및 세툭시맙 (분자 9)에 대해 수득된 것과 비교하여 훨씬 더 강력하였다.
실시예 7. 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC는 시험관내에서 야생형 및 돌연변이체 EGFR 암 세포를 사멸시킨다
상이한 EGFR 돌연변이 상태를 갖는 암 세포에 대한 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효과를 결정하기 위해서,EGFR 야생형 (wt) 세포, EGFR 엑손 결실 돌연변이체 세포, 및 EGFR 이중 치환 돌연변이체 세포에 대해 분자 1을 사용해 세포 사멸 어세이를 수행하였다.
방법
NSCLC 세포 NCI-H292 (EGFR 야생형 (wt)), HCC827 (EGFR del E746-A750), 및 NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M)는 모두 ATCC에서 구매하였다. NCI-H292 및 NCI-H1975는 안정한 L-글루타민 (Millipore® Sigma), 10% FBS (Millipore® Sigma) 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco® Thermo Fisher Scientific® 또는 Millipore® Sigma)가 존재하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. HCC827 세포는 안정한 2 mM L-글루타민, 2.5 g/L D-(+)- 포도당 용액 (Millipore® Sigma), 10 mM HEPES (Millipore® Sigma), 10% FBS, 및 1 mM 소듐 피루베이트 (Gibco® Thermo Fisher Scientific® 또는 Millipore® Sigma)가 존재하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다.
NSCLC 세포 상에서 MUC1 또는 EGFR의 발현 수준은 각각 H02 IgG1 (항-MUC1 항체) 또는 세툭시맙 (항-EGFR 항체)을 사용한 FACS에 의해서, 그리고 중간 형광 강도 (MFI) 비율 (MFI 표적-특이적 항체/MFI 이소타입)을 계산하여 평가하였다. 발현 수준은 100 이하의 MFI 비율 경우 +, MFI 비율 >100 경우 ++, 또는 MFI 비율 >200 경우 +++으로 결정되었다. 이에 따라서, NSCLC 세포에 대한 발현 수준은 MUC1+/EGFR++ (NCI-H292 세포), MUC1+/EGFR+++ (HCC827 세포) 또는 MUC1+/EGFR+ (NCI-H1975)로 정의되었다.
세포독성 시험을 위해서, 세포 단층을 1회 Gibco® D-PBS (Thermo Fisher Scientific®)로 세척하였고, ACCUTASE® (Millipore® Sigma)를 사용해 세포 배양 플라스크로부터 탈착시켰다. 생존 세포는 0.4% Gibco® 트립판 블루 용액 (Thermo Fisher Scientific®)을 사용해 자동화 세포 계측기 LUNA-FL™ (Logos Biosystems)에서 계측하였다. 총 625 세포 (NCI-H292), 1250 세포 (NCI-H1975) 또는 3000 세포 (HCC827)는 96-웰 검은색/투명 편평 바닥 TC-처리 이미지화 마이크로플레이트 (Corning®)의 웰 당 90 ㎕ 세포 배양 배지에 플레이팅하였고 밤새 배양하였다. 10배 출발 농도의 ADC 또는 화합물 및 개별 연속 희석물 (1:4)은 사용 직전에 세포 배양 배지로 제조하였다. 웰은 10 ㎕ ADC 또는 화합물 용액이 공급되었다. 처리는 기술적 삼중물로 수행되었다. 플레이트는 후속하여 144시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션하였다. ADC 또는 EGFR 티로신 키나제 억제제 (TKI)에 대한 미처리 대조군 세포는 상응하는 양의 희석 배지 또는 디메틸술폭시드 (DMSO; Millipore Sigma)를 각각 받았다. 후속 세포 생존능 측정을 위해서, 100 ㎕ Cell Titer-Glo® 시약 (Promega® Corp, Madison, WI, USA)을 각 웰에 파이펫팅해 넣었고, 플레이트는 제조사 설명서에 따라서 더욱 처리하였다. 발광 신호는 Varioskan® Flash 플레이트 판독기 (Thermo Fisher Scientific®)에서 측정하였다. 상대 발광 단위의 미가공 데이터는 Microsoft® Excel (버전 16.0, Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA)에서 배경값 (무세포 대조군, 배지 단독)을 차감하고 생존능% (미처리 대조군 세포= 100%) 또는 효과% (생존능% - 100%)를 계산하여 처리하였다. 용량-반응 곡선 및 IC50 값은 Graph Pad Prism (버전 8.2.0 Windows®용, GraphPad software, La Jolla California USA)에서 비-선형 회귀 분석 함수 (log(억제제) 대 반응-변수 기울기 (4개 매개변수))를 사용해 데이터 전환 및 후속 데이터 적합화를 통해 수득되었다. 데이터는 기술적 삼중물의 SD를 표시하는 오차 막대와 효과% 대 화합물 농도 용량 [M]으로 표시되었다.
결과
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)의 세포 사멸 활성은 상이한 EGFR 돌연변이 상태 (NCI-H292: EGFR wt; HCC827: EGFR del E746_A750; 및 NCI-H1975: EGFR L858R/T790M)를 갖는 NSCLC 세포에서 평가되었다. 단일특이적 ADC 항-MUC1 ADC (분자 2) 및 항-EGFR ADC (분자 3)는 대조군 분자로서 사용되었다 (도 5, 표 5). NCI-H292 및 NCI-H1975 세포 경우에, 추가적인 세포 사멸 어세이는 분자 1 및 EGFR TKI 엘로티닙 (분자 12), 제피티닙 (분자 13), 아파티닙 (분자 14) 및 오시머티닙 (분자 15)을 사용해 수행되었다 (도 6, 표 6). ADC 또는 EGFR TKI의 역가는 세포 생존능의 최대 억제의 50%가 관찰된 수득되 세포 사멸 곡선으로부터 평균 농도로서 기하평균 IC50 [nM]으로서 몇회의 개별 실험에서 결정되었다. 또한, 기하평균 범위 (%) (사용된 최고 시험 농도에서 미처리 대조군 세포에 비해 사멸된 세포의 평균 백분율)가 결정되었다. 기하평균 범위는 세포 생존능 어세이에서 ADC 또는 화합물의 효능을 나타낸다.
도 5에 도시된 바와 같이, 분자 1은 그들 MUC1 및 EGFR 발현 수준 및 그들 EGFR 돌연변이 상태 (EGFR wt, EGFR L858R/T790M, 또는 EGFR del E746_A750)에 독립적으로, 세포 생존능 어세이에서 NSCLC 세포에 대해 높은 효능 및 역가를 보였다.
NCI-H292 (EGFR wt) 세포 경우에, 항-EGFR ADC (분자 3)는 항-MUC1 ADC (분자 2)와 비교하여 더 높은 역가를 보였다 (도 5, 표 5). 분자 2에 비해서 분자 3에 대한 더 높은 감수성은 이들 세포에서 EGFR의 더 높은 발현 수준 및 MUC1의 비교적 낮은 발현 수준의 결과일 수 있다. 이들 결과에 따라서, 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)의 세포 사멸 활성은 단일특이적 ADC (분자 2 및 3)의 중간에 있다. 그러나, 분자 1은 각각의 단일특이적 ADC에 비해서 약간 더 양호한 효능을 보였고, 상승적 작용을 의미할 수 있다.
Figure pct00011
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)는 단일특이적 항-EGFR ADC (분자 3)와 비슷한 사멸 범위 (%)로 나노몰 이하 범위에서 EGFR 돌연변이체 세포 HCC827 (EGFR del E746_A750)에 대해 세포 사멸 활성을 보였다 (도 5, 표 5). EGFR의 발현 수준이 높은 이들 세포에서, 분자 3 및 분자 1 둘 모두는 비슷한 역가에서 세포 생존능을 억제하였다.
양쪽 항원을 더 낮은 수준으로 발현하는, EGFR 이중 돌연변이체 (L858R/T790M) NCI-H1975 세포에서, 항-EGFR ADC (분자 3)는 항-MUC1 ADC (분자 2)와 비교하여 우수한 역가 및 세포 생존능 억제에 대해 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)에 비해 더 높은 활성을 보였다 (도 5, 표 5). 그러나, 분자 1은 각각 54% 및 75%의 사멸 범위를 갖는, 분자 2 및 분자 3과 비교하여 90%의 더 양호한 세포 사멸 효능을 보였다. 이들 결과는 더 낮은 MUC1 및 EGFR 발현 수준을 갖는 세포에서 단일특이적 ADC 변이체에 비해서 이중특이적 ADC의 상승적 활성을 의미할 수 있다.
도 6 및 표 6은 소형 분자 EGFR TKI를 사용해 수행된 실험의 결과를 도시한다. 분자 1의 결과가 또한 비교를 위해 표시된다.
Figure pct00012
상이한 EGFR TKI에 대한 선택된 NSCLC 세포 NCI-H292 (EGFR wt) 및 NCI-H1975 (EGFR L858R/T790M)의 감수성은 문헌에 기술된 결과와 일관되었다 (도 6, 표 4; 참조: Hirano et al., In vitro modeling to determine mutation specificity of EGFR tyrosine kinase inhibitors against clinically relevant EGFR mutants in non-small-cell lung cancer, Oncotarget 2015, 6, 38789-38803). Hirano 등이 기술한 결과와 일관되게, 아파티닙 (분자 14)은 다른 TKI 억제제 (분자 12, 13, 15)와 비교하여 가장 효과적으로 야생형 EGFR을 억제하였는데 반해서 오시머티닙 (분자 15)으로서, T790M 내성 돌연변이의 표적화에 선택적인 EGFR TKI는 NCI-H1975 세포의 최고 세포 사멸 활성을 보였다 (도 6, 표 6).
요약하면, 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC (분자 1)는 MUC1 및 EGFR에 대한 다양한 발현 수준을 특징으로 하는, 야생형 및 돌연변이체 EGFR 세포 둘 모두에 대해 나노몰 이하 범위의 역가를 입증하였다.
실시예 8. 설치류에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 약동학적 성질
분자 1의 비-구획 약동학 (PK) 매개변수는 비-종양 보유 암컷 CB17 SCID 마우스 및 스프라그-다우리 래트에서 평가되었다.
방법
마우스에서, 단일 5 mg/kg IV 볼러스를 투여하였고, 상이한 시점에 샘플채취하고, 상이한 동물로부터 풀링하였다 (비-반복 측정). 래트에서, IV 볼러스에 의한 단일 5 mg/kg 용량은 유치 경정맥 카테터를 통해 투여되었고, 혈액 샘플은 반복 측정 디자인을 사용해 상이한 시점에 수집되었다.
결과
결과의 요약은 표 7에 표시된다.
Figure pct00013
제거 반감기 (T1/2)는 농도-시간 곡선의 log-선형 그래프의 회귀 분석으로부터 결정되었다. 분자 1의 T1/2, CL, 및 Vss를 포함한 PK 매개변수는 마우스 및 래트에서 비슷하였다 (도 7). 또한, 분자 1은 다른 FDA-승인된 단일클론 IgG 항체의 것과 유사하게 보이는 설치류 PK 프로파일을 나타냈다.
실시예 9. 자궁경부암 (WISH) 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 용량 반응 효능 연구
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 용량-반응 관계는 2회 독립 연구에서, 시험된 모든 다른 세포주에 비해서 최고 내생성 수준의 MUC1 (+++), 및 낮은 내생성 수준의 EGFR (+)을 발현하는 인간 자궁경부 세포주 (HeLa 오염물)인, WISH 종양에서 평가하였다.
방법
WISH 종양 (∼150 ㎣)이 확립된 암컷 무흉선 누드 마우스를 0.1 mg/kg 내지 1.5 mg/kg (연구 1) 또는 1.25 mg/kg 내지 5 mg/kg (연구 2)의 용량 범위로 분자 1의 단일 정맥내 (IV) 주사로 처리하였다.
결과
양쪽 연구에서, 치료는 독성없이 충분히 내약성이었고 정상 체중 증가가 관찰되었다 (도 8A 및 8B). 비히클 대조군 처리 종양이 연구 종점 (> 1,200 ㎣)에 도달한 날에 WISH 종양 성장 및 개별 종양 크기에 대한 치료 효과는 도 9A, 9B, 및 10에서 설명된다. 연구 1에서, 0.1, 0.3, 0.75 및 1.5 mg/kg으로 투여된 분자 1은 용량 의존적 항-종양 활성을 입증하였다. 시험된 최저 용량, 0.1 및 0.3 mg/kg는 각각 0% 및 12% 종양 성장 억제 (TGI)로 불량한 효능을 보였다 (도 9A 및9B). 중간 활성 (47% TGI)이 0.75 mg/kg 분자 1에서 관찰된 한편, 1.5 mg/kg은 21일에 종양 크기의 통계적 분석을 기반으로 비히클 대조군과 비교하여 81% TGI에서 유의한 활성을 유발하였다 (p = 0.0009) (도 8B). 최고 용량의 분자 1 (1.5 mg/kg)은 초기에 종양 퇴행을 유도하였고 치료 후 대략 10일에 재성장이 관찰되었다 (도 9A). 연구 2에서, 1.25, 2.5 및 5 mg/kg의 분자 1의 단일 용량은 모든 용량에서 종양 퇴행의 유도를 통해 입증된 바와 같이 강건하고 유의한 효능을 입증하였다 (도 10). 연구 종료 시, 최저 용량으로 처리된 동물의 50% 초과 (7마리 중 4마리) 및 2.5 및 5 mg/kg의 분자 1을 받은 동물의 100% (7마리 중 7마리)에서 완전한 반응이 관찰되었다.
결론적으로, 양쪽 연구의 결과는 WISH 종양에서 종양 퇴행을 비롯하여 유의한 효능을 일으키는 분자 1의 강력한 항-종양 활성을 독립적으로 입증하였다. (치료 개시 후 임의 시점에 대한) 기준치로부터 종양 부피의 > 20% 감소를 유도하기 위한 최저 용량으로 정의되는, 최소 유효 용량은 양쪽 연구에서 일관적이었고 WISH 종양 모델에서 분자 1의 대략 1.5 mg/kg으로 결정되었다.
실시예 10. 난소암 (OVCAR-3) 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 용량 반응 효능 연구
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 용량-반응 관계는 낮은 내생성 수준의 MUC1 (++) 및 EGFR (+)을 발현하는 인간 난소 선암종에서 평가되었다.
방법
OVCAR-3 종양 (∼100 ㎣)이 확립된 암컷 CB17 SCID (중증 복합 면역결핍, C.B-17-IcrHSD-Prkdcscid) 마우스는 2.5 mg/kg 내지 10 mg/kg 용량 범위로 분자 1의 단일 IV 주사로 처리되었다.
결과
치료는 충분히 내약성이었는데, 독성 또는 임상 징후가 나타나지 않았고, 또한 시험된 모든 용량에서 초기 체중의 3.10% 내지 6.04% 사이에서 유의한 (p ≤ 0.05) 평균 체중 증가가 있었다 (도 11). 2.5, 5 및 10 mg/kg의 분자 1은 종양 퇴행 (>100% TGI)을 유도하였고, 치료 후 대략 31일까지 성장을 억제하였다 (도 12A). 28일에 종양 크기의 분석은 분자 1이 비히클 대조군과 비교하여 유의하게 (p < 0.0001) 효율적임을 보여주었다 (도 12B). 결론적으로, 분자 1은 OVCAR-3 종양에서 강력한 효능을 입증하였다.
실시예 11. 유방암 (MDA-MB-468) 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 용량 반응 효능 연구
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 용량-반응 관계는 MDA-MB-468 종양으로서, 높은 EGFR 수준 (+++)에 비해서 낮은 수준의 MUC1 발현 (+)으로 발현하는 인간 유방 전이성 선암종 모델에서 평가되었다.
방법
MDA-MB-468 종양 (∼130 ㎣)이 확립된 암컷 SCID 베이지 마우스는 2.5 mg/kg 내지 10 mg/kg 용량 범위로 분자 1의 단일 정맥내 주사로 처리되었다.
결과
치료는 충분히 내약성이었고, 독성없이 정상 체중 증가가 관찰되었다 (도 12). 분자 1의 모든 용량 (2.5, 5 및 10 mg/kg)은 유의한 항-종양 활성을 유도하여, 치료 후 63일에 연구 종료까지 완전한 종양 퇴행을 얻었고, 성장을 억제하였다 (도 14). 결론적으로, 분자 1은 MDA-MB-468 모델에서 종양 퇴행을 야기하는 강력한 활성 및 연장된 반응 지속기간을 나타냈다.
실시예 12. 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자-유래 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 용량 반응 효능 연구
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 용량-반응 관계는 NSCLC 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델 LUX089에서 평가되었다. 이러한 PDX 모델은 MUC1 및 EGFR 둘 모두를 발현한다.
방법
LUX089 종양 (∼150 ㎣)이 확립된 암컷 누드 마우스 (Nu/Nu, Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd., Beijing, China)는 2 mg/kg 내지 10 mg/kg 용량 범위에서 분자 1의 단일 IV 주사로 처리되었다.
결과
치료는 충분히 내약성이었고, 독성 또는 임상 징후를 보이지 않았고 체중 감량은 관찰되지 않았다 (도 15B). 2, 5 및 10 mg/kg으로 0일에 1회 투여된 분자 1은 10 mg/kg 용량 그룹에서 완전한 퇴행을 가져서, 용량-의존적 종양 성장 억제를 보여주었다 (도 15A). 10 mg/kg 용량 그룹으로 처리된 5마리 동물 중 3마리에서, 실험이 종료된, 60일까지 종양이 측정불가하였다. 2 및 5 mg/kg 용량은 비히클 종양이 1300 ㎣의 평균 부피에 도달했을 때, 38일에, 각각 69% 및 24% 퇴행의 TGI (p<0.001)를 야기시켰다. 결론적으로, 분자 1은 PDX 모델 LUX089에서 강력한 효능을 입증하였다.
실시예 13. 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자-유래 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 및 단일특이적 ADC 간 비교
단일특이적 항-EGFR 및 항-MUC1 ADC와 비교하여 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 효능은 동일 용량으로 3종의 상이한 NSCLC 환자-유래 이종이식 (PDX) 모델에서 평가되었다. 모든 3종 PDX 모델은 MUC1 및 EGFR 둘 모두를 발현한다.
방법
LUX089, LUX019 및 LUX003 종양 (∼150 ㎣)이 확립된 암컷 누드 (Nu/Nu, Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd., Beijing, China) 마우스는 5 mg/kg 용량의 분자 1 및 단일특이적 ADC의 단일 IV 주사로 처리되었다.
결과
모든 3종 PDX 모델에서, 분자 1은 모델 LUX003 및 LUX019에서 완전한 퇴행으로 가장 강력한 종양 성장 억제를 보였다. LUX089에서, 치료는 부분 퇴행을 야기하였다. 2번째로 가장 효율적인 치료인, 항-EGFR ADC는 모델 LUX019에서 종양 정체를 야기하였다. 항-MUC1 ADC는 5 mg/kg 단일 치료로 3회 시험된 PDX 모델에서 종양 수축을 초래하지 않았다 (도 16). 결론적으로, 분자 1은 3종의 시험된 NSCLC PDX 모델에서 가장 강력한 항-종양 효능을 보였다.
실시예 14. 상이한 암 적응증의 환자-유래 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효능
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 효능은 상이한 암 적응증의 PDX 모델에서 시험되었다. 적응증은 MUC1 및 EGFR의 기지 발현 수준을 기반으로 선택되었다.
방법
NSCLC, 위암, 식도암, 난소암, 유방암, 두경부암, 자궁경부암, 및 중피종으로부터의 PDX 모델을 갖는 암컷 누드 (Nu/Nu) 마우스는 8 mg/kg 용량으로 분자 1의 단일 IV 주사로 처리되었다. 효능은 최고 반응일 (종양 반응이 지연된 경우)/ 비히클 그룹 종양 부피 (중간)가 1000 ㎣에 도달했을 때, 하기 기준을 사용해 진행성 질환 (PD), 안정한 질환 (SD); 부분 퇴행 (PR) 또는 완전 퇴행 (CR)으로서 평가되었다: 종양 부피 변화 >73%, <73% 및 > -66%, ≤ -66%은 PD, SD, PR에 상응하고, 측정불가 종양은 CR에 상응한다.
결과
강력한 항-종양 반응 (부분 또는 완전 퇴행)이 모든 시험된 적응증에서 관찰되었다. 다양한 수준의 MUC1 또는 EGFR을 발현하는 모델에서 반응을 확인하였다. 표 8에서, 높은 EGFR 및 MUC1 발현 수준을 발현하는 NSCLC PDX 모델은 별표로 표시하였다 (haloscore 소프트웨어를 사용한 면역조직화학 채점 > 15 기반). EGFR 돌연변이 (LUPF049: EGFR19del (748-753); LUPF104: EGFR19 del (746-750), T790M, 및 C797S)를 갖는 NSCLC PDX 모델은 해시태그로 표시하였다. 결론적으로, 분자 1은 다양한 수준의 MUC1 및 EGFR을 발현하는 몇몇 암 적응증에서 광범위한 적용가능성을 보였다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
실시예 15. 상이한 치료 일정을 사용한 환자-유래 이종이식 모델 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효능
이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC 분자 1의 효능은 상이한 일정을 사용해 NSCLC PDX 모델에서 시험되었다.
방법
환자-유래 NSCLC 종양 (∼150 ㎣)이 확립된 암컷 누드 (Nu/Nu, Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd., Beijing, China) 마우스는 8 mg/kg의 분자 1의 단일 IV 주사, 1주 또는 2주 간격으로 4 mg/kg의 분자 1의 2회 IV 주사, 또는 매주 2 mg/kg 분자 1의 4회 IV 주사로 처리되었다.
결과
모든 일정에서, 8 mg/kg의 동일한 총량의 사용은 강력하고 견고한 종양 성장 억제를 유도하였다 (도 17A 및 17B). 결론적으로, 분자 1은 상이한 치료 용법을 사용해 강력한 항-종양 효능을 보였다.
실시예 16. NSCLC, 식도암, 및 두경부 편평 세포 암종으로부터의 환자-유래 이종이식 모델에서 이중특이적 항-MUC1/EGFR ADC의 효능
단일 8 mg/kg 용량의 분자 1의 효능은 NSCLC, 식도암, 및 두경부 편평 세포 암종으로부터의 다양한 환자-유래 이종이식 모델에서 시험되었다. 도 18A, 18B, 및 18C에 도시된 바와 같이, NSCLC, 식도암, 및 두경부 편평 세포 암종으로부터의 환자-유래 이종이식의 실질적 분획은 단일 용량 이후에 완전한 관해를 나타냈다. 종양 반응은 표적 발현과 연관되었다.
실시예 17. 항-MUC1 항체의 에피토프 맵핑
분자 1의 항-MUC1 팔부의 최소 결합 에피토프를 결정하기 위해서, 인간 항-MUC1 항체 HT186-D11 및 H02의 PEPperMAP® 에피토프 맵핑이 14, 11 및 9 아미노산의 펩티드-펩티드 중복을 갖는 선형 15, 12 및 10 아미노산 펩티드로 번역되는 인간 MUC1 펩티드 APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS (SEQ ID NO:22)를 비롯하여 15 아미노산 펩티드 APDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO:23), PAPGSTAPPAHGVTS (SEQ ID NO:24), TAPPAHGVTSAPDTR (SEQ ID NO:25) 및 HGVTSAPDTRPAPGS (SEQ ID NO:26)의 서열 절두형에 대해서 수행되었다. 최종 펩티드 마이크로어레이는 인큐베이션 완충액 중 1 ㎍/mL 농도의 항체 샘플과 인큐베이션 후 2차 및 대조군 항체로 염색을 비롯하여 LI-COR Odyssey Imaging System을 사용한 판독을 수행하였다. 반점 강도의 정량화 및 펩티드 주석은 PepSlide® 분석기로 수행하였다.
펩티드 마이크로어레이 카피의 사전-염색은 주요 어세이를 방해할 수 있는 야생형 펩티드의 펩티드 변이체와 2차 또는 대조군 항체의 배경 상호작용을 강조하지 않았다. 대조적으로, 항체 샘플과 인큐베이션은 매우 유사하고 매우 명확한 IgG 반응 프로파일을 생성시켰다. 항체 HT186-D11은 최소 공통 모티프 TRPAP (SEQ ID NO:27)를 갖는 펩티드에 대해 가장 강력한 반응을 보였다. 동일한 최소 공통 모티프는 중간 반점 강도이지만, 항체 H02에 의해 인식되었다. 최소 공통 모티프 DTRPAP (SEQ ID NO:28)를 갖는 펩티드와 상호작용하는 항체 H02에서 강력한 반응이 또한 확인되었다. C-말단 프롤린 또는 N-말단 트레오닌의 제거는 반점 강도의 유의한 감소 및 그리하여 항체 결합의 감소를 야기하였다.
실시예 18. 인간 및 사이노몰거스 원숭이 EGFR에 대한 분자 1의 동역학적 상호작용 분석
EGFR에 대한 결합 친화성을 평가하기 위해서, 분자 1 (항-MUC1/EGFR ADC; 실시예 3 참조) 및 분자 10 (비접합된 항-MUC1/EGFR; 실시예 2 참조)은 바이오센서 팁에 고정되었다. 가용성 피분해물 (인간 EGFR 또는 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis)) EGFR; "사이노 EGFR")의 결합 및 해리는 바이오센서 팁에 대한 단백질 결합으로 직접 발생되는 간섭 이동 (nm)으로서 측정되었다. 데이터는 1:1 상호작용 모델 및 글로벌 곡선 적합화를 사용해 kon, kdis 및 KD 값을 수득하도록 처리되었다.
결과는 표 9A 및 9B에 표시된다. 인간 및 사이노 EGFR에 대한 분자 1의 해리 상수 (KD)는 낮은 한자릿수 nM 범위 (1.5 nM)였다. 분자 10의 동역학적 결합 상수는 대략 1.4 nM에서 매우 유사하였다.
따라서, 분자 1 (항-MUC1/EGFR ADC)은 비접합된 항-MUC1/EGFR (분자 10)과 유사한 동역학으로 EGFR에 결합한다. 이들 결과는 분자 1을 만들기 위한 헤미아스텔린 유도체의 접합 (실시예 3 참조)이 EGFR와의 결합에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 19. 인간 및 사이노몰거스 원숭이 MUC1에 대한 분자 1의 동역학적 상호작용 분석
MUC1에 대한 결합 친화성을 평가하기 위해서, 분자 1 (항-MUC1/EGFR ADC; 실시예 3 참조) 및 분자 10 (비접합된 항-MUC1/EGFR; 실시예 2 참조)은 개별 아민 커플링 키트를 사용해 1차 아민 상에서 공유 커플링을 통해 C1 시리즈 S 센서 칩에 고정되었다. 1000 nM의 피분석물 (사이노 (마카카 파시쿨라리스) (Macaca fascicularis) MUC1 펩티드 및 인간 MUC1 펩티드 VHH 융합체)의 결합 및 해리는 각가가 180초 동안 측정되었다.
판독치는 센서 칩의 표면에 대한 단백질 결합에 의한 직접적으로 측정된 반응이다. 데이터는 이종성 상호작용 모델 및 글로벌 곡선 적합화를 사용해 kon, kdis 및 KD 값을 수득하도록 처리되었다. 결과는 표 10에 표시된다. 인간 MUC1 펩티드 (낙타과 VHH에 대한 N-말단 융합으로서)에 대해 측정된 해리 상수 (KD)는 분자 1 경우 21.5 nM이었고, 분자 10의 경우 47.2 nM이었다. 이들 분자 각각에 대한 곡선 형상은 이종성 결합 방식을 의미하였다. 이러한 제2 상호작용은 모든 시험된 분자에 대해서 유의하게 더 약한 것으로 보인다. 상호작용은 사이노 MUC1 펩티드에서는 측정할 수 없었다.
따라서, 분자 1 (항-MUC1/EGFR ADC)은 비접합된 항-MUC1/EGFR (분자 10)과 유사한 동역학으로 인간 MUC1에 결합한다. 이들 결과는 분자 1을 만들기 위해 헤미아스텔린 유도체의 접합 (실시예 3 참조)이 MUC1과의 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
사이노 MUC1 펩티드에 대한 결합 결여는 아미노산 서열의 종 특이적 차이로 인한 것일 수 있다. 실시예 17에 기술된 바와 같이, 분자 1의 항-MUC1 결합 팔부는 아미노산 서열 TRPAP (SEQ ID NO:27)을 포함하는 최소 결합 에피토프를 갖는 것으로 결정되었다. 상이한 종의 MUC1의 서열 정렬은 이러한 최소 에피토프가 사이노 및 설치류 MUC1에 존재하지 않는다는 것을 보여준다.
Figure pct00019
실시예 20. MUC1에 대한 결합 방식
분자 1의 MUC1-결합 팔부인, H02-scFv의 결합 방식에 대한 추가 통찰력을 수득하기 위해서, H02-scFv 및 인간 MUC1 면역우성 코어 펩티드 (APDTRPAPGSTAPPA; SEQ ID NO:23)의 단편 간 복합체의 결정 구조를 해결하였다.
결정화 전에, H02-scFv는 10x 몰 과량의 MUC1 펩티드와 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션되었고, 후속하여 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4 완충액 중에서 22 mg/mL로 농축되었다. 1.0 ㎕ 단백질 용액과 1.0 ㎕ 저장소 용액 (0.1 M Tris, 0.2 M MgCl2, 28% w/v PEG4000, pH 8.5)을 혼합하여 현적 증기 확산 기술을 사용해 277 K에서 결정을 성장시켰다. 복합체의 전체 구조는 도 19A에 도시되어 있다.
결정 구조 내에서, MUC1 펩티드 사슬은 도 19A에 도시된 바와 같이, 전자 밀도 지도 (2Fo-Fc)에서 Asp 3에서 Ala 15로 충분히 한정된다. Arg 5 [MUC1]의 측쇄 구아니디늄은 Glu 99 [H02-scFv]의 카르복실레이트 기와 비덴테이트 염 가교를 형성하는 한편, Arg 5 [MUC1]의 주쇄 질소는 Asp 103 [H02-scFv]의 주쇄 카르보닐 산소와 수소 결합을 형성한다. 2개 더 많은 수소 결합이 관찰되었다: 1) Gly 9 [MUC1]의 주쇄 질소 및 Asp 52 [H02-scFv]의 카르복실레이트 사이, 및 2) Thr 11 Oγ [MUC1] 및 Asp 52 [H02-scFv] 사이. MUC1 펩티드 및 H02-scFv 간 상호작용은 반 데르 발스 접촉에 의해서, 특히 H02-scFv의 CDR1 Thr 30 - His32 패치 및 H02-scFv의 CDR2 Asp 52 - Val54 패치에 의해 형성된 공동에 Pro 8 [MUC1] 결합을 통해서 더욱 안정화된다. MUC1 펩티드 및 H02-scFv 간 접촉의 나머지는 물 분자에 의해 매개된다.
등가물
본 명세서에서 참조되는 특허 문서 및 과학 논문의 각각의 전체 개시는 모든 목적을 위해 참조로 편입된다.
본 개시는 이의 정신 또는 필수 특징을 벗어나지 않고 다른 특별한 형태로 구현될 수 있다. 그러므로, 전술한 구현예는 본 명세서에 기술된 개시를 제한하기 보다는 예시적인 것으로 모든 측면에서 간주되어야 한다. 상이한 구현예 및 다양한 개시된 방법 단계의 다양한 구조적 구성요소는 다양한 조합 및 순열로 이용될 수 있고, 모든 이러한 변이는 본 개시의 형태로 간주되어야 한다. 따라서, 본 개시의 범주는 전술한 설명보다는 첨부된 청구항에 의해 표시되고, 청구항의 등가 범위 및 범위 내에 있는 모든 변화는 본 명세서에 포괄하는 것으로 의도된다.
서열
SEQ ID NO:1 (항-MUC1 scFvFc (AG SEED))
Figure pct00020
SEQ ID NO:2 (항-EGFR Fab(중쇄)Fc (GA SEED))
Figure pct00021
SEQ ID NO:3 (항-EGFR Fab(경쇄))
Figure pct00022
SEQ ID NO:4 (HT186-D11 및 1993 시리즈 항체에 대한 CDRH1 모티프)
GYX1FX2X3X4X5MH
여기서,
X1 은 S (세린) 또는 P (프롤린)이고,
X2 는 T (트레오닌) 또는 N (아스파라긴)이고,
X3 은 G (글리신), D (아스파르트산), 또는 S (세린)이고,
X4 는 H (히스티딘) 또는 N (아스파라긴)이고,
X5 는 Y (티로신) 또는 F (페닐알라닌)이다.
SEQ ID NO:5 (HT186-D11 및 1993 시리즈 항체에 대한 CDRH2 모티프)
WIDPVTGX1TX2YAQX3FQG
여기서,
X1 은 G (글리신) 또는 E (글루탐산)이고,
X2 는 K (리신) 또는 R (아르기닌)이고,
X3 은 N (아스파라긴) 또는 D (아스파르트산)이다.
SEQ ID NO:6 (HT186-D11 및 1993 시리즈 항체에 대한 CDRH3 모티프)
EX1X2X3X4RGQFDK
여기서,
X1 은 V (발린) 또는 A (알라닌)이고,
X2 는 T (트레오닌) 또는 R (아르기닌)이고,
X3 은 G (글리신) 또는 A (알라닌)이고,
X4 는 D (아스파르트산) 또는 S (세린)이다.
SEQ ID NO:7 (HT186-D11 및 1993 시리즈 항체에 대한 CDRL1)
GGNNIGSKSVH
SEQ ID NO:8 (HT186-D11 및 1993 시리즈 항체에 대한 CDRL2)
YGSNRPS
SEQ ID NO:9 (HT186-D11 및 1993 시리즈 항체에 대한 CDRL3)
QVWDSSSDWV
SEQ ID NO:10 (MUC1의 VNTR 펩티드)
APDTRPAPGSTAPPAC
SEQ ID NO:11 (비천연 아미노산 (예를 들어, pAMF)이 * 표시된 부위에 도입된 항-MUC1 scFvFc (AG SEED))
Figure pct00023
SEQ ID NO:12 (비천연 아미노산 (예를 들어, pAMF)이 * 표시된 부위에 도입된 항-EGFR Fab(중쇄)Fc (GA SEED))
Figure pct00024
SEQ ID NO:13 (hC225에 대한 CDRH1)
GFSLTNYG
SEQ ID NO:14 (hC225에 대한 CDRH2)
IWSGGNT
SEQ ID NO:15 (hC225에 대한 CDRH3)
ARALTYYDYEFAY
SEQ ID NO:16 (hC225에 대한 CDRL1)
QSIGTN
SEQ ID NO:17 (hC225에 대한 CDRL2)
YASE
SEQ ID NO:18 (hC225에 대한 CDRL3)
QQNNNWPTT
SEQ ID NO:19 (hC225 중쇄 내 CH1)
Figure pct00025
SEQ ID NO:20 (비천연 아미노산 (예를 들어, pAMF)이 * 표시된 부위에 도입된 hC225 중쇄 내 CH1)
Figure pct00026
SEQ ID NO:21 (hC225 경쇄 내 CL1)
Figure pct00027
SEQ ID NO:22 (인간 MUC1 유래 펩티드)
APDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS
SEQ ID NO:23 (인간 MUC1 절두된 펩티드)
APDTRPAPGSTAPPA
SEQ ID NO:24 (인간 MUC1 절두된 펩티드)
PAPGSTAPPAHGVTS
SEQ ID NO:25 (인간 MUC1 절두된 펩티드)
TAPPAHGVTSAPDTR
SEQ ID NO:26 (인간 MUC1 절두된 펩티드)
HGVTSAPDTRPAPGS
SEQ ID NO:27 (인간 MUC1 최소 공통 모티프)
TRPAP
SEQ ID NO:28 (인간 MUC1 최소 공통 모티프)
DTRPAP
SEQ ID NO:29 (HT186-D11에 대한 CDRH1 - 카밧)
GHYMH
SEQ ID NO:30 (HT186-D11에 대한 CDRH2 - 카밧)
WIDPVTGGTKYAQNFQG
SEQ ID NO:31 (HT186-D11에 대한 CDRH3 - 카밧)
EVTGDRGQFDK
SEQ ID NO:32 (HT186-D11에 대한 CDRH1 - 초티아)
GYSFTGH
SEQ ID NO:33 (HT186-D11에 대한 CDRH2 - 초티아)
DPVTGG
SEQ ID NO:34 (HT186-D11에 대한 CDRH3 - 초티아)
EVTGDRGQFDK
SEQ ID NO:35 (1993-H02에 대한 CDRH1 - 카밧)
SHFMH
SEQ ID NO:36 (1993-H02에 대한 CDRH2 - 카밧)
WIDPVTGGTKYAQNFQG
SEQ ID NO:37 (1993-H02에 대한 CDRH3 - 카밧)
EARADRGQFDK
SEQ ID NO:38 (1993-H02에 대한 CDRH1 - 초티아)
GYSFTSH
SEQ ID NO:39 (1993-H02에 대한 CDRH2 - 초티아)
DPVTGG
SEQ ID NO:40 (1993-H02에 대한 CDRH3 - 초티아)
EARADRGQFDK
SEQ ID NO:41 (HT186-D11에 대한 VH)
Figure pct00028
SEQ ID NO:42 (1993-H02에 대한 VH)
Figure pct00029
SEQ ID NO:43 (HT186-D11 및 1993-H02에 대한 VL)
Figure pct00030
SEQ ID NO:44 (1993-E03에 대한 VH)
Figure pct00031
SEQ ID NO:45 (1993-H08에 대한 VH)
Figure pct00032
SEQ ID NO:46 (1993-G09에 대한 VH)
Figure pct00033
SEQ ID NO:47 (1993-E04에 대한 VH)
Figure pct00034
SEQ ID NO:48 (1993-D01에 대한 VH)
Figure pct00035
SEQUENCE LISTING <110> Merck Patent GmbH <120> BISPECIFIC ANTIBODY-DRUG CONJUGATES TARGETING EGFR AND MUC1 AND USES THEREOF <130> EMD-016 <150> 63/034,296 <151> 2020-06-03 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-MUC1 scFvFc (AG SEED) <400> 1 Met Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 20 25 30 His Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn 50 55 60 Phe Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly 145 150 155 160 Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Lys Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370 375 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Lys Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr 420 425 430 Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Thr Ile Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-EGFR Fab(heavy)Fc (GA SEED) <400> 2 Met Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn 20 25 30 Tyr Gly Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe 50 55 60 Thr Ser Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp 385 390 395 400 Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ile Leu 405 410 415 Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Asp 435 440 445 Arg Ser Pro Gly Lys 450 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-EGFR Fab(light chain) <400> 3 Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr 20 25 30 Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro 85 90 95 Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 motif for HT186-D11 and 1993 series antibodies <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Ser or Pro <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Thr or Asn <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> Xaa is Gly, Asp, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> Xaa is His or Asn <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Tyr or Phe <400> 4 Gly Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 motif for HT186-D11 and 1993 series antibodies <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> Xaa is Gly or Glu <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> VARIANT <222> (14)..(14) <223> Xaa is Asn or Asp <400> 5 Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Xaa Thr Xaa Tyr Ala Gln Xaa Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 motif for HT186-D11 and 1993 series antibodies <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa is Val or Ala <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa is Thr or Arg <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa is Gly or Ala <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa is Asp or Ser <400> 6 Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Gln Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 for HT186-D11 and 1993 series antibodies <400> 7 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 for HT186-D11 and 1993 series antibodies <400> 8 Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 for HT186-D11 and 1993 series antibodies <400> 9 Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp Val 1 5 10 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VNTR peptide of MUC1 <400> 10 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala Cys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-MUC1 scFvFc (AG SEED) with non-natural amino acids (e.g., pAMF) introduced at Xaa sites <220> <221> MUTAGEN <222> (269)..(269) <223> Non-natural amino acid, e.g., para azidomethyl L-phenylalanine (pAMF) <220> <221> MUTAGEN <222> (435)..(435) <223> Non-natural amino acid, e.g., para azidomethyl L-phenylalanine (pAMF) <400> 11 Met Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser 20 25 30 His Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn 50 55 60 Phe Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly 145 150 155 160 Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly 180 185 190 Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu 195 200 205 Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 Thr Val Leu Lys Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Xaa Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Ser Arg Glu 370 375 380 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Lys Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr 420 425 430 Thr Thr Xaa Ala Val Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Thr Ile Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 12 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> anti-EGFR Fab(heavy)Fc (GA SEED) with non-natural amino acids (e.g., pAMF) introduced at Xaa sites <220> <221> MUTAGEN <222> (183)..(183) <223> Xaa is an unnatural amino acid, e.g., para azidomethyl L-phenylalanine (pAMF) <220> <221> MUTAGEN <222> (244)..(244) <223> Xaa is an unnatural amino acid, e.g., para azidomethyl L-phenylalanine (pAMF) <400> 12 Met Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn 20 25 30 Tyr Gly Val His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe 50 55 60 Thr Ser Arg Val Thr Ile Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Xaa Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Xaa Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp 385 390 395 400 Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Ile Leu 405 410 415 Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Asp 435 440 445 Arg Ser Pro Gly Lys 450 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 for hC225 <400> 13 Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 for hC225 <400> 14 Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 for hC225 <400> 15 Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL1 for hC225 <400> 16 Gln Ser Ile Gly Thr Asn 1 5 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL2 for hC225 <400> 17 Tyr Ala Ser Glu 1 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRL3 for hC225 <400> 18 Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr 1 5 <210> 19 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CH1 within hC225 heavy chain <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 20 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CH1 within hC225 heavy chain with non-natural amino acid (e.g., pAMF) introduced at Xaa <220> <221> MUTAGEN <222> (63)..(63) <223> Xaa is a non-natural amino acid, e.g., para azidomethyl L-phenylalanine (pAMF) <400> 20 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Xaa Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CL1 within hC225 light chain <400> 21 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 22 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> peptide from human MUC1 <400> 22 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 1 5 10 15 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 20 25 30 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 35 40 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human MUC1 truncated peptide <400> 23 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human MUC1 truncated peptide <400> 24 Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human MUC1 truncated peptide <400> 25 Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human MUC1 truncated peptide <400> 26 His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser 1 5 10 15 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human MUC1 minimal consensus motif <400> 27 Thr Arg Pro Ala Pro 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> human MUC1 minimal consensus motif <400> 28 Asp Thr Arg Pro Ala Pro 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 for HT186-D11 - Kabat <400> 29 Gly His Tyr Met His 1 5 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 for HT186-D11 - Kabat <400> 30 Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 for HT186-D11 - Kabat <400> 31 Glu Val Thr Gly Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 for HT186-D11 - Chothia <400> 32 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 for HT186-D11 - Chothia <400> 33 Asp Pro Val Thr Gly Gly 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 for HT186-D11 - Chothia <400> 34 Glu Val Thr Gly Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 for 1993-H02 - Kabat <400> 35 Ser His Phe Met His 1 5 <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 for 1993-H02 - Kabat <400> 36 Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 for 1993-H02 - Kabat <400> 37 Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH1 for 1993-H02 - Chothia <400> 38 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser His 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH2 for 1993-H02 - Chothia <400> 39 Asp Pro Val Thr Gly Gly 1 5 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDRH3 for 1993-H02 - Chothia <400> 40 Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys 1 5 10 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for HT186-D11 <400> 41 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for 1993-H02 <400> 42 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser His 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL for HT186-D11 and for 1993-H02 <400> 43 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ala Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Tyr Gly Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Trp 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 44 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for 1993-E03 <400> 44 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Asn Asp His 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 45 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for 1993-H08 <400> 45 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 46 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for 1993-G09 <400> 46 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp His 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for 1993-E04 <400> 47 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Asn 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Ala Ser Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120 <210> 48 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH for 1993-D01 <400> 48 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Glu Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Gly His 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Val Thr Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Ala Asp Arg Gly Gln Phe Asp Lys Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ala Ser 115 120

Claims (83)

  1. 하기를 포함하는 면역접합체:
    (a) EGFR 및 MUC1에 결합하는 이중특이적 항체로서, 이중특이적 항체는
    (i) 제1 조작된 Fc 도메인 및 단쇄 Fv (scFv)를 포함하는 제1 폴리펩티드로서, scFv는 MUC1에 결합하는 것인 제1 폴리펩티드,
    (ii) 제2 조작된 Fc 도메인 및 Fab 단편의 중쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드, 및
    (iii) Fab 단편의 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩티드
    를 포함하고,
    제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 함께 EGFR에 결합하는 Fab 단편을 한정하고,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 제1 조작된 Fc 도메인 및 제2 조작된 Fc 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결되고;
    제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 중쇄 및 제3 폴리펩티드의 경쇄 사이에 형성되는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결되고;
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각이 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인, EGFR 및 MUC1에 결합하는 이중특이적 항체; 및
    (b) 다수의 헤미아스텔린 모이어티로서, 각각의 헤미아스텔린 모이어티가 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 비천연 아미노산 잔기 중 하나에 링커를 통해서 독립적으로 접합되는 것인, 다수의 헤미아스텔린 모이어티.
  2. 제1항에 있어서, 다수의 헤미아스텔린 모이어티는 4개 헤미아스텔린 모이어티를 포함하는 것인 면역접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 조작된 Fc 도메인은 제2 조작된 Fc 도메인과 상이한 것인 면역접합체.
  4. 제3항에 있어서, 제1 및 제2 조작된 Fc 도메인은 각각이 가닥-교환 조작된 도메인을 포함하는 것인 면역접합체.
  5. 제4항에 있어서, 각각의 가닥-교환 조작된 도메인은 인간 IgA 및 IgG 불변 중쇄-3 (CH3) 서열의 교대 절편을 포함하는 것인 면역접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 조작된 Fc 도메인은 2개의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  7. 제6항에 있어서, 제1 조작된 Fc 도메인은 2개 이하의 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 제1 조작된 Fc 도메인은 EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241 및 F404에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 조작된 Fc 도메인은 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  10. 제9항에 있어서, 제2 조작된 Fc 도메인은 1개 이하 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 제2 조작된 Fc 도메인은 EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, Fab 단편은 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  13. 제12항에 있어서, 제2 폴리펩티드 내 Fab 단편의 중쇄는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, Fab 단편은 1개 이하 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  15. 제12항, 제13항 또는 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, Fab 단편은 EU 지수에 따른 중쇄 위치 Y180에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 것인 면역접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기의 각각은 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-아이오도페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, 및 p-아지도메틸-L-페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 면역접합체.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 비천연 아미노산 잔기의 각각은 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌 (pAMF)인 면역접합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 이중특이적 항체는 비글리코실화된 것인 면역접합체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 면역접합체:
    - SEQ ID NO:7로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1;
    - SEQ ID NO:8로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및
    - SEQ ID NO:9로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
  20. 제19항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 면역접합체:
    - SEQ ID NO:4로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    - SEQ ID NO:5로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    - SEQ ID NO:6으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
  21. 제19항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 면역접합체:
    (a) (i) SEQ ID NO:29로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) SEQ ID NO:30으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) SEQ ID NO:31로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    또는
    (b) (i) SEQ ID NO:32로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) SEQ ID NO:33으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) SEQ ID NO:34로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
  22. 제21항에 있어서, 제1 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:41로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및
    (b) SEQ ID NO:43으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역
    을 포함하는 것인 면역접합체.
  23. 제19항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 면역접합체:
    (a) (i) SEQ ID NO:35로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) SEQ ID NO:36으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) SEQ ID NO:37로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3;
    또는
    (b) (i) SEQ ID NO:38로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (ii) SEQ ID NO:39로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    (iii) SEQ ID NO:40으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
  24. 제23항에 있어서, 제1 폴리펩티드는
    (a) SEQ ID NO:42로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 영역; 및
    (b) SEQ ID NO:43으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 영역
    을 포함하는 것인 면역접합체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 면역접합체:
    - SEQ ID NO:13으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    - SEQ ID NO:14로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및
    - SEQ ID NO:15로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 하기 상보성-결정 영역 (CDR)을 포함하는 것인 면역접합체:
    - SEQ ID NO:16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    - SEQ ID NO:17로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    - SEQ ID NO:18로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 면역접합체.
  28. 제27항에 있어서, 제1 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인 면역접합체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 면역접합체.
  30. 제29항에 있어서, 제2 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인 면역접합체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3으로 기재된 것과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 면역접합체.
  32. 제31항에 있어서, 제3 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3으로 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 것인 면역접합체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 링커는 절단가능한 링커인 면역접합체.
  34. 제33항에 있어서, 절단가능한 링커는 발린-시트룰린-p-아미노벤질알콜 (PABA)인 면역접합체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 헤미아스텔린 모이어티는 헤미아스텔린 유도체인 면역접합체.
  36. 제35항에 있어서, 헤미아스텔린 유도체는 3-아미노페닐-헤미아스텔린인 면역접합체.
  37. 제36항에 있어서, 면역접합체는 하기 구조를 포함하는 것인 면역접합체:
    Figure pct00036

    (식에서, n은 4임).
  38. 하기를 포함하는 면역접합체:
    (a) EGFR 및 MUC1에 결합하는 이중특이적 항체로서, 이중특이적 항체는
    (i) 제1 조작된 Fc 도메인 및 단쇄 Fv 단편 (scFv)을 포함하는 제1 폴리펩티드로서, scFv는 MUC1에 결합하고, 제1 폴리펩티드 사슬은 EU 지수에 따른 중쇄 위치 F241 및 F404에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제1 폴리펩티드,
    (ii) 제2 조작된 Fc 도메인 및 Fab 단편의 중쇄를 포함하는 제2 폴리펩티드로서, EU 지수에 따른 위치 Y180 및 F241에 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제2 폴리펩티드, 및
    (iii) Fab 단편의 경쇄를 포함하는 제3 폴리펩티드로서, SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제3 폴리펩티드
    를 포함하고;
    제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 함께 EGFR에 결합하는 Fab 단편을 한정하고,
    제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 제1 조작된 Fc 도메인 및 제2 조작된 Fc 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결되고,
    제2 폴리펩티드 및 제3 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 중쇄 및 제3 폴리펩티드의 경쇄 사이에 형성되는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 공유적으로 연결되는 것인, EGFR 및 MUC1에 결합하는 이중특이적 항체; 및
    (b) 다수의 3-아미노페닐 헤미아스텔린 모이어티로서, 각각이 비천연 아미노산 잔기 중 하나에 절단가능한 발린-시트룰린-p-아미노벤질알콜 링커를 통해서 독립적으로 접합되는 것인, 다수의 3-아미노페닐 헤미아스텔린 모이어티.
  39. 제38항에 있어서, 면역접합체는 4개 3-아미노페닐 헤미아스텔린 모이어티를 포함하는 것인 면역접합체.
  40. 제39항 또는 제40항에 있어서, 각각의 비천연 아미노산은 파라-아지도메틸-L-페닐알라닌 (pAMF)인 면역접합체.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  42. 암의 치료를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 방법은
    제1항 내지 제40항 중 어느 하나의 항의 면역접합체 또는 제41항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 치료 방법.
  43. 제42항에 있어서, 포유동물 대상체는 인간인 치료 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 포유동물 대상체는 암을 갖는다고 진단된 것인 치료 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 고형 종양을 포함하는 것인 치료 방법.
  46. 제45항에 있어서, 암은 유방암, 폐암, 식도암, 두경부암, 자궁경부암, 난소암, 위암, 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
  47. 제46항에 있어서, 암은 유방암인 치료 방법.
  48. 제47항에 있어서, 유방암은 삼중 음성 유방암인 치료 방법.
  49. 제46항에 있어서, 암은 폐암인 치료 방법.
  50. 제49항에 있어서, 폐암은 비-소세포 폐암 (NSCLC)인 치료 방법.
  51. 제50항에 있어서, NSCLC는 선암종을 포함하는 것인 치료 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, NSCLC는 편평 세포 암종을 포함하는 것인 치료 방법.
  53. 제46항에 있어서, 암은 식도암인 치료 방법.
  54. 제53항에 있어서, 식도암은 편평 식도암인 치료 방법.
  55. 제54항에 있어서, 암은 두경부암인 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서, 두경부암은 두경부 편평 세포 암종인 치료 방법.
  57. 제46항에 있어서, 암은 자궁경부암인 치료 방법.
  58. 제46항에 있어서, 암은 난소암인 치료 방법.
  59. 제46항에 있어서, 암은 위암인 치료 방법.
  60. 제46항에 있어서, 암은 중피종인 치료 방법.
  61. 제42항 내지 제44항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 비-고형 종양을 포함하는 것인 치료 방법.
  62. 제61항에 있어서, 암은 다발성 골수종인 치료 방법.
  63. 제42항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 EGFR에 대해 야생형인 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  64. 제63항에 있어서, 암은 EGFR에 대해 야생형인 세포를 주로 포함하는 것인 치료 방법.
  65. 제42항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 EGFR의 돌연변이체 형태를 포함하는 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  66. 제65항에 있어서, 암은 EGFR의 돌연변이체 형태를 포함하는 세포를 주로 포함하는 것인 치료 방법.
  67. 제42항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 고 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  68. 제67항에 있어서, 암은 고 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 주로 포함하는 것인 치료 방법.
  69. 제42항 내지 제67항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 저 또는 중간 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  70. 제69항에 있어서, 암은 저 또는 중간 수준의 EGFR을 발현하는 세포를 주로 포함하는 것인 치료 방법.
  71. 제42항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 고 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  72. 제71항에 있어서, 암은 고 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 주로 포함하는 것인 치료 방법.
  73. 제42항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 있어서, 암은 저 또는 중간 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 포함하는 것인 치료 방법.
  74. 제73항에 있어서, 암은 저 또는 중간 수준의 MUC1을 발현하는 세포를 주로 포함하는 것인 치료 방법.
  75. 제42항 내지 제74항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여 단계는 전신 경로를 통한 투여를 포함하는 것인 치료 방법.
  76. 제75항에 있어서, 전신 경로는 정맥내 경로인 치료 방법.
  77. 제75항에 있어서, 전신 경로는 피하 경로인 치료 방법.
  78. 제42항 내지 제77항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양 성장은 포유동물 대상체에게 면역접합체의 투여 후 기준 수준에 비해 감소되는 것인 치료 방법.
  79. 제78항에 있어서, 기준 수준은 포유동물 대상체에게 면역접합체를 투여하는 단계 이전 종양 성장의 수준인 치료 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 종양 성장은 포유동물 대상체에게 면역접합체의 투여 후 퇴행하는 것인 치료 방법.
  81. 제80항에 있어서, 종양 성장은 포유동물 대상체에게 면역접합체의 투여 후 완전히 퇴행하는 것인 치료 방법.
  82. 제42항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 투여 단계는 적어도 2회 용량의 투여를 포함하고, 적어도 2회 용량은 집합적으로 치료적 유효량을 포함하는 것인 치료 방법.
  83. 제42항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 면역접합체를 투여하는 단계는 치료적 유효량을 포함하는 단일 용량의 투여를 포함하는 것인 치료 방법.
KR1020227044556A 2020-06-03 2021-06-03 Egfr 및 muc1을 표적화하는 이중특이적 항체-약물 접합체 및 이의 용도 KR20230033648A (ko)

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