KR20240035378A - 항-넥틴-4 항체 엑사테칸 접합체 - Google Patents

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잭 이랜즈
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쎄비에르 프레빌르
다니엘 올리브
마르크 로페즈
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위니베르시떼 덱스-마르세이유
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쌍트르 나시오날 드 라 르쉐르쉐 싸이엉띠피끄(쎄.엔.에르.에스.)
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Abstract

본 발명은 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 또는 그의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)에 관한 것으로, 상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4에 결합하며, 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor), 특히 엑사테칸(exatecan)이다.

Description

항-넥틴-4 항체 엑사테칸 접합체
본 발명은 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 또는 그의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)에 관한 것으로, 상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4(Nectin-4)에 결합하며, 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor), 특히 엑사테칸(exatecan) 또는 데룩스테칸(deruxtecan)이다.
넥틴(Nectins)은 상피(epithelial)와 내피(endothelial) 접합부(junctions)를 구성하는 것을 돕고 단순포진 바이러스(herpes simplex virus), 홍역 바이러스(measles viru) 및 폴리오바이러스(poliovirus)의 진입에 대한 수용체 역할을 하는 접착 분자이다.
이들은 면역글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하며 폴리오바이러스 수용체(PVR/CD155)의 상동체이고, 이에 대한 폴리오바이러스 수용체 결합 단백질(PRR)이라고도 부른다. 현재까지 5개의 멤버, 즉 PVR/CD155, 넥틴-1/PRR1/CD111, 넥틴-2/PRR2/CD112, 넥틴-3/PRR3, 넥틴-4/PRR4가 기재되어 있다. 그들의 엑토도메인은 아미노산 서열에서 30 내지 55%의 동일성을 공유하는 3개의 면역글로불린 유사(Ig)-형 V, C, C 도메인으로 구성된다.
넥틴/PRR 분자의 발현은 일반적으로 조혈, 신경세포, 내피 및 상피세포를 포함한 조직에서 광범위하게 나타나지만, 보다 제한된 발현 프로파일을 보이는 넥틴-3 및 -4는 예외이다.
넥틴-4는 특히 흥미로운 표적이다. 태아 발달 과정에서 발현되지만 넥틴 계열의 다른 구성원과 비교하여 성인 조직에서는 발현이 감소하고 매우 제한적이다. 넥틴-4는 방광암 83%, 유방암 78%(주로 삼중 음성 및 ERBB2+), 췌장암 71%, 폐암 55%, 난소암 57%, 두경부암 59%, 식도암 55%에서 종양 관련 항원이다.
이러한 병리에서 넥틴-4의 발현은 아마도 넥틴-4의 시험관 내 종양 세포에 전달할 수 있는 능력, 더 높은 이동 용량, 증식 및 전이 형성의 결과로서 불량한 예후와 관련된다. 정상 조직에서는 피부, 침샘, 방광, 식도에서만 넥틴-4가 검출된다. 최근 진행성 요로상피암(urothelial cancer)의 2차 치료를 위한 엔포르투맙 베도틴(Enfortumab vedotin)의 보건 당국에 의한 승인으로 암 치료의 표적으로서 넥틴-4의 검증을 완료했다.
발명의 요약
본 발명의 제 1 측면은 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 또는 그의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment)을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)로서, 상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4에 결합하며, 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor), 특히 엑사테칸(exatecan) 또는 데룩스테칸(deruxtecan)이다.
본 발명의 추가 측면은, 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체인 활성제 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4에 결합하고 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제, 특히 엑사테칸인 약학 조성물이다.
본 발명의 추가 측면은 의약, 특히 인간 의약에서의 전술한 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물의 용도이다.
본 발명의 추가 측면은 넥틴-4 관련 장애(Nectin-4 associated disorder)의 예방 및/또는 치료, 특히 넥틴-4 양성 암(Nectin-4 positive cancer)의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서의 전술한 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물의 용도이다.
본 발명의 추가 측면은 방광암, 요로상피암, 자궁내막암, 자궁경부암, 대장암, 간암, 갑상선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 두경부암 및/또는 식도암으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서의 전술한 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물의 용도이다.
본 발명의 추가 측면은 넥틴-4 관련 장애의 예방 및/또는 치료, 특히 넥틴-4 양성 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 상기 방법은 전술한 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 암의 예방 및/또는 치료, 특히 방광암, 요로상피암, 자궁내막암, 자궁경부암, 대장암, 간암, 갑상선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 난소암, 두경부암 및/또는 식도암으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 상기 방법은 전술한 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은 항-넥틴-4 항체와 토포이소머라제-I 억제제 예를 들어 엑사테칸의 접합체가 항-넥틴-4 항체와 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E; MMAE)의 접합체인 시판되는 항체 엔포르투맙 베도틴에 비해 개선된 항암 활성을 나타내는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 항-넥틴-4 항체 접합체는 넥틴-4 관련 질환 예를 들어 넥틴-4 양성 암의 개선된 치료를 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체-약물 접합체는 인간 각질형성세포(human keratinocytes)에 의해 발현된 넥틴-4, 예를 들어 시험관 내 분화된 넥틴-4 발현 각질형성세포에 비해 높은 친화성으로 종양에 의해 발현된 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 신규한 항-넥틴-4 항체를 포함한다. 바람직한 예는 단일 클론 항체(mAb) 15A7.5, 9A2.7, 3A1.4 및/또는 8F06이다.
특히 바람직한 예로는 단일 클론 항체(mAb) 15A7.5 또는 그로부터 유래된 항체가 있다. 시험관 내에서 이러한 선택성은 종양 세포에 비해 각질형성세포에 대한 결합 친화성, 내재화 및/또는 세포독성이 낮은 mAb 15A7.5를 제공하며, 동일한 분석에서 HA22 mAb(엔포르투맙)의 활성을 참조한다.
특히, 본 발명의 접합체는 단일 클론 항-넥틴-4 항체 15A7.5 mAb로부터 유래된 인간화된 항체를 포함한다.
생체 내에서 이러한 각질형성세포에 대한 낮은 결합능(binding capacity)은 피부에서의 낮은 흡수율로 인해 더 높은 반감기를 갖는 mAb 15A7.5를 제공한다.
이종이식 마우스 모델(xenograft mouse model)에서 확립된 종양의 엑사테칸과 결합한 mAb를 1mg/kg의 I.V.로 1회 투여한 치료는 신속하고 오래-지속되는 퇴행을 유도하였다.
보다 구체적으로, 본 발명자들은 이러한 구성에서 항체-엑사테칸 접합체가 엔포르투맙 베도틴의 대용물(surrogate), 즉 시판되는 엔포르투맙 베도틴과 구별할 수 없는 제 3 자에 의해 비-GMP 방법으로 제조한 엔포르투맙 베도틴 제품보다 더욱 효율적임을 입증하였다.
항 체
본 발명의 접합체의 항체는 특정 아미노산 서열을 특징으로 하는 단일 클론 항체(mAb) 또는 단일 클론 항체 단편이다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "단일 클론"은 항체 또는 항체 단편의 단일 종, 즉 단일 아미노산 조성을 의미한다.
본원에서 제공된 항체는 바람직하게는 넥틴-4에 특이적으로 결합하며, 인간 넥틴-계열(human Nectin-family)의 다른 단백질, 특히 넥틴-1, 및/또는 설치류 넥틴-4, 예를 들어 래트 및/또는 마우스 유래의 넥틴-4에 대한 필수적이거나 또는 교차-반응성(cross-reactivity)이 없음을 보여준다.
본 발명의 항체의 항원-결합 부위는 중쇄 가변 도메인/영역(heavy chain variable domains/regions)(VH) 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인/영역(light chain variable domains/regions)(VL), 또는 VH/VL의 쌍들(pairs)을 포함한다.
용어 "항원-결합 부위"는 리간드(예를 들어 항원, 즉 넥틴-4, 또는 그의 항원 단편)가 실제로 결합하고 항체로부터 유래되는 항체 분자의 영역(들)을 의미한다.
가변 도메인/영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄의 쌍 각각을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 약칭하고, 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 약칭한다.
본 발명에 따른 항체의 항원-결합 부위는 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 다양한 정도로 기여하는 6개의 상보성-결정 영역(complementarity determining region; CDR)을 포함할 수 있다. 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3), 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)이 있다. 또한, 소수의 CDR로 이루어진 기능성 항원-결합 부위가 본 발명의 범위에 포함된다(즉, 여기서 결합 특이성은 3개, 4개 또는 5개 CDR에 의해 결정됨). 예를 들어 6개의 CDR의 완전한 세트 미만이면 결합에 충분할 수 있다. 경우에 따라서는 VH 또는 VL 도메인이면 충분할 것이다.
본 발명에 따르면, VH 영역 또는 그의 CDR은 단독으로 완전한 항원-결합 부위를 구성할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 VH 영역 또는 그의 CDR을 단독으로 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 VH 영역 또는 그의 CDR과 함께 VL 영역 또는 그의 CDR, 특히 본원에 정의된 VL 영역 또는 그의 CDR을 포함한다.
VH 또는 VL 영역 내의 CDR의 위치는 Kabat 등의 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의될 수 있으며, 이 둘은 당업자에게 공지되어 있다. IMGT 넘버링은 항원 수용체, 사슬 유형 또는 종에 관계없이 가변 도메인을 비교하기 위해 정의되어 있다(Lefranc M.P.의 문헌 ["Unique database numbering system for immunogenetic analysis" Immunology Today, 18, 509 (1997)]; Lefranc M.P.의 문헌 ["The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains" The Immunologist, 7, 132-136 (1999)] 참조). 달리 언급하지 않는 한, 본원에서는 Kabat 시스템을 사용한다.
본원에서 사용되는 용어 "결합" 및 "특이적 결합"은 본 발명의 항체 또는 그의 단편이 넥틴-4 항원의 에피토프에 결합하는 것을 의미한다. 항체의 결합력 측정은 친화성이라고 한다. 시험관 내 분석을 이용하여 이러한 결합 및/또는 친화성을 측정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따르면, 유세포 분석법, 면역조직화학 및/또는 형광을 이용한 검출이 기술되며, 특히 바람직하다.
항체가 항원에 결합하는 친화성은 Ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 결합에 대한 속도 상수), KD(해리 상수), Kdis(KD/Ka)라는 용어로 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 접합체의 항체는 키메라 항체(chimeric antibody), 다중특이적 항체(multispecific antibody), 특히 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다.
본 발명에 따르면, "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 원(source) 또는 종(species)으로부터 유래된 항체를 의미하는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 원 또는 종으로부터 유래된 항체를 의미한다.
"다중특이적 항체"는 둘 이상의 상이한 에피토프(epitopes)에 결합한다. 에피토프는 동일하거나 상이한 항원에 결합할 수 있다. 다중특이적 항체의 바람직한 예는 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 "이중특이적 항체"이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다.
용어 "인간화된 항체" 또는 "항체의 인간화 버전"은 항체 엔지니어링의 결과 중쇄와 경쇄가 모두 인간화된 항체를 의미한다. 인간화 사슬(humanized chain)은 일반적으로 V-영역 아미노산 서열이 변화되어 전체적으로 분석된 것이 기원 종의 생식계열 서열보다 인간 생식계열 서열과 더 가깝게 존재하는 사슬이다. 예를 들어 뮤린(murine) CDR을 인간 항체의 골격 영역(framework region)에 이식하여 "인간화된 항체"를 제조할 수 있다. 예를 들어 Riechmann, L. 등의 문헌 [Nature 332 (1988) 323-327]; 및 Neuberger, M. S. 등의 문헌 [Nature 314 (1985) 268-270]을 참조한다. 본 발명에 포함되는 다른 형태의 인간화된 항체는 본 발명에 따른 특성을 생성하기 위하여 원래 항체의 것으로부터 불변 영역을 추가적으로 변형 또는 변경시킨 것이다. 인간화 평가는 생성된 아미노산 서열을 기준으로 한 것이지 방법론 자체에 따른 것이 아니다.
또 다른 바람직한 구현예는 인간 항체를 포함하는 접합체를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다(문헌 [van Dijk, M.A., van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374] 참조). 인간 항체는 면역화 시 내인성 면역글로불린 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리 또는 선별을 할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어 마우스)에서 생산될 수도 있다.
본 발명의 접합체의 항체는 임의의 적합한 클래스(class)일 수 있다. 용어 "클래스"는 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 종류를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "불변 도메인" 또는 "불변 영역"은 가변 영역 이외의 항체의 도메인의 합을 의미한다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않고 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 5가지 주요 클래스의 항체, 특히 5가지 주요 클래스의 인간 항체: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 또는 그의 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgA3 중의 임의의 것일 수 있다. 면역글로불린의 다른 클래스에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, μ라 한다. 본 발명에 따르면, 클래스의 항체, 구체적으로 인간 클래스 IgG, IgA 또는 IgM 또는 그의 단편이 특히 적합하다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 접합체의 항체는 클래스 IgG, 특히 인간 IgG의 클래스의 항체, 예를 들어 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 항체, 클래스 IgM의 항체, 클래스 IgA의 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 항체는, 불변 도메인, 특히 중쇄 불변 도메인, 보다 특히 클래스 IgG의 중쇄 불변 도메인, 특히 클래스 인간 IgG, 예를 들어 동일한 서브클래스의 야생형 서열에 비해 감소된 이펙터 기능을 갖는, 예를 들어 Fc 수용체에 대해 감소된 결합을 갖는, 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의, 클래스 IgM의, IgA의 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 감소된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 도메인의 예로는 인간 IgG, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 서열의 돌연변이 D265C, L234A, L235A, P331S, L234Q 및 L235F 중의 적어도 하나를 포함할 수 있다.
항체의 "항원-결합 단편"은 온전한 항체(intact antibody)가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 분자를 의미한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 당뇨체(diabodies); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자(예를 들어 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 융합 단백질, 예를 들어 비-면역글로불린 펩티드 또는 폴리펩티드와의 융합 단백질, 및 비-단백질성 구조, 예를 들어 표지 또는 독소와의 접합체도 포함한다. 용어 "항체의 항원-결합 단편" 및 "항체의 단편"은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편은 1가 또는 다가일 수 있으며, 즉 단일 항원-결합 부위 또는 다수의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어 Fab 단편은 단일 항원-결합 부위를 갖고, IgG 클래스 또는 Fv 또는 scFv 단편의 항체는 2개의 항원-결합 부위를 가지며, IgM 클래스의 항체는 5개의 항원-결합 부위를 갖는다. 또한, 용어 "항체"는 이종-특이적 항체(hetero-specific antibodies), 예를 들어 항원-결합 부위가 상이한 이종-이중특이적 항체, 특히 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 대한 항체도 포함한다. 본원에서 사용되는 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원의 영역이다. 용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정기를 포함한다.
종양-선택적 항-넥틴-4 항체
특정 구현예에서, 접합체의 항체는 인간 각질형성세포 발현 넥틴-4, 예를 들어 시험관내에서 분화된 각질형성세포 발현 넥틴-4에 비해 높은 친화성으로 종양 발현 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 종양-선택적 항-넥틴-4 항체, 예를 들어 단일 클론 항체(mAb) 15A7.5, 9A2.7, 3A1.4 및/또는 8F06으로부터 유래된 단일 클론 항체이다. mAb 15A7.5는 특히 바람직하다.
이에 비해, 결합 친화성은 유세포 분석법, 면역조직화학 및/또는 형광 분석법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 특이적 결합은 특히 본 발명의 항체를 기반으로 한 치료시 부작용을 적게 할 수 있다.
따라서, 항체 15A7.5, 9A2.7, 3A1.4 및/또는 8F06 및 특히 그로부터 유래된 인간화된 변이체를 포함하는 항체-약물 접합체는 낮은 관련 피부 독성과 높은 항종양 선택성 및 효능을 통해 넥틴-4 양성 암 치료의 치료 지수를 개선하는 새로운 방법을 나타낸다.
종양-선택적 항-넥틴-4 항체 및 그의 항원-결합 단편은 바람직하게는 40(nM) 이상, 보다 바람직하게는 45(nM) 이상, 더욱 바람직하게는 50(nM) 이상, 가장 바람직하게는 55(nM) 이상의 해리 상수 KD를 나타낸다.
더 낮은 결합 친화성 이외에도, 본원에 제공된 종양-선택적 항체 및 단편은 종양 세포에 비해 각질형성세포로의 내재화 및/또는 세포독성 활성이 더 낮은 것이 바람직하다.
특히 바람직한 한 구현예에 따르면, 종양-선택적 항체 및 단편은 종양 세포에 비해 더 낮은 결합 친화성, 더 낮은 내재화, 및 각질형성세포로의 세포독성 활성이 더 낮은 것이다.
물론, 종양에 의해 발현된 넥틴-4에 대한 특이적 결합이 바람직하다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 인간 각질형성세포에 의해 발현된 넥틴-4에 비해 더 높은 친화성으로 종양에 의해 발현된 넥틴-4에 결합하는 것을 특징으로 하는 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 이를 위해, 결합 친화성은 유세포 분석법, 면역조직화학 및/또는 형광에 의해 검출될 수 있다.
특정 구현예에서, 종양-선택적 단일 클론 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 상보성-결정 영역(CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 영역, 여기서
(i) CDR-H1은 서열번호 1, 7, 88, 96 또는 104에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-H2는 서열번호 2, 8, 89, 97 또는 105에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-H3은 서열번호 3, 9, 90, 98 또는 106에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
및 선택적으로
(b) 가변 경쇄(VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
(i) CDR-L1은 서열번호 4, 10, 92, 100 또는 108에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-L2는 서열번호 5, 11, 93, 101 또는 109에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-L3은 서열번호 6, 12, 94, 102 또는 110에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함;
을 포함한다.
서열번호 1-6은 IMGT 넘버링 시스템에 따른 본 발명의 부모 항체(parental antibody) 15A7.5의 6개의 CDR 서열을 정의한다. 서열번호 7-12는 Kabat에 따른 본 발명의 부모 항체의 6개의 CDR 서열을 정의한다.
본원에서 사용된 서열번호에 대한 구체적인 아미노산 서열은 첨부된 서열목록에 제공된다.
서열번호 88-95는 mAb 9A2.7을 특징으로 한다.
서열번호 96-103은 mAb 3A1.4를 특징으로 한다.
서열번호 104-111은 mAb 8F06을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 이러한 CDR 서열에서 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입이 가능하다. 특정 구현예에서, 보존적 아미노산 치환, 즉 유사한 생화학적 특성을 갖는 다른 아미노산에 의한 아미노산의 치환, 예를 들어 지방족 아미노산, 예를 들어 Gly, Ala, Val, Leu 또는 Ile를, 다른 지방족 아미노산, 예를 들어 His, Lys 또는 Arg으로, 또 다른 염기성 아미노산, 산성 아미노산 또는 그의 아미드, 예를 들어 Asp, Glu, Asn 또는 Gln으로, 또 다른 산성 아미노산 또는 그의 아미드, 방향족 아미노산, 예를 들어 Phe, Tyr 또는 Trp로, 또 다른 방향족 아미노산, 또는 하이드록시 또는 황 함유 아미노산, 예를 들어 Ser, Thr, Met 또는 Cys로, 또 다른 하이드록시 또는 황 함유 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 또 다른 특정 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 히스티딘 잔기가 하나 이상의 CDR 서열, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3에 삽입된다. 이는 낮은 pH, 예를 들어 pH 5.5 내지 6.5 대 중성 pH, 예를 들어 pH 7.0 내지 7.5에서 우선적인 결합을 일으킬 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, IMGT 넘버링 시스템에 따라,
(i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, Kabat에 따라,
(i) 서열번호 7의 CDR-H1, 서열번호 8의 CDR-H2 및 서열번호 9의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) 서열번호 10의 CDR-L1, 서열번호 11의 CDR-L2 및 서열번호 12의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(i) 서열번호 88의 CDR-H1, 서열번호 89의 CDR-H2 및 서열번호 90의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) 서열번호 92의 CDR-L1, 서열번호 93의 CDR-L2 및 서열번호 94의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(i) 서열번호 96의 CDR-H1, 서열번호 97의 CDR-H2 및 서열번호 98의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) 서열번호 100의 CDR-L1, 서열번호 101의 CDR-L2 및 서열번호 102의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(i) 서열번호 104의 CDR-H1, 서열번호 105의 CDR-H2 및 서열번호 106의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) 서열번호 108의 CDR-L1, 서열번호 109의 CDR-L2 및 서열번호 110의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
보다 특히, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 서열번호 13, 91, 99 또는 107에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(b) VL 영역, 특히 서열번호 14, 95, 103 또는 111에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
바람직한 한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 서열번호 13에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(b) VL 영역, 특히 서열번호 14에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
바람직한 한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 서열번호 91에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(b) VL 영역, 특히 서열번호 95에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
바람직한 한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 서열번호 99에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(b) VL 영역, 특히 서열번호 103에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
바람직한 한 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 서열번호 107에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로
(b) VL 영역, 특히 서열번호 111에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
펩티드 또는 폴리펩티드 서열에 대한 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 최대 백분율 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어 BLAST와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적으로 정렬을 달성할 수 있는, 특정 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 인간화 또는 인간 항체는 적어도 3개, 바람직하게는 6개의 상보성-결정 영역(CDR)의 조합에 의해 정의되며, 즉
(a) 상보성-결정 영역(CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 영역, 여기서
(i) CDR-H1은 서열번호 21, 35, 49 또는 63에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-H2는 서열번호 22, 36, 50 또는 64에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-H3은 서열번호 23, 37, 51 또는 65에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
및 선택적으로
(b) 가변 경쇄(VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
(i) CDR-L1은 서열번호 24, 38, 52 또는 66에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-L2는 서열번호 25, 39, 53 또는 67에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-L3은 서열번호 26, 40, 54 또는 68에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함;
을 포함하는, 종양-선택적 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에 따른 특이적인 인간화 또는 인간 항체는,
(a) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(b) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역; 또는
(c) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(d) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(e) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(f) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(g) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(h) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(j) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(k) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(l) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(m) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(n) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(o) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(p) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(q) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
위에서 정의된 인간화된 항체 (a), (b), (c), (d), (j), (k), (n) 및 (q)가 특히 바람직하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 인간화 또는 인간 항체는 적어도 3개, 바람직하게는 6개의 상보성-결정 영역(CDR)의 조합에 의해 정의되며, 즉
(a) 상보성-결정 영역(CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 영역, 여기서
(i) CDR-H1은 서열번호 21, 35, 49 또는 63에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-H2는 서열번호 22, 36, 50 또는 64에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-H3은 서열번호 23, 37, 51 또는 65에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
및 선택적으로
(b) 가변 경쇄(VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
(i) CDR-L1은 서열번호 24, 38, 52 또는 66에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-L2는 서열번호 25, 39, 53 또는 67에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-L3은 서열번호 26, 40, 54 또는 68에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함;
을 포함하는, 종양-선택적 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에 따른 특이적인 인간화 또는 인간 항체는,
(a) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(b) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역; 또는
(c) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(d) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(e) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(f) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(g) (i) 서열번호 21의 CDR-H1, 서열번호 22의 CDR-H2, 및 서열번호 23의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(h) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(j) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(k) (i) 서열번호 35의 CDR-H1, 서열번호 36의 CDR-H2, 및 서열번호 37의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(l) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(m) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(n) (i) 서열번호 49의 CDR-H1, 서열번호 50의 CDR-H2, 및 서열번호 51의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 66의 CDR-L1, 서열번호 67의 CDR-L2, 및 서열번호 68의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(o) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 24의 CDR-L1, 서열번호 25의 CDR-L2, 및 서열번호 26의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(p) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 38의 CDR-L1, 서열번호 39의 CDR-L2, 및 서열번호 40의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
(q) (i) 서열번호 63의 CDR-H1, 서열번호 64의 CDR-H2, 및 서열번호 65의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 52의 CDR-L1, 서열번호 53의 CDR-L2, 및 서열번호 54의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
위에서 정의된 인간화된 항체 (a), (b), (c), (d), (j), (k), (n) 및 (q)가 특히 바람직하다.
물론, 본 발명에 따른 인간화 또는 인간 항체는 또한 그들의 VH 및/또는 VL 영역에 의해 정의될 수 있다.
상기 항체는,
(i) 서열번호 27, 41, 55 또는 69로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) VL 영역, 특히 서열번호 28, 42, 56, 70 또는 71로부터 선택된 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 특정 인간화 또는 인간 항체는 그들의 VH 및/또는 VL 영역에 의해 정의될 수 있으되, 이러한 항체는,
(a) (i) 서열번호 27에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 28에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(b) (i) 서열번호 41에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 42에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(c) (i) 서열번호 55에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 56에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(d) (i) 서열번호 69에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 70 또는 71에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(e) (i) 서열번호 27에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 42에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(f) (i) 서열번호 27에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 56에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(g) (i) 서열번호 27에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 70 또는 71에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(h) (i) 서열번호 41에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 28에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(j) (i) 서열번호 41에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 56에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(k) (i) 서열번호 41에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 70 또는 71에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(l) (i) 서열번호 55에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 28에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(m) (i) 서열번호 55에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 42에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(n) (i) 서열번호 55에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 70 또는 71에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(o) (i) 서열번호 69에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 28에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(p) (i) 서열번호 69에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 42에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
(q) (i) 서열번호 69에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 56에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
위에서 정의된 인간화된 항체 (a), (b), (c), (d), (j), (k), (n) 및 (q)가 특히 바람직하다.
추가의 항-넥틴-4 항체
추가 구현예에서, 본 발명의 접합체의 항체는 항체 5A12.2 또는 그의 항원-결합 단편이다.
서열번호 80 내지 87은 mAb 5A12.2를 특징으로 한다.
바람직한 구현예에 따르면, 5A12.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(i) 서열번호 80의 CDR-H1, 서열번호 81의 CDR-H2, 및 서열번호 82의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(ii) 서열번호 84의 CDR-L1, 서열번호 85의 CDR-L2 및 서열번호 86의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 5A12.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은,
(a) 서열번호 83에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
및 선택적으로
(b) VL 영역, 특히 서열번호 87에 따른 아미노산 서열 또는 상기 서열의 전체 길이에 대하여 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 접합체의 항체는 시판되는 항체-약물 접합체 엔포르투맙 베도틴의 항체인 항체 HA22, 또는 HA22-유래 항체이다.
HA22는 국제공개공보 제WO2012/047724호에 기재된 인간 단일 클론 항-넥틴-4 항체로서, 그 내용은 본원에 참고로 포함된다. HA22 항체 또는 HA22-유래 항체는 특히 상기 기재된 바와 같이 선택적으로 이펙터 기능이 감소된 중쇄 G1m17 또는 G1m3 하플로타입 서열(haplotype sequence), 예를 들어 TM 돌연변이: P331S, L234Q 및 L235F, 또는 LALA 돌연변이: L234A 및 L235A 및 카파 경쇄 서열을 포함하는 IgG1 항체를 의미한다. 특히, HA22 VH 서열 및 그의 인간 IgG1 불변 영역은 도 3a에, HA22 VL 서열 및 그의 인간 카파 불변 영역은 국제공개공보 제WO2012/047724호의 도 3b에 나타나 있다.
특정 구현예에서, HA22-유래 단일 클론 항-넥틴-4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 그의 CDR 서열에 의해 정의되되,
(a) 상보성-결정 영역(CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 영역, 여기서
(i) CDR-H1은 서열번호 72에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-H2는 서열번호 73에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-H3은 서열번호 74에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
및 선택적으로
(b) 가변 경쇄(VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
(i) CDR-L1은 서열번호 75에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(ii) CDR-L2는 서열번호 76에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
(iii) CDR-L3은 서열번호 77에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함;
을 포함한다.
서열번호 72-77은 IMGT 넘버링 시스템에 따른 부모 항체 HA22의 6개의 CDR 서열을 정의한다.
특정 구현예에서, HA22-유래 항체는 그의 VH 및/또는 VL 영역에 의해 정의될 수 있으되, 이러한 항체는,
(a) (i) 서열번호 78에 따른 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 79에 따른 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
더욱 특정한 구현예에서, HA22-유래 항체는,
(a) (i) 서열번호 78에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 (ii) 서열번호 79에 따른 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
을 포함한다.
토포이소머라제 I 억제제
본 발명의 항체 접합체의 약물은 토포이소머라제 I 억제제이다. 토포이소머라제 I 억제제는 토포이소머라제 I 및 DNA와 3원 복합체(ternary complex)를 형성하여, DNA 재-결찰(re-ligation)을 방지하고 세포 게놈에 DNA 가닥 단절(strand breaks)을 도입할 수 있는 화합물이다. 토포이소머라제 I 억제제는 예를 들어 캠프토테신(camptothecin) 또는 그의 유사체, 인데노이소퀴놀린(indenoisoquinolines) 및 인돌로카르바졸(indolocarbazoles)로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 토포이소머라제-I-억제제는 캠프토테신 또는 그의 유사체, 즉 캠프토테신의 펜타사이클릭 기본 구조 및 선택적으로 추가 고리의 존재를 초래하는 변형된 치환체를 포함하는 화합물이다. 구체적인 예로는 캠프토테신, 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), SN-38, 벨로테칸(belotecan), 이들의 유도체, 예를 들어 데룩스테칸(deruxtecan), 루토테칸(lurtotecan) 또는 아트라테칸(atiratecan)을 비롯한 엑사테칸(exatecan)이다.
특정 구현예에서, 토포아이소머라제 I 억제제는 엑사테칸이다:
엑사테칸은 전형적으로 NH2 기를 통해 항체에 접합된다.
접 합
토포이소머라제-I-억제제, 특히 엑사테칸은 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 공유적으로 접합된다.
원칙적으로, 토포이소머라제-I-억제제, 예를 들어 엑사테칸은 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 임의의 적합한 위치, 특히 항체가 넥틴-4에 결합하는 것을 어벌리쉬(abolish)하지 않는 임의의 위치에 접합될 수 있다. 예를 들어 토포아이소머라제-I 억제제, 예를 들어 엑사테칸은 항체 상의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 아미노기, 히드록시기 또는 티올기를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 또는 항체 글리칸 구조에서의 반응성 기에 접합될 수 있다. 특정 구현예에서, 토포이소머라제-I-억제제, 예를 들어 엑사테칸은 항체 상의 접근가능한 시스테인 잔기의 측쇄에서 반응성 티올기에 접합된다.
특정 구현예에서, 항체 약물 접합체는 1 초과의 약물-항체/항체 단편 몰 비(molar drug-antibody/antibody fragment ratio)(DAR)를 갖는 것, 즉 하나 초과의 약물 분자가 항체/항체 단편에 부착되어 있는 것을 포함한다. 전형적으로, 접합체는 약 2:1 내지 약 16:1, 특히 약 4:1 내지 약 10:1, 더욱 특히 약 6:1 내지 약 8:1의 DAR을 갖는다. DAR은 공지된 방법에 따라 통계 분포로부터 계산될 수 있다.
특정 구현예에서, 토포이소머라제-I-억제제는 링커를 통해 항체 또는 항원-결합 단편에 접합된다. 특정 구현예에서, 링커는 절단가능한 링커(cleavable linker), 즉 생리학적 조건 하에, 예를 들어 생리학적 효소에 의해 절단가능한 링커이다. 절단 가능한 링커의 구체적인 예로는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩티드계 링커, 또는 글리코시다제(glycosidase)에 의해 절단될 수 있는 글리코시드계 링커(glycoside-based linkers)가 있다.
특정 구현예에서, 링커는 예를 들어 Conilh 등의 문헌 ["Exatecan antibody drug conjugates based on a hydrophilic polysarcosine drug-linker platform" (Pharmaceuticals 14 (2021), 247)]에서 기술한 바와 같은 친수성 폴리사르코신 링커(hydrophilic polysarcosine linker)이다. 더욱 바람직한 링커는 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 링커, 예를 들어 항체-약물 접합체 MEDI7247, mcc-트리아졸 스페이서-PEG7-x-Lys-PABC 글리콜 링커(공급원 Trodelvy®)를 포함한다. 더욱 바람직한 링커는 올리고펩티드, 특히 디- 내지 데카펩티드, 예를 들어 테트라펩티드 서열, 예를 들어 글리신-글리신-페닐알라닌-글리신(공급원 Enhertu®)을 포함한다. 더욱 바람직한 링커는 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 에틸렌 글리콜 단위에 부가된 아실기, 카바모일기 및/또는 설파미드기와 같은 고극성 스페이서(highly polar spacer), 예를 들어 HydraspaceTM으로 불리는 링커 기술을 포함한다.
특정 구현예에서, 링커는 예를 들어 15개 이하의 사르코신 단위, 및 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커이며, 여기서 링커는 글리코시다제(glycosidase)에 의해 절단되고, 특히 글루쿠로니다제(glucuronidase)에 의해 절단된다.
특정 구현예에서, 링커는 예를 들어 약 8 내지 12개의 사르코신 단위, 및 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 10개 이하의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커이며, 여기서 링커는 글리코시다제에 의해 절단되고, 특히 글루쿠로니다제에 의해 절단된다.
특정 구현예에서, 링커는 10개의 사르코신 단위 및 2개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커이며, 여기서 링커는 글루쿠로니다제에 의해 절단된다.
본 발명의 항체 약물 접합체는 공지의 방법으로 제조할 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 핵산 분자, 예를 들어 항체 VH 영역 또는 항체 VL 영역을 암호화하거나 완전한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 DNA 분자, 또는 벡터 또는 벡터 시스템, 즉 상기 핵산 분자(들)를 포함하는 복수의 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 생산될 수 있으며, 바람직하게는 발현 조절 서열, 특히 이종 발현 조절 서열과 작동적으로 연결된다. 숙주세포는 항체 또는 항체 단편을 생산하는 임의의 공지된 숙주세포일 수 있으며, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 하이브리도마 세포(hybridoma cell)와 같은 원핵세포일 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 링커-약물 접합체와 반응시켜서 항체-약물 접합체를 얻을 수 있다. 링커-약물 접합체는 예를 들어 적절한 링커가 부착된 약물 분자를 포함하며, 여기서 링커는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 상의 원하는 부착 위치와 반응할 수 있는 반응성 기를 포함한다. 시스테인 잔기에 부착시키기 위해, 링커-약물 접합체는 티올-반응성 기, 예를 들어 말레이미드 기를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은,
(i) 예를 들어 약 8 내지 12개의 사르코신 단위, 및 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커(hydrophilic polysarcosine linker), 상기 링커는 글리코시다제(glycosidase), 특히 글루쿠로니다제(glucuronidase)에 의해 절단되며, 상기 링커는 티올 반응성 기, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편 상의 시스테인 잔기와 반응할 수 있는 말레이미드 기를 포함함, 및
(ii) 상기 링커에 공유적으로 부착된 토포이소머라제 I 억제제, 특히 엑사테칸,
을 포함하는 링커-약물 접합체에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 링커-약물 접합체는,
(i) 10개의 사르코신 단위 및 2개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커, 상기 링커는 글리코시다제, 특히 글루쿠로니다제에 의해 절단되며, 상기 링커는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 상의 시스테인 잔기와 반응할 수 있는 말레이미드기를 포함함, 및
(ii) 상기 링커에 공유 부착된 엑사테칸,
을 포함한다.
링커-약물 접합체는 본원에 기술된 바와 같이 항-넥틴-4 항체에 부착하기에 특히 적합하다. 그러나, 링커-약물 접합체는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 종양 항원 또는 그의 항원-결합 단편에 결합하는 항체에도 부착되기에 적합하다는 점에 유의해야 한다.
약학 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 약학 조성물로서, 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체인 활성제, 상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4에 결합하고, 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제, 특히 엑사테칸임; 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제;를 포함하는 약학 조성물이다.
항체 약물 접합체의 제형화에 적합한 담체 및 부형제의 예로는 식염수 및 완충 수용액 등이 있으며, 이 분야에 잘 알려져 있다. 통상적으로, 상기 약학 조성물은 비경구 투여, 예를 들어 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 또는 주입에 의하여 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 국소 투여, 예를 들어 방광내 점적주입에 의하여 투여될 수 있다.
장애의 단계 및 중증도에 따라, 상기 약학 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 인간 개체에게 치료학적 유효량으로 1회 또는 수회 투여될 수 있다. 예를 들어 이를 하루에 1회 또는 수회, 2일마다, 매주 또는 매주 2회, 예를 들어 적어도 1주일 또는 적어도 1개월의 적절한 기간 동안 투여할 수 있다.
의학적 응용
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 기재된 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물은 인간 및 가축 의약을 포함하는 의약, 특히 인간 의약에 사용된다.
특정 구현예에서, 상기 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물은 넥틴-4 관련 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 특히 넥틴-4 양성 암의 예방 및/또는 치료 방법, 보다 특히 넥틴-4 과발현과 관련된 암의 예방 및/또는 치료 방법에 사용된다.
예방 및/또는 치료할 암은 임의 유형의 암일 수 있으며, 본원에서 "암"이란 증식성 질환을 의미한다. 본 발명에 따른 예방 및/또는 치료할 암은 바람직하게는 방광암, 요로상피암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 갑상선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 두경부암 및/또는 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
치료학적 용도로 사용되는 경우, 이를 필요로 하는 대상체, 특히 인간 개체에게 유효량으로 투여한다. 투여량은 특정 약제의 종류, 예를 들어 항체 또는 항체 단편의 종류, 질환의 종류, 투여 방식, 예를 들어 국소 또는 전신적으로 투여한다.
암의 예방 및/또는 치료에 있어서, 항체 약물 접합체의 치료학적 투여량은 통상적으로 약 0.3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg이다.
항체 약물 접합체는 단독으로 투여하거나 화학치료제, 예를 들어 항대사산물, 알킬화제, 삽입제(intercalating agents), 또는 항-유사분열제(anti-mitotic agents), 특정 키나아제 억제제, 예를 들어 티로신 키나아제 억제제, 세린/트레오닌 키나아제 억제제 또는 포스포이노시티드 키나아제 억제제, 면역치료 화합물, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitors), CAR-T 세포, 치료용 백신 또는 종양용해성 바이러스(oncolytic viruses)와 함께 투여할 수 있다.
또한, 본 발명을 하기 표, 도면 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.
도면의 설명
도 1: Ch-15A7.5 및 Ch-5A12.2는 인간 넥틴-4를 인식한다. 유세포분석법에 의한 검출
Ch-15A7.5 또는 Ch-5A12.2 항체의 용량 범위(0.3 ng/mL - 5 μg/mL)를 사용하여 넥틴-4의 N-말단 프래그-태그된 에피토프(N-terminal Flag-tagged epitope)를 형질감염시킨 MDA-MB231의 유세포 분석. 부모 MDA-MB231 세포가 대조군으로 포함된다. 이어서 세포를 피코에리트린 접합 염소 항-인간 Fc 항체로 염색하였다. 정규화된 평균 형광 강도가 표시된다. 인레이(inlay): 항-넥틴-1, -2 및 -3 mAb(5μg/mL)로 염색하였다. 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 2: Ch-15A7.5는 인간 넥틴-4의 IgV-유사 도메인을 인식한다. ELISA에 의한 검출
나타낸 바와 같이, 5μg/mL의 넥틴-1 세포외 도메인 Fc 융합 재조합 단백질(Nec1-VCC), 또는 넥틴-4 IgV 유사 도메인 Fc 융합 재조합 단백질(Nec4-V) 또는 넥틴-4 세포외 도메인 Fc 융합 재조합 단백질(Nec4-VCC)로 96-웰 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. Ch15A7.5는 넥틴-4 세포외 도메인을 인식하며, 보다 정확하게는 넥틴-1 세포외 도메인이 아닌 넥틴-4 IgV-유사 도메인을 인식한다.
도 3: Ch-15A7.5 에피토프의 특성 분석. 경쟁 분석은 ELISA에 의해 수행되었다.
96-웰 플레이트를 5μg/mL의 넥틴-4 세포외 도메인 Fc 융합 재조합 단백질(Nec4-VCC)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 퍼옥시다제(peroxidase)-접합 Ch-15A7.5 mAb(5μg/mL)의 결합은 리툭시맙, Ch-15A7 mAb, 엔포르투맙(HA22), Ch-N41 mAb 및 Ch-14A5 mAb의 증가하는 농도(2.75ng/mL - 6μg/mL) 하에서 측정되었다. HA22, Ch-N41 및 CH-14A5는 넥틴-4의 IgV 도메인을 인식한다.
도 4: 넥틴-4 결합에 대한 넥틴-1과 Ch-15A7.5 및 5A12.2 mAb의 경쟁. 경쟁은 유세포 분석에 의해 평가되었다.
96-웰 플레이트에 인간 넥틴-4 cDNA로 형질감염된 50,000개의 CHO 세포를 접종하였다. 세포를 45분 동안 증가하는 농도(8 ng/mL - 5 μg/mL)의 이소타입 대조군, Ch-15A7.5 또는 Ch-5A12.2 mAb로 인큐베이션하였다. 세척 후, 20μg/mL의 넥틴-1 세포외 도메인 Fc 융합 재조합 단백질(Nec1-VCC)로 플레이트를 배양하였다. 피코에리트린에 결합된 염소 항-인간 Fc 항체로의 인큐베이션 후 넥틴-1 결합이 드러났다.
도 5: 시노몰구스 원숭이, 래트, 마우스로부터의 넥틴-4와의 교차-반응성(cross-reactivity). 유세포 분석에 의한 검출.
Ch-15A7(A), Ch-3A1.4(B), Ch-5A12.2(C), Ch-9A2.7(D) 또는 엔포르투맙(Enfortumab)(HA22, B) 항체의 용량 범위(0.05 ng/mL - 5 μg/mL)를 사용하여 시노몰구스 원숭이, 래트 또는 마우스 넥틴-4로 감염시킨 CHO 세포의 유세포 분석. 이어서 세포를 피코에리트린 접합체 염소 항-인간 Fc 항체로 염색하였다. 정규화된 평균 형광 강도를 나타낸다. 표는 비-선형 곡선 피팅(non-linear curve fitting)(4개의 파라미터)을 사용하여 그래프패드 프리즘 9 소프트웨어에 의해 결정된 추정 EC50 값을 보고한다. 기호는 보고된 값이 불량한 곡선 맞춤으로 인해 모호함을 나타낸다.
도 6: 종양 세포주 및 정상 분화된 인간 각질형성세포에 의해 발현된 넥틴-4에 대한 차별적인 결합. 유세포 분석에 의한 검출.
엔포르투맙(HA22, 사각형), Ch-15A7.5(원), Ch-3A1.4(삼각형), Ch-9A2.7(마름모)의 용량 범위(1.2ng/mL-5μg/mL)를 사용하여 TNBC 세포주(SUM190, 플레인 심볼(plain symbols)) 및 정상 분화된(0.1 mM CaCl2) 인간 각질형성세포(NHEK, 오픈 심볼(open symbols))의 유세포 분석. 이어서 세포를 피코에리트린 접합체 염소 항-인간 Fc 항체로 염색하였다. 정규화된 평균 형광 강도를 나타낸다. 비선형 곡선 맞춤(4개의 파라미터)은 GraphPad Prism 9 소프트웨어로 수행하였다. 수평 바(horizontal bar)는 SUM190 세포 상에서 HA22 항체로 얻은 최대 염색 강도의 50%에 위치된다.
도 7: 종양 세포주 및 정상 분화된 인간 각질형성세포에 의해 발현된 넥틴-4와의 차별적인 결합. 유세포 분석에 의한 검출.
HA22(엔포르투맙), Ch-5A12.2, Ch-15A7.5, 및 Ch-8F06의 5 μg/mL를 사용하여 TNBC 세포주(SUM190, A) 및 정상 분화된(0.1 mM CaCl2) 인간 각질형성세포(NHEK, B)의 유세포 분석. 이어서 세포를 피코에리트린 접합체 염소 항-인간 Fc 항체로 염색하였다. 정규화된 평균 형광 강도를 나타낸다.
도 8: 종양 세포주 및 인간 각질형성세포에 의해 발현된 넥틴-4와의 차별적 결합. 면역-조직화학(immuno-histochemistr)에 의한 검출.
높은 발현 수준의 넥틴-4 종양 세포주(SUM190), 낮은 발현 수준의 넥틴-4 종양 세포주(SUM149), 인간 및 시노몰구스 피부의 냉동-예약된 OCT-임베딩된 블록(cryo-reserved OCT-embedded block)을 15A7.5 mAb(A) 및 9A2.7 mAb(B)로 염색 처리하였다. 각각의 mAb에 대해 보고된 빠른 점수(quick score)가 표시된다(A, B.). C, 인간 피부에 대한 빠른 점수 SUM190의 비율.
도 9: 종양 세포주 및 인간 각질형성세포에서 차등 내재화. 형광에 의한 검출.
엔포르투맙(HA22), Ch-15A7.5 및 이소형 대조군 mAb를 pHAB 티올 반응성 염료에 커플링하여 4.58 내지 5.55의 염료 항체 비율에 도달하였다. 이들 항체 염료 접합체 각각의 용량 범위(1.6ng/mL~5μg/mL)를 SUM190PT 넥틴-4-발현 세포주(A) 정상 인간 분화된(0.1mM CaCl2) 각질형성세포(B)와 함께 2회 인큐베이션하였다. 세포내 형광은 형광 마이크로플레이트 리더기(ClarioStar)로 24시간 후에 기록하였다. 염료 항체 접합체 농도에 따른 형광 강도가 보고되어 있다.
도 10: 종양 세포 및 정상 분화된 인간 각질형성세포에 대한 시험관 내 세포독성 활성의 차이. MTT 분석으로 측정한 세포 생존율.
엔포르투맙(HA22, 마름모), Ch-15A7.5(삼각형) 및 Ch-9A2.7(사각형) mAb를 -아마니틴(amanitin)에 커플링하여 항체 약물 접합체를 생성하고, 용량 범위(7.7 pg/mL - 15 μg/mL)의 세포 독성 활성을 SUM190PT 넥틴-4-발현 세포주(A, D) 또는 정상 인간 분화된(0.1mM CaCl2) 각질형성세포(B, E)에서 비교 평가하였다. 5일의 인큐베이션 기간 후 생존율(MTT 분석)이 보고된다. EC50 값은 비선형 곡선 맞춤(4개의 파라미터)을 사용하여 GraphPad Prism 9 소프트웨어로 측정하였다. 각각의 조건에 대해, HA22-ADC에 대한 Ch-15A7.5 ADC(C) 또는 Ch-9A2.7 ADC(F)의 EC50의 비율을 계산하여 보고하였다. 표시된 데이터는 2개의 서로 다른 넥틴-4 발현 종양 세포주(SUM190PT 및 MDA-MB468)와 3개의 독립적인 인간 각질 세포 기증자를 대표한다.
도 11: Ch-15A7.5-MA-PS-ßGlu-엑사테칸 ADC를 사용한 SUM190 이식된 NSG 마우스의 처리는 오래 지속되는 종양 퇴행 기간을 유도한다.
NSG 마우스(n=5/그룹)에 매트리젤에 임베딩된 SUM190PT 세포를 양측에 정위적으로 이종 이식하였다. 하기 3종의 다른 ADC에 대해 시험하였다: 이소형 대조군, ICT- 및 Ch-15A7.5-MA-PS-ß글루-엑사테칸 및 엔포르투맙 베도틴 대용물(Enfortumab vedotin surrogate), HA22-MC-vc-PABC-MMAE. 마우스의 처리(1회 정맥 주사)는 종양이 약 150 mm3에 도달했을 때 시작되었다. Ch-15A7.5-MA-PS-ßGlu-엑사테칸(Ch-15A7.5-Ex) 및 Ch-5A12.2-MA-PS-ßGlu-엑사테칸(Ch-5A12.2-Ex)은 2가지 용량(4 또는 8 mg/kg)으로 평가되었고, ICT-MA-PS-ßGlu-엑사테칸(ICT-Ex)은 8 mg/kg으로 제공되었고, 엔포르투맙 베도틴(EV) 대용물은 4 mg/kg으로 제공되었다. 그후 일주일에 2회 캘리퍼로 종양 크기(n=10/그룹)를 모니터링하고 수학식 LxlxhxPi/6을 사용하여 그 크기를 보고하였다.
도 12: 종양 세포에 대한 인간화된 변이체의 명백한 친화성. 유세포 분석에 의한 검출.
넥틴-4를 발현하는 T47D 인간 종양 세포를 넘버링하고 Ch-15A7.5 또는 지시된 인간화된 변이체의 용량 범위(169 pg/mL - 30 μg/mL)로 인큐베이션하였다. H 및 L과 관련된 숫자는 도입된 역돌연변이(back mutations)의 수를 의미한다. 이후 세포를 피코에리트린 접합체 염소 항-인간 Fc 항체로 염색하고 유세포 분석으로 분석하였다. 평균 형광 강도가 보고된다. GraphPad Prism 9 소프트웨어는 비선형 곡선 맞춤(4개의 파라미터)을 이용하였다.
도 13: HA22-MA-PS-ßGlu-엑사테칸 ADC를 사용한 SUM190 이식된 NSG 마우스의 처리는 오래 지속되는 종양 퇴행 기간을 유도한다.
NSG 마우스(n=5/그룹)에 매트리젤에 임베딩된 SUM190PT 세포를 양측에 정위적으로 이종 이식하였다. 하기 3종의 다른 ADC에 대해 시험하였다: 이소형 대조군, ICT- 및 HA22-MA-PS-ß글루-엑사테칸 및 엔포르투맙 베도틴 대용물(Enfortumab vedotin surrogate), HA22-MC-vc-PABC-MMAE. 마우스의 처리(1회 정맥 주사)는 종양이 약 150 mm3에 도달했을 때 시작되었다. HA22MA-PS-ßGlu-엑사테칸(HA22-Ex)은 2가지 용량(4 또는 8 mg/kg)으로 평가되었고, ICT-MA-PS-ßGlu-엑사테칸(ICT-Ex)은 8 mg/kg으로 제공되었고, 엔포르투맙 베도틴(EV) 대용물은 4 mg/kg으로 제공되었다. 그후 일주일에 2회 캘리퍼로 종양 크기(n=10/그룹)를 모니터링하고 수학식 LxlxhxPi/6을 사용하여 그 크기를 보고하였다.
도 14: HA22-MA-PS-ßGlu-엑사테칸 및 A22-MC-GGFG-DX8951 ADC를 사용한 SUM190 이식된 NSG 마우스의 처리는 오래 지속되는 종양 퇴행 기간을 유도한다.
NSG 마우스(n=5/그룹)에 매트리젤에 임베딩된 SUM190PT 세포를 양측에 정위적으로 이종 이식하였다. 하기 5종의 다른 ADC에 대해 시험하였다: MA-PS-ßGlu-엑사테칸(ICT-Ex 및 HA22-Ex) 또는 MC-GGFG-DX8951(ICT- 및 HA22-Dxd)로 커플링된 이소형 대조군, ICT- 및 HA22-MA-PS-ß글루-엑사테칸 및 엔포르투맙 베도틴 대용물, HA22-MC-vc-PABC-MMAE. 마우스의 처리(1회 정맥 주사)는 종양이 약 150 mm3에 도달했을 때 시작되었다. HA22-Ex 및 HA22-Dxd는 2가지 용량(4 또는 8 mg/kg)으로 평가되었고, ICT-EX 및 ICT-Dxd는 8 mg/kg으로 제공되었으며, 엔포르투맙 베도틴(EV) 대용물은 4 mg/kg으로 제공되었다. 그후 일주일에 2회 캘리퍼로 종양 크기(n=10/그룹)를 모니터링하고 수학식 LxlxhxPi/6을 사용하여 그 크기를 보고하였다.
도 15: 종양 세포주 및 정상 분화된 인간 각질형성세포에 의해 발현된 넥틴-4에 대한 Ch-15A7.5 및 그의 인간화된 변이체의 차별적인 결합. 유세포 분석에 의한 검출.
Ch-5A12.2, Ch-15A7.5 및 그의 인간화된 변이체 15A7.5-H1L2, -H1L3, -H2L2, -H2L3, -H3L0, -H3L2, -H3L3의 용량 범위(8 pM - 33 nM)를 사용하여 TNBC 세포주(SUM190, 윗쪽 패널(upper panels)) 및 정상 분화된(0.1 mM CaCl2) 인간 각질형성세포(NHEK, 아랫쪽 패널(lower panels))의 유세포 분석. 이어서 세포를 피코에리트린 접합체 염소 항-인간 Fc 항체로 염색하였다. 정규화된 평균 형광 강도를 나타낸다. 비선형 곡선 맞춤(4개의 파라미터)은 GraphPad Prism 9 소프트웨어로 수행하였다. 각질 세포(아랫쪽 패널)에 대한 Ch-15A7.5 및 그의 인간화된 변이체(아랫쪽 패널)의 겉보기 EC50이 Ch-5A12.2에 비해 훨씬 낮다는 점에 주목한다.
도 16: 부모 항체 클론 5A12.2의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK)의 아미노산 서열. IMTG 명명법에 따른 H-CDR 및 L-CDR 서열은 밑줄로 표시한다.
도 17: 9A2.7의 인간화된 변이체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK)의 아미노산 서열. IMTG 명명법에 따른 H-CDR 및 L-CDR 서열은 밑줄로 표시한다.
도 18: 3A1.4의 인간화된 변이체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK)의 아미노산 서열 IMTG 명명법에 따른 H-CDR 및 L-CDR 서열은 밑줄로 표시한다.
도 19: 8F06의 인간화된 변이체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK)의 아미노산 서열. IMTG 명명법에 따른 H-CDR과 L-CDR 서열은 밑줄로 표시하였다.
도 20: 15A7.5의 인간화된 변이체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 아미노산 서열. IMTG 명명법에 따른 H-CDR과 L-CDR 서열은 회색-음영으로 표시한다.
도 21: 인간화된 15A7.5 변이체의 친화도 값.
도 22: 부모 항체 클론 15A7.5 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK)의 아미노산 서열. IMTG 명명법에 따른 H-CDR과 L-CDR 서열은 회색-음영으로 표시한다.
도 23: 항체 HA22의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VK)의 아미노산 서열. IMTG 명명법에 따른 H-CDR과 L-CDR 서열은 회색-음영으로 표시한다.
실시예
물질 및 방법
세포주
인간 유방암 세포주 MDA-MB231(ATCC, Manassas, VA)을 10% 태아소 혈청, 50 IU/mL의 페니실린, 50 μg/mL의 스트렙토마이신 및 2 mM의 글루타민이 보충된 DMEM에서 배양하였다. PVRL4 cDNA를 함유하는 발현 벡터 p3XFLR4.C1로 세포를 형질감염시켰다. 인간 삼중 음성 유방암 세포주 SUM190PT(BioIVT, Westbury, NY)는 5% 태아소 혈청, 1% 비필수 아미노산, 1% 헤르페스(Hepes), 1% 인슐린, 1 μg/mL의 하이드로코르티손, 6.8 ng/mL의 트리요오도 L-티로신, 100 IU/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신 및 2 mM의 글루타민이 보충된 Ham's F12 배지에서 배양하였다. 중국 햄스터 난소 CHO 세포주는 10% 태아소 혈청, 100 IU/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신 및 2 mM의 글루타민이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 인간 유방암 MDA-MB-468 세포주 및 T47D 세포주는 10%의 태아소 혈청, 100 IU/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI에서 배양하였다.
ELISA:
Ch-15A7.5 항체의 특이성을 조절하고 다른 mAb 간의 경쟁 분석을 수행하기 위해 샌드위치 효소 연계 면역흡착 분석을 사용하였다. 10 nM의 넥틴-4-VCC-Fc, 넥틴-1-VCC-Fc(세포외 부분 포함) 또는 넥틴-4-V-Fc(IgV 도메인만 포함)으로 96-웰 플레이트를 +4℃에서 밤새 코팅하였다. PBS 1% BSA로 세척 및 포화시킨 후, 세포를 25℃에서 2 시간 동안 10 nM의 퍼옥시다제가 결합된 Ch-15A7.5 mAb와 함께 인큐베이션하였다. 경쟁의 경우, “차가운(cold)” mAb의 가변 농도(0.018 nM 내지 40 nM)의 존재하에서 0.5 nM의 퍼옥시다제가 접합된 Ch-15A7.5 mAb의 결합을 측정하였다. 100 μL의 퍼옥시다제 기질을 첨가하고(One Step ABST, Pierce), OD는 405 nm에서 적색으로 나타났다.
유세포 분석:
넥틴-4(천연 또는 형질감염된)를 발현하는 세포 또는 세포주(10,000 - 50,000개)를 지시된 항체의 용량 범위에서 배양하였다. 세척 후, 피코에리트린-접합된 염소 항-인간 항체(5 μg/mL)(Jackson Immuno Research)로 염색하였다. 고정 후, 유세포 분석 획득 전에 세포를 생존 염료(e780, Invitrogen)로 염색하였다.
면역-조직화학:
-80℃에 보관한 동결된 샘플을 드라이아이스에 보관하고 후속 절편 수를 최대화할 수 있도록 플라스틱 냉동 몰드(plastic cryomolds)에 넣어 최적 절삭 온도(Optimal Cutting Temperature; OCT) 배지에 넣었다. OCT의 동결된 블록을 OCT를 갖는 디스크에 장착하고 NX70 냉동조(cryostat)(Thermo Scientific) 상에서 -20℃에서 냉동 절단(cryosections)이 수행되었다. 냉동 절편(cryosections)(7μm)를 상청액+슬라이드(VWR)에 장착하였다. 각 일련의 시험에 대해 요청된 슬라이드 수만 준비하여 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 남은 블록은 추가 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 슬라이드에 절편을 배열하여 -20℃에서 10분간 아세톤에 고정하였다. Roche DAB 키트 프로토콜의 일부로 슬라이드를 과산화수소(H2O2)에 침지시켜 내인성 퍼옥시다제를 억제하였다. 각 mAb의 여러 희석액을 시험하여 노이즈 대 신호비(noise to signal ratio)를 최적화하고 0.5μg/mL의 마우스 15A7.5 mAb 및 10μg/mL의 마우스 9A2.7 mAb를 최적의 것으로 결정하였다. 마우스 조직에 대한 2차 항체의 비특이적 결합을 완화하기 위해 1차 Ab 인큐베이션 후 토끼 항-마우스 IgG(4μg/mL, Abcam)를 첨가하였다. 이후 제조사의 지침(Ventana Auto)에 따라 Omni-map anti-rabbit HRP(Roche)를 이용하여 DAB 염색을 실시하였다. 염색 강도 및 염색된 세포 둘 다의 비율 평가를 실시하였다. 훈련된 기술자 2명은 동일한 현미경 영역을 독립적으로 순차적으로 관찰하였다. 염색된 세포 비율 및 염색 강도를 모두 각 영역별로 평가하였다. 각 염색을 위해 조직의 최상의 시각화를 허용하는 배율로 10개의 영역을 무작위로 선택하였다. 점수 매김 절차는 다음과 같았다: (i) 양성 염색된 세포의 비율을 추정하고 각 영역별로 0 내지 4의 점수를 부여하고(0=0-5%; 1=5-25%; 2=25-50%; 3=50-75%; 4=75-100%); (ii) 염색강도는 각각 음성, 약, 중간, 강한 갈색 염색의 존재에 해당하는 0, 1, 2, 또는 3으로 점수를 부여하였다. 각각의 영역별과 각 관찰자에 대한 최종 점수는 두 값의 곱이다(0=조직에 염색 없음; 12=조직이 강하게 염색된 세포를 함유함). 각각의 조직 유형에 대해, 각각의 슬라이드 세트의 5개의 슬라이드 각각에 대해 염색 강도 및 표지된 세포의 비율을 모두 10개의 독립 관찰 영역이 병렬적으로 점수를 부여받았다. 기술자는 주어진 영역을 동시에 관찰하고(컴퓨터 스크린 상의 가상 슬라이드), 독립적으로 점수를 부여하여 다른 관찰자 결과를 맹검하였다. 각각의 슬라이드에 대해 각각의 기술자의 10점을 평균하여 각각의 관찰자에 대한 최종 점수를 설정하였다. 주어진 슬라이드에 대한 조직 점수를 산출하는 두 관찰자의 최종 점수를 평균하였다. 인간 피부에 대해서는 첫 번째 반복성 결과만 제시한다
내재화 분석
96-웰 플레이트에 1000만개의 SUM190PT 또는 인간 분화된 각질형성세포(0.1 mM CaCl2)를 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 pHAB 티올 반응성 염료와 접합된 이소형 대조군 및 항 넥틴-4 mAbs의 용량 범위(1.6ng/mL - 1μg/mL)로 인큐베이션하였다. 내재화 및 엔도-리소좀 가공 시 산성 환경은 염료가 형광을 일으킨다. 532nm에서 여기, 560nm에서 방출하는 형광 강도를 플레이트 리더에서 모니터링하였다.
시험관 내 세포독성 분석
ADC의 시험관 내 세포독성 활성을 분석하기 위해 제조사(Biosource, CA, USA)가 권장하는 AlamarBlue 염색 프로토콜을 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 시험은 형광 산화-환원 지시약(fluorescent oxidation-reduction indicator)을 포함한다. 형광 강도는 세포 대사 감소에 비례한다. 96-웰 플레이트에서 0일째 ADC의 연속 희석액과 3000개 세포/웰(SUM190PT 또는 분화된 NHEK)을 3회 인큐베이션하여 실험을 수행하였다. AlamarBlue는 10분의 1 부피의 alamarBlue 용액을 37℃에서 2시간 인큐베이션하여 5일째 측정하고, 595nm(FLUOstar Optima, BMG Labtech)에서 판독하였다.
마우스 실험
Charles River Laboratory(Margate, UK)로부터 NOD/SCID(비만 당뇨병/중증 복합 면역결핍)/gc null 마우스(NSG)를 얻었다. 6주 내지 7주령의 암컷(n=5/그룹)을 매트리젤에 내장된 SUM190PT(0.5×106) 세포와 양측에 정위적으로 이종이식하였다. ADC 처리는 각 실험에서 언급한 바와 같이 수행하였다. 종양 크기(n=10/그룹)를 캘리퍼로 1주일에 2회 모니터링한 후 수학식 LxlxhxPi/6으로 그 크기를 보고하였다.
하이브리도마 시퀀싱(hybridoma sequencing)
하이브리도마 시퀀싱을 위해 먼저 하이브리도마 세포 펠렛으로부터 RNA를 추출하였다. cDNA는 역전사에 의해 생성하였고, VH 및 VL 도메인은 Prime STARMax DNA Polymerase(Takara)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하였다. 이후 PCR 산물을 전용 중쇄 및 경쇄 발현 벡터에 클로닝한 후 시퀀싱하였다.
키메라 항체 생성, 생산, 정제 및 대조군
경쇄 발현 벡터는 V 카파 사슬(kappa chain)을 암호화한다. 사용된 페이로드에 따라 2개의 상이한 중쇄 발현 벡터를 사용하였으며, 하나는 D265C(ThiomAb) L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 Fc 단편에 대한 암호화이며, 다른 하나는 P331S, L234Q 및 L235F 돌연변이를 갖는 Fc 단편에 대한 암호화이다. 두 Fc 단편은 모두 "Fc-silent"이다. 항-넥틴-4 엔포르투맙(HA22)의 서열도 동일한 벡터에서 복제되었다.
경쇄 및 중쇄 벡터를 HEK293에 1.2/1 비율로 접종하였다. 6일 생산 후 배양상청액을 정화하고, 제조사의 지침에 따라 MabSelect PrismA 수지(resin)(GE Healthcare)를 이용하여 mAb를 정제하였다. 결합 완충액(binding buffer)으로 0.5 M 글리신, 3 M NaCl, pH 8.9를 사용하였고, 용리를 위해 0.1 M 시트레이트 pH 3을 사용하였다. 10%(V/V) 1M 트리스-HCl pH 9로 즉시 중화를 수행하였다. 이후 PBS 1X pH 7.4(미니 투석 장치, 2 ml-10k, Thermo Scientific)에 대해 단일 클론 키메라 항체를 투석한 후 0.22 μm 필터(Millex GV 친수성 PVDF, Millipore)로 여과하였다. 나노드롭 2000 분광광도계(Thermo Scientific)로 농도를 측정하여 각 단일 클론 항체의 특이 흡광 계수(E1%280nm)를 고려하였다. 순도는 10% 이소프로판올이 첨가된 0.2 M NaPO4, 0.3 M NaCl pH 6.9로 평형화된 Protein-BEH 200A 컬럼을 사용하여 Acquity UPLC-HClass Bio(Waters)를 사용하여 UPLC-SEC로 측정하였다. 항체의 질량은 역상 컬럼(PLRP-S 4000A, Agilent technologies)을 사용하여 Xevo G2-S Q-Tof 질량분광기(Waters)에서 측정하였다. 모든 샘플은 제조사의 지침에 따라 37℃에서 PNGase F 글리코시다제(New England Biolabs)로 탈당화 후 분석하였다. 최종 물질의 단편화 및/또는 응집은 SDS-PAGE로 평가하였다. 내독소 부하는 발색성 LAL-동력학적 분석(chromogenic LAL-kinetic assay)(Charles River Endosafe)을 사용하여 측정하였다.
항체 접합
티올 반응성 염료 pHAB(Promega)를 제조사의 지침에 따라 말레이미드 화학을 사용하여 선별된 항-넥틴-4 티오mAb(D265C, L234A, L235A) 항체의 시스테인에 접합하였다. 간략하게, 항체는 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.0에 대해 투석한 후 온화한 교반 하에 상온에서 1시간 동안 2.5 mM로 환원하였다. 이후, DTT는 Zeba 스핀 탈염 컬럼(7 MWCO)에서 2회 세척/원심분리하여 제거하였다. pH 염료 시약(10 μg/mL DMSO) 1.2 L를 항체 100 μg에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 광으로부터 보호하여 인큐베이션하였다. Zeba 탈염 컬럼으로 과잉 염료를 제거한 후 염료 항체 비율을 계산하여 서로 다른 항체 간의 등가 접합을 확인하였다.
시스테인 반응성 링커-엑사테칸 화합물 밀레이미드-Gly-PSAR10-글루쿠로니드-엑사테칸(MabLink)은 선별된 항-넥틴-4 mAb(P331S, L234Q 및 L235F)의 시스테인 잔기에 접합하였다. 간략하게, PBS 1X 중 mAb는 1 mM EDTA를 TCEP 14 몰당량으로 37℃에서 2시간 동안 환원한 후 완충액을 100 mM KPO4, 1 mM EDTA pH 7.4로 교환하였다(Amicon ultra 30kDa). 시스테인 반응성 링커-엑사테칸 화합물 12 몰당량은 반응성 시스테인과의 접합을 위해 상온에서 35분 동안 사용하였다. 이후, 완충액을 100 mM KPO4 pH 8.0으로 교환한 후, 산소 없이 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 말레이미드를 자가 가수분해하였다. 최종 교환 완충액은 0.22 μM 필터를 여과하기 전에 20mM His pH 6.0에서 수행하였다. LC-MS 분석에 따른 약물-항체 비율(DAR)은 접합된 mAb 당 7.77 내지 7.82개의 독소로 구성되었다. SEC-HPLC로 측정한 물질의 8% 미만이 응집되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Emergence Therapeutics AG <120> Anti-Nectin-4 Antibody Exatecan conjugates <130> 72919P WO <160> 111 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR1 VH_15A7.5 IMGT <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR2 VH_15A7.5 IMGT <400> 2 Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Gly Ile 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR3 VH_15A7.5 IMGT <400> 3 Ala Arg Gly Ala Arg Ala Thr Gly Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR1 VK_15A7.5 IMGT <400> 4 Gln Asn Val Asp Thr His 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR2 VK_15A7.5 IMGT <400> 5 Ser Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR3 VK_15A7.5 IMGT <400> 6 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR1 VH_15A7.5 Kabat 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Claims (22)

  1. 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate)로서,
    상기 항체-약물 접합체는 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 또는 그의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment) 및 약물을 포함하고,
    상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4(Nectin-4)에 결합하며, 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor)인,
    항체-약물 접합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    키메라 항체(chimeric antibody), 다중특이적(multispecific) 항체, 특히 이중특이적(bispecific) 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로부터 선택된 항체를 포함하는, 항체-약물 접합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    클래스(class) IgG의 항체, 예를 들어 서브클래스(subclass) IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 항체, 클래스 IgM의 항체, 클래스 IgA의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 단일-사슬 항체, 또는 항체 Fv 단편으로부터 선택된 항체를 포함하되, 상기 항체는 선택적으로, 감소된 이펙터 기능(reduced effector function)을 갖는, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 중쇄 불변 도메인(heavy chain constant domain)을 갖는 것인, 항체-약물 접합체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    인간 분화된 각질형성세포(human differentiated keratinocytes)에 의해 발현된 넥틴-4에 비해 높은 친화성으로 종양에 의해 발현된 넥틴-4에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상보성-결정 영역(complementarity-determining regions; CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(variable heavy chain; VH) 영역, 여기서
    (i) CDR-H1은 서열번호 1 또는 7, 88, 96 또는 104에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (ii) CDR-H2는 서열번호 2 또는 8, 89, 97 또는 105에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (iii) CDR-H3은 서열번호 3 또는 9, 90, 98 또는 106에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
    및 선택적으로
    (b) 가변 경쇄(variable light chain; VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
    (i) CDR-L1은 서열번호 4 또는 10, 92, 100 또는 108에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (ii) CDR-L2는 서열번호 5 또는 11, 93, 101 또는 109에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (iii) CDR-L3은 서열번호 6 또는 12, 94, 102 또는 110에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함,
    를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
    (b) (i) 서열번호 7의 CDR-H1, 서열번호 8의 CDR-H2, 및 서열번호 9의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 10의 CDR-L1, 서열번호 11의 CDR-L2, 및 서열번호 12의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역; 또는
    (c) (i) 서열번호 88의 CDR-H1, 서열번호 89의 CDR-H2, 및 서열번호 90의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 92의 CDR-L1, 서열번호 93의 CDR-L2, 및 서열번호 94의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
    (d) (i) 서열번호 96의 CDR-H1, 서열번호 97의 CDR-H2, 및 서열번호 98의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 100의 CDR-L1, 서열번호 101의 CDR-L2, 및 서열번호 102의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 또는
    (e) (i) 서열번호 104의 CDR-H1, 서열번호 105의 CDR-H2, 및 서열번호 106의 CDR-H3을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) 서열번호 108의 CDR-L1, 서열번호 109의 CDR-L2, 및 서열번호 110의 CDR-L3을 포함하는 VL 영역,
    을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 13, 91, 99 또는 107에 따른 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역,
    및 선택적으로
    (b) VL 영역, 특히 서열번호 14, 95, 103 또는 111에 따른 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
    을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 서열번호 13에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 14에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
    (b) (i) 서열번호 91에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 95에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
    (c) (i) 서열번호 99에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 103에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역, 또는
    (d) (i) 서열번호 107에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역, 및 선택적으로 (ii) VL 영역, 특히 서열번호 111에 따르는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역,
    을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상보성-결정 영역(CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 영역, 여기서
    (i) CDR-H1은 서열번호 21, 35, 49 또는 63에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (ii) CDR-H2는 서열번호 22, 36, 50 또는 64에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (iii) CDR-H3은 서열번호 23, 37, 51 또는 65에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
    및 선택적으로
    (b) 가변 경쇄(VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
    (i) CDR-L1은 서열번호 24, 38, 52 또는 66에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (ii) CDR-L2는 서열번호 25, 39, 53 또는 67에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (iii) CDR-L3은 서열번호 26, 40, 54 또는 68에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함;
    을 포함하는, 항체 또는 유래된 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상보성-결정 영역(CDR) CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄(VH) 영역, 여기서
    (i) CDR-H1은 서열번호 72 또는 80에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (ii) CDR-H2는 서열번호 73 또는 81에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (iii) CDR-H3은 서열번호 74 또는 82에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함;
    및 선택적으로
    (b) 가변 경쇄(VL) 영역, 특히 상보성-결정 영역(CDR) CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 VL 영역, 여기서
    (i) CDR-L1은 서열번호 75 또는 84에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (ii) CDR-L2는 서열번호 76 또는 85에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열,을 포함함,
    (iii) CDR-L3은 서열번호 77 또는 86에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 하나의 아미노산, 예를 들어 1 또는 2개의 아미노산의 치환 또는 삽입, 특히 보존적 치환 및/또는 히스티딘 삽입을 포함하는 아미노산 서열을 포함함;
    을 포함하는, 항체 또는 유래된 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 토포이소머라제 I 억제제는 캠프토테신(camptothecin) 또는 그의 유사체이고, 상기 토포이소머라제 I 억제제는 특히 엑사테칸(exatecan) 또는 데룩스테칸(deruxtecan)인, 항체-약물 접합체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    약 2:1 내지 약 16:1, 특히 약 4:1 내지 약 10:1, 더욱 특히 약 6:1 내지 약 8:1의 약물-항체/항체 단편 몰 비(molar drug-antibody/antibody fragment ratio)(DAR)를 갖는 것인, 항체-약물 접합체.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 약물은 상기 항체 상의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 아미노기, 히드록시기 또는 티올기를 포함하는 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 또는 항체 글리칸 구조에서 반응성 기에 접합되고, 상기 약물은 특히 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 상의 시스테인 잔기의 측쇄에서 반응성 티올 기에 접합되는 것인, 항체-약물 접합체.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 약물은 링커(linker)를 통해 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합되되, 특히 상기 링커는 특히 절단가능한 링커(cleavable linker)이고/이거나, 상기 링커는 특히 친수성 폴리사르코신 링커(hydrophilic polysarcosine linker), 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 링커, 고극성 스페이서(highly polar spacer)를 포함하는 링커, 또는 올리고펩티드 링커인, 항체-약물 접합체.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 링커는 친수성 폴리사르코신 링커 및 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위이고, 상기 링커는 글리코시다제(glycosidase)에 의해 절단될 수 있고, 특히 글루쿠로니다제(glucuronidase)에 의해 절단될 수 있는 것인, 항체-약물 접합체.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 링커는, 예를 들어 8-12개의 사르코신 단위, 및 적어도 하나의 에틸렌 글리콜 단위, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커이며, 상기 링커는 글리코시다제에 의해 절단되고, 특히 글루쿠로니다제에 의해 절단되는 것인, 항체-약물 접합체.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 10개의 사르코신 단위 및 2개의 에틸렌 글리콜 단위를 포함하는 친수성 폴리사르코신 링커인, 항체-약물 접합체.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는 글루쿠로니다제에 의해 절단되는 것인, 항체-약물 접합체.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 링커는, 티올-반응성 기, 특히 말레이미드 기를 통해, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 상의 시스테인 잔기에 부착되는 것인, 항체-약물 접합체.
  20. 약학 조성물로서,
    상기 약학 조성물은 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체인 활성제 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하고,
    상기 단일 클론 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 넥틴-4에 결합하고, 상기 약물은 토포이소머라제 I 억제제인, 약학 조성물.
  21. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 제 19 항의 의약 조성물의 용도로서, 의약, 특히 인간 의약에서의 용도.
  22. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 제 19 항의 의약 조성물의 용도로서,
    넥틴-4 관련 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 특히 넥틴-4 양성 암의 예방 및/또는 치료 방법, 방광암, 요로상피암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 갑상선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 두경부암 및/또는 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 예방 및/또는 치료 방법에서의 용도.
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