KR20180104148A - 개선된 내재화 특징을 갖는 다중특이적 항원-결합 분자 - Google Patents

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KR20180104148A
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다비드 사테인
파울 파렌
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Abstract

본 발명은 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. 제1 도메인은 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하고, 제2 도메인은 내재화 이펙터 단백질 (E)에 특이적으로 결합하며, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 다중특이적 항원-결합 분자는 암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 유용하다.

Description

개선된 내재화 특징을 갖는 다중특이적 항원-결합 분자
본 발명은 다중특이적 항원-결합 분자, 상기 다중특이적 항원-결합 분자를 포함하는 조성물, 및 질환의 치료에서의 상기 다중특이적 항원-결합 분자의 용도에 관한 것이다.
제1 모노클로날 항체의 개발 이후로 연구는 인간 치료를 위한 항체의 추가의 최적화를 지향하였다. 제1 모노클로날 항체는 마우스 및 래트로부터 유래하였다. 항체 기술의 진전은 감소된 면역원성 위험 프로파일을 갖는 인간화 및 인간 항체의 가용성으로 이어졌다. 유전 및 화학 공학은 증가된 치료 잠재력을 갖는 보다 더 강력한 항체의 개발로 나아가고 있다. 이는 독성 분자에 대한 접합을 통해 최적화된 Fc-매개 이펙터 기능, 최적화된 결합 특징 또는 최적화된 항종양 활성을 갖는 항체를 포함한다 (항체-약물 접합체).
항체-약물 접합체 (ADC)는 항체-매개 종양-표적화를 독소의 세포독성 활성과 조합함으로써 암의 치료를 위한 강력한 치료제로 부상하고 있다. ADC는 세포독성 페이로드 또는 약물에 연결된 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체, 단일-쇄 가변 단편 [scFv], 또는 이중특이적 항체)를 포함한다. 종양-연관 항원에 대한 항체를 사용하여 세포독성 약물을 종양으로 향하게 하는 것의 이점은 치료 범위가 미접합된 세포독성 약물에 비해 개선될 수 있다는 것이다. 이는 증가된 효력의 세포독성 페이로드의 적용을 가능하게 한다.
현재, 2종의 ADC가 이미 치료 용도로 승인되었다: 재발성 호지킨 림프종 및 재발성 sALCL의 치료를 위한 브렌툭시맙 베도틴 (애드세트리스(Adcetris)), 및 이전에 트라스투주맙 및 탁산을 개별적으로 또는 조합으로 제공받은 HER2-양성 전이성 유방암 환자의 치료를 위한 트라스투주맙 엠탄신 (카드실라(Kadcyla)). 또한, 50종 초과의 상이한 ADC가 현재 임상 평가 중이다. 많은 경우에, ADC는 그의 페이로드를 방출하고 후속 세포독성을 유도하기 위해 독소-접합된 항체 분자의 표적화된 세포 내로의 내재화에 의존한다. 임상 개발 중인 대부분의 ADC는 항원/ADC 복합체의 내재화 및 리소솜 프로세싱 후에 순환에서 안정하고 그의 세포독성 페이로드를 방출하도록 설계된다.
그러나, 항원- 및 항체-매개 내재화를 위한 요건은 적합한 ADC 표적의 수를 제한한다. 많은 종양-연관 항원은 잘 내재화하지 않거나 또는 리소솜으로 잘 라우팅(routing)하지 않고, 따라서 ADC-기반 치료제에 대한 덜 유망한 후보 표적에 해당한다. 또한, 많은 경우에, ADC의 세포내 프로세싱은 비효율적이다. 내재화 후에, 수용체 예컨대 트랜스페린, HER2, 세포 부착 분자 L1 및 인테그린은 엔도솜 구획에서 형질 막까지 계속적으로 다시 재순환된다. 따라서 높은 항원 턴 오버, 리소솜으로의 효율적인 전위, 및 고도로 독성인 페이로드가 ADC에 의한 최대 사멸 활성을 달성하는 데 요구된다.
ADC의 내재화, 리소솜 표적화, 종양내 및 세포내 프로세싱을 증진시키는 방법은 ADC의 종양 세포 사멸 활성을 증진시키는 데 사용될 수 있다. ADC 활성을 최적화하기 위한 하나의 접근법은 종양-연관 표적 상의 특정한 에피토프를 선택하는 것인데, 이는 인식된 특정한 에피토프가 내재화 및 리소솜 라우팅에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 예를 들어, HER2-ADC의 효능은 이종이량체 형성을 통한 다른 ErbB 분자 상의 HER2의 피기백킹(piggybacking)에 의해 증진된 내재화를 가능하게 하는 HER2-ADC를 선택함으로써 개선될 수 있는 것으로 이전에 밝혀졌다. 이는 높은 및 낮은 HER2 발현 종양 세포 둘 다에 대한 ADC 전달 및 종양 세포 사멸 능력을 증가시키기 위한 매력적인 전략을 제공한다.
일반적으로, ADC의 효율적인 내재화에 이은, 단백질분해가 일어날 수 있는 리소솜으로의 라우팅이 바람직하다. 그러나, 종양 세포 상의 많은 세포 표면 단백질 및 탄수화물 구조의 경우, 이들 과정의 규모는 ADC에 의한 충분히 강력한 세포 사멸을 가능하게 하기에 불충분하다.
국제 특허 출원 WO2013/138400은 표적 항원 예컨대 IL-4R 또는 SOST에 특이적으로 결합하는 제1 도메인, 및 내재화 이펙터 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 도메인을 갖는 다중특이적 항체를 기재한다. 표적 항원이 종양-연관 항원인 경우에, 다중특이적 항체에 의한 종양-연관 항원 및 내재화 이펙터 단백질의 결합은 종양 세포의 표적화된 사멸을 용이하게 한다.
본 발명의 목적은 내재화 능력이 종양-연관 표적에 대한 단일특이적 항원-결합 분자에 비해 증가된 이중특이적 또는 다중특이적 항원-결합 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 내재화 능력이 종양-연관 표적에 대해 지시된 단일특이적 항체 약물 접합체 분자에 비해 증가된 이중특이적 또는 다중특이적 항체 약물 접합체 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 세포에서의 증가된 내재화, 리소솜 표적화 및/또는 세포내 프로세싱을 갖는 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 세포에 대한 증가된 세포독성 및/또는 더 적은 부작용을 갖는 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 증가된 치료 범위를 갖는 ADC를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불량하게 내재화하거나 또는 리소솜에 불량하게 라우팅하는 종양-연관 항원에 대한 효과적인 ADC의 생성을 가능하게 하는 것이다.
제1 측면에서, 본 발명은 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이며, 여기서 제1 도메인은 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하고, 제2 도메인은 내재화 이펙터 단백질 (E)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 KD를 갖는다.
제2 항원-결합 도메인의 특정한 친화도 범위가 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자에 놀랍도록 유익한 특성을 부여하는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 제2 항원-결합 도메인은 다중특이적 분자의 내재화를 용이하게 유도할 뿐만 아니라 약물-접합된 다중특이적 분자의 세포독성을 유도하기 위한 특정한 범위의 결합 친화도 내에서 발견된다. 이는 특히 제1 도메인이 종양-연관 항원 예컨대 예를 들어 HER2에 특이적으로 결합하는 데 적용된다. 동시에, 제2 항원-결합 도메인은 제1 결합 도메인의 결합 없이는 특정한 범위의 결합 친화도 내에서 제한된 내재화 및 세포독성만을 발휘하며 (ADC의 상황에서 사용되는 경우), 즉, 종양-연관 표적 (T)의 부재 하에 내재화 이펙터 단백질 (E)을 발현하는 세포에서 놀랍도록 낮은 세포독성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자는 비-종양 세포에서 최소 내재화, 리소솜 라우팅 및 독소 방출을 동반하면서, 종양 세포에서 결합, 내재화, 리소솜 라우팅 및 독소 방출을 나타낸다.
또한, 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자는 통상적으로 내재화하지 않거나 또는 불량하게 내재화하는 종양 항원의 이용을 가능하게 함으로써 잠재적 ADC 표적의 풀을 크게 증진시키는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이며, 여기서 분자는 세포독성 모이어티, 방사성동위원소, 약물, 시토카인 또는 RNA 침묵 비히클에 접합된다. 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방하는 방법에서의 다중특이적 항원-결합 분자의 용도, 및 종양을 표적화하는 방법에서의 다중특이적 항원-결합 분자의 용도에 관한 것이며, 방법은 대상체에게 다중특이적 항체 또는 ADC를 투여하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 다중특이적 항원-결합 분자를 활성 성분으로서 포함하는 제약 조성물, 다중특이적 항원-결합 분자를 코딩하는 핵산(들), 상기 핵산(들)을 함유하고 단일 또는 다중 원핵 또는 진핵 숙주 세포주에서 상기 핵산을 적절하게 발현할 수 있는 발현 벡터, 및 상기 벡터(들)를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포주에 관한 것이다.
정의
결합, 친화도 및 KD
본원에 사용된 용어 "결합"은 예를 들어 약 10-8 M 이하의 KD 값에 상응하는 결합 친화도를 갖는 미리 결정된 항원 또는 표적에 대한 항원-결합 분자 예컨대 항체의 결합을 지칭한다.
통상의 기술자는 친화도 및 평형 해리 상수 KD의 개념에 익숙할 것이다. 해리 상수 KD는 생물층에 의해 측정될 수 있다.
KD 값은 항원-결합 분자, 예를 들어 항체를 고정화된 리간드로서, 및 항원을 분석물로서 사용하는 옥테트 HTX 기기에서의 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 결정될 수 있다.
KD (M)는 다중특이적-항원 결합 분자와 항원 사이의 특정한 상호작용, 바람직하게는 항체 분자의 단일 결합 아암과 항원 사이의 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고, kd를 ka로 나눔으로써 수득할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "kd" (sec- 1)는 다중특이적-항원 결합 분자와 항원 사이의 특정한 상호작용의 해리율 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 kdis, koff 값 또는 오프-레이트로 지칭된다. 본원에 사용된 용어 "ka" (M-1 x sec- 1)는 다중특이적-항원 결합 분자와 항원 사이의 특정한 상호작용의 회합률 상수를 지칭한다. 상기 값은 또한 kon 값 또는 온-레이트로 지칭된다.
항체
본 발명의 문맥에서 본원에 사용된 용어 "항체" (Ab)는 항원에 결합하는 항체와 연관된 생리학적 반응을 유도, 촉진, 증진 및/또는 조정하기 위한 적절한 기능적으로 규정된 기간 동안 전형적 생리학적 조건 하에, 항원에 특이적으로 결합하는, 바람직하게는 이중특이적 항체의 경우와 같이 2개의 상이한 항원에 이중 결합하는 능력을 갖는 이뮤노글로불린 분자, 이뮤노글로불린 분자의 단편, 또는 그 중 하나의 유도체를 지칭한다.
이뮤노글로불린 분자 (중쇄 및/또는 경쇄 중 어느 하나 또는 중쇄 단독)의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체 (Ab)의 불변 영역은 FcRn에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 또한 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 예컨대 비제한적으로: 듀오바디(DuoBody) 분자, 탠덤 scFv, 탠덤 scFv-Fc, 노브-인투-홀(knob-into-hole) IgG, scFv-Fc 노브-인투-홀, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, 디아바디, sc디아바디, sc디아바디-Fc, 또는 sc디아바디-CH3, 트리오맙, kih IgG 공통 LC, 크로스맙(CrossMab), DVD-Ig, 투 인 원-IgG, IgG-scFv, bi-나노바디, BiTE, 탠드Ab, DART, DART-Fc, scFv-HSA-scFv, 오르토Fab-IgG, 4가 Tv-IgG, 독-앤-락(dock-and-lock) (DNL) 포맷 예컨대 DNL-Fab3 및 아지메트릭 스캐폴드, 또는 유사한 분자일 수 있다.
상기 나타난 바와 같이, 본원에서의 용어 항체는 달리 언급되거나 또는 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 항원-결합 단편인, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 "항체" 내에 포괄되는 항원-결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편 또는 WO2007059782 (젠맙(Genmab))에 기재된 바와 같은 1가 항체인 Fab' 또는 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 도메인의 VL 및 VH 도메인으로 본질적으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 본질적으로 이루어지고 또한 도메인 항체로 불리는 dAb 단편; (vi) 낙타류 또는 나노바디 및 (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 게다가, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 개별 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 단일 단백질 쇄로서 이들이 제조되도록 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있으며 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성되어 1가 분자 (단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fv (scFv)로 알려짐)를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체는 달리 언급되거나 또는 문맥에 의해 명백하게 나타내지 않는 한 용어 항체 내에 포괄된다. 본 발명의 문맥에서의 이들 및 다른 유용한 항체 단편, 뿐만 아니라 이러한 단편의 이중특이적 포맷은 본원에 추가로 논의된다. 또한, 달리 명시되지 않는 한, 용어 항체는 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 (mAb), 항체-유사 폴리펩티드, 키메라 항체, 인간화 및 완전 인간 항체, 및 임의의 알려져 있는 기술, 예컨대 효소적 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술에 의해 제공되는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편 (항원-결합 단편)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 생성된 바와 같은 항체는 임의의 이소형을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 (하위)부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE 또는 IgM)를 지칭한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "1가 항체"는 항체 분자가 항원의 단일 분자에만 결합할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 문맥에서 용어 "2가 항체"는 항체 분자가 특정한 항원에 대한 2개의 결합 도메인을 함유하고, 따라서 그 항원의 1 또는 2개 분자에 결합할 수 있음을 의미한다.
다중특이적 항체의 생성
본 발명의 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체는 문헌 [Labrijn et al., Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange, PNAS, vol. 110, no.13, pp. 5145-5150, March 2013], WO 2011/131746 A2, 또는 문헌 [Labrijn et al. Controlled Fab-arm exchange for the generation of stable bispecific IgG1, Nat Protoc, 2014 Oct;9(10):2450-63]에 기재된 바와 같은, 듀오바디® 기술로도 알려져 있는 제어된 Fab-아암 교환 (FAE)을 통해 생성될 수 있다. 간략하게, 이 시험관내 방법에서, 2종의 상이한 항체가 제공되는데, 둘 다 CH3 영역을 갖는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함하며, 여기서 각각의 CH3 영역의 서열은 상이하고, 매칭되는 돌연변이를 함유한다. 그 결과, 제1과 제2 CH3 영역 사이의 이종이량체 상호작용은 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 더 강하다. 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 디술피드-결합 이성질화를 겪게 하고 제어된 Fab-아암 교환에 의해 이중특이적 항체를 수득하기 위한 환원 조건 하에 인큐베이션된다. 환원제는 그 후에 디술피드 결합의 산화를 가능하게 하기 위해 혼합물 (이제 이중특이적 항체를 함유함)로부터 제거된다. 상기 CH3 영역의 서열은 매칭되는 돌연변이, 즉 2개의 CH3 영역 내의 상이한 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 IgG1 분자의 CH3 영역 중 1개 내의 위치 405에서의 돌연변이 및 또 다른 IgG1 분자의 CH3 영역 내의 위치 409에서의 돌연변이를 함유한다. 다중특이적 항체, 예컨대 비제한적으로: 탠덤 scFv, 탠덤 scFv-Fc, 노브-인투-홀 IgG, scFv-Fc 노브-인투-홀, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, 디아바디, sc디아바디, sc디아바디-Fc, 또는 sc디아바디-CH3, 트리오맙, kih IgG 공통 LC, 크로스맙, DVD-Ig, 투 인 원-IgG, IgG-scFv, bi-나노바디, BiTE, 탠드Ab, DART, DART-Fc, scFv-HSA-scFv, 오르토Fab-IgG, 4가 Tv-IgG, 독-앤-락 (DNL) 포맷 예컨대 DNL-Fab3 및 아지메트릭 스캐폴드, 또는 유사한 분자는 또한 다른 기술 및 포맷을 사용하여 생성될 수 있다.
다중특이적 항원-결합 분자의 내재화의 유도
다중특이적 항원-결합 분자에 의한 T 및 E 둘 다의 결합은 바람직하게는 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화, 뿐만 아니라 본 발명의 다중특이적 약물-접합된 항체의 세포독성을 표적 T 단독에 대한 결합에 의한 것보다 더 큰 정도로 유도한다. 예를 들어, 다중특이적 항원-결합 분자에 의한 T 및 E의 결합, 바람직하게는 동시 결합에 의해 유도되는 내재화는 E가 아닌 T에 대한 결합만을 함유하는 대조군 구축물의 존재 하에 측정된 내재화의 수준보다 10% 초과, 예컨대 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 100% 초과, 110% 초과, 150% 초과, 200% 초과, 300% 초과, 400% 초과, 500% 초과, 750% 초과, 1000% 초과, 2000% 초과 또는 5000% 초과 더 높을 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자가 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화를 제1 도메인 단독에 의한 표적 분자 (T)의 결합보다 더 큰 정도로 증진시키는지 결정하는 것의 비제한적 예는 하기 논의된 바와 같이, 실시예 5 및 8에서의 공동국재화 검정에, 또는 실시예 9의 HER2 하향조정 검정에 제시된다. 이들 실시예에서, T는 HER2이고 E는 CD63이다. 증진된 내재화의 개념에 관해, 실시예 13 및 14에서, 인테그린 베타-1 (CD29)을 표적 (T)으로서, 및 CD63을 증진된 내재화를 유도하고 있는 내재화 이펙터 단백질 (E)로서 사용하여 다중특이적 항체의 증진된 내재화가 입증된다.
본 발명자들은 특히 E가 CD63인 경우에, 제2 항원-결합 도메인의 특정한 친화도 범위가 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자에 놀랍도록 유익한 특성을 부여하는 것을 밝혀냈다. 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 KD의 특정한 친화도 범위 내의 E에 대한 항원-결합 도메인의 1가 결합은, 특히 제1 도메인이 종양-연관 항원 예컨대 예를 들어 HER2에 특이적으로 결합하는 경우에, 이중특이적 항체의 내재화 및 이중특이적 약물-접합된 항체의 세포독성을 용이하게 유도한다. 더욱이, 오직 E만 존재하고 종양-연관 표적 항원 (T)은 그렇지 않은 경우에, 제2 항원-결합 도메인은 이 특정한 친화도 범위 내에서 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화 및 다중특이적 약물-접합된 항체의 세포독성에 대한 제한된 기여만을 발휘하며, 즉, 종양 표적 (T)의 부재 하에 내재화 이펙터 단백질 (E)을 발현하는 세포에서 놀랍도록 낮거나 부재하는 세포독성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자는 비-종양 세포 내로의 최소 내재화를 동반하면서, 종양 세포에서 결합, 내재화, 리소솜 축적을 나타낸다.
CD63
분화 클러스터 63 (CD63, 유니프롯(Uniprot) ID P08962) 분자는 또한 리소솜-연관 막 당단백질 3 (LAMP-3)으로도 알려져 있다. CD63은 또한 혈소판 당단백질 40 (Pltgp40), 흑색종 항원 ME491 또는 MLA1, 안구 흑색종-연관 항원 (OMA81H), 테트라스파닌-30 (TSPAN30), 그라눌로피신 또는 리소솜 내재성 막 단백질-1 (LIMP-1)로도 알려져 있다. CD63은 테트라스파닌 슈퍼패밀리의 구성원이고 편재적으로 발현된다. CD63 유전자는 인간 염색체 12q13 상에 위치하며, 최초로 특징화된 테트라스파닌이었다. 원래, CD63은 활성화된 혈소판의 세포 표면 상에 (Pltgp40으로 알려짐) 및 초기 단계 인간 흑색종 세포에 (ME491로 알려짐) 존재하는 단백질로서 발견되었다.
CD63은 많은 세포 유형에서 발현된다. 다른 것들 중에서, CD63은 휴지기 혈소판 및 호염기구의 리소솜, 엔도솜, 과립에서 세포내 발현된다. CD63의 세포 표면 발현은 활성화된 호염기구 및 혈소판, 단핵구, 대식세포 및 과립구 상에서 검출될 수 있다. CD63은 또한 내피 세포, 섬유모세포, 골모세포, 신경 조직, 흑색종 세포, 평활근 세포 및 비만 세포 상에서 발현된다. CD63은 형질 막과 세포내 구획 사이를 셔틀링하는 것으로 기재된다.
CD63의 주요 풀은 세포내 구획 예컨대 엔도솜 및 리소솜에 상주하지만, 일부 발현은 세포 표면 상에서 발견될 수 있다. CD63은 전형적으로 세포내이입을 통해 다른 단백질의 수송을 조절하는 것으로 기재되어 있다. 게다가, CD63은 리소솜 분해를 위한 효소를 표적화함으로써 막-유형 1 매트릭스 메탈로프로테이나제의 표면 발현을 조절하는 것으로 기재되어 있고, 내피 세포에서의 CD63의 침묵은 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2)의, 그의 리간드 VEGF에 반응한 내재화를 막는다. 또한 상이한 종양 유형에 걸쳐, CD63은 형질 막과 리소솜 사이에서 계속해서 셔틀링하는 것으로 나타났으며, 이는 AP2 및 클라트린의 존재에 의존하였다. 따라서 CD63은 그 자체로 리소솜에 충분히 내재화하고/거나 셔틀링하지 않는 종양 항원을 표적화하는 특정 항체 약물 접합체 (ADC)의 효능을 증진시키는 데 적합한 특색인 내재화 및 리소솜 전달을 용이하게 하는 매력적인 항원으로 보인다.
CD63은 초기 단계 흑색종 세포에서 풍부하게 발현된 표면 항원으로서 최초로 발견되었지만, CD63 발현은 종양-특이적 발현을 나타내지 않는다. CD63 세포 표면 발현은 악성 흑색종 진행 동안 감소되며, 이는 CD63의 세포 표면 발현과 종양 침습성 사이의 음성 상관관계를 나타낸다.
종양-연관 항원
종양-연관 항원은 (특정) 종양 세포의 표면 상에 발현되고 더 적은 정도의 표면 발현이 정상 세포 상에서 발견되는 항원이다. 본원에 사용된 용어 "종양-연관 항원"은 단백질 또는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 탄수화물, 당단백질, 지질, 지단백질, 리포폴리사카라이드, 또는 종양 세포의 (외부) 표면 상에 우선적으로 발현되는 다른 비-단백질 중합체를 지칭한다. 이 문맥에서 사용된 용어 "우선적으로 발현되는"은 항원이 비-종양 세포 상의 항원의 발현 수준보다 적어도 10%, 예컨대 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 750%, 적어도 1000%, 적어도 2000% 또는 적어도 5000% 더 큰 수준으로 종양 세포 상에 발현되는 것을 의미한다. 종양-연관 항원은 종양 세포에 의해 합성되는 임의의 단백질, 당단백질 또는 다른 거대분자로부터 유래할 수 있다.
종양-연관 항원은 상이한 부류의 항원으로 분류될 수 있다: 1) MAGE, BAGE, GAGE, NY-ESO 및 BORIS 패밀리로부터의 항원을 포함한, 통상적으로 고환에서 또는 일부 종양에서 발현되나 정상 조직에서는 그렇지 않은 부류 I HLA-제한된 암 고환 항원; 2) 멜라닌세포 분화 항원 예컨대 MART-1, gp100, PSA, 티로시나제, TRP-1 및 TRP-2를 포함한 부류 I HLA 제한된 분화 항원; 3) CEA, HER2/neu, hTERT, MUC1, MUC2 및 WT1을 포함한, 정상 및 종양 세포 둘 다에서 발현되나 상이한 수준 또는 변경된 번역 생성물로 발현되는 항원인 광범위하게 발현된 항원; 4) β-카테닌, α-태아단백질, MUM, RAGE, SART 등을 포함한, 정상 유전자의 돌연변이로부터 발생한 고유한 항원인 종양 특이적 항원; 5) 바이러스 항원 예컨대 HPV, EBV; 및 6) Bcr-Abl과 같은, 종양 세포에 의해 독점적으로 발현되는 새로운 단백질을 생성하는 염색체 재배열 예컨대 결실, 전위, 역위 또는 중복에 의해 생성되는 단백질인 융합 단백질.
종양-연관 항원의 바람직한 예는 5T4, A33, 액티빈 수용체, 아드레노메둘린 수용체, AFP, AGS-5, ALK, 아넥신, AXL, B7-H3, B7-H4, BAGE 단백질, BCMA, 봄베신, C33 항원, C4.4a, C-유형 렉틴-유사(-수용체), CA19.9, CA-125, CADM1, CAIX, CanAg, CAR, 탄산 안히드라제, 카베올린-1, CCK2R, CD4, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD37, CD38, CD44, CD51, CD57, CD70, CD73, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CEA, CEACAM, c-kit, 클라우딘, 케모카인 수용체 (즉, CXCR4, CXCR5), c-Met, Cripto-1, DEC-205, 데를린-1, 데스모글레인-3, Dlk-1, DLL3, DS6, E-카드헤린, E-셀렉틴, EAG-1, ED-B, EpCAM, EGFR, EGFRvlll, 엠프린, 엔도텔린 수용체, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, 에프린 유형-A 수용체, 에피레귤린, ETA, FAP-알파, FcyR's, FGFR, FOLR1, 프리즐드, Fyn3, 갈렉틴, 강글리오시드, GCC, GD2, GD3, 글로보H, 리피칸-3, GLUT3, GPNMB, G-단백질 커플링된 수용체 (즉, GPR49), gp100, Hsp, HLA/B-raf, HLA-DR, HLA/k-ras, HLA MAG E-A3, HMW-MAA, hTERT, ICAM-3, IGF-R, IL-13-R, L1CAM, 라미닌 수용체, LIV1, LMP2, LRP5, LRP6, MAGE 단백질, MART-1, 멜라노트랜스페린, 메소텔린, 메탈로프로테이나제, ML-IAP, 뮤신, Mud, Mud 6 (CA-125), MU M1, N-카드헤린, NA17, NCAM-1, 넥틴4, Notch, NP-55, NRP1, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ES01, PLAC1, PRLR, PRAME, 프로미닌-1, PSMA (FOLH 1), RON, SLC44A4, SLITRK6, Steap-1, Steap-2, 서바이빈, 신데칸, TAG-72, TF, TGF-β, TMPRSS2, TMEFF2, TNFR, Tn, TROP2, TRP-1, TRP-2, TWEAKR, 티로시나제, 우로플라킨-3 및 VEGFR을 포함한다.
종양-연관 항원의 바람직한 예는 고도로 과다발현되나 충분한 리소솜 수송이 결여된 종양-연관 항원, 예컨대 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커링된 단백질 (즉, 글리피칸 패밀리, uPAR, 폴레이트 결합 수용체, 프로스타신, FcgRIIIb [CD16b], 알칼리성 포스파타제, 아세틸콜린에스테라제, 5' 뉴클레오티다제 [p36], Cripto, LFA-3 [CD58], DAF [CD55], Thy-1 [CD90], Qa-2, Ly-6A 및 MIRL [CD59]), 부착 분자 (즉, 셀렉틴, L1CAM, N-CAM, LRP1, TAG1, 카드헤린)를 포함하며, 이들은 종종 세포내이입 후에 형질 막으로 다시 재순환되며, 단지 부차적 분획만이 리소솜 분해에 대해 표적화된다.
종양-연관 항원의 바람직한 예는 낮은 카피수의 bsADC의 2가 결합을 개선시킬 수 있는 CD63과 상호작용하는 것으로 알려져 있는 종양-특이적 항원을 포함한다. 예를 들어, CD63은 다른 테트라스파닌 (즉 CD81, CD82, CD9 및 CD151), 인테그린, MHCII, CXCR4, TM4SF5, 신테닌-1, TIMP-1, H, K-ATPase, L6-항원 및 MT1-MMP와 상호작용하는 것으로 기재되어 있다.
종양-연관 항원의 예는 당표적 예컨대, 루이스-Y (CD174), 루이스-X (CD15), SLeX, SLeA, sTn, 푸코실-GM1, 글로보 H, SSEA-3, GM2, GD2, GD3, 폴리시알산 또는 당단백질 (즉, 뮤신)의 선택을 포함한다.
도 1은 ELISA에 의한 측정된, 재조합 인간 CD63에 결합하는 항-CD63 항체의 용량 반응 곡선을 보여준다.
도 2는 무표지 생물층 간섭측정법으로 측정된, 항-CD63 항체의 친화도 변이체의 친화도 측정치를 보여준다.
도 3은 Colo205 세포에서의 1가 bsCD63N74Hxb12-Duo3 ADC 및 bsHER2xCD63N74H-Duo3 ADC의 세포독성을 시험하는 생존율 검정의 결과를 보여준다.
도 4는 SK-OV-3 세포에서의 1가 bsCD63N74Hxb12-Duo3 ADC 및 bsHER2xCD63N74H-Duo3 ADC의 세포독성을 시험하는 생존율 검정의 결과를 보여준다.
도 5는 HCC1954 세포에서의 1가 bsCD63N74Hxb12-Duo3 ADC 및 bsHER2xCD63N74H-Duo3 ADC의 세포독성을 시험하는 생존율 검정의 결과를 보여준다.
도 6은 SK-OV-3 세포에서 공초점 현미경검사로 측정된, 1가 bsCD63N74Hxb12 이중특이적 분자의 리소솜 공동국재화를 보여준다.
도 7은 유동 세포측정법에 의해 결정된, SK-OV-3 세포에 대한 bsHER2xCD63N74H의 결합을 보여준다.
도 8은 과립구 및 혈전구에서의 FITC-접합된 CD63 항체 및 CD63 친화도 변이체 항체의 세포내 축적을 보여준다.
도 9는 시간 경과에 따른 SK-OV-3 세포에서의 bsHER2xCD63N74H의 리소솜 공동국재화를 보여준다.
도 10은 bsHER2xCD63N74H와의 3일의 인큐베이션 후에 ELISA에 의해 정량화된, 상이한 발현 수준의 HER2를 갖는 종양 세포주에서의 HER2 단백질의 총량을 비처리된 세포와 비교하여 보여준다.
도 11은 시험관내 듀오스타틴-3 접합된 이중특이적 ADC의 세포독성을 시험하는 생존율 검정의 결과를 보여준다.
도 12는 SK-OV-3 종양 이종이식편으로 피하 접종된 후 듀오스타틴-3 접합된 다중특이적 ADC로 처리된 마우스에서의 평균 종양 크기 및 종양 부재 생존의 백분율을 보여준다.
도 13은 유동 세포측정법에 의해 평가된, SK-OV-3 세포에 대한 bs베타1xCD63N74H의 결합을 보여준다.
도 14는 SK-OV-3 세포에서의 bs베타1xCD63N74H의 리소솜 공동국재화를 보여준다.
도 15는 시간 경과에 따른 SK-OV-3 세포에서의 bs베타1xCD63N74H의 리소솜 공동국재화를 보여준다.
한 측면에서, 본 발명은 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이며, 여기서 제1 도메인은 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하고, 제2 도메인은 내재화 이펙터 단백질 (E)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 KD 값을 갖는다.
본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자의 종양 특이성을 제공하기 위해, 제1 항원-결합 도메인의 부재 하에, 내재화 이펙터 단백질 (E)에 특이적으로 결합하는 제2 도메인은 유리하게는 결합하지 않거나 또는 단지 낮은 친화도로 결합하고, 후속적으로 내재화하지 않거나 또는 적어도 유의하게 더 적은 정도로 내재화할 수 있다. 제2 항원-결합 도메인이 E에 대해 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 KD 값을 갖는 다중특이적 항원-결합 분자가 이러한 기준을 충족시키는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
표적 분자 (T), 바람직하게는 종양-연관 표적 분자는 단백질, 폴리펩티드, 지질 또는 다른 거대분자일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 표적 분자는 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 분자, 바람직하게는 종양-연관 표적 분자는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, T는 세포 표면-발현된 표적 단백질 또는 표적 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, T는 가용성 표적 단백질 또는 표적 폴리펩티드, 바람직하게는 세포 표면 수용체와 상호작용하는 것이다. 다중특이적 항원-결합 분자에 의한 표적 결합은 세포외에서 또는 세포 표면 상에서 일어날 수 있다.
한 실시양태에서, 표적 분자는 세포 표면-발현된 수용체이다. 바람직한 실시양태에서, 표적 분자는 티로신 키나제 수용체, 바람직하게는 막횡단 티로신 키나제 수용체이다. 또 다른 실시양태에서, 표적 분자는 막-결합된 리간드이다.
다른 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자, 바람직하게는 이중특이적 항원-결합 분자는 세포 표면 상에서 또는 세포 내부에서 E에 결합한다.
표적 분자가 종양-연관 항원, 예컨대 종양-연관 단백질 또는 폴리펩티드인 것이 특히 바람직하다. 유리하게는, 종양-연관 항원은 통상적으로 내재화되지 않거나 또는 불량하게 내재화되는 항원이다. 바람직하게는, 종양-연관 항원은 리소솜 구획으로의 비효율적인 라우팅을 보여주는 항원이다.
내재화 이펙터 단백질 (E)은 종양-연관 또는 종양-특이적일 수 있다. 다른 실시양태에서, 내재화 이펙터 단백질 (E)은 종양뿐만 아니라 비-종양 세포 상에서 또는 그 안에서 발현될 수 있다.
내재화 이펙터 단백질 (E)은 세포 내로 내재화될 수 있거나 또는 달리 내재화에 참여하거나 그에 기여하는 단백질이다. 일부 실시양태에서, 내재화 이펙터 단백질은 세포통과를 겪는 단백질이며; 즉, 단백질은 세포의 한 측면에서 내재화되고 세포의 다른 측면으로 수송된다. 바람직하게는, 내재화 이펙터 단백질은 막-결합된 수용체에 결합하는 막 단백질 또는 가용성 세포외 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 내재화 이펙터 단백질은 세포의 리소솜 구획으로의 효율적인 라우팅을 보여주는 단백질이다.
내재화 이펙터 단백질에 대한 제2 도메인의 결합은 유리하게는 다중특이적 항원-결합 분자 및 그와 연관된 표적 분자의 세포 내로의 내재화를 발생시킨다. 바람직한 실시양태에서, 내재화 이펙터 단백질은 적어도 1개의 세포외 도메인 또는 영역을 갖는 막-연관 단백질이며, 단백질은 내재화되고 바람직하게는 세포내 분해 및/또는 재순환 경로를 통해 프로세싱된다. 세포 내로 직접적으로 내재화되는 내재화 이펙터 단백질의 구체적 예는 예를 들어, CD63, MHC-I (예를 들어, HLA-B27), 크레멘-1, 크레멘-2, LRP5, LRP6, LRP8, 트랜스페린 수용체, LDL-수용체, LDL-관련 단백질 1 수용체, ASGR1, ASGR2, 아밀로이드 전구체 단백질-유사 단백질-2 (APLP2), 아펠린 수용체 (APLNR), MAL (미엘린 및 림프구 단백질, VIP17), IGF2R, 공포-유형 H+ ATPase, 디프테리아 독소 수용체, 폴레이트 수용체, 글루타메이트 수용체, 글루타티온 수용체, 렙틴 수용체, 스캐빈저 수용체 (예를 들어, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 내재화 이펙터 단백질 E는 세포 표면 내재화 수용체이다. 바람직한 실시양태에서, 내재화 이펙터 단백질 E는 CD63이다.
바람직한 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 i) 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 결합 아암 및 ii) 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 결합 아암을 포함한다.
다중특이적 항원-결합 분자가 이중특이적 항원-결합 분자인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 10-9보다 높고 10-8 M보다 낮은 해리 상수 KD 값을 갖는다. 또 다른 실시양태에 따르면, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 2.0x10-9 내지 9.0x10-9 M의 해리 상수 KD를 갖는다. 또 다른 실시양태에 따르면, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 2.0x10-9 내지 7.3x10-9 M의 해리 상수 KD를 갖는다.
또 다른 실시양태에 따르면, E는 세포 내로 내재화되는, 바람직하게는 직접적으로 내재화되는 세포 표면-발현된 분자이다. 바람직하게는, 다중특이적 항원-결합 분자는 표적 분자 (T)의 존재 하에서만 E에 결합함으로써 세포 내로 내재화된다. 제1 도메인이 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하는 경우에만 다중특이적 항원-결합 분자가 E에 결합함으로써 세포 내로 내재화되는 것이 또한 바람직하다.
한 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 E에 결합 시 T를 발현하지 않는 세포에 비해 T를 발현하는 세포 내로 보다 효율적으로 내재화한다.
또 다른 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 T에 결합 시 E를 발현하지 않는 세포에 비해 E를 발현하는 세포 내로 보다 효율적으로 내재화한다.
또 다른 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 E에 결합 시 T를 발현하는 세포에서 리소솜 구획으로 수송된다.
또 다른 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 E에 결합 시 T를 발현하지 않는 세포에 비해 T를 발현하는 세포에서 리소솜 구획으로 보다 효율적으로 수송된다.
또 다른 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 T에 결합 시 E를 발현하지 않는 세포에 비해 E를 발현하는 세포에서 리소솜 구획으로 보다 효율적으로 수송된다.
또 다른 실시양태에 따르면, E는 CD63, MHC-I, 크레멘-1, 크레멘-2, LRP5, LRP6, 트랜스페린 수용체, LDLr, MAL, V-ATPase 및 ASGR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, E는 CD63이다.
또 다른 실시양태에 따르면, E는 E와 내재화 세포 표면-발현된 수용체 분자 사이의 상호작용을 통해 세포 내로 내재화되는 가용성 리간드이다.
또 다른 실시양태에 따르면, T는 세포 표면-발현된 표적 분자이다. 특히 바람직한 실시양태에서, T는 종양-연관 항원이다. 따라서, 본 발명의 내재화-증진 전략은 종양-연관 표적 항원을 항원 예컨대 CD63의 내재화 능력과 조합하는 것을 수반할 수 있다. 특히, CD63 및 종양-연관 표적 둘 다에 결합하는 이중특이적 항체는 항체-약물-접합체의 특이적 표적화 및 증진된 내재화가 바람직한 치료 환경에서 유용할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, T는 HER2이다.
또 다른 실시양태에 따르면, 제1 및/또는 제2 항원-결합 도메인은 적어도 1개의 항체 가변 영역, 바람직하게는 적어도 2개의 항체 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 다중특이적 항원-결합 분자는 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체, 또는 그의 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항체 단편 또는 재조합적으로 조작된 부분이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 하나의 아암으로 1종의 항원에 결합함으로써 1종의 항원의 내재화 증진 특성을 사용하고, 이중특이적 항체의 다른 아암으로 표적 분자, 예컨대 종양-연관 표적 분자에 결합하는 데 사용될 수 있다. 이어서, 이러한 이중특이적 항체는 세포독성 접합체와 함께 로딩되어 ADC의 내재화 시에 세포 사멸을 유도할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체는 (i) 본원에 정의된 바와 같은 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 항체, 및 (ii) 본원에 정의된 바와 같은 내재화 이펙터 단백질 (E)에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 항체를 포함하는 이중특이적 항체이다.
바람직한 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 결합 아암 및 상기 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 결합 아암을 포함하는 이중특이적 항체이다. 유리하게는, 상기 제1 항원-결합 도메인은 제1 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제1 경쇄 가변 서열 (VL)을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 도메인은 제2 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제2 경쇄 가변 서열 (VL)을 포함하며, 여기서 상기 가변 서열은 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, (i) 상기 제1 결합 아암은 제1 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제1 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 서열 (VL) 및 제1 경쇄 불변 서열 (CL)을 포함하는 제1 경쇄를 포함하고, (ii) 상기 제2 결합 아암은 제2 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제2 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 가변 서열 (VL) 및 제2 경쇄 불변 서열 (CL)을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다.
또 다른 실시양태에 따르면, 제1 결합 아암은 키메라 항체로부터 또는 인간화 항체로부터 또는 인간 항체로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 제2 결합 아암은 키메라 항체로부터 또는 인간화 항체로부터 또는 인간 항체로부터 유래된다. 따라서, 한 실시양태에서, 제1 결합 아암은 인간 항체로부터 유래되고, 제2 결합 아암은 인간화 항체로부터 또는 키메라 항체로부터 유래된다.
본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자는 이중특이적 항체이며, 여기서 이중특이적 항체는 전장 항체, 바람직하게는 IgG1 항체인 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자는 단리된다. 본원에 사용된 "단리된 다중특이적 항원-결합 분자"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항원-결합 분자 또는 항체가 실질적으로 없는 다중특이적 항원-결합 분자, 예컨대 이중특이적 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 더욱이, 단리된 다중특이적 항원-결합 분자는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 상기 제2 항원-결합 도메인은 제2 항원-결합 도메인의 E에 대한 친화도를 조정하는 1개 이상의 돌연변이를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 항원-결합 도메인은 제2 항원-결합 도메인의 E에 대한 친화도를 조정하는 VH 및/또는 VL에서의 1개 이상의 돌연변이를 갖는 항체로부터 유래된다. 제2 항원-결합 도메인이 E에 대해 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 KD 값을 갖도록 친화도가 조정되는 것이 바람직하다.
또 다른 실시양태에 따르면, 상기 항체는 제2 항원-결합 도메인의 E에 대한 친화도를 조정하는 항-CD63 Fab 영역에서의 1개 이상의 돌연변이를 가지며, 여기서 E는 CD63이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 돌연변이는 단일 아미노산 치환, 바람직하게는 단일 아미노산 히스티딘 치환이다.
또 다른 실시양태에 따르면, VH 및/또는 VL에서의 상기 1개 이상의 돌연변이는 하기 표 1의 서열식별번호: 5에 따른 VL의 위치 54 또는 하기 표 1의 서열식별번호: 1에 따른 VH의 위치 71, 72 및/또는 74에서의 아미노산 치환, 바람직하게는 히스티딘 치환이다. 예를 들어, 항-CD63-N74H는 서열식별번호: 1에 따른 중쇄의 위치 74에서의 아스파라긴에서 히스티딘으로의 돌연변이를 갖고, 항-CD63-LN54H는 서열식별번호: 5에 따른 경쇄의 위치 54에서의 아스파라긴에서 히스티딘으로의 돌연변이를 갖는다. 또 다른 실시양태에 따르면, 제2 항원-결합 도메인은 그가 바람직한 친화도 범위 내의 KD로 표적 E에 결합하도록 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 상기 아미노산 치환, 바람직하게는 히스티딘 치환은 서열식별번호: 1에 따른 VH의 위치 74에 존재한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 서열식별번호: 1에 따른 VH의 N74H이다.
바람직한 실시양태에서, 바람직하게는 상기 제2 결합 아암의 일부로서의 상기 제2 도메인은
a) 각각 서열식별번호: 2, 3 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 9, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3, 또는
b) 각각 서열식별번호: 2, 10 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3, 또는
c) 각각 서열식별번호: 2, 11 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3, 또는
d) 각각 서열식별번호: 2, 12 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3
을 포함한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 바람직하게는 상기 제2 결합 도메인의 일부로서의 상기 제2 도메인은 각각 서열식별번호: 2, 12 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3을 포함한다.
또 다른 실시양태에 따르면, 상기 다중특이적 항원-결합 분자는 CD63-특이적 모노클로날 항체의 돌연변이된 Fab 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 상기 다중특이적 항원-결합 분자는 CD63-특이적 모노클로날 Ab 2192의 돌연변이된 Fab 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 상기 다중특이적 항원-결합 분자는 하이브리도마 또는 파지-디스플레이 라이브러리로부터 선택되는 CD63에 특이적인 항원-결합 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에 따르면, 상기 제1 및 제2 항원-결합 도메인은 각각 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍이다.
이중특이적 항원-결합 분자는 바람직하게는 항체 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 항원-결합 분자는 종양-연관 표적 (T)xCD63 이중특이적 항체이다. 바람직한 실시양태에서, (T)xCD63 이중특이적 항체는 세포독성 약물에 접합된다. 한 실시양태에서, (T)xCD63 이중특이적 항체는 듀오스타틴-3에 접합된다. 한 실시양태에서, (T)xCD63 이중특이적 항체는 듀오스타틴-3에 접합되고, 제2 결합 도메인인 항-CD63 결합 도메인은 각각 서열식별번호: 2, 12 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3을 포함한다. 특히, 종양-연관 표적 (T)xCD63 이중특이적 항체-약물 접합체 (ADC)는 항체-약물-접합체의 특이적 표적화 및 증진된 내재화가 바람직한 치료 환경에서 유용하다. 단일특이적 ADC를 사용하여 종양-연관 항원만을 표적화하는 것에 비해 본 발명의 (T)xCD63 이중특이적 ADC는 표적 T를 발현하는 세포를 사멸시킴에 있어서 보다 효율적인 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀졌다. 이러한 ADC는 선행 기술 이중특이적 ADC보다 시험관내에서 및 동물 모델에서 종양 세포를 근절함에 있어서 보다 강력한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 (T)xCD63 이중특이적 ADC는 종양-연관 표적 및 CD63 항원의 강력한 내재화 특징 둘 다에 결합할 수 있어 ADC의 내재화를 증진시키기 때문에 유리하며, 그에 의해 표적화된 세포 내부로의 보다 효율적인 페이로드 전달에 의해 세포의 더 강한 사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 다양한 종양-항원을 표적화하는 항체의 효능을 증가시킬 필요를 충족시키기 위해, 좁은 범위의 놀랍도록 효율적인 CD63 친화도 변이체 (소정 범위의 CD63 친화도에 걸침)가 이중특이적 ADC의 효능을 증진시키는 것으로 밝혀졌다.
또 다른 실시양태에 따르면, 항원-결합 분자는 HER2xCD63 이중특이적 항체이다.
또 다른 실시양태에 따르면, 항원-결합 분자는 종양-연관 표적 (T)-발현 세포, 예컨대 HER2-발현 세포에 대한 결합에 대해, 유동 세포측정법에 의한 결정 시 5.0 μg/ml 미만, 예컨대 4.0 μg/ml 미만, 예컨대 3.0 μg/ml 미만, 예컨대 2.0 μg/ml 미만, 예컨대 1.0 μg/ml 미만, 예컨대 0.9 μg/ml 미만, 예컨대 0.8 μg/ml 미만, 예컨대 0.7 μg/ml 미만, 예컨대 0.6 μg/ml 미만, 예컨대 0.5 μg/ml 미만, 예컨대 0.4 μg/ml 미만, 예컨대 0.3 μg/ml 미만, 예컨대 0.2 μg/ml 미만, 예컨대 0.1 μg/ml 미만, 예컨대 0.05 μg/ml 미만, 예컨대 0.01 μg/ml 미만의 EC50 값을 갖는다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자에 의한 T 및 E의 결합은 제1 도메인 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화를 유도한다. 유사하게, 본 발명의 다중특이적 약물-접합된 항체에 의한 T 및 E의 결합은 바람직하게는 제1 도메인 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 세포독성을 유도한다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항원-결합 분자에 의한 T 및 E의 결합은 T에 결합하는 상응하는 2가 단일특이적 항체보다 더 큰 정도로 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화를 유도한다. 유사하게, 본 발명의 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 약물-접합된 항체에 의한 T 및 E의 결합은 T에 결합하는 상응하는 2가 단일특이적 ADC보다 더 큰 정도로 세포독성을 유도한다.
또 다른 실시양태에 따르면, KD 값은 30℃에서 생물층 간섭측정법에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, KD는 30℃ 및 7.2 내지 7.5, 예컨대 7.3 내지 7.4의 pH, 예컨대 pH 7.4에서 생물층 간섭측정법에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, KD는 1000 RPM 진탕기 속도로 30℃에서 생물층 간섭측정법에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, KD는 옥테트 시스템, 예컨대 옥테트 HTX (포르테바이오(ForteBio))를 사용하여 생물층 간섭측정법에 의해 결정된다.
바람직한 실시양태에서, 항원-결합 분자는
i) 제1 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제1 중쇄를 포함하며, 상기 제1 CH는 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 제1 결합 아암, 및
ii) 제2 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제2 중쇄를 포함하며, 상기 제2 CH는 제2 CH3 영역을 포함하는 것인 제2 결합 아암
을 포함하며,
여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1과 제2 결합 아암 사이의 이종이량체 상호작용이 각각의 상기 제1 및 제2 결합 아암의 동종이량체 상호작용보다 더 강하게 하는 것인
이중특이적 항체이다.
바람직하게는, 상기 제1 중쇄 CH3 영역에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 또는 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되었고, 상기 제2 중쇄 CH3 영역에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 또는 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되었으며, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않고, 아미노산 위치는 EU-인덱스에 따라 넘버링된다.
또 다른 실시양태에서, (i) 제1 CH3 영역은 F405L 치환을 갖고 제2 CH3 영역은 K409R 치환을 갖거나, 또는 (ii) 제1 CH3 영역은 K409R 치환을 갖고 제2 CH3 영역은 F405L 치환을 갖는다.
또 다른 실시양태에 따르면, 다중특이적 항원-결합 분자는 세포독성 모이어티, 방사성동위원소, 약물, 시토카인 또는 RNA 침묵 비히클에 접합된다. 바람직하게는, 다중특이적 항원-결합 분자는 세포독성 모이어티, 방사성동위원소 또는 약물에 접합된다. 바람직하게는, 다중특이적 항원-결합 분자는 세포독성 모이어티에 접합된다.
세포독성 모이어티는 듀오스타틴-3, 듀오스타틴-5, 피롤로벤조디아제핀 또는 그의 유사체 또는 유도체, IGN-기반 독소 또는 그의 유사체 또는 유도체, 알파-아마니틴 또는 그의 유사체 또는 유도체, 돌라스타틴 또는 그의 유사체 또는 유도체, 탁솔; 시토칼라신 B; 그라미시딘 D; 브로민화에티듐; 에메틴; 미토마이신; 에토포시드; 테노포시드; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 콜키신; 독소루비신; 다우노루비신; 디히드록시 안트라신 디온; 튜불린-억제제 예컨대 메이탄신 또는 그의 유사체 또는 유도체; 미톡산트론; 미트라마이신; 악티노마이신 D; 1-데히드로테스토스테론; 글루코코르티코이드; 프로카인; 테트라카인; 리도카인; 프로프라놀롤; 퓨로마이신; 칼리케아미신 또는 그의 유사체 또는 유도체; 항대사물 예컨대 메토트렉세이트, 6 메르캅토퓨린, 6 티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5 플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈, 또는 클라드리빈; 알킬화제 예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴, 카르보플라틴, 두오카르마이신 A, 두오카르마이신 SA, 라켈마이신 (CC-1065), 또는 그의 유사체 또는 유도체; 항생제 예컨대 닥티노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 안트라마이신 (AMC); 항유사분열제 예컨대 아우리스타틴 또는 그의 유사체 또는 유도체, 모노메틸 아우리스타틴 E 또는 F 또는 그의 유사체 또는 유도체; 디프테리아 독소 및 관련 분자 예컨대 디프테리아 A 쇄 및 그의 활성 단편 및 하이브리드 분자, 리신 독소 예컨대 리신 A 또는 탈글리코실화 리신 A 쇄 독소, 콜레라 독소, 시가(Shiga)-유사 독소 예컨대 SLT I, SLT II, SLT IIV, LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍 독소, 대두 바우만-버크(Bowman-Birk) 프로테아제 억제제, 슈도모나스 외독소, 알로린, 사포린, 모데신, 젤라닌, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 예컨대 PAPI, PAPII 및 PAP S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신 독소; 리보뉴클레아제 (RNase); DNase I, 스타필로코쿠스 장독소 A; 포크위드 항바이러스 단백질; 디프테린 독소, 슈도모나스 내독소 및 RNAi (즉, 항체에 접합되거나 나노입자로 전달되는 siRNA, shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 세포독성 모이어티는 메이탄신, 칼리케아미신, 두오카르마이신, 듀오스타틴, 듀오스타틴-3, 듀오스타틴-5, 라켈마이신 (CC-1065), 아우리스타틴, 모노메틸 아우리스타틴 E, 모노메틸 아우리스타틴 F, 독소루비신, 돌라스타틴, 피롤로벤조디아제핀, IGN-기반 독소, 알파-아마니틴, 또는 그 중 어느 것의 유사체, 유도체 또는 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 세포독성 모이어티, 약물 또는 방사성동위원소는 절단가능한 링커, 예컨대 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)-펜타노에이트 (SSP), 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (mc-vc-PAB) 또는 AV-1 K-락 발린-시트룰린에 의해 상기 항체 또는 그의 단편에 연결된다.
본원에 사용된 용어 "절단가능한 링커"는 표적화된 세포에서 또는 종양 미세환경에서 특이적 프로테아제에 의해 촉매되어 세포독성제를 방출시키는 링커의 하위세트를 지칭한다. 절단가능한 링커의 예는 디술피드, 히드라존 또는 펩티드를 포함한 화학 모티프에 기초한 링커이다. 절단가능한 링커의 또 다른 하위세트는 세포독성제와 1차 링커 사이, 즉, 링커-약물 조합물을 항체에 부착시키는 부위에 추가의 링커 모티프를 부가한다. 일부 실시양태에서, 추가의 링커 모티프는 세포내 환경에 (예를 들어 리소솜 또는 엔도솜 또는 소포 내에) 존재하는 절단가능한 작용제에 의해 절단가능하다. 링커는 예를 들어 리소솜 또는 엔도솜 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티딜 링커는 적어도 2개 아미노산 길이 또는 적어도 3개 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민을 포함할 수 있으며, 이들 모두는 디펩티드 약물 유도체를 가수분해하여 표적 세포 내부에서 활성 약물을 방출시키는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123] 참조). 구체적 실시양태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단가능한 펩티딜 링커는 Val-Cit (발린-시트룰린) 링커 또는 Phe-Lys (페닐알라닌-리신) 링커이다 (예를 들어, Val-Cit 링커를 갖는 독소루비신의 합성을 기재하는 US6214345 참조). 치료제의 세포내 단백질분해 방출을 사용하는 것의 이점은 작용제가 접합되는 경우 전형적으로 약화되고, 접합체의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 세포독성제, 약물 또는 방사성동위원소는 비-절단가능한 링커, 예컨대 숙신이미딜-4(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (MCC) 또는 말레이미도카프로일 (MC)에 의해 상기 항체 또는 그의 단편에 연결된다.
본원에 사용된 용어 "비-절단가능한 링커"는 절단가능한 링커와 대조적으로, 세포내 또는 세포외 프로테아제에 의해 특이적으로 및 예측가능하게 인식되는 모티프를 포함하지 않는 링커의 하위세트를 지칭한다. 따라서, 비-절단가능한 링커에 기초한 ADC는 완전한 항체-링커-약물 복합체가 리소솜 구획에서 분해될 때까지 항체로부터 방출되거나 절단되지 않는다. 비-절단가능한 링커의 예는 티오에테르이다. 또 다른 실시양태에서, 링커 단위는 절단가능하지 않고, 약물은 항체 분해에 의해 방출된다.
특히 바람직한 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자에 의한 T 및 E의 결합은 표적 T 단독에 대한 결합보다 더 큰 정도로 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화를 유도한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 기술 또는 포맷을 사용함으로써 생성된 다중특이적 항체 예컨대 비제한적으로: 듀오바디, 크로스맙, 트리오맙, kih IgG 공통 LC, DVD-Ig, 투 인 원-IgG, IgG-scFv, bi-나노바디, BiTE, 탠드Ab, DART, DART-Fc, scFv-HSA-scFv, 오르토Fab-IgG, 4가 Tv-IgG, 독-앤-락 (DNL) 포맷 예컨대 DNL-Fab3, 또는 단편 예컨대 탠덤 scFv, 탠덤 scFv-Fc, 노브-인투-홀 IgG, scFv-Fc 노브-인투-홀, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, 디아바디, sc디아바디, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, 또는 아지메트릭 스캐폴드에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다중특이적 항원-결합 분자의 이중특이적 항체 단편에 관한 것이며, 여기서 항체 단편은 탠덤 scFv, 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc 노브-인투-홀, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, 디아바디, sc디아바디, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 다중특이적 항원-결합 분자 또는 이중특이적 항체 단편에 관한 것이다. 이러한 방법으로 치료되는 대상체는 바람직하게는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 개체, 예컨대 암 환자이다. 한 실시양태에서, 암은 원발성, 전이성 및 불응성 유방암을 포함한 유방암이다.
일부 실시양태에서, 암은 자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 악성 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 연부조직 종양 예컨대 활막 육종, 유방암, 뇌 종양, 백혈병, 림프종, 비만세포종, 신암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 위암 또는 결장직장암이다.
다중특이적 항원-결합 분자에 대한 유효 투여량 및 투여 요법은 치료될 암에 따라 달라진다. 본 발명의 치료 유효량의 이중특이적 항체에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.1-100 mg/kg, 예컨대 약 0.1-50 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-20 mg/kg, 예컨대 약 0.1-10 mg/kg, 예를 들어 약 0.5, 약 예컨대 0.3, 약 1, 약 3, 약 5, 또는 약 8 mg/kg이다.
일부 실시양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 암이 발생할 위험을 감소시키고/거나, 암 진행에서 또는 보조 세팅에서 사건 발생의 개시를 지연시키고/거나, 암이 완화 상태인 경우 재발의 위험을 감소시키기 위해 예방적으로 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 암을 치료 또는 예방하는 방법은 치료 유효량의 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자 및 적어도 1종의 추가의 치료제를 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나제, 겜시타빈 또는 클라드리빈으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 알킬화제, 예컨대 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 로무스틴 (CCNU), 시클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 다카르바진 (DTIC), 프로카르바진, 미토마이신 C, 시스플라틴 및 다른 백금 유도체, 예컨대 카르보플라틴으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 항유사분열제, 예컨대 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 및 파클리탁셀 및 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈데신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 비노렐빈으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 토포이소머라제 억제제, 예컨대 토포테칸 또는 이리노테칸, 또는 세포증식억제성 약물, 예컨대 에토포시드 및 테니포시드로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 성장 인자 억제제, 예컨대 ErbB1 (EGFR)의 억제제 (예컨대 EGFR 항체, 예를 들어 잘루투무맙, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 니모투주맙 또는 다른 EGFR 억제제, 예컨대 게피티닙 또는 에를로티닙), ErbB2 (HER2/neu)의 또 다른 억제제 (예컨대 HER2 항체, 예를 들어 트라스투주맙, 트라스투주맙-DMl 또는 페르투주맙) 또는 EGFR 및 HER2 둘 다의 억제제, 예컨대 라파티닙)로부터 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 추가의 치료제는 티로신 키나제 억제제, 예컨대 이마티닙 또는 라파티닙으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 다중특이적 항원-결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양을 표적화하는 방법에 사용하기 위한 다중특이적 항원-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명에 따라 표적화될 수 있는 종양은 악성 및 비-악성 종양을 포함한다. 치료될 수 있는 악성 (원발성 및 전이성 포함) 종양은 부신; 방광; 골; 유방; 자궁경부; 내분비선 (갑상선, 뇌하수체 및 췌장 포함); 결장; 직장; 심장; 조혈 조직; 신장; 간; 폐; 근육; 신경계; 뇌; 눈; 구강; 인두; 후두; 난소; 음경; 전립선; 피부 (흑색종 포함); 고환; 흉선; 및 자궁에서 발생하는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 종양의 예는 APUD종양, 분리종, 아가미종양, 악성 카르시노이드 증후군, 카르시노이드 심장 질환, 암종 (예를 들어, 워커(Walker), 기저 세포, 기저편평, 브라운-피어스(Brown-Pearce), 관, 에를리히(Ehrlich) 종양, 계내, 크렙스 2, 메르켈 세포, 점액성, 비소세포 폐, 귀리 세포, 유두상, 경화성, 세기관지, 기관지원성, 편평 세포 및 이행 세포), 형질세포종, 흑색종, 연골모세포종, 연골종, 연골육종, 섬유종, 섬유육종, 거대 세포 종양, 조직구종, 지방종, 지방육종, 중피종, 점액종, 점액육종, 골종, 골육종, 유잉(Ewing) 육종, 활막종, 선섬유종, 선림프종, 암육종, 척삭종, 중간엽종, 중신종, 근육종, 사기질모세포종, 시멘트종, 치아종, 기형종, 흉선종, 영양막 종양, 선암종, 선종, 담관종, 진주종, 원주종, 낭선암종, 낭선종, 과립막 세포 종양, 음양모세포종, 간세포암, 한선종, 도세포 종양, 라이디히 세포 종양, 유두종, 세르톨리 세포 종양, 난포막 세포 종양, 평활근종, 평활근육종, 근모세포종, 근종, 근육종, 횡문근종, 횡문근육종, 상의세포종, 신경절신경종, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경초종, 신경모세포종, 신경상피종, 신경섬유종, 신경종, 부신경절종, 비크롬친화성 부신경절종, 혈관각화종, 호산구증가증을 동반한 혈관림프구 증식증, 경화성 혈관종, 혈관종증, 사구맥관종, 혈관내피종, 혈관종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 림프관종, 림프관근종, 림프관육종, 송과체종, 암육종, 연골육종, 엽상 낭육종, 섬유육종, 혈관육종, 평활근육종, 백혈육종, 지방육종, 림프관육종, 근육종, 점액육종, 난소 암종, 횡문근육종, 육종 (예를 들어, 유잉 실험적, 카포시(Kaposi), 및 비만-세포), 신생물 및 다른 이러한 세포에 대한 것을 포함한다. 투여는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함할 수 있다.
유사하게, 본 발명은 종양-연관 표적 분자, 예컨대 HER2를 발현하는 종양 세포의 사멸을 필요로 하는 개체에게, 유효량의 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자, 예컨대 이중특이적 항체, 예컨대 항체 약물-접합체 (ADC)를 투여하는 것을 포함하는, 종양-연관 표적 분자, 예컨대 HER2를 발현하는 종양 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 상기 종양 세포는 유방암, 전립선암, 비소세포 폐암, 방광암, 난소암, 위암, 결장직장암, 식도암 및 두경부의 편평 세포 암종, 자궁경부암, 췌장암, 고환암, 악성 흑색종 및 연부조직암 (예를 들어, 활막 육종)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 형태에 관련된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 다중특이적 항원-결합 분자를 활성 성분으로서 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 유리하게는, 이러한 제약 조성물은 적합한 부형제, 예컨대 항산화제, 항박테리아제, 킬레이트화제, 완충제, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제 및/또는 현탁화제와 함께 제제화된다. 제약 조성물은 주입에 의해, 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 1종 이상의 추가의 제약 활성 성분, 예컨대 세포독성 물질 또는 항암 약물을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자 또는 본 발명의 제약 조성물을 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 다중특이적 항원-결합 분자를 코딩하는 핵산, 예컨대 DNA 분자에 관한 것이다. 핵산은 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산을 함유하고 원핵 또는 진핵 숙주 세포주에서 상기 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터 또는 발현 벡터의 세트에 관한 것이다. 항체의 중쇄 및 경쇄는 사용되는 이중특이적 항체 기술에 따라 상이한 벡터에 의해 또는 동일한 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 항체의 재조합 생산에 사용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서의 발현 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 핵산 벡터 (발현 제어 요소의 적합한 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산 (RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체-코딩 핵산은 예를 들어 선형 발현 요소, 컴팩트 핵산 벡터, 플라스미드 벡터 예컨대 pBR322, pUC 19/18 또는 pUC 118/119, "밋지(midge)" 최소 크기 핵산 벡터, 또는 침전된 핵산 벡터 구축물, 예컨대 CaP04-침전된 구축물을 포함한 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터에 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포주에 관한 것이다. 숙주 세포는 발현 벡터, 즉, 듀오바디 기술이 본 발명의 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하는 데 사용되는 경우에 동종이량체 단일특이적 전구체 분자를 코딩하는 발현 벡터가 도입된 세포이거나, 또는 본 발명의 이중특이적 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 단일 숙주 세포이다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어 트랜스펙토마, 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, NS/0 세포 및 림프구성 세포를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자에 대해 생성된 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 항-이디오타입 (Id) 항체는 일반적으로 항체의 항원-결합 부위와 연관된 고유한 결정인자를 인식하는 항체이다. Id 항체는 그에 대한 항-Id가 제조되고 있는 상기 기재된 바와 같은 다중특이적 항원-결합 분자, 예컨대 이중특이적 항체로 동물을 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 전형적으로 이들 이디오타입 결정인자에 대한 항체 (항-Id 항체)를 생산함으로써 면역화 이중특이적 항체의 이디오타입 결정인자를 인식하고 그에 반응할 수 있다.
한 실시양태에서, 항-이디오타입 항체는 샘플 중, 상기 정의된 바와 같은 다중특이적 항원-결합 분자의 수준을 검출하는 데 사용된다.
실시예
실시예 1: 항체 생성, 부위-지정 돌연변이유발 및 듀오스타틴-3 접합
인간 HER2 항체 IgG1-153의 클로닝 및 생산은 다른 곳에 기재되어 있다; de Goeij B.E.C.G. MAbs, 2014. 6(2): p. 392-402. 마우스 모노클로날 CD63 항체 2192의 가변 도메인 중쇄 및 경쇄 영역 (하기 표 1, 서열식별번호: 1 및 5 참조)을 하이브리도마-유래 RNA로부터의 가변 영역의 5'-RACE 및 서열분석에 의해 하이브리도마 2.19로부터 수득하였다 (Metzelaar M.J. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol, 1991. 61(4): p. 269-77). 적절한 인간 중쇄 불변 도메인 돌연변이 (K409R 또는 F405L)를 갖는 적절한 인간 경쇄 불변 도메인 (코돈 최적화됨, 인비트로젠(Invitrogen))을 함유하는 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.3 (인비트로젠)에 가변 영역을 클로닝하였다. 인간-마우스 키메라 CD63 항체를 야생형 IgG1-CD63으로 지칭하였다. IgG1-CD63 친화도 변이체의 패널을 생성할 목적으로, 부위 지정 돌연변이유발 또는 직접 유전자 합성에 의해 가변 도메인 내에 IgG1-CD63 항체 돌연변이를 도입하였다. 아미노산 돌연변이를 항체 명칭에 표시하였다 (즉, 항-CD63-N74H는 중쇄 (서열식별번호: 1, 표 1)의 아미노산 위치 74에서의 아스파라긴에서 히스티딘으로의 돌연변이를 가짐, 항-CD63-LN54H는 서열식별번호: 5, 표 1에 넘버링된 바와 같은 경쇄의 위치 54에서의 아스파라긴에서 히스티딘으로의 돌연변이를 가짐). 문헌 [Vink T. Methods, 2014. 65(1): p. 5-10]에 의해 기재된 바와 같이 중쇄 및 경쇄 벡터의 공동-형질감염 및 HEK-293 프리스타일 세포 (인비트로젠)에서의 일시적 발현에 의해 항체를 생산하였다. 문헌 [Labrijn A.F. Nat Protoc, 2014. 9(10): p. 2450-63]에 의해 기재된 바와 같이 제어된 Fab-아암 교환에 의해 이중특이적 항체 (듀오바디)를 제조하였다. HIV gp120-특이적 인간 항체 IgG1-b12를 이소형 대조군으로서 포함시켰으며; 문헌 [Parren P.W.H.I. AIDS, 1995. 9(6): p. F1-6]을 참조한다.
문헌 [de Goeij B.E.C.G. Mol Cancer Ther. 2015. 14(5):1130-40]에 의해 기재된 바와 같이 IgG1-HER2-F405L 및 IgG1-b12-F405L의 항체 리신 기에 대한 발린-시트룰린-듀오스타틴-3 (Duo3)의 공유 접합에 의해 듀오스타틴-3 접합된 항체를 생성하였다. Duo3-접합된 항체 IgG1-HER2-F405L-Duo3과 미접합된 IgG1-CD63-K409R 또는 IgG1-b12-K409R의 Fab-아암 교환에 의해 이중특이적 ADC bsHER2xCD63-Duo3 및 bsHER2xb12-Duo3을 생성하였다. IgG1-b12-F405L-Duo3과 IgG1-CD63-K409R의 Fab-아암 교환에 의해 이중특이적 ADC bsCD63xb12-Duo3을 생성하였다. 모든 이중특이적 ADC는 1의 DAR을 가졌다. 1의 DAR을 갖는 대조군 ADC를 생성하기 위해, IgG1-HER2-F405L-Duo3 및 IgG1-b12-F405L-Duo3을 IgG1-HER2-K409R 및 IgG1-b12-K409R과 Fab-아암 교환하여, 각각 IgG1-HER2-Duo3 및 IgG1 b12-Duo3을 생성하였다. ADC의 DAR은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 결정하였다.
표 1 - 항-CD63 항체 2192의 중쇄 가변 영역 (VH), 경쇄 가변 영역 (VL) 및 CDR 서열
Figure pct00001
실시예 2: CD63 결합 ELISA
ADC의 효능을 개선시키기 위해, 하나의 Fab-아암으로 표적 단백질 (T)에 특이적으로 결합하고, 제2 Fab-아암이 세포독성 페이로드의 내재화 및 리소솜 전달을 용이하게 하는 이펙터 단백질 (E)에 결합하는 이중특이적 ADC를 생성하였다. 생성된 bsADC는 T 및 E 둘 다를 발현하는 세포에서 세포독성을 유도해야 한다. 일부 세포독성은 또한 T를 발현하나 E를 발현하지는 않는 세포에서 유도될 수 있는 반면, bsADC는 E를 발현하나 T를 발현하지는 않는 세포에서 세포독성을 유도해서는 안된다. CD63이 이펙터 단백질 (E)로서 사용된다. bsAb의 종양 특이성을 보장하기 위해, bsAb의 항-CD63 아암 (E)은 바람직하게는 종양-특이적 아암 (T)의 부재 하에 결합 및 내재화해서는 안되거나, 또는 매우 제한된 정도로만 이를 행해야 한다. 가변 영역에서 돌연변이를 갖는 IgG1-CD63 변이체의 패널을 상기 문헌에 기재된 바와 같이 생성하였다. ELISA를 사용하여 가용성 CD63에 대한 결합에 대해 IgG1-CD63 항체 변이체를 스크리닝하였다. 간략하게, ELISA 플레이트 (그라이너(Greiner))를 밤새 4℃에서 0.8 μg/mL 염소 항-인간 IgG (잭슨(Jackson))로 코팅하였다. 플레이트를 2% 닭 혈청으로 차단하고, 항-CD63 mAb 2192의 1 μg/mL 히스티딘-돌연변이된 변이체와 함께 인큐베이션하였다. 연속 희석된 (1-0.0005 μg/mL) 재조합 인간 CD63 (크리에이티브 바이오마트(Creative Biomart))을 첨가하고 이어서 1 μg/mL 마우스 항-폴리-히스티딘-비오틴 (알앤디(R&D))을 첨가하였다. 반응을 ABTS를 사용하여 가시화하고 옥살산으로 정지시켰다. 405 nm에서의 형광을 측정하고 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6 소프트웨어를 사용하여 도시하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, CD63 결합 곡선에서 상이한 히스티딘 돌연변이된 항-CD63 항체에 대해 광범위한 다양성이 발견되었다. 친화도 변이체 중 일부의 경우, CD63에 대한 결합은 야생형 (wt) IgG1-CD63 (wt IgG1-CD63으로 지칭됨)과 대등한 한편, 다른 것들은 결합의 부분적 또는 완전한 손실을 보여주었다.
실시예 3: CD63 친화도 측정치
C-말단에서의 폴리히스티딘 태그 및 N-말단에서의 신호 펩티드와 융합된 재조합 인간 CD63 제2 세포외 도메인 (Ala 103-Val 203) (크리에이티브 바이오마트)에 대한 항-CD63 항체의 결합 동역학을 옥테트 HTX (포르테바이오) 상에서 무표지 생물층 간섭측정법을 사용하여 평가하였다. wt IgG1-CD63 또는 그의 친화도 변이체를 1 μg/mL에서 항-인간 IgG Fc 포획 바이오센서 (포르테바이오) 상에서 1000초 동안 고정화시켰다. 인간 His-태그부착된 CD63 (100 nM, 50 nM, 25 nM 및 12.5 nM, 농도는 13 kDa의 예측된 분자량을 사용하여 계산함)의 회합 및 해리 동역학을 샘플 딜루언트(Sample Diluent) (포르테바이오)에서, 30℃에서 1000초의 회합 시간, 2000초의 해리 시간 및 1000 rpm의 진탕기 속도를 사용하여 결정하였다. 회합 및 해리 단계 동안에만 샘플 딜루언트에 노출된 참조 센서를 사용하여 데이터 추적치를 보정하고, Y-축을 기준선에 대해 정렬하고, 단계간 보정뿐만 아니라 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 필터링을 적용하였다. 1:1 모델 및 글로벌 풀 피트(global full fit)를 사용하여 포르테바이오 데이터 애널리시스 소프트웨어(ForteBio Data Analysis Software) v8.1에 의해 회합률 상수 Kon (1/Ms), 해리율 상수 Kdis (1/s) 및 평형 해리 상수 KD (M)를 결정하였다. 200초의 해리 시간이 사용된 친화도 변이체 T71, P72, N74, Y121, LV49 및 LY51을 제외하고, 1000초의 해리 시간을 KD의 계산에 사용하였다.
상이한 항-CD63 항체 변이체에 대해 3.6 x 10-10 - 2.7 x 10-8 M 범위의 넓은 범위의 Ab-친화도가 측정되었다 (도 2 및 표 2 참조). 따라서, 단일 아미노산 히스티딘 치환을 도입함으로써, wt IgG1-CD63의 친화도를 감소시키는 것이 가능하였다.
표 2
Figure pct00002
실시예 4: HCC1954, SK-OV-3 및 Colo205 세포를 사용한 bsCD63xHER2-Duo3 ADC의 친화도 변이체 및 1가 bsCD63xb12-Duo3 ADC의 친화도 변이체의 세포독성
표적 단백질 (T) 및 이펙터 단백질 (E) 둘 다를 발현하는 종양 세포에 대한 bsADC의 결합은 우선적으로 세포독성을 발생시켜야 한다. 그러나, 종양-연관 표적 단백질 (T)의 부재 하에, bsADC는 바람직하게는 세포독성을 유도해서는 안된다. 상이한 항-CD63 친화도 변이체를 사용하여, CD63 (E) 및 HER2 (T)를 표적화하는 다수의 bsADC를 생성하였다. 동일한 항-CD63 친화도 변이체를 또한 사용하여 CD63 및 HIV gp120을 표적화하는 bsADC를 생성하였다. HIV gp120은 시험된 종양 세포 상에 발현되지 않는 바이러스 단백질이다. 따라서 CD63 및 gp120을 표적화하는 bsADC (즉 CD63 항체 및 gp120-특이적 항체 IgG1-b12로부터 유래된 결합 도메인을 함유하는 bsADC)는 CD63에만 결합할 수 있으며, 이는 T의 발현이 결여된 정상 조직에 대한 ADC의 활성을 반영한다.
HCC1954, SK-OV-3 및 Colo205 세포를 사용하여 bsADC의 세포독성을 시험하였다. 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하였고 (5,000개 세포/웰), 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 연속 희석된 ADC (10-0.0005 μg/mL)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 제조업체의 가이드라인에 따라 셀타이터-글로(CellTiter-GLO) (프로메가(Promega))를 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. 생존 세포의 백분율을 비처리된 세포 (0% 세포 사멸) 및 스타우로스포린-처리된 세포 (100% 세포 사멸)에 비한 백분율로서 도시하였다.
백분율 생존 세포 = (RFU ADC 처리된 세포 - RFU 스타우로스포린-처리된 세포) x 100 / (RFU 비처리된 세포 - RFU 스타우로스포린-처리된 세포)
RFU = 상대 형광 단위
도 3-5는 비처리된 세포에 비한 백분율로서의 연속 희석된 ADC를 사용한 4일 처리 후의 세포 생존율을 보여준다. 제시된 데이터는 적어도 2개의 상이한 실험의 평균 ± 표준 편차이다. 그래프패드 프리즘 6 소프트웨어를 사용하여 세포독성에 대한 IC50 값을 결정하고 표 3에 도시하였다.
표 3 - IC50 값
Figure pct00003
도 3A, 4A 및 5A에서의 bsADC는 CD63에 대한 가장 높은 친화도를 가졌고 (3.6 x 10-10 - 7.8 x 10-10 M 범위; 표 2), bsCD63xHER2-ADC로서 시험된 경우에 낮은 IC50 값으로 세포독성을 유도하였으나, 또한 bsCD63xb12-ADC로서 시험된 경우에 일부 세포독성을 보여주었다. 도 3B, 4B 및 5B에서의 bsADC는 중간 정도의 친화도를 가졌고 (2.0 x 10-9 - 7.3 x 10-9 M 범위), bsCD63xHER2-ADC로서 시험된 경우에 낮은 IC50 값으로 세포독성을 유도하였고, bsCD63xb12-ADC로서 시험된 경우에 제한된 세포독성을 보여주었다. 도 3C, 4C 및 5C에서의 항체는 낮은 친화도를 가졌고 (1.7 x 10-8 - 2.7 x 10-8 M 범위), bsCD63xHER2-ADC로서 시험된 경우에 불량한 IC50 값으로 세포독성을 유도하였고, bsCD63xb12-ADC로서 시험된 경우에 조합 시 세포독성을 거의 보여주지 않았다.
결론적으로, 도 3B, 4B 및 5B에 도시된, 2.0 x 10-9 - 7.3 x 10-9 M 범위의 친화도를 갖는 CD63 항체는 ADC의 증진된 전달을 위한 가장 유리한 특징을 보여주었다. 이들 항체는 bsCD63xb12-ADC로서 제한된 세포독성을 유도한 한편, bsCD63xHER2-ADC로서 낮은 IC50 값으로 세포독성을 유도할 수 있었다.
실시예 5: 1가 bsCD63xb12 ADC의 친화도 변이체의 리소솜 공동국재화
공초점 현미경검사 실험을 수행하여 CD63에 대한 감소된 친화도를 갖는 CD63xb12 이중특이적 항체가 더 적은 내재화 및 리소솜 수송을 보여주는 것을 확인하였다. SK-OV-3 세포를 유리 커버슬립 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 상에서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 항체 (2 및 10 μg/mL)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정하고, 투과화하고, 인간 IgG를 염색하기 위한 염소 항-인간 IgG1-FITC (잭슨) 및 리소솜을 염색하기 위한 마우스 항-인간 CD107a-APC (비디(BD))와 함께 45분 인큐베이션하였다. 커버슬립을 현미경 슬라이드 상에 올리고 (칼바이오켐(Calbiochem)), LAS-AF 소프트웨어가 구비된 레이카 SPE-II 공초점 현미경 (레이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))으로 영상화하였다. 12-비트 그레이스케일 TIFF 이미지를 메타모르프(MetaMorph)® 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 공동국재화에 대해 분석하였다. 공동국재화를 리소솜 마커 LAMP1과 중첩된 항체의 총 픽셀 강도를 나타내는 임의 단위 [AU]로서 도시하였다. 이 값을 LAMP1의 총 픽셀 강도로 나누어, 상이한 이미지들 사이의 세포 밀도의 차이를 보정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 야생형 IgG1-CD63은 가장 높은 공동국재화 값을 보여주며, 그 뒤로 그의 1가 대응물 (bsCD63WTxb12) 및 bsCD63-Y79Hxb12가 이어진다. bsP72Hxb12, bsY121Hxb12, bsLN54Hxb12 및 bsN74Hxb12에 대한 리소솜 공동국재화 값은 bsY79Hxb12 및 야생형 bsCD63xb12에 비해 ~10배 더 낮았다. bsV52Hxb12, bsG76Hxb12, bsLV49Hxb12 및 bsLY51Hxb12에 대한 값은 그보다도 더 낮았으며, 이는 1가 CD63 항체의 리소솜 수송이 거의 존재하지 않았음을 나타낸다. 별표 (*)로 표시된 샘플은 영상화되지 않았다. 제시된 데이터는 3개 이미지의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 6: 유동 세포측정법에 의해 결정된, SK-OV-3 세포에 대한 bsHER2xCD63N74H의 결합
bsCD63xb12-ADC로서 제한된 세포독성을 유도하는 한편 bsCD63xHER2-ADC로서 낮은 IC50 값으로 세포독성을 유도하는 그의 능력에 기초하여, 클론 항-CD63-N74H를 추가 분석을 위해 선택하였다. 유동 세포측정법 (FACS 칸토 II, 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 사용하여 HER2 양성 SK-OV-3 세포에 대한 bsHER2xCD63N74H의 결합을 시험하였다. 연속 희석된 항체를 4℃에서 SK-OV-3 세포와 함께 30분 인큐베이션하였다. 피코에리트린-접합된 염소-항-인간 IgG 항체 (잭슨)를 사용하여 항체 결합을 검출하고, 샘플을 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. IgG1-b12를 이소형 대조군 항체로서 사용하였다. 도 7에 제시된 생성된 데이터는 2개 실험의 평균이다.
도 7에 나타난 바와 같이, bsHER2xCD63N74H 및 1가 HER2 항체 bsHER2xb12의 결합 곡선은 동일하였다. 이는 bsHER2xCD63N74H의 종양 세포 결합이 HER2에 대한 1가 결합을 통해 발생한다는 것을 나타낸다. IgG1-CD63N74H 및 bsCD63N74Hxb12는 SK-OV-3 세포에 대한 결합을 보여주지 않았으며, 이는 형질 막 상에서의 CD63의 낮은 발현과 연관이 있다.
실시예 7: 전혈 세포 상의 bsHER2xCD63N74H 및 bsCD63N74Hxb12를 사용한 mAb-FITC 축적 검정
bsHER2xCD63N74H가 모델 종양 항원 HER2를 발현하지 않는 건강한 조직에 결합하지 않고 그 안에 축적되지 않는다는 것을 입증하기 위해, bsHER2xCD63N74H 및 1가 및 2가 대조군 항체를 FITC와 접합시켰다. 그들의 축적을 HER2를 발현하지 않는 건강한 공여자의 과립구 및 혈전구에서 조사하였다. 건강한 공여자로부터의 전혈 샘플을 헤파린 튜브 내에 수집하였다. 전혈을 10% 열-불활성화된 코스믹 송아지 혈청으로 보충된 RPMI-1640에서 1:2 희석하였다. 항-CD63 항체를 제조업체의 지침에 따라 FITC (써모 사이언티픽)와 접합시키고, 10 μg/mL의 최종 농도로 전혈 세포에 첨가하였다.
4℃에서의 1시간 인큐베이션 또는 37℃에서의 3 및 16시간 인큐베이션 후, 적혈구를 적혈구 용해 완충제 (pH 7.4에서 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 및 0.1 mM EDTA)와 함께 4℃에서 15분 인큐베이션함으로써 용해시켰다. FITC의 형광 강도를 유동 세포측정기 (비디) 상에서 측정하였다. 마우스 항-인간 CD66b-PerCP-Cy5.5 (비디)를 사용하여 과립구를 게이팅하고, 마우스 항-인간 CD62-APC (비디)를 사용하여 혈전구를 게이팅하였다.
도 8은 1시간 후에 과립구 또는 혈전구에 대한 CD63 항체의 결합을 거의 보여주지 않거나, 또는 매우 낮은 수준으로 보여주었다. 그러나, 과립구 상의 IgG1-CD63의 FITC 형광은 16시간의 인큐베이션 후에 명백하게 증가하였으며, 이는 과립구 내로의 IgG1-CD63의 축적을 나타낸다. 대조적으로, bsCD63N74Hxb12 및 bsHER2xCD63N74H의 FITC 형광은 16시간 후에 거의 증가하지 않았다 (도 8 참조). 마찬가지로 IgG1-HER2 및 bsHER2xb12는 과립구 또는 혈전구에 대한 어떠한 결합 또는 그 안에서의 세포내 축적을 보여주지 않았으며, 이는 이들 세포 유형 상의 HER2 발현의 결여와 연관이 있었다. 따라서, 저친화도 CD63-특이적 Fab-아암을 사용함으로써, 1가 CD63 Ab의 건강한 세포 내로의 결합 및 세포내 축적을 최소화하는 것이 가능하였다.
실시예 8: 공초점 현미경검사, 시간 경과에 따른 bsHER2xCD63N74H의 리소솜 공동국재화
bsHER2xCD63N74H의 내재화 및 리소솜 공동국재화를 시간 경과에 따라 추적하였다. SK-OV-3 세포 (20.000개)를 유리 커버슬립 (써모 피셔 사이언티픽) 상에서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 항체 처리 1시간 전에, 세포를 50 μg/mL 류펩틴 (시그마(Sigma))과 함께 사전-인큐베이션하여 리소솜 활성을 차단하였다. 항체 (5 또는 1 μg/mL)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 1, 3 또는 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정하고, 투과화하고, 인간 IgG를 염색하기 위한 염소 항-인간 IgG1-FITC (잭슨) 및 리소솜을 염색하기 위한 마우스 항-인간 CD107a-APC (비디)와 함께 45분 인큐베이션하였다. 훽스트(Hoechst) (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 1:10.000)를 첨가하여 핵을 염색하였다 (RT에서 5분). 커버슬립을 현미경 슬라이드 상에 올리고 (칼바이오켐), LAS-AF 소프트웨어가 구비된 레이카 SPE-II 공초점 현미경 (레이카 마이크로시스템즈)으로 영상화하였다. 12-비트 그레이스케일 TIFF 이미지를 메타모르프® 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 공동국재화에 대해 분석하였다. 공동국재화를 리소솜 마커 LAMP1과 중첩된 항체의 총 픽셀 강도를 나타내는 임의 단위 [AU]로서 도시하였다. 이 값을 LAMP1의 총 픽셀 강도로 나누어, 상이한 이미지들 사이의 세포 밀도의 차이를 보정하였다. 총 IgG 염색을 LAMP1의 총 픽셀 강도로 나눈 FITC의 총 픽셀 강도로서 도시하였다.
도 9에서의 회색 막대는 총 IgG 염색을 나타낸다 (임의 단위로 도시됨). 도 9에서의 흑색 막대는 리소솜 공동국재화를 나타낸다 (임의 단위로 도시됨). IgG1-HER2 및 bsHER2xb12 둘 다는 1, 3 및 16시간 후에 SK-OV-3 세포의 유사한 염색을 보여주었다 (회색 막대). IgG1-HER2 및 bsHER2xb12의 작은 부분은 16시간 항체 노출 후에 리소솜 공동국재화를 보여주었다 (흑색 막대). CD63 표적화 항체인 IgG1-CD63N74H는 1 및 3시간 후에 염색 (회색 막대) 또는 리소솜 공동국재화 (흑색 막대)를 보여주지 않았으나, 16시간 항체 노출은 모두 리소솜 마커 LAMP1로 공동국재화된 세포의 Ab 염색을 발생시켰다. 1가 CD63 항체인 bsCD63N74Hxb12는 측정된 시점 중 어느 것에서 mAb 염색 또는 리소솜 공동국재화를 보여주지 않았다. 다른 한편으로, bsHER2xCD63N74H의 리소솜 공동국재화는 시간 경과에 따라 점진적으로 증가하였다 (흑색 막대). 제시된 데이터는 3개 이미지의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 9: bsHER2xCD63N74H는 HER2의 하향조정을 유도한다
HER2 하향조정 ELISA를 사용하여, bsHER2xCD63N74H에서 관찰된 강한 리소솜 표적화가 또한 표적화된 항원의 하향조정을 증가시키는지 조사하였다. AU565, SK-OV-3 및 Colo 205 세포를 T25 플라스크 (그라이너)에 시딩하고 (1백만개 세포/플라스크), 37℃에서 밤새 인큐베이션하여 전면생장 단층을 수득하였다. 항체를 첨가하고 (10 μg/mL), 세포를 37℃에서 또 다른 3일 동안 배양하고, 세척하고, 용해시켰다. 제조업체의 지침에 따라 비신코닌산 (BCA) 단백질 검정 시약 (피어스(Pierce))을 사용하여 총 단백질 수준을 정량화하였다. 다음에, ELISA 플레이트 (그라이너)를 1 μg/mL 토끼 항-인간 HER2 (셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signalling Technology))로 코팅하고, 2% 닭 혈청 (하이클론(Hyclone))으로 차단하고, 50 μL 세포 용해물과 함께 인큐베이션하였다. HER2를 검출하기 위해 염소 항-인간 HER2-비오틴 (알앤디, 50 ng/mL)을 첨가한 후, 스트렙타비딘-폴리-HRP (산퀸(Sanquin), 100 ng/mL)를 첨가하였다. 반응을 ABTS를 사용하여 가시화하고 옥살산으로 정지시켰다. 405 nm에서의 형광을 측정하고 HER2의 양을 비처리된 세포에 비한 백분율로서 나타내었다.
상이한 발현 수준의 HER2를 갖는 종양 세포주에서의 HER2 단백질의 총량; AU565 (500,000개 HER2/세포, 도 10A), SK-OV-3 (200,000개 HER2/세포, 도 10B) 및 Colo205 (50,000개 HER2/세포, 도 10C)을 HER2 항체와의 3일의 인큐베이션 후에 정량화하고 비처리된 세포와 비교하였다 (도 10 참조). IgG1-HER2는 높은 수준의 HER2를 발현하는 AU565 세포에서 총 HER2의 ~40% 하향조정을 유도하였다. 1가 bsHER2xb12 항체가 HER2-양성 SK-OV-3 세포에 대한 용량-의존성 결합을 보여주었다는 사실에도 불구하고 (FACS 결합 예), bsHER2xb12에서 HER2의 어떠한 하향조정도 관찰되지 않았다. 이는 2가 항체 결합이 HER2의 분해를 증가시키는 데 중요하였음을 강조한다. bsHER2xCD63N74H는 AU565 세포 상의 HER2의 하향조정을 회복시킬 수 있었다. 더욱이, 더 낮은 HER2 발현을 갖는 세포주, 예컨대 SK-OV-3 및 Colo205 상에서, bsHER2xCD63N74H는 또한 HER2의 하향조정을 유도한 반면, IgG1-HER2는 HER2 단백질 수준에 영향을 미치지 않았다.
실시예 10: 듀오스타틴-3 접합된 ADC에 의해 유도되는 세포독성
세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고 (5,000개 세포/웰), 37℃에서 6시간 동안 부착되도록 두었다. 연속 희석된 ADC (10-0.0005 μg/mL)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 또 다른 3일 동안 인큐베이션하였다. 제조업체의 가이드라인에 따라 셀타이터-글로 (프로메가)를 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. 생존 세포의 백분율을 비처리된 세포에 비한 백분율로서 도시하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, IgG1-HER2-Duo3은 높은 HER2 발현 (500.000개 HER2/세포)을 보여준 HCC1954 중 ~80%를 사멸시킬 수 있었다. 200.000개 HER2/세포를 발현하는 SK-OV-3 세포 상에서, IgG1-HER2-Duo3은 세포 중 단지 ~30%만을 사멸시킨 반면, 낮은 HER2 발현 Colo205 세포 (50.000개 HER2/세포)의 생존율은 영향을 받지 않았다.
1가 bsHER2xb12는 IgG1-HER2-Duo3에 비해 유사한 백분율의 세포를, 그러나 ~10배 감소된 IC50 값으로 사멸시켰다. HCC1954 세포 상의 bsHER2xCD63N74H-Duo3 ()에 의해 유도된 세포독성은 IgG1-HER2-Duo3과 동등하였다. 그러나 더 낮은 카피수의 HER2를 갖는 세포 (SK-OV-3 및 더 적은 정도로 Colo205) 상에서, bsHER2xCD63N74H-Duo3은 HER2만을 표적화하는 ADC에 비해 훨씬 더 높은 세포독성을 유도하였다 (도 11 참조). 제시된 데이터는 적어도 2개의 개별 실험의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 11: SK-OV-3 종양 이종이식편 상의 bsHER2xCD63N74H-ADC의 항종양 효과
bsHER2xCD63N74H-ADC의 항종양 효과를 SK-OV-3 종양 이종이식편 상에서 조사하였다. 6-11주령 암컷 SCID 마우스 (C.B-17/IcrPrkdc-scid/CRL)를 찰스 리버(Charles River)로부터 구입하였다. 마우스의 우측 측복부에서의 5 x 106개 SK-OV-3 세포의 접종에 의해 피하 종양을 유도하였다. 종양 부피는 디지털 캘리퍼 측정치로부터 0.52 x 길이 x 폭2 (mm3)으로 계산하였다. 종양이 200 - 400 mm3에 도달한 경우에, 마우스를 동등한 종양 크기 분포를 갖는 7마리 마우스의 군으로 분류하고, mAb를 복강내로 주사하였다 (8 mg/kg). 연구 동안, 혈액 샘플을 헤파린-함유 튜브 내로 수집하여 혈장 내 인간 IgG의 존재를 확인하였다. 비탁계 (지멘스 헬스케어(Siemens Healthcare))를 사용하여 IgG 수준을 정량화하였다. 혈장 내 인간 IgG를 보여주지 않은 마우스를 분석에서 배제시켰다.
도 12에 제시된 바와 같이, bsHER2xCD63N74H-ADC는 종양 성장의 유의한 억제를 유도한 반면, 1가 bsHER2xb12-ADC 또는 bsCD63N74Hxb12-duo3은 종양 성장에 영향을 미치지 않았다. 이는 저친화도 CD63-특이적 Fab-아암이 생체내 종양에서 불량하게 내재화하는 ADC의 리소솜 전달 및 독소 방출을 유도하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. 칼란 마이어(Kalan Meyer) 플롯의 맨텔-콕스(Mantel-Cox) 분석은 bsHER2xCD63N74H-ADC에 의한 종양 성장의 유의한 억제를 나타내었다 (P-값 <0.0001).
실시예 12: 유동 세포측정법으로 검출된, SK-OV-3 세포에 대한 bs베타1xCD63N74H의 결합
E에 대해 지시된 저친화도 결합-도메인이 또한 다른 종양 항원의 내재화 및 리소솜 표적화를 증진시키는 데 사용될 수 있는지 조사하였다. 인테그린은 그의 내재화를 위해 클러스터링에 의존하는 것으로 기재되어 있다. 따라서 1가 인테그린 항체는 최소 내재화 및 리소솜 표적화를 보여줄 것으로 예상되고, 따라서 내재화가 T 및 E를 표적화하는 이중특이적 포맷에서 증진될 수 있는지 시험하기 위한 적합한 모델 시스템을 제시할 수 있다. 이를 위해, 인테그린 베타-1을 표적화하는 항체 huK20을 선택하였다. 항체 huK20의 서열을 WO1996/008564로부터 수득하고, 그의 실시예 1에 기재된 바와 같이 클로닝 및 생산하였다.
유동 세포측정법 (FACS 칸토 II, 비디 바이오사이언시스)을 사용하여 SK-OV-3에 대한 IgG1-베타1 항체, 1가 대조군 bs베타1xb12 및 이중특이적 항체 bs베타1xCD63N74H의 결합을 조사하였다. 연속 희석된 항체를 SK-OV-3 세포와 함께 4℃에서 30분 인큐베이션하였다. 그 후, 피코에리트린-접합된 염소-항-인간 IgG 항체 (잭슨)를 사용하여 항체 결합을 검출하고, 샘플을 유동 세포측정기 상에서 분석하였다. IgG1-b12를 이소형 대조군 항체로서 사용하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, bs베타1xCD63N74H 및 1가 인테그린 베타-1 항체 bs베타1xb12의 결합 곡선은 매우 많이 유사하였다. 이는 bs베타1xCD63N74H의 종양 세포 결합이 인테그린 베타-1에 대한 1가 결합을 통해 발생한다는 것을 나타낸다. IgG1-CD63N74H 및 bsCD63N74Hxb12는 SK-OV-3 세포에 대한 결합을 보여주지 않았으며, 이는 형질 막 상의 CD63의 낮은 발현과 연관이 있다.
실시예 13: 공초점 현미경검사로 측정된, bs베타1xCD63N74H의 리소솜 공동국재화
인테그린 베타-1 및 CD63의 이중 표적화가 bs베타1xCD63N74H의 리소솜 공동국재화를 증가시키는지 조사하기 위해, 형질 막 상의 상이한 카피수의 인테그린 베타-1을 갖는 종양 세포주를 사용하여 공초점 현미경검사 실험을 수행하였다. 20.000개의 SK-OV-3, NCI-H1975 및 MDA-MB-468 세포를 유리 커버슬립 (써모 피셔 사이언티픽) 상에서 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 항체 처리 1시간 전에, 세포를 50 μg/mL 류펩틴 (시그마)과 함께 사전-인큐베이션하여 리소솜 활성을 차단하였다. 항체 (2, 0.4 및 0.08 μg/mL)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정하고, 투과화하고, 인간 IgG를 염색하기 위한 염소 항-인간 IgG1-FITC (잭슨) 및 리소솜을 염색하기 위한 마우스 항-인간 CD107a-APC (비디)와 함께 45분 인큐베이션하였다. 훽스트 (몰레큘라 프로브스, 1:10.000)를 첨가하여 핵을 염색하였다 (RT에서 5분). 커버슬립을 현미경 슬라이드 상에 올리고 (칼바이오켐), LAS-AF 소프트웨어가 구비된 레이카 SPE-II 공초점 현미경 (레이카 마이크로시스템즈)으로 영상화하였다. 12-비트 그레이스케일 TIFF 이미지를 메타모르프® 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 공동국재화에 대해 분석하였다. 공동국재화를 리소솜 마커 LAMP1과 중첩된 항체의 총 픽셀 강도를 나타내는 임의 단위 [AU]로서 도시하였다. 이 값을 LAMP1의 총 픽셀 강도로 나누어, 상이한 이미지들 사이의 세포 밀도의 차이를 보정하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, bs베타1xCD63N74H는 모든 시험된 세포주 및 mAb 농도 상에서 가장 강한 양의 리소솜 공동국재화를 나타내었다 (SK-OV-3에 대해서만 제시됨). IgG1-베타1 및 bsAb-베타1xb12는 mAb 농도에 의해 영향을 받지 않은 보통의 리소솜 공동국재화를 보여주었다. IgG1-CD63N74H만이 NCI-H1975 세포 상에서 2 μg/mL 및 0.4 μg/mL에서 실질적인 리소솜 공동국재화를 보여주었다. 한편 1가 대조군 bsCD63N74Hxb12만이 NCI-H1975 세포 상에서 2 μg/mL에서 리소솜 공동국재화를 보여주었으며, 이는 CD63N74H의 감소된 친화도와 상관관계가 있었다. bs베타1xCD63N74H의 증가된 리소솜 공동국재화는 높은 인테그린 베타-1 카피수를 발현하는 세포 상에서 가장 명백하였다 (SK-OV-3 > NCI-H1975 > MDA-MB-468). 일부 클론의 경우 리소솜 공동국재화가 측정되지 않았기 때문에 AU를 도시하지 않았다. 제시된 데이터는 3개 이미지의 평균 ± 표준 편차이다.
실시예 14: 공초점 현미경검사, 시간 경과에 따른 bs베타1xCD63N74H의 내재화 및 리소솜 공동국재화
bs베타1xCD63N74H의 내재화 및 리소솜 공동국재화 동역학을 더 잘 이해하기 위해, bs베타1xCD63N74H의 내재화 및 리소솜 공동국재화를 시간 경과에 따라 추적하였다. SK-OV-3 세포 (20.000개)를 유리 커버슬립 (써모 피셔 사이언티픽) 상에서 37℃에서 16시간 동안 성장시켰다. 항체 처리 1시간 전에, 세포를 50 μg/mL 류펩틴 (시그마)과 함께 사전-인큐베이션하여 리소솜 활성을 차단하였다. 항체 (2 μg/mL)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 1, 3 또는 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 고정하고, 투과화하고, 인간 IgG를 염색하기 위한 염소 항-인간 IgG1-FITC (잭슨) 및 리소솜을 염색하기 위한 마우스 항-인간 CD107a-APC (비디)와 함께 45분 인큐베이션하였다. 훽스트 (몰레큘라 프로브스, 1:10.000)를 첨가하여 핵을 염색하였다 (RT에서 5분). 커버슬립을 현미경 슬라이드 상에 올리고 (칼바이오켐), LAS-AF 소프트웨어가 구비된 레이카 SPE-II 공초점 현미경 (레이카 마이크로시스템즈)으로 영상화하였다. 12-비트 그레이스케일 TIFF 이미지를 메타모르프® 소프트웨어 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 공동국재화에 대해 분석하였다. 공동국재화를 LAMP1의 총 픽셀 강도로 나눈, 리소솜 마커 LAMP1과 중첩된 항체의 총 픽셀 강도를 나타내는 임의 단위 [AU]로서 도시하였다. 총 IgG 염색을 LAMP1의 총 픽셀 강도로 나눈 FITC의 총 픽셀 강도로서 도시하였다.
도 15에서의 회색 막대는 총 IgG 염색을 나타낸다 (임의 단위로서 도시됨). 도 15에서의 흑색 막대는 리소솜 공동국재화를 나타낸다 (임의 단위로서 도시됨). IgG1-베타1 및 bs베타1xb12 둘 다는 1, 3 및 16시간 후에 SK-OV-3 세포의 유사한 염색을 보여주었으나 (회색 막대), 리소솜 공동국재화는 거의 측정되지 않았다 (흑색 막대). 따라서 IgG1-베타1 및 bs베타1xb12가 SK-OV-3 세포에 결합할 수 있음에도 불구하고, 이들은 리소솜으로 수송되지 않았다. CD63 표적화 항체인 IgG1-CD63N74H 및 bsCD63N74Hxb12는 1시간 후에 염색 (회색 막대) 또는 리소솜 공동국재화 (흑색 막대)를 보여주지 않았다. 그러나 지속된 인큐베이션은 모두 리소솜 마커 LAMP1로 공동국재화된 세포의 Ab 염색을 발생시켰으며, 이는 항체 둘 다가 리소솜으로 즉시 수송되었음을 나타낸다. 이 효과는 IgG1-CD63N74H에 대해 가장 현저하였고 bsCD63N74Hxb12에 대해 덜 현저하였다. 최종적으로 베타1xCD63N74H는 1, 3 및 16시간 후에 SK-OV-3 세포의 동등한 염색을 나타내었다 (회색 막대). 한편 리소솜 공동국재화가 시간 경과에 따라 점진적으로 증가되었으며 (흑색 막대), 이는 베타1xCD63N74H가 먼저 인테그린 베타-1을 통해 종양 세포에 결합하고, 후속적으로 리소솜으로 수송된다는 것을 나타낸다. 제시된 데이터는 적어도 3개 이미지의 평균 ± 표준 편차이다.
SEQUENCE LISTING <110> Genmab A/S <120> MULTISPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH IMPROVED INTERNALIZATION CHARACTERISTICS <130> P/0099-WO <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Thr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Ala 115 120 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Ile Thr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Val Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 114 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 5 Asn Ile Met Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Ser Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 7 Trp Ala Ser 1 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8 His Gln Tyr Phe Ser Ser Phe Thr 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser His Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 10 Ile His Pro Tyr Asn Asp Gly Thr 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 11 Ile Thr His Tyr Asn Asp Gly Thr 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 12 Ile Thr Pro Tyr His Asp Gly Thr 1 5

Claims (53)

  1. 제1 항원-결합 도메인 및 제2 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 제1 항원-결합 도메인은 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 내재화 이펙터 단백질 (E)에 특이적으로 결합하고, 제2 항원-결합 도메인은 E에 대해 10-9 내지 10-8 M의 해리 상수 KD 값을 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, i) 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 결합 아암 및 ii) 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 결합 아암을 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자인 다중특이적 항원-결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 E에 대해 10-9보다 높고 10-8 M보다 낮은 해리 상수 KD 값을 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 E에 대해 2.0x10-9 내지 9.0x10-9 M의 해리 상수 KD 값을 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 E에 대해 2.0x10-9 내지 7.3x10-9 M의 해리 상수 KD 값을 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, E가 세포 내로 내재화되는 세포 표면-발현된 분자인 다중특이적 항원-결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, 표적 분자 (T)의 존재 하에서만 E에 결합함으로써 세포 내로 내재화되는 다중특이적 항원-결합 분자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 도메인이 표적 분자 (T)에 특이적으로 결합하는 경우에만 E에 결합함으로써 세포 내로 내재화되는 다중특이적 항원-결합 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, E에 결합 시 T를 발현하지 않는 세포에 비해 T를 발현하는 세포 내로 보다 효율적으로 내재화하는 다중특이적 항원-결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, T에 결합 시 E를 발현하지 않는 세포에 비해 E를 발현하는 세포 내로 보다 효율적으로 내재화하는 다중특이적 항원-결합 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, E에 결합 시 T를 발현하는 세포에서 리소솜 구획으로 수송되는 다중특이적 항원-결합 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, E에 결합 시 T를 발현하지 않는 세포에 비해 T를 발현하는 세포에서 리소솜 구획으로 보다 효율적으로 수송되는 다중특이적 항원-결합 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, T에 결합 시 E를 발현하지 않는 세포에 비해 E를 발현하는 세포에서 리소솜 구획으로 보다 효율적으로 수송되는 다중특이적 항원-결합 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, E가 CD63, MHC-I, 크레멘-1, 크레멘-2, LRP5, LRP6, 트랜스페린 수용체, LDLr, MAL, V-ATPase 및 ASGR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, E가 CD63인 다중특이적 항원-결합 분자.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, E가 E와 내재화 세포 표면-발현된 수용체 분자 사이의 상호작용을 통해 세포 내로 내재화되는 가용성 리간드인 다중특이적 항원-결합 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, T가 세포 표면-발현된 표적 분자인 다중특이적 항원-결합 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, T가 종양-연관 항원인 다중특이적 항원-결합 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, T가 HER2인 다중특이적 항원-결합 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 항원-결합 도메인이 적어도 1개의 항체 가변 영역을 포함하는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항체, 바람직하게는 이중특이적 항체, 또는 그의 다중특이적, 바람직하게는 이중특이적 항체 단편 또는 재조합적으로 조작된 부분인 다중특이적 항원-결합 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인을 포함하는 제1 결합 아암 및 상기 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 제2 결합 아암을 포함하는 이중특이적 항체인 다중특이적 항원-결합 분자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 도메인이 제1 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제1 경쇄 가변 서열 (VL)을 포함하고, 상기 제2 항원-결합 도메인이 제2 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제2 경쇄 가변 서열 (VL)을 포함하며, 여기서 상기 가변 서열은 각각 3개의 CDR 서열, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, (i) 상기 제1 결합 아암이 제1 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제1 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제1 중쇄, 및 제1 경쇄 가변 서열 (VL) 및 제1 경쇄 불변 서열 (CL)을 포함하는 제1 경쇄를 포함하고, (ii) 상기 제2 결합 아암이 제2 중쇄 가변 서열 (VH) 및 제2 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제2 중쇄, 및 제2 경쇄 가변 서열 (VL) 및 제2 경쇄 불변 서열 (CL)을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 결합 아암이 키메라 항체로부터 또는 인간화 항체로부터 또는 인간 항체로부터 유래된 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 결합 아암이 키메라 항체로부터 또는 인간화 항체로부터 또는 인간 항체로부터 유래된 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체이며, 여기서 이중특이적 항체는 전장 항체, 바람직하게는 IgG1 항체인 다중특이적 항원-결합 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 도메인이 제2 항원-결합 도메인의 E에 대한 친화도를 조정하는 1개 이상의 돌연변이를 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제2 항원-결합 도메인이 제2 항원-결합 도메인의 E에 대한 친화도를 조정하는 VH 및/또는 VL에서의 1개 이상의 돌연변이를 갖는 항체로부터 유래된 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  31. 제30항에 있어서, 돌연변이가 단일 아미노산 치환, 바람직하게는 단일 아미노산 히스티딘 치환인 다중특이적 항원-결합 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 도메인이
    a. 각각 서열식별번호: 2, 3 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 9, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3, 또는
    b. 각각 서열식별번호: 2, 10 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3, 또는
    c. 각각 서열식별번호: 2, 11 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3, 또는
    d. 각각 서열식별번호: 2, 12 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3
    을 포함하는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인이 각각 서열식별번호: 2, 12 및 4에 제공된 바와 같은 VH CDR 1, 2 및 3, 및 각각 서열식별번호: 6, 7 및 8에 제공된 바와 같은 VL CDR 1, 2 및 3을 포함하는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원-결합 도메인이 각각 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인의 쌍인 다중특이적 항원-결합 분자.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가 종양-연관 표적 (T)xCD63 이중특이적 항체인 다중특이적 항원-결합 분자.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가 HER2xCD63 이중특이적 항체인 다중특이적 항원-결합 분자.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 세포측정법에 의한 결정 시, 항원-결합 분자가 종양-연관 표적 (T)-발현 세포, 예컨대 HER2-발현 세포에 대한 결합에 대해 5.0 μg/ml보다 낮은, 예컨대 0.5 μg/ml보다 낮은 EC50 값을 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, KD가 30℃에서 생물층 간섭측정법에 의해 결정되는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가
    i) 제1 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제1 중쇄를 포함하며, 상기 제1 CH는 제1 CH3 영역을 포함하는 것인 제1 결합 아암, 및
    ii) 제2 중쇄 불변 서열 (CH)을 포함하는 제2 중쇄를 포함하며, 상기 제2 CH는 제2 CH3 영역을 포함하는 것인 제2 결합 아암
    을 포함하는 이중특이적 항체이며,
    여기서 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1과 제2 결합 아암 사이의 이종이량체 상호작용이 각각의 상기 제1 및 제2 결합 아암의 동종이량체 상호작용보다 더 강하게 하는 것인
    다중특이적 항원-결합 분자.
  40. 제39항에 있어서, 상기 제1 중쇄 CH3 영역에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 또는 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되었고, 상기 제2 중쇄 CH3 영역에서 인간 IgG1 중쇄의 위치 T366, L368, K370, D399, F405, Y407 또는 K409에 상응하는 위치에서의 아미노산 중 적어도 1개가 치환되었으며, 여기서 상기 제1 및 상기 제2 중쇄는 동일한 위치에서 치환되지 않고, 아미노산 위치는 EU-인덱스에 따라 넘버링되는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  41. 제40항에 있어서, (i) 제1 CH3 영역이 F405L 치환을 갖고 제2 CH3 영역이 K409R 치환을 갖거나, 또는 (ii) 제1 CH3 영역이 K409R 치환을 갖고 제2 CH3 영역이 F405L 치환을 갖는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 모이어티, 방사성동위원소 또는 약물에 접합된 다중특이적 항원-결합 분자.
  43. 제42항에 있어서, 세포독성 모이어티가 메이탄신, 칼리케아미신, 두오카르마이신, 듀오스타틴, 듀오스타틴-3, 듀오스타틴-5, 라켈마이신 (CC-1065), 아우리스타틴, 모노메틸 아우리스타틴 E, 모노메틸 아우리스타틴 F, 독소루비신, 돌라스타틴, 피롤로벤조디아제핀, IGN-기반 독소, 알파-아마니틴, 또는 그의 유사체, 유도체 또는 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자에 의한 T 및 E의 결합이 T 단독의 결합보다 더 큰 정도로 다중특이적 항원-결합 분자의 내재화를 유도하는 것인 다중특이적 항원-결합 분자.
  45. 탠덤 scFv, 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc 노브-인투-홀, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, 디아바디, sc디아바디, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3 또는 아지메트릭 스캐폴드인, 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항원-결합 분자의 이중특이적 항체 단편.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 다중특이적 항원-결합 분자 또는 이중특이적 항체 단편.
  47. 제46항에 있어서, 암이 자궁내막암/자궁경부암, 폐암, 악성 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 연부조직 종양 예컨대 활막 육종, 유방암, 뇌 종양, 백혈병, 림프종, 비만세포종, 신암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 위암 또는 결장직장암인 다중특이적 항원-결합 분자.
  48. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 다중특이적 항원-결합 분자를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양을 표적화하는 방법에 사용하기 위한 다중특이적 항원-결합 분자.
  49. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항원-결합 분자를 활성 성분으로서 포함하는 제약 조성물.
  50. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항원-결합 분자 또는 제49항에 따른 제약 조성물을 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환의 치료 방법.
  51. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 항원-결합 분자를 코딩하는 핵산.
  52. 제51항에 따른 핵산을 함유하며, 원핵 또는 진핵 숙주 세포주에서 상기 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
  53. 제52항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포주.
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